JPH03997B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は、バチルス属の１新菌株を培養するこ
とにより得られる。新規アルカリプロテアーゼに
関する。特には、洗浄剤全般に配合して優れた安
定性を有し、洗浄力の改善に寄与する新規アルカ
リプロテアーゼに関する。 ［従来技術とその問題点］ 近年、洗浄剤、特に液体洗浄剤の洗浄力を更に
向上させるために、洗浄剤原液のPHをよりアルカ
リ性にするとともに、プロテアーゼ、アミラー
ゼ、リパーゼ、セルラーゼ等の各種加水分解酵素
の配合が試みられている。その中でも蛋白質分解
酵素なかんずくアルカリプロテアーゼは、洗浄剤
のみでは落ちにくい蛋白汚垢を分解し、洗浄力の
改善に寄与する。そのため、該酵素を洗浄剤に添
加することが不可欠である。一般的にアルカリプ
ロテアーゼとして、バチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフオルミ
ス（Bacillus licheniforumis）、バチルス・アル
カロフイルス（Bacillus alcalophilus）、その他
ストレプトマイセス属（Streptomyces）、アスペ
ルギルス属（Aspergillus）、アースロバクター属
（Arthrobacter）、フザリウム属（Fusarium）等
の微生物により生産されるものが知られている。
具体的１例として、バチルス・リケニフオルミス
（Bacillus licheniforumis）より単離されたアル
カリプロテアーゼ［商品名アルカラーゼ、ノボ社
（以下本文中Ａ酵素と称する）］が当該分野でよく
知られている。しかし、これらの酵素は、高PHお
よび界面活性剤溶液中で直ちに失活するため、液
体洗浄剤に配合することは困難である。本発明で
は、上記Ａ酵素とともにバチルス・アルカロフイ
ルス（Bacillusalcalophilus）No.221（ATCC
21522）より単離されたアルカリプロテアーゼ
［堀越ら、理研（以下本文中Ｂ酵素と称する）］を
比較例とした。 ［問題点を解決するための手段］ 本発明は、洗浄剤成分共存下の高アルカリ条件
において優れた安定性を有し、洗浄力の改善に寄
与するアルカリプロテアーゼを提供することを目
的とする。 本発明者らは、上記の問題を克服したアルカリ
プロテアーゼを得るために、広く自然界よりアル
カリプロテアーゼ産生菌を検索した結果、バチル
ス属に属する１菌種が、前記の性質において公知
のアルカリプロテアーゼより優れたアルカリプロ
テアーゼを培地中に産生することを見出した。該
酵素を産生する菌株は、微工研条寄第1029号バチ
ルス・エスビー（Bacillus sp.）Ｙである。本発
明者らは、該酵素を以下に述べる方法により単離
精製し、種々の性質を従来の酵素と比較しながら
検討した。 本発明のアルカリプロテアーゼ（以下、Ya酵
素と称する）の単離精製法は第１図に示したとお
りである。まず微生物培養液を、10000rpmで５
分間遠心分離した上清を得た。次に該上清を、70
％飽和の硫安塩析にかけた。更に得られる沈澱物
を20mMトリス−塩酸緩衝液（Caイオン2mM添
加、PH7.2）に溶解し、同緩衝液に対して透析し
た。続いて該溶液を、ジエチルアミノエチル
（DEAE）−53セルロースのアニオン交換クロマト
グラフイーにかけ10mMホウ酸緩衝液（PH9.3）
で溶出させ、非吸着画分を得た。尚続いて該非吸
着画分を、再び70％飽和の硫安塩析にかけた。得
られた沈澱物を再び20mMトリス−塩酸緩衝液
（Caイオン2mM添加、PH7.2）に溶解し、同緩衝
液に対して透析した。更にまた該溶液を、トヨパ
ールHW−55（商標、東洋曹達工業（株）製）の
ゲル濾過クロマトグラフイーにかけ、20mMトリ
ス−塩酸緩衝液（Caイオン2mM添加、PH7.2）で
溶出させ、活性のある画分を集めた。尚また該画
分を70％飽和の硫安塩析にかけ、得られた沈澱物
を20mMトリス−塩酸緩衝液（Caイオン2mM添
加、PH7.2）に対して透析した。最後に変性蛋白
質を除去するために、透析後の活性画分をミリポ
アフイルターで濾過し、精製Ya酵素を得た。 ［作用］ 上述の方法に従つて得られたYa酵素の様々な
性質を調べた。 該Ya酵素の作用は、蛋白質の加水分解である。
その酵素の基質特異性を第１表に示す。

