JPH0365957B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は微生物起源の酵素を利用して次の式(2) で表わされる４−カルバモイル−１−β−Ｄ−リ
ボフラノシル−イミダゾール−５−オレイトを製
造する方法に関する。 ４−カルバモイル−１−β−Ｄ−リボフラノシ
ル−イミダゾール−５−オレイトはブレデニンと
称される化合物で免疫抑制作用を有しており、医
薬として利用できるものである。 ブレデニンの製造方法としては化学的合成法の
他に４−カルバモイル−イミダゾリウム−５−オ
レイトに特定の微生物を作用させる方法が知られ
ている（特開昭51−1693）。本発明者等は再に効
率的な製造法を開発することを目的として研究を
行つた結果、４−カルバモイル−イミダゾリウム
−５−オレイト、リン酸塩及びリボヌクレオシド
若しくはリボヌクレオチドの混合物にヌクレオシ
ド・ホスホリラーゼを作用させると４−カルバモ
イル−１−β−Ｄ−リボフラノシル−イミダゾー
ル−５−オレイトが生成されることを見い出し
た。 しかしながら、この反応は精製した酵素では良
好に進行するが、酵素源として微生物菌体等を使
用する場合には副反応が起り収率が低下してしま
う欠点が有ることがわかつた。精製酵素の代りに
安価な微生物菌体等が使用できれば経済的に有利
であるので副反応を防ぐ方法について更に検討を
行つたところ、上記反応を40〜70℃の高温で行う
と副反応が抑えられ高収率で目的化合物が生成さ
れることを発見し本発明を完成するに至つた。 本発明は、次の式(1) で表わされる４−カルバモイル−イミダゾリウム
−５−オレイト、リン酸塩及びリボヌクレオシド
若しくはリボヌクレオシドを含む水溶液に微生物
に含まれるヌクレオシドホスホリラーゼを40〜70
℃で作用させ４−カルバモイル−１−β−Ｄ−リ
ボフラノシル−イミダゾール−５−オレイトを生
成せしめ、これを分離・採取することを特徴とす
る４−カルバモイル−１−β−Ｄ−リボフラノシ
ル−イミダゾール−５−オレイトの製造法に係る
ものである。 以下、本発明について説明する。 ヌクレオシドホスホリラーゼはプリンリボヌク
レオシドあるいはピリミジンリボヌクレオシドを
加リン酸分解してピリミジン又はプリンとリボー
ス−１−リン酸を生じせしめる酵素で、プリンヌ
クレオシドに作用するプリンヌクレオシドホスホ
リラーゼとピリミジンヌクレオシドに作用するピ
リミジンヌクレオシドホスホリラーゼが有り、微
生物によつて生産されることが知られている（特
開昭56−8695）。 本発明でいう微生物に含まれるヌクレオチドホ
スホリラーゼとはヌクレオシドホスホリラーゼを
主として菌体内に生成する能力を有する微生物を
栄養培地で培養して得られる微生物菌体、菌体の
処理物をいう。 ヌクレオシドホスホリラーゼを生産する能力を
有する微生物としてはシユードモナス
（Pseudomonas）属、フラボバクテリウム
（Flavobacterium）属、アクロモバクター
（Achromobacter）属、サルモネラ
（Salmonella）属、シトロバクター
（Citrobacter）属、エシエリヒア（Escheriehia）
属、スポロサルシナ（Sporosarcina）属、アル
カリゲネス（Alcaligenes）属、エンテロバクタ
ー（Enterobacter）属、エーロモナス
（Aeromonas）属、アースロバクター
（Arthrobacter）属、ブレビバクテリウム
（Brevibacterium）属、セラチア（Serratia）
属、エルビニア（Erwinia）属、プロテウス
（Proteus）属、コリネバクテリウム
（Corynebacterium）属、セルロモナス
（Cellulomonas）属、キサントモナス
（Xanthomonas）属、クレブシエラ
（Klebsiella）属、ミクロコツカス
（Micrococcus）属、バシルス（Bacillus）属又
はバクテリウム（Bacterium）属、キヤンジダ属
（Candida）、サツカロミセス（Saccharomyces）
属、スタヒロコツカス（Staphylococcus）属、
ビブリオ（Vibrio）属、あるいはマイコブラナ
（Mycoplana）属に属する微生物が使用され、更
に具体的には次の微生物が挙げられる。

