JPH038760B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、リバビリン（Ribavirin）の酵素的
な製造法に関するものである。 リバビリンの化学名は１−β−Ｄ−リボフラノ
シル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキ
サミドであり、バイラゾール（Virazole）とも
称され、DNAおよびRNAウイルスに対して広範
囲で強力な抗ウイルス作用を示す化合物として知
られている（アナルズ・オブ・ザ・ニユーヨー
ク・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ann.
New York Acad.Sci.）284，272〜292（1977））。 従来技術 従来知られているリバビリンの製造法としては
合成法、発酵法および酸素法がある。 合成法の代表的な方法としては、３−メトキシ
カルボニル−１，２，４−トリアゾールと１−Ｏ
−アセチル−２，３，５−トリ−Ｏ−アシル−β
−Ｄ−リボフラノースを反応させ（溶融法）、得
られた１−（2′，3′−5′−トリ−Ｏ−アシル−β−
Ｄ−リボフラノシル）−３−メトキシカルボニル
−１，２，４−トリアゾールをアンモニアで処理
し、アミド化と脱保護を行う方法（特開昭48−
4469号、特開昭49−80070号、特開昭49−80071号
各公報参照）、前記と同様の方法においてトリア
ゾールの３位の置換基としてアラルキルオキシ基
を用いる方法（特開昭55−160793号公報参照）、
３−メトキシカルボニル−１，２，４−トリアゾ
ールをトリメチルシリル化し、２，３，５−トリ
−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシドのハ
ロゲン化物と反応させた（シリル化法）後、アン
モニアで処理する方法（特開昭48−4469号、特開
昭49−86372号各公報参照）などが知られている。
このような合成法は、いずれも反応前に原料化合
物の活性基を保護する必要があり、また反応に際
してはリボースの活性化が必要であつたり、高温
に加熱する必要がある場合もあり、さらに、反応
後に脱保護およびアミド化が必要であるなど反応
操作が煩雑であるなどの問題がある。また、縮合
反応の位置選択性はいずれも高くない。 発酵法としては、ブレビバクテリウム属、コリ
ネバクテリウム属、アースロバクター属、ミクロ
コツカス属またはバチルス属に属する微生物を培
養して増殖させる際に、使用微生物の培養のため
に必要な炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養
物を含有する培地に、培養開始前または培養中、
一時にまたは間歇的に１，２，４−トリアゾール
−３−カルボキサミドを添加し、培養開始後２〜
８日間という長期間にわたつて培養し、培地中に
リバビリンを生成蓄積せしめる方法が知られてい
る（特公昭54−17830号公報、日本農芸化学会誌、
50(9)、423〜430（1976）参照）。この方法は、しか
しながら、次のような欠点を有するものと思われ
る。すなわち、リバビリンの製造は微生物の増
殖中に栄養培地中で行われるので、まず微生物を
増殖させるために各種の栄養源を含有る培地を調
製しなければならず、種菌を植菌する前にこれら
の培地を殺菌しなければならないなど前処理が煩
雑である。リバビリンの蓄積を目的とする、微
生物の増殖を伴う培養は、通常20〜40℃の常温で
行われるので、常に雑菌汚染への配慮が必要であ
るばかりではなく、このような条件下ではリバビ
リン分解活性も存在しているので、生成したリバ
ビリンも分解され、目的物の収量が低下する。
培養を２〜８日間という長期間にわたつて行わな
ければならない。各種のヌクレオシド、リバビ
リンのりん酸化物、その他の代謝産物が副生し、
培養液からリバビリンを回収するためには、原料
化合物だけでなく、各種の副生物とも分離しなか
ればならず単離精製が煩雑である。微生物をリ
バビリンの製造の度に培養しなければならない。 また、酵素的な製造法としては１，２，４−ト
リアゾール−３−カルボキサミドとリボース−１
−りん酸とをPH５〜９、温度０〜50℃の条件下で
ヌクレオシドホスホリラーゼの存在下において反
応させる方法が知られている（特開昭50−29720
号公報参照）。この方法も、リボース供与体と
して用いられるリボース−１−りん酸が不安定で
ある上に、入手が容易でない酵素として精製酵
素が用いられており、酵素の調製が容易でないな
どの欠点を有するものと思われる。 発明の概要 要 旨 本発明者らは、微生物の培養物、菌体または菌
体処理物を酵素源とし、微生物の非増殖条件下に
酵素反応によつてリバビリンを生成させることが
できることを初めて知見し、この知見に基づいて
本発明を完成した。 すなわち本発明は、１，２，４−トリアゾール