【表】 Ａ酵素の活性を100としたときの相対分解率＊ 条件；温度 35℃ PH 10.5（50mMホウ酸緩衝液） 反応時間 60分ただしケラチンは30分 基質濃度 １％ ただしヘモグロビンは0.4
％ 酵素使用量 100APU／ml ただし卵白は
500APU／ml ＊蛋白質分解率すなわち活性の測定は、アンソ
ン−萩原の変法に従つた。反応後濾過した反応溶
液の吸光度を275nmにて測定した。１分間にチロ
シン1μgを遊離させる酵素活性を１アルカリプロ
テアーゼ単位（APU）とした。 この表から、本Ya酵素はケラチンに対する特
異性の強いことが分る。 次に、本Ya酵素の至適PHおよび安定PH領域の
グラフ図を第２図に示す。用いた緩衝液は以下の
とおりである。 PH領域 緩衝液 3.5−5.5 酢酸 4.5−7.0 クエン酸 6.0−8.0 リン酸 7.5−9.0 トリス−HCl 8.0−9.0 ホウ酸−HCl 9.0−10.5 グリシン−NaOH 9.5−11.0 ホウ酸−NaOH 11.0−12.0 リン酸−NaOH 12.0−13.0 KCl−NaOH 至適PHを調べるに当やつては、カゼイン0.6％
を含む20mMの各緩衝液に各酵素を約400APU／
mlとなるように加え、35℃で10分間反応させ活性
を測定した。至適PHでの活性を100とするときの
各PHでの相対活性を求めた。安定PH領域を調べる
に当たつては、20mMの各緩衝液に各酵素を約
400APU／mlとなるように加え、25℃で24時間イ
ンキユベートした後、活性を測定した。インキユ
ベート前の活性を100とした各PHでの相対活性を
求めた。第２図から分るように、本Ya酵素の至
適PHは10.0ないし12.5であり、安定PH領域は6.5な
いし13.0である。 更に、本Ya酵素の至適温度と耐熱性を第３図
に示す。至適温度を調べるに当たつては、基質と
して0.6％のカゼインを含むPH10.5の緩衝液に各
酵素を加え、10分間各温度で反応させた。35℃で
の活性を100として各温度での相対活性を求めた。
耐熱性は次のようにして調べた。50mMホウ酸−
NaOH緩衝液（35℃でPH10.5）に約400APU／ml
の酵素を加え、各温度で10分間熱処理し、氷冷し
た後、活性を測定した。第３図から分るように、
本Ya酵素の至適温度は70℃であり、55℃の温度
まで活性が維持される。 続いて、本Ya酵素の紫外吸収スペクトルを第
４図に示す。試料を50mMのトリス−塩酸緩衝液
（PH8.0）に溶かし、紫外吸収スペクトルを測定し
たところ、276nmの波長で極大吸収を示した。そ
の波長での吸光係数Ｅ１％ １cmは7.4と計算された。 尚次に、金属イオンの本Ya酵素の活性に与え
る影響を調べた。その結果を第２表に示す。
20mMホウ酸−NaOH緩衝液（PH10.5）に本Ya
酵素を約400APU／mlを加え、更に各種金属塩を
1mMの濃度で添加し、各所定の条件で処理後残
存活性を測定した。数値は０分の活性を100とし
てその相対活性で表わす。

【表】 この表から、硫酸銅、硝酸銀、塩化水銀、塩化
カドミウムの添加により本Ya酵素の活性は阻害
されるが、塩化カルシウムの添加では活性の熱に
対する安定性が増すことが分る。 尚続いて、本Ya酵素に対する各種阻害剤の影
響を調べた。条件および方法は以下のとおりであ
る。50mMトリス−塩酸緩衝液（PH7.2）で本Ya
酵素を800APU／mlになるように調製した。各阻
害剤を添加して、35℃で30分間インキユベート
後、残存活性を測定した。値は、阻害剤無添加の
ものを100とした相対活性で示した。その結果を
第３表に示す。