【表】

【表】 これら微生物を培養する方法は、炭素源、窒素
源、無機イオン及び更に必要ならばビタミン等の
有機微量栄養素を含有する通常の培地用いて培養
すればよく、特別な方法を要せず、従来知られて
いる方法が適宜採用される。 微生物に含まれるヌクレオチドホスホリラーゼ
としては、上記の方法で得られた培養液そのま
ま、或いは洗滌菌体が使用できる他に、菌体処理
物も使用できる。菌体処理物としては、アセトン
乾燥菌体、菌体の摩砕物、菌体の超音波処理物、
界面活性剤又はトルエン等に接触せしめた菌体、
リゾチーム等の酵素で処理した菌体、菌体より抽
出した後、塩析等により分離した菌体の蛋白区
分、更に上記菌体または、菌体処理物の天然ある
いは合成ポリマー等による固定化物等いずれもが
使用できる。 本発明で使用するリボヌクレオシド類としては
ウリジン、シチジン、イノシン、アデノシン、グ
アノシン等の天然リボシド等が用いられ、又リボ
ヌクレオチドとしてはこれらリボヌクレオシドに
リン酸の結合したウリジル酸、イノシン酸、グア
ニル酸等が使用される。添加量は0.1％以上、望
ましくは1.0％であり、0.1％以下では反応が遅
く、効率が低くて実用的ではない。 リボヌクレオシドとしてプリンリボヌクレオシ
ド、リボヌクレオチドとしてプリンリボヌクレオ
チドを用いる場合にはプリンヌクレオシドホスホ
リラーゼ単独で反応は進行するがピリミジンリボ
ヌクレオシド又はピリミジンリボヌクレオチドを
原料として用いる場合にはプリンヌクレオシドホ
スホリラーゼの他にピリミンヌクレオシドホスホ
リラーゼが必要である。この場合には両方の酵素
を生成する能力を有する微生物を使用すれば良
く、前記の微生物には両者がバランス良く含まれ
ている。 酵素反応を行う際には式(1)の４−カルバモイル
−イミダゾリウム−５−オレイト、リン酸塩及び
リボヌクレオシド若しくはリボヌクレオチドを含
む水溶液を調製しPHを４〜10の範囲に調節しこれ
にヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する微生
物菌体、又は菌体処理物若しくは未精製酵素を加
え40〜70℃の高温に保持する。この間時々撹拌し
ながら１〜20時間保持すると反応液中に目的とす
る４−カルバモイル−１−β−Ｄ−リボフラノシ
ル−イミダゾール−５−オレイトが蓄積される。
反応する際の酵素活性は0.01〜1U／mlで行えば
良い。 本発明の方法では反応温度を40〜70℃の範囲と
することが必要で、40℃未満では副反応が起り、
長時間反応させても収率が低く、又副反応によつ
て生ずる不純物の分離に手間がかかるので不利で
ある。 反応液より生成物を分離・採取する方法は公知
の方法に従つて行えば良く、遠心分離等により不
溶性残渣を除去した後、水等の溶媒に対する溶解
度差を利用する方法あるいはイオン交換クロマト
グラフイー等によつて分離することができる。 以下、実施例にて詳細に説明する。 実施例 １ 酵母エキス0.5ｇ／dl、ペプトン1.0ｇ／dl、肉
エキス1.0ｇ／dl及び食塩0.5ｇ／dlの組成の培地
を調製しPH7.0に調節した。これを500ml容の肩付
フラスコに100ml宛分注し120℃で10分間加熱し
た。これにクレブシエラ・ニユーモニア
ATCC9621を接種し30℃で20時間振盪培養した。
培養液を遠心分離して菌体を集め、0.05Mリン酸
緩衝液（PH7.0）に懸濁した（湿潤菌体濃度50
mg／ml）。この菌体懸濁液を５℃に冷却し10分間
超音波照射して菌体を破砕し遠心分離して得られ
る上清液にはウリジンホスホリラーゼ活性及びプ
リンヌクレオシドホスホリラーゼ活性が認められ
た。次に未処理菌体懸濁液1.0mlにウリジン10mg、
KH₂PO₄4.0mg及び４−カルバモイル−イミダゾ
リウム−５−オレイト2.0mgを添加し、PH7.0に調
節した後、10ないし75℃で３時間保持し、その間
時々撹拌した。反応液中のブレデニンの生成量を
高速液体クロマトグラフイー（日立製作所(株)635
型）を用いて定量した。その結果を第１表に示
す。