−３−カルボキサミドまたはその塩とリボース供
与体とをブレビバクテリウム・アセチリカムの酵
素作用下に該微生物の非増殖条件下において水性
媒体中で反応させてリバビリンを生成させること
を特徴とするリバビリンの製造法を提供するもの
である。 本発明で「酵素作用下」ということは、使用微
生物の培養物、菌体または菌体処理物の存在下に
ということを意味する。 本発明方法と、従来の発酵法とが最も相違する
点は、本発明においては微生物の培養物、菌体ま
たは菌体処理物を酵素剤とし、しかも微生物が増
殖しない、酵素反応に最適な条件下で反応基質で
ある１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサ
ミドまたはその塩とリボース供与体とを反応させ
る点である。 効 果 本発明方法は、発酵法に比べて、微生物の非
増殖条件、たとえば高温条件下で反応を行う場合
には雑菌汚染がほとんどなく、リバビリンの分解
反応が抑制されるのでリバビリンの収率低下がな
い、酵素反応なので反応時間が短かく、副生物
の生成も少なく、リバビリンの単離精製が容易で
ある、酵素源の反復使用も、連続使用も、連続
使用も可能である、酵素源の保存が可能であ
り、酵素源の調製および使用を任意な時期に行う
ことができるなどの利点がある。また、酵素法に
比べて酵素源の調製が容易である、リボース
供与体をヌクレオシド、ヌクレオチドなどから広
く選択でき、リボース供与体の入手が容易である
などの利点がある。また、本発明方法の最適の酵
素源を選択すれば、従来のこれらの方法に比べて
はるかに高収率にリバビリンを製造することがで
きる。 発明の具体的説明 酵素源／使用微生物 本発明において使用される微生物は、その培養
物、菌体または菌体処理物が、１，２，４−トリ
アゾール−３−カルボキサミドとリボース供与体
との反応を触媒して、リバビリンを生成する酵素
系を含有するものであり、具体的にはブレビバク
テリウム・アセチリカム（Brevibacterium
acetylicum）に属する微生物である。 前記の酵素活性の強い代表的菌株の一つとし
て、兵庫県西宮市の甲子園球場の砂より分離され
たAT−６−７株を挙げることができる。この菌
株の菌学的性質を以下に記載する。 Ａ 形態 (1) 細胞の形態および大きさ：短桿状、0.8〜1.0
×1.0〜1.2μｍ (2) 胞子の形成：なし (3) グラム染色性：陽性 Ｂ 各種培地における生育状態 (1) 肉汁寒天板培養（28℃、48時間） 集落の形状：円形（Circular） 集落表面の隆起：扁平状（Flat）、平滑
（Smooth） 大きさ：２〜４mm 色調：黄色ないし桃黄色 (2) 肉汁寒天斜面培養（28℃、48時間） 生育：良好 生育の形：疣状（Echinulate） (3) 肉汁液体培養（28℃、48時間） 生育：表面に菌環（Ring）を形成し、やや沈
渣（Sediment）を生じる。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養（20℃、６日間）：層
状（Straitiform）に液化する。 (5) リトマスミルク培地（28℃、４日間）：わず
かに凝固し、ペプトン化も見られる。 Ｃ 生理的性質 (1) 硝酸塩の還元（28℃、５日間）：還元性なし。 (2) 硫化水素の生成（28℃、５日間）：生成しな
い。 (3) 殿粉の加水分解：分解性あり。 (4) カタラーゼ：陽性 (5) インドールの生成：生成しない。 (6) ペプトンおよびアルギニンからのアンモニア
の生成：陰性 (7) メチルレツドテスト：陰性 (8) Ｖ−Ｐテスト：陽性 (9) 酸素に対する態度：好気的 (10) Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法による）：Ｆ
型（Fermention） (11) 糖類からの酸の生成 陽性：グルコース、マンノース、フラクトー
ス、マルトース、サツカロース、トレハロ
ース 陰性：アラビノース、キシロース、ガラクトー
ス、ラクトース、ソルビツト、イノシツ
ト、グリセリン 生育PH範囲：PH6.0〜9.0 (13) 生育最適温度：25〜37℃ 以上の菌学的性質を、バージエーズ・マニユア
ル・オフ・デイタミネーテイブ・バクテリオロジ
ー（Berey′s Manual of Determinative
Bacteriology）第７版（1957年）の分類基準に
より検索した。その結果、AT−６−７株はほと
んど球菌に近い短桿菌で、グラム陽性であり、フ
イラメントを形成せず、炭水化物より酸を生成す
ることよりブレビバクテリウム
（Brevibacterium）属に属する菌株と固定し、ブ
レビバクテリウム・アセチリカム
（Brevibacterium acetylicum）AT−６−７と命
名した。 なお、AT−６−７株の同定帰属はバージエー
ズ・マニユアル・オフ・デイタミネーテイブ・バ