【表】 この表から分るように、本Ya酵素は、活性中
心にセリンを有するプロテアーゼである。 尚更に、液体界面活性剤中での本Ya酵素の安
定性を第５図に示す。各酵素を液体ヘビー洗浄剤
原液中で40℃にて１箇月間保存した後、各酵素の
ケラチンに対する分解活性を測定した。グリシン
−NaOHの緩衝液でPHを変化させた。また、各
酵素を液体ヘビー洗浄剤原液中にて温度を変化さ
せて１箇月間保存した後、各酵素のケラチンに対
する分解活性を測定した。グリシン−NaOHの
緩衝液でPHを11に定めた。第５図から分るよう
に、本Ya酵素の液体界面活性剤中での安定性に
ついては、40℃にて１箇月間保存した場合、PH
9.0では100％活性が残存し、PH10.5では50％活性
が残存する。また温度依存性については、PH11に
て一箇月保存した場合、25℃以下では100％活性
が残存し、35℃では65％活性が残存する。このよ
うに、本Ya酵素は、公知のアルカリプロテアー
ゼに比べると、液体界面活性剤中での安定性につ
いて優れていることが分る。 尚続いて、本Ya酵素の分子量をゲル濾過クロ
マトグラフイーにより調べた。充填剤には、トヨ
パールHW−55（商標、東洋曹達工業(株)製）を用
い、20mMトリス−塩酸緩衝液（Caイオン2mM
添加、PH7.2）を溶出液とした。標準蛋白に以下
の蛋白（分子量）を用いて検量線を作成した。卵
白アルブミン（43000）、サーモライシン
（37500）、ズブチリシン（27300）、キモトリプシ
ノーゲン（25700）、ミオグロビン（17200）、チト
クロームＣ（11700）を用いた。検量線を第６図に
示す。この方法により、本Ya酵素の分子量は
21000と決定した。 また次に、本Ya酵素の等電点を等電点電気泳
動法により調べた。カラム用担体には、フアルマ
ライト３−10（商標、フアルマシア(株)製）を用い
た。本酵素の等電点電気泳動模様を第７図に示
す。この方法により本Ya酵素の等電点は10.1と
決定した。 また更に、本Ya酵素のアミノ酸組成［アミノ
酸分析器JLC−200A（日本電子）使用］を調べ
た。その組成をその他のプロテアーゼのものと比
較して第４表に示す。

【表】

【表】 また続いて、本Ya酵素の元素分析値を第５表
に示す。

【表】 最後にまとめとして、本Ya酵素の各種性状を
Ａ酵素とＢ酵素のものと比較して第６表に示す。

【表】 り引用。
＊＊ 生化学データブツク第1巻より引用。
［実施例］ 菌株の培養 可溶性デンプン２％、硫酸マグネシウム0.02％
を含む液体培地と、乾燥酵母１％、リン酸水素二
カリウム0.1％を含む液体培地とを、それぞれ121
℃にて20分間別々に滅菌した後、各20mlを500ml
の坂口フラスコに分注し、更に滅菌済みの炭酸ナ
トリウムを終濃度１％となるように該フラスコに
加え、50mlの培養液を調製した。該培養液にバチ
ルス・エスビー（Bacillussp）Ｙ株を接種し、該
培養液を30℃で15時間培養し、種培養液を調製し
た。該種培養液100mlを同じ組成の培地３，５
の入つた醗酵タンクに加え、該タンクに30℃で毎
分3.5の空気を送りながら70時間通気撹拌培養
した。得られた培養液3.5（2500APU／ml）を
遠心分離により除菌し、上清約3.0を得た。 Ya酵素の精製 このようにして得た培養上清2650mlを冷却撹拌
しながら該上清に硫安1250ｇを添加すると、アル
カリプロテアーゼが析出した。該沈澱物を遠心分
離により回収し、該沈渣を20mMトリス−塩酸緩
衝液（PH7.2、Caイオン2mMを含む）500mlに溶
解し、該溶液を透析膜に入れ同緩衝液に対して一
晩透析した。ここに890mlの粗酵素液
（6600APU／ml、比活性4350APU／mg蛋白）を
得た。夾雑蛋白の除去および脱色のため、10mM
ホウ酸緩衝液（PH9.3）で平衡化したDEAE−53
を充填したカラムに該溶液を展開させ、同緩衝液
で溶出させた。非吸着の活性画分を集めたとこ
ろ、全量は420ml、活性は11300APU／ml、比活
性は11800APU／mg蛋白であつた。ここまでの精
製度は6.2倍、回収率は72％であつた。更に、該
画分に硫安198ｇを添加し、蛋白を塩析させた。
続いて、該沈澱物を20mMトリス−塩酸緩衝液
（PH7.2、Caイオン2mMを含む）30mlに溶かし、
該溶液をトヨパールHW−55（商標、東洋曹達工
業(株)製）のゲル濾過クロマトグラフイーにかけ、
同緩衝液で展開させた。得られた活性画分を硫安
塩析し、沈澱物を同緩衝液10mlに溶解し、同緩衝
液に対して透析した。透析後、ミリポアフイルタ
ーで不溶変性蛋白質を除去し、活性
210000APU／ml、比活性15900APU／mg蛋白の
溶液16.4mlを得た。この精製過程を第７表にまと
めて示す。