【表】 実施例 ２ 実施例１で用いた液体培地を5.0ml宛大型試験
管に分注し120℃で10分間滅菌した。この培地に
第２表に示す微生物を１白金耳ずつ接種し、30℃
にて24時間振盪培養した。得られた培養液より菌
体を遠心分離して集め、生理食塩水にて洗滌後
0.05M燐酸緩衝液（PH7.0）に懸濁した（50mg−
湿量／ml）。 上記の菌体懸濁液0.5mlをウリジン2.0ｇ／dl、
４−カルバモイル−イミダゾリウム−５−オレイ
ト0.2ｇ／dl、KH₃PO₄0.8ｇ／dlを含みPH7.0に調
節した反応液0.5mlに加えた。これを60℃に５時
間保ち、その間時々撹拌し、次いで100℃にて５
分間加熱した。 反応液中の生成物を高速液体クロマトグラフイ
ーで調べたところ、第２表に示す結果が得られ
た。第２表にはウリジンの代りにイノシンを用い
た時の結果を併記した。

【表】

【表】 実施例 ３ 実施例１に示した液体培地の100mlを500ml容肩
付フラスコに入れ殺菌した。これにエシエリヒ
ア・コリATCC10798を接種し30℃に保ちつつ、
36時間振盪した。遠心分離にて菌体を集め、５ｇ
（湿重）を10mlのリン酸バツフアー（PH7.0）に懸
濁し、15分間の超音波処理を行つた。遠心分離後
得られた上清10mlを４−カルバモイル−イミダゾ
リウム−５−オレイト100mg、ウリジル酸500mg、
KH₂PO₄350mgを含み、PH7.0に調節した反応液90
ml中に添加した。これを60℃に10時間保つた。反
応後、100℃、５分間処理した後、反応液を遠心
分離してタンパクを除き上清を濃縮し、濃縮液を
セフアデツクスＧ−10のカラムにチヤージレ、水
にて溶出した。溶出液は濃縮し冷所に置き結晶を
析出させた。得られた結晶を水から再結し75mgの
結晶を得た。 このものは、ブレデニンの標品とNMRスペク
トル、赤外線吸収スペクトル、UVスペクトルが
一致していることからブレデニンであることが確
認された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式(1) で表わされる４−カルバモイル−イミダゾリウム
   −５−オレイト、リン酸塩及びリボヌクレオシド
   若しくはリボヌクレオチドを含有する水溶液に、
   微生物に含まれるヌクレオシドホスホリラーゼを
   添加して40ないし70℃に保持し、式(2) で表わされる４−カルバモイル−１−β−Ｄ−リ
   ボフラノシル−イミダゾール−５−オレイトを生
   成せしめ、これを分離・採取することを特徴とす
   る４−カルバモイル−１−β−Ｄ−リボフラノシ
   ル−イミダゾール−５−オレイトの製造法。