クテリオロジー第７版によるものであり、分類基
準の変更などにより、異なる分類基準によつてこ
の菌株の同定帰属が行われた場合には、他種ある
いは他属に属することもあり得るが、本発明にお
いて上記のごとく命名された微生物は、寄託機関
への寄託および前記の菌学的性質に基づいて、一
義的に特定され得るものである。 この菌株について、昭和56年通商産業省告示第
178号に従つて工業技術院微生物工業技術研究所
に対して寄託申請を行い、昭和57年１月13日付け
で受託され、受託番号として微工研菌寄第6305号
（FERM Ｐ−6305）が付与されている。 また、前記の菌株から、紫外線、Ｘ線、γ線の
照射などの物理的処理もしくはニトロソグアニジ
ンなどによる薬剤処理など、一般的変異誘導法に
よる誘発突然変異または自然の原因に起因する自
然突然変異によつて誘導された変異株も、本発明
の目的とするリバビリン製造に関与する酵素活性
を失なわない限り、本発明に使用される。 さらに、以上のような本発明に好適に使用され
る菌株から得られた本発明の目的とするリバビリ
ン製造に関与する酵素系の遺伝子がブレビバクテ
リウム属、コリネバクテリウム属、アースロバク
ター属、ミクロコツカス属またはバチルス属以外
の微生物に取り込まれてそのような形質が発現す
るに至つた場合、このような微生物の培養物、培
養菌体またはその処理物を本発明の目的に使用す
る方法は、本発明に包含される。 酵素源の調製／培養 本発明に使用する酵素源を調製するために、こ
れらの微生物を培養するに際しては、使用される
培地および培養法は、これらの微生物が生育する
限り、特に限定されない。 培地としてはこれらの微生物が資化可能な炭素
源および窒素源を適当量含有し、必要に応じて無
機塩、微量発育促進物質、消泡剤などを添加した
ものが使用される。具体的には、炭素源として
は、グルコース、フラクトース、マルトース、ガ
ラクトース、リボース、サツカロース、殿粉、殿
粉加水分解物、糖密、廃糖密などの糖類もしくは
その脂肪酸エステルなどの誘導体、麦、〓、米な
どの天然炭水化物、グリセロール、マンニトー
ル、メタノール、エタノールなどのアルコール
類、グルコン酸、ピルビン酸、酢酸、クエン酸な
どの脂肪酸類、ノルマルパラフイン、ケロシンな
どの炭化水素類、グリシン、グルタミン酸、グル
タミン、アラニン、アスパラギンなどのアミノ酸
類など、一般的な炭素源より使用する微生物の資
化性を考慮して一種または二種以上を適宜に選択
して使用すればよい。窒素源としては、肉エキ
ス、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、大豆加水
分解物、大豆粉、ミルクカゼイン、カザミノ酸、
各種アミノ酸、コーンステイープリカー、コツト
ンシードミールないしその加水分解物、フイツシ
ユミールないしその加水分解物、その他の動物、
植物、微生物の加水分解物などの有機窒素化合
物、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、りん酸アンモニウ
ム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの
アンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、
尿素などの無機窒素化合物より使用微生物の資化
性を考慮し、一種または二種以上を適宜に選択し
て使用する。さらに、無機塩として微量のマグネ
シウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅、ナトリウム、
カルシウム、カリウムなどのりん酸塩、塩酸塩、
硫酸塩、炭酸塩、硝酸塩、酢酸塩などの一種また
は二種以上を適宜添加し、必要に応じて植物油、
界面活性剤などの消泡剤、ビタミンB₁，B₂、ニ
コチン酸、パントテン酸、ビオチン、ｐ−アミノ
安息香酸などの微量発育促進物質を添加してもよ
い。また、栄養要求を同時に示す微生物を使用す
る場合、当然その生育を満足させる物質を培地に
添加しなかればならない。 培養は、前記培地成分を含有する液体培地中で
振盪培養、通気撹拌培養、静置培養、連続培養な
どの通常の培養法より使用微生物に適した培養法
を選択して行う。 培養条件は、使用微生物および培地の種類によ
り適宜選択すればよいが、通常は培養開始のPHを
約６〜８に調整し、約25〜35℃の温度条件下で培
養を行う。培養期間は使用微生物の生育に十分な
時間であればよく、通常１〜３日間である。 酵素源の態様 本発明方法において使用される酵素源は、１，
２，４−トリアゾール−３−カルボキサミドとリ
ボース供与体とからリバビリンを生成する反応を
触媒する酵素系を含有するものである。 本発明方法における酵素反応の主たる必須酵素
はヌクレオシドホスホリラーゼであり、本発明に
使用する酵素源としては本酵素活性をすることが