【表】 次に、精製済みの本Ya酵素を試料としたゲル
濾過クロマトグラフイーの溶出曲線を第８図に示
す。樹脂はトヨパールHW−55を用い、溶出液は
20mMトリス塩酸緩衝液（PH7.2、Caイオン2mM
を含む）を用い、展開を上昇法により実施した。
また、精製済みの本Ya酵素を試料とした高速液
体クロマトグラフイーの溶出曲線を第９図に示
す。機種はウオーターズWISP−710Bを用い、
−125カラムを２本直列させた。50mMリン酸緩
衝液（PH7.0）で溶出させた。この２つの図から
明らかなように、上記の精製により本Ya酵素は
完全に精製された。 本Ya酵素の洗浄力 洗浄剤の基準組成として、アルキルポリエトキ
シ硫酸ナトリウム20、アルコールエトキシレート
10、エタノール６、トルエンスルホン酸ナトリウ
ム６、アルカリビルダー（グリシン6.6、
NaOH3.3）、水（バランス）の配合物を準備し
た。数値の単位はいずれも重量パーセントであ
る。 前記組成だけの試料をサンプル−１とし、前記
組成物に本Ya酵素を5000APU／ｇ添加させた試
料をサンプル−２とした。また市販の液体洗浄剤
の試料をサンプル−０とした。洗浄装置には、
US−テスチング社のTerg−Ｏ−Tometer（ター
ゴツトメーター）を使用し、蛋白質配合湿式汚垢
布10枚、セバム布および洗浄メリヤス布を入れ、
浴比30倍に合せ、25℃で120rpmにて10分間洗浄
した。洗浄液には、洗浄剤濃度0.1％のもの900ml
を用い、濯ぎは900mlの水で３分間行なつた。使
用水には、3゜DHのものを用いた。尚、洗浄力指
数は、油化学、30，432（1981）に示された式に準
じて計算した。該結果を第８表に示す。

【表】 この結果から、本Ya酵素を含むサンプルは、
本Ya酵素を含まないサンプルよりも明らかに洗
浄作用が強く、本Ya酵素は液体ヘビー洗浄剤の
洗浄力の改善に寄与することが分る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本Ya酵素の精製段階を示すフローシ
ートである。第２図は本Ya酵素の至適PHおよび
安定PH領域を示すグラフ図である。第３図は本
Ya酵素の至適温度および耐熱性を示すグラフ図
である。第４図は本Ya酵素の紫外領域吸収スペ
クトル曲線を示すグラフ図である。第５図は本
Ya酵素の界面活性剤中での安定性を示すグラフ
図である。第６図は本Ya酵素の分子量決定の際
の検量線を示すグラフ図である。第７図は本Ya
酵素の等電点電気泳動模様を示すグラフ図であ
る。第８図は本Ya酵素のゲル濾過クロマトグラ
フイー溶出曲線を示すグラフ図である。第９図は
本Ya酵素の高速液体クロマトグラフイー溶出曲
線を示すグラフ図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次の理学的性質を有するアルカリプロテアー
   ゼ。 (イ) 作用：高アルカリ条件下で各種の蛋白質を分
   解する。 (ロ) 基質特異性：不溶性蛋白質、特にケラチンに
   対して著しい特異性を示す。 (ハ) 至適PH：カゼインを基質として35℃で10分間
   反応させた場合、PH10.0ないし12.5において作
   用が至適である。 (ニ) 安定PH範囲：カゼインを基質として25℃で24
   時間処理した場合、PH6.5ないし13.0の範囲に
   おいて作用が安定である。 (ホ) 至適温度：カゼインを基質としてPH10.5で反
   応させた場合、温度70℃において作用が至適で
   ある。 (ヘ) 耐熱性：PH10.5で60℃にて10分間熱処理した
   場合、90％以上活性が残存する。 (ト) 吸収スペクトル：PH8.0の50mMのトリス−
   塩酸緩衝液中において紫外領域276nmに極大吸
   収を示す。 (チ) 金属イオンの影響：カゼインを基質とした場
   合、Hgイオンでは活性が阻害され、Caイオン
   では活性の熱安定性が増す。 (リ) 阻害剤の影響：カゼインを基質とした場合、
   EDTA（エチレンジアミン四酢酸）および
   PCMB（ｐ−クロロマーキユリー安息香酸）で
   は活性が阻害されないが、DFP（ジイソプロピ
   ルフルオロリン酸）およびPMSF（フエニルメ
   タンスルフオニルフルオリド）では活性が阻害
   される。 (ヌ) 界面活性剤の影響：界面活性剤中で40℃にて
   １箇月間保存した場合、PH9.0では100％活性が
   残存し、PH10.5では50％活性が残存する。 （ル） 分子量：21000（ゲル濾過法）。 （ヲ） 等電点：10.1（等電点電気泳動法）。