必須である。さらにリボース供与体として本酵素
の直接の基質とならないものを使用する態様にお
いては、リボース供与体から基質に導く酵素系の
活性を含有するものであることが好ましい。 以上のように微生物を培養した後、得られた培
養物、培養物から遠心分離、沈降分離、凝集分離
などの通常の方法によつて集菌した生菌体、また
は生菌体に適宜な処理を施して得られる菌体処理
物を本発明における酵素源として使用できる。こ
こで、培養物とは培養後の培地と培養菌体が未分
離の状態のものをいう。また、菌体処理物とは、
乾燥菌体、細胞膜および／または壁変性菌体、破
砕菌体、固定化菌体、菌体抽出物、本発明の目的
とするリバビリンの製造に関与する酵素活性を有
する菌体抽出物の蛋白質画分もしくはその精製
物、蛋白質画分もしくはその精製物の固定化物な
どを指称する。 菌体処理物を得るための方法を以下に例示す
る。すなわち、生菌体に対し、たとえば凍結融
解処理、凍結乾燥処理、通風乾燥処理、アセトン
乾燥処理、酸性ないしアルカリ性下における加温
処理、磨砕処理、超音波処理、浸透圧差処理など
の物理的処理手段、もしくはたとえば、リゾチー
ム、細胞壁溶解酵素などの酵素処理、トルエン、
キシレン、ブチルアルコール（ブタノール）など
の溶媒もしくは界面活性剤との接触処理などの化
学的ないし生物化学的処理を単独もしくは組み合
せて施すことにより、また、菌体抽出物に対
し、たとえば塩析処理、等電点沈殿処理、有機溶
媒沈殿処理、各種クロマトグラフ処理、透析処理
などの酵素分離精製手段を単独もしくは組み合せ
て施すことにより、さらに、生菌体、菌体抽出
物もしくはその精製物に包括処理、架橋処理、担
体への吸着処理などの酵素固定化手段を施すこと
により菌体処理物を得ることができる。 反応基質 本発明の酵素反応における反応基質は１，２，
４−トリアゾール−３−カルボキサミドおよびリ
ボース供与体である。 １，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミ
ドは遊離型またはナトリウム塩などの塩のいずれ
も使用できる。 リボース供与体としてはリボヌクレオシドもし
くはＤ−リボースまたはこれらの各種りん酸エス
テルのいずれでもよい。すなわち、リボヌクレオ
シドはその塩基部分がプリン系またはピリジン系
のいかなる塩基であつてもよく、天然物由来であ
れ化学合成によるものであれ使用することができ
る。また、リボヌクレオシドもしくはＤ−リボー
スの糖部水酸基は非置換のものであつてもあるい
は２位、３位もしくは５位水酸基のいずれか一個
所、二個所もしくは全てにモノりん酸エステル残
基、ジりん酸エステル残基、トリりん酸エステル
残基を有するものであつてもよい。また、これら
のりん酸エステルは遊離型であつてもよく、また
ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウ
ム、アンモニウム、トリエチルアンモニウムなど
の一般的なアルカリ塩であつてもよい。リボース
供与体の具体例としてはイノシン、アデノシン、
グアノシン、キサントシン、ウリジン、シチジン
などのリボヌクレオシド、5′−イノシン酸、5′−
アデニル酸、5′−グアニル酸、5′−キサンチル
酸、5′−ウリジン酸、5′−シチジル酸、2′（3′）−
イノシン酸、2′（3′）−アデニル酸、2′（3′）−グ
ア
ニル酸、2′（3′）−キサンチル酸、2′（3′）−ウリ
ジ
ル酸、2′（3′）−シチジル酸などのリボヌクレオチ
ド、Ｄ−リボース、Ｄ−リボース−１−りん酸な
どが例示される。 反応基質溶液 本発明の酵素反応に使用される基質溶液は、基
本的には前記の反応基質が水性媒体に溶解もしく
は懸濁した水性液である。 水性液中には前記の反応基質のほかに、必要に
応じてりん酸イオン供与体、有機溶媒、界面活性
剤、金属塩類補酵素類、酸、塩基、糖類など酵素
反応を促進する物質、反応基質の溶解性を向上さ
せる物質、酵素と反応基質の接触を向上させる物
質等を含有していてもよい。 水性媒体としては、水または酵素反応に好適な
各種緩衝液（りん酸緩衝液、イミダゾール−塩酸
緩衝液、ベロナール−塩酸緩衝液、トリス−塩酸
緩衝液など）を用いることができる。 本発明の酵素反応は主にヌクレオシドホスホリ
ラーゼの作用に基づくものであり、それ故反応系
にりん酸イオンの存在が必要である。酵素反応系
にりん酸イオンが存在しない場合は、りん酸イオ
ン供与体の添加が必要である。 りん酸イオン供与体としては、水性媒体中でり
ん酸イオンに解離しうるもののいずれを用いても
よく、たとえば遊離型りん酸そのもの、無機りん
酸塩、たとえばナトリウム、カリウムなどのアル
カリ金属、カルシウム、マグネシウムなどのアル
カリ土類金属、アンモニウムとの塩が好適に使用
される。また、りん酸イオン供与体としては、酵
素反応液中でりん酸イオンを遊離しうる系、たと
えばリボース供与体のリボヌクレオチドとホスフ
アターゼの組み合せ、同じくヌクレオチドとヌク
レオチターゼの組み合せなどを利用することがで
きる。このような系における反応に関与する酵素
は、本発明に使用される酵素源に混在するもので
あつてもよく、別途添加された酵素、またはその
酵素活性を有する菌体もしくは菌体処理物等であ
つてもよい。以上のようなりん酸供与系は、酸素
反応に際して系外から添加されたものでも、酵素
源がその成分として含有しているものであつても
よい。すなわち、酵素反応に利用しうる形態であ
る限り、上記の物質の単独もしくは二種以上を組
合せた系を、または上記の物質を含有する微生物
菌体もしくはその菌体処理物を、本発明の酵素反
応に際して反応液に別途添加してもよく、あるい
は使用微生物が菌体成分として含有しているこれ
らの物質をそのまま利用してもよい。 有機溶媒としては、たとえばメタノール、エタ
ノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノー
ル、アセトン、メチルエチルケトン、酢酸エチ
ル、トルエン、トテラヒドロフラン、ジオキサ
ン、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミ
ド、ジメチルホルムアミド、２−メトキシエタノ
ール、２−エトキシエタノール、１，２−ジメト
キシエタンなどが例示される。 接触方法 本発明の反応は、前記の酵素源と反応基質とを
水性媒体中で微生物の非増殖条件下において接触
させることにより達成される。 接触方法は、酵素源の形態に応じて適宜に選択
すればよいが、通常、酵素源を反応基質溶液に懸
濁もしくは溶解し、好ましくは加温しながら撹拌
もしくは振盪するバツチ方式、または酵素源を必
要に応じて適当な担体、助剤、吸着剤と混和し、
もしくはこれらに担持させてカラムに充填し、反
応基質溶液を通液するカラム方式などが適用され
る。 反応基質および酵素源源の濃度もしくは添加量 反応に際し、反応液の基質濃度は特に制限され
るものではなく、反応温度における使用水性媒体
に対する基質の飽和濃度以下の基質濃度が通常採
用されるが、反応基質溶液に添加された前記の有
機溶媒、界面活性剤などにより基質濃度を増大さ
せることもできる。また、反応液中に飽和濃度以
上の基質を懸濁状態で存在させ、反応の進行に従
つて各基質を溶解させることもできる。また、基
質を反応中に逐次添加して、その濃度を適当レベ
ルに保つこともできる。基質を溶解させる場合、
基質濃度は１，２，４−トリアゾール−３−カル
ボキサミドまたはその塩については通常５〜
200mM程度、好ましくは10〜100mM程度であ
る。リボース供与体については、これを別途添加
する場合は通常５〜300mM程度、好ましくは10
〜150mM程度である。 酵素源の使用量は微生物の種類、その使用形
態、反応効率、経済性などを考慮し、当業質が予
備実験等によつて容易に決定できるものである
が、通常バツチ方式の場合、たとえば生（湿）菌
体であれば10〜150mg／ml基質溶液程度、乾燥菌
体であれば２〜30mg／ml基質溶液程度であればよ
く、カラム方式においてはバツチ方式に準じて適
当な量を設定することができる。 反応条件 本発明の反応の条件は、菌体等を非増殖条件
下、すなわち休止もしくは死滅菌体の状態で反応
に供すること以外は特に限定されない。 微生物の非増殖条件下で反応に供する方法とし
ては、酵素反応温度を使用微生物が増殖できない
温度範囲（ただし、本発明の反応に関与する酵素
が失活しない温度範囲である。）に設定する方法、
使用微生物菌体をあらかじめ前記のとおり物理
的、化学的ないし生物化学的に処理することによ
つて微生物を増殖できない状態にした後、反応に
供する方法、反応に際して、たとえばトルエンな
どの使用微生物の増殖を阻害する物質を反応基質
溶液に添加する方法などを単独にあるいは組も合
せて採用すればよいが、特に反応温度を操作する
方法が最も効果的で簡便である。 本発明の反応において反応温度は上記のとおり
重要な条件であり、本発明を特徴づけるものであ
る。反応は37〜80℃の範囲において進行するが、
実用性を考慮すれば40〜70℃の範囲が好ましい。
なお、最適の温度条件は反応基質の種類によつて
異るが、当業者であれば予備実験などにより容易
に決定することができる。 40℃以上の温度範囲で酵素反応を行うことによ
り使用微生物の生育は大部分抑制される。たとえ
ば、後記実施例１と同一の微生物の生菌体を使用
し、28〜60℃の各所定温度でそれぞれ実施例１と
同様に反応させたときの１，２，４−トリアゾー
ル−３−カルボキサミドからのリバビリンの生成
率（％）と反応後の使用微生物の生存率（％）と
の関係を示すと下記第１表のとおりである。な
お、微生物の生存率は反応開始前の微生物の生菌
数／mlに対する反応後の生菌数／mlの百分率であ
る。 【表】 以上のとおり、本反応は使用微生物の非増殖条
件下、すなわち、大部分の微生物が休止もしくは
死滅する条件下で行われなければならない。 さらに、本発明において反応温度を前記の範囲
に設定することにより、酵素反応速度を増大させ
るだけでなく、生成したリバビリンの分解反応を
抑制することが実験により確認された。一例とし
て、実施例１と同一の微生物の生菌体の懸濁液１
mlを20mMリバビリン溶液１mlに加えて28〜60℃
の各所定温度で20時間インキユベートしたときの
リバビリンの残存率（％）を第２表に示す。 【表】 以上の結果からも37℃以上の反応温度が好適で
あることが確認できる。 反応基質溶液の液性は、通常PH４〜10、好まし
くはPH６〜８の範囲に保たれればよく、反応中に
PHが変動するときは、塩酸、硫酸、りん酸などの
酸または水酸ナトリウム、水酸化カリウム、アン
モニア水、アンモニアガスなどのアルカリを用い
て好ましいPH範囲に補正すればよい。 反応時間は、反応基質の目的物への変換率を確
認しながら決定すれべよいが、通常バツチ方式で
は２〜45時間程度、好ましくは24〜36時間程度反
応させればよく、カラム方式ではバツチ方式に準
じて適当な条件を設定して反応させればよい。 分離精製 反応後、必要に応じて菌体等を過、遠心分離
または凝集分離などの常法によつて分離除去し、
リバビリンの分離精製工程に供する。 リバビリンの分離精製は、公知の方法またはこ
れを応用して行えばよく、たとえばイオン交換ク
ロマトグラフイー、吸着クロマトグラフイー、分
配クロマトグラフイー、ゲル過法など各種のク
ロマトグラフイー、向流分配、向流抽出など二液
相間の分配を利用する方法、濃縮、冷却、有機溶
媒添加など溶解度の差を利用する方法などの一般
的な分離精製法を単独で、あるいは適宜に組み合
せて行えばよい。 分 析 本発明の実施例等においてリバビリンおよび
１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド
の分析は高速液体クロマトグラフイーによつて行
つた。以下に示す装置および条件で分析すると、
リバビリンは保持時間3.50分付近に、１，２，４
−トリアゾール−３−カルボキサミドは保持時間
2.65分付近に溶出され、検量線よりそれぞれの量
を算出できる。 装置：島津高速液体クロマトグラフLC−3A型
（(株)島津製作所製） カラム：マイクロ・ボンダパツク
（μBONDAPAK）C₁₈、4.6mm×250mm （日本ウオーターズリミテツド社製） 溶出剤：２％アセトニトリルを含む20mMトリ
ス−塩酸緩衝液（PH7.5） 流速：１ml／分 測定波長：225nm カラム操作温度：室温 実験例 以下、実験例をもつて本発明をより具体的に説
明するが、これらはいずれも実施の一態様を示す
ものであつて、本発明の範囲を制限するものでは
ない。 実施例 １ ブレビバクテリウム・アセチリカムAT−６−
７を粉末ブイヨン（極東製薬工業(株)製）２％水溶
液５リツトルに植菌し、28℃、24時間振盪培養し
た。 培養終了後、遠心分離によつて集菌し、洗滌
後、殺菌水を加えて250mlの菌体懸濁液を得た。
66.7mM1，２，４−トリアゾール−３−カルボ
キサミド、66.7mMイノシンおよび100mMりん
酸−カリウムを含む水溶液（PH7.0）750mlに前記
菌体懸濁液250mlを加え、60℃で24時間反応させ
た（リバビリン生成率74.88％）。 反応液を遠心分離して菌体を除去した後、カチ
オン交換樹脂（H⁺型）を通過させ、この通過水
洗液を活性炭に吸着させた。活性炭カラムよりエ
タノール−アンモニア溶液でリバビリンを溶出
し、溶出後のエタノールを除去した後、アニオン
交換樹脂を通過させ、通過水洗液を減圧濃縮して
50mlとし、冷却した。冷却後、析出した結晶を分
離し、乾燥してリバビリンの結晶6.5ｇを得た。 比較例 実施例１と同一の菌株を使用し、特公昭54−
17830号公報の実施例１と同様の方法で微生物の
増殖中に原料トリアゾール化合物を添加してリバ
ビリンの製造を試みた。すなわち、前記菌株をグ
ルコース130ｇ、りん酸−カリウム１ｇ、りん酸
二カリウム３ｇ、硫酸マグネシウム１ｇ、塩化カ
ルシウム0.1ｇ、硫酸鉄10mg、硫酸亜鉛５mg、硫
酸マンガン10mg、ビタミンB₁5mg、パントテン酸
カルシウム10mg、シスチン20mg、ビオチン30μ
ｇ、肉エキス10ｇ、硫酸アンモニウム２ｇおよび
尿素２ｇ（別殺菌）を１リツトル中に含有する組
成で、PH7.6に調整した培地10mlに植菌し、12時
間毎にアンモニア水でPH7.2に調整しつつ28℃で
振盪培養した。培養開始24時間後に１，２，４−
トリアゾール−３−カルボキサミドを２mg／ml濃
度で添加し、さらに４日間培養した。培養液を遠
心分離した後、上澄液を分析したが、リバビリン
の生成は全く認められなかつた。 実施例 ２ 実施例１と同一の菌株を実施例１と同様に培養
し（ただし、培養液は各10mlとした。）、培養後、
遠心分離によつて集菌し、各１mlの殺菌水を加え
て菌体懸濁液を得た。 この菌体懸濁液に20mM1，２，４−トリアゾ
ール−３−カルボキサミド、20mMの第３表に示
す各種リボース供与体および25mMりん酸一カリ
ウムを含む水溶液（PH7.0）各１mlを添加し、60
℃で24時間反応させた。反応終了後、遠心分離に
よつて除菌し、上澄液を分析したところ、リバビ
リンの生成率は第３表に示すとおりであつた。 なお、リバビリン生成率とは、１，２，４−ト
リアゾール−３−カルボキサミドからリバビリン
への転換率（％）をいう。 【表】 実施例 ３ ２％粉末ブイヨン培地各100mlに実施例１と同
一の菌株を植菌し、28℃、22時間振盪培養し、培
養菌体を得、次いで以下の処理を行つて、菌体処
理物懸濁液を得た。 １ アセトン乾燥菌体：生菌体に50mlのアセトン
を加え、15分間放置し、遠心分離して得た菌体
にさらに50mlのアセトンを加え、同様の処理を
行つた後、真空乾燥して乾燥菌体を得た。これ
に水を加えて菌体処理物懸濁液10mlを得た。 ２ 凍結融解菌体：生菌体を−80℃で１晩凍結
後、解凍し、水を加えて菌体処理物懸陳液10ml
を得た。 ３ 浸透圧差処理菌体：生菌体に100mlの飽和食
塩水を加え、一晩氷冷後、遠心分離によつて上
澄液を捨て、分離菌体に水を加えて菌体処理物
懸濁液10mlを得た。 ４ 超音波処理菌体：生菌体に水を加えて10mlと
し、出力電圧1.6KVで20分間超音波処理を行つ
た。 以上の菌体処理物懸濁液各10mlおよび実施例１
と同様にして得た無処理菌体懸濁液10mlに
20mM1，２，４−トリアゾール−３−カルボキ
サミド、20mMイノシンおよび25mMりん酸−カ
リウムを含む反応基質溶液（PH7.0）各10mlを加
え、60℃、24時間反応後、リバビリンの生成率を
分析したところ第４表に示すとおりであつた。 【表】 実施例 ４ ２％ブイヨン培地25mlに実施例１と同一の菌株
を植菌し、28℃、24時間振盪培養し、培養後、集
菌し、水を加えて各2.5mlの菌体懸濁液を調製し
た。これに実施例３と同じ反応基質溶液各2.5ml
を加え、28〜70℃の各温度（第５表）で20時間反
応後、リバビリンの生成率を分析したところ第５
表に示すとおりであつた。 【表】 実施例 ５ 実施例１と同一の菌株を使用し、実施例４と同
様に調製した菌体懸濁液各2.5mlに以下の反応基
質溶液(A)または(B)各2.5mlを加え、60℃、20時間
反応後、リバビリンの生成率を分析したところ第
６表に示すとおりであつた。 反応基質溶液(A)：20mM1，２，４−トリアゾ
ール−３−カルボキサミドおよび20mMイノシン 反応基質溶液(B)：上記反応基質溶液(A)と同量の
各基質に25mMりん酸一カリウムを加える。 【表】 実施例 ６ 実施例５と同じ菌体懸濁液2.5mlに実施例５の
反応基質溶液(B)2.5mlを加え、60℃で20時間反応
後、菌体を分離した。この分離菌体に水10mlを加
えて次回の反応に使用し、上記と同様の反応を10
回繰り返した。第１回のリバビリン生成率を100
としたときの各回の反応の相対生成率を第７表に
示す。 【表】 実施例 ７ ２％ブイヨン培地１リツトルに実施例１と同一
の菌株を植菌し、30℃、22時間振盪培養した後、
遠心分離によつて生菌体を得た。 この生菌体にＡ液〔1N−塩酸24ml、トリス
3.425ｇ、TEMED（Ｎ，Ｎ，N′，N′−テトラメ
チレンジアミン）0.23mlを溶解して水で100mlに
希釈した水溶液〕20ml、Ｂ液〔アクリルアミド30
ｇ、BIS（Ｎ，Ｎ−メチレンビス（アクリルアミ
ド））0.8ｇを水に溶解して100mlとした水溶液〕
20mlおよびＣ液〔過硫酸アンモニウム0.3ｇを水
に溶解して200mlとした水溶液〕40mlを加えて放
置し、菌体を固定化した。固定化後ホモジナイザ
ーで細片化し、180mlの固定化菌体を得た。 この固定化菌体10mlに20mM1，２，４−トリ
アゾール−３−カルボキサミド、20mlイノシンお
よび25mMりん酸一カリウムを含む基質溶液20ml
（PH7.0）を加え、60℃、24時間反応し、反応液を
分析したところ62.89％のリバビリンが生成して
いた。なお、生菌体を使用して同一条件で反応を
行つたところリバビリンの生成率は65.44％であ
つた。 実施例 ８ ブレビバクテリウム・アセチリカムAT−６−
７と公知の菌株であるブレビバクテリウム・アン
モニアゲネス（B.ammoniagenes）ATCC 6871
株を同一条件で培養し、同一条件で酵素反応に供
して、リバビリンの生成量（生成率）を比較し
た。 すなわち、1.5％酵母エキス培地（PH7.0）各９
mlに両菌株を植菌し、28℃で１日振盪培養した。 40mM1，２，４−トリアゾール−３−カルボ
キサミド、60mM5′−ウリジル酸二ナトリウムお
よび8mMりん酸一カリウムを含有する溶液10ml
に前記培養液より遠心分離によつて集菌した菌体
を加え、45℃で20時間反応させた。 反応後、遠心分離によつて菌体を除去し、反応
液を高速液体クロマトグラフイーによつて分析し
たところ、結果は第８表に示す通りであつた。 【表】 実施例 ９ AT−６−７株とATCC 6871株とを実施例８
と同様に各100ml培養し、遠心分離によつて集菌
して、菌体を得た。 この菌体を、40mM1，２，４−トリアゾール
−３−カルボキサミド、60mMウリジンおよび
50mMりん酸一カリウムを含有する溶液100mlに
加えて、45℃で20時間反応させた。 反応後、リバビリンの生成率を測定したとこ
ろ、AT−６−７株の場合は86.04％であり、
ATCC 6871株の場合は2.30％であつた。 実施例 10 実施例８と同様の方法で得たAT−６−７株お
よびATCC 6871株のそれぞれの菌体（培養液20
ml分）を、4mM1，２，４−トリアゾール−３−
カルボキサミド、4mMウリジンおよび5mMりん
酸一カリウムを含有する溶液（基質溶液Ａ）なら
びに4mM1，２，４−トリアゾール−３−カルボ
キサミド、4mM5′−ウリジン酸二ナトリウムお
よび1mMりん酸一カリウムを含有する溶液（基
質溶液Ｂ）のそれぞれに加えて、24時間反応させ
た。なお、反応はAT−６−７菌の場合は45℃
で、ATCC 6871株の場合は60℃で、行なつた。 反応後、リバビリンの生成率を測定したとこ
ろ、第９表に示すとおりであつた。 【表】 実施例 11 実施例８と同様の方法でAT−６−７株と
ATCC 6871株を培養して得た菌体（培養液５ml
分）に水を加えて菌体懸濁液0.5mlを得た。 17.8mM1，２，４−トリアゾール−３−カル
ボキサミド、81.9mMウリジンおよび58.8mMり
ん酸一カリウムを含む溶液（PH7.0）0.5mlに上記
菌体懸濁液0.5mlを加えて、60℃で10時間反応さ
せた。 反応後、反応液中のリバビリンの生成量を測定
し、リバビリンの生成率を算出したところ、第10
表に示す通りであつた。 【表】 実施例 12 第11表に示すブレビバクテリウム・アセチリカ
ムの各種菌株を実施例８と同様の方法で培養し、
培養液を遠心分離して、菌体（各培養液４ml分）
を得た。 40mM1，２，４−トリアゾール−３−カルボ
キサミド、60mM5′−ウリジン酸二ナトリウムお
よび10mMりん酸一カリウムを含有する溶液４ml
に上記各菌体を加え、45℃で22時間反応させ、反
応後、リバビリンの生成率を測定したところ、第
11表に示す通りであつた。 【表】 実施例 13 リボース供与体として60mMのイノシンを使用
し、反応温度を60℃とするほかは実施例12と同一
の操作を行つて、第12表の結果を得た。 【表】 参考例 AT−６−７株およびATCC 6871株のホスフ
アターゼ活性を比較するために、各菌株の菌体懸
濁液を5′−ウリジル酸二ナトリウム溶液に加えて
反応させ、ウリジンへの転換率を測定した。な
お、菌体懸濁液は実施例８と同様に培養して得た
菌体（培養液９ml分）を水１mlに懸濁させて調製
し、基質溶液としては6mM5′−ウリジル酸二ナ
トリウムを含有する水溶液９mlを使用した。反応
は45℃で行ない、0.5〜24時間の各時間において
転換率を測定した。転換率の測定は、高速液体ク
ロマトグラフイーによつて行なつた。結果は、第
13表に示す通りであつた。 【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ １，２，４−トリアゾール−３−カルボキサ
   ミドまたはその塩とリボース供与体とをブレビバ
   クテリウム・アセチリカム（Brevibacterium
   acetylicum）の酵素作用下に該微生物の非増殖
   条件下において水性媒体中で反応させてリバビリ
   ンを生成させることを特徴とする、リバビリンの
   製造法。 ２ ブレビバクテリウム・アセチリカムが、ブレ
   ビバクテリウム・アセチリカムAT−６−７（微
   工研菌寄第6305号）である、特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ３ 酵素反応を微生物の非増殖条件下において行
   う方法が、反応液を微生物の増殖できない温度条
   件に保持して反応を行う方法、微生物菌体をあら
   かじめ該微生物が休止もしくは死滅する方法によ
   つて処理し、これを用いて反応を行う方法、およ
   び反応液に微生物の増殖を阻害する物質を添加し
   て反応を行う方法からなる群より選ばれた一種の
   方法または二種以上の組み合せた方法である、特
   許請求の範囲第１〜２項のいずれか１項に記載の
   リバビリンの製造法。 ４ 微生物の非増殖条件が、37〜70℃の温度条件
   である、特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１
   項に記載のリバビリンの製造法。