JPH04100801A - シクロデキストリン誘導体及びそれを用いた発色方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は塩基性官能基で修飾されたシクロデキストリン
に関するもので、合成基質を用いた測定法等に応用され
、臨床化学検査等の分野において効果的に用いられる。

更に本発明はニトロフェノール類を中性ないし酸性条件
下で発色させるための試薬及び方法に関するものである
。

［従来の技術及びその問題点コ ニトロフェノール類の１種である４−ニトロフェノール
（パラニトロフェノールともいう）は４−ニトロフェノ
ール基をもつ各種合成基質が特定の酵素作用により分解
されるときに生成する物質で、この物質の増加を経時的
に定量することにより当該酵素の活性を容易に測定する
ことができる。例えば、フォスファターゼの活性を測定
するためには４−ニトロフェノールリン酸を基質として
遊離して生じる４−ニトロフェノールを定量する。フォ
スフオシエステラーゼの活性測定にはビス（４−ニトロ
フェニル）リン酸を基質として同様に測定スる。β−Ｎ
−アセチルへキソサミニダーゼとβ−Ｎ−アセチルグル
コサミニダーゼの活性測定では、合成基質として４−ニ
トロフェニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドが
利用される。その他、各種のグリコシダーゼ（グリコシ
ド結合の加水分解を触媒する酵素）、グルクロニダーゼ
、スルファターゼ、ホスホリパーゼＣ１トリプシンやキ
モトリプシンなどのセリンプロテアーゼ、Ｄ−グリセル
アルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼなどに対し、
４−ニトロフェニル基をもつ合成基質が開発され、臨床
検査をはじめとするさまざまな分野で実用に供されてい
る。

以上の例で示した各種酵素の活性測定が可能となる原理
は、例えば４−ニトロフェニル基をもつ合成基質の場合
は、その合成基質と遊離して生じる４−ニトロフェノー
ルの間で吸光スペクトルに差があるという事実に基礎を
おいている。すなわち、４−ニトロフェニル基をもつ合
成基質は広いｐＨ領域において紫外部（波長３００〜３
２０ｎｍ）に強い吸光ピークをもち可視部（波長４００
ｎｍ以上）にはほとんど吸光を示さないが、４−ニトロ
フェノールはアルカリ性ｐＨ領域において電離し、４０
Ｏｎｍ付近を中心とする強い吸光ピークをもつ４−ニト
ロフェルレート・アニオンを生じる。したがって、測定
しようとする酵素の活性をアルカリ性ｐＨ領域で測定で
きれば、酵素反応の進行にともなう可視部の発色を４０
０ｎｍの吸光度増加として連続モニターでき、正確なレ
ートアッセイが可能となる。しかし、測定しようとする
酵素の最適ｐＨが中性ないし顕著には弱酸性の領域にあ
れば、４−ニトロフェノールはその解離が不完全か、は
とんど解離せず、吸光スペクトルは４〜ニトロフエニル
基をもつ合成基質の吸光スペクトルとほとんどオーバー
ラツプしてしまい、発色が微弱で、反応を経時的に連続
モニターすることが著しく不都合となる。そこで、現行
の測定法では、酵素反応をスタートさせてから一定時間
後に、アルカリを添加して反応を停止させると同時に生
成した４−二トロフェノールを発色させ、その４００ｎ
ｍ付近の吸光度を測定するという方法が多く採用されて
いる。すなわち、現行測定法では酵素活性測定法として
より正確で簡便な形式といわれる理想的なレートアッセ
イが困難なだけでなく、アルカリ添加という余分な操作
を必要とする。中性ないし弱酸性の領域に最適ｐＨをも
つ酵素には、例えば酸性ホスフアターゼ、β−Ｎ−アセ
チルグルコサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼなど臨
床化学的に重要な酵素が含まれている。これら諸酵素の
反応を経時的に連続モニターするための有用な手段を得
ることができれば、測定操作を簡素化し、測定時間を短
縮できるだけでなく、測定精度をも高め、各種疾患の早
期発見や診断に正確な情報を提供できる。

従って、４−二トロフェノール及びその他のニトロフェ
ノール類の中性ないし弱酸性のｐＨ領域での効果的な発
色促進作用を有す試薬の開発は、臨床化学検査分野にお
ける実用面に重要な課題となっている。

［問題点を解決するための手段］ そこで、以前本発明者らは、塩基性官能基を共有結合さ
せた新規シクロデキストリン誘導体を用いて、アグリコ
ンである各種ニトロフェノール誘導体を包接し、中性な
いし弱酸性条件下における発色効果を向上させる技術を
開示した。（特開昭８３−２４３１０１号公報） 該技術は実用的には充分な効果を得られるものであるが
、本発明者らは、それに満足することなく更に検討を加
えた。

該技術はα−又はβ−ンクロデキストリンに、例えば、
ジエチルアミノエチル基、ジメチルアミノメチル基、ジ
メチルアミノプロピル基、アミノエチル基等を結合させ
たものである。明細書にも記述している通り、その導入
個数はシクロデキストリン１分子に対し、１個ないし２
個が共有結合されていることが確認でき、例えばジエチ
ルアミノエチル修飾化シクロデキストリン（以下ＤＥ−
ＣＤともいう）を含む溶液中、４−ニトロフェノ−ルの
ｐＨ５，０，４００ｎｍにおける吸光度は４−ニトロフ
ェノールの紫外部吸光度の３０％以上に達し、必要充分
な感度を得たのである。

上記特許に記されているように塩基性官能基を共有結合
させたシクロデキストリン誘導体は、未修飾のシクロデ
キストリンに比し、多（の長所を持っていることが明白
になった。しかしながら、これらのシクロデキストリン
誘導体をもってしても、測定ｐＨが更に酸性にずれた場
合、又はｐＫａの酸性側から中性側にシフトしているニ
トロフェノール誘導体に対しては、充分にニトロフェノ
ール類を解離させることが出来ず、可視部における飛躍
的な吸光度上昇が望まれるところであった。そこで、本
発明者らは該技術をおし進め、シクロデキストリフ１分
子に対し平均３分子以上の塩基性官能基を結合させる方
法を見い出し、これら３分子以上の塩基性官能基が共有
結合したシクロデキストリンの共存が従来のシクロデキ
ストリン又は１ないし２分子の塩基性官能基結合シクロ
デキストリンの共存に比べ、中性ないしは酸性領域にお
いで４−二トロフェノールを始めとする各覆ニトロフェ
ノール誘導体のｐＫａを極めて大きく酸性側にずらし、
その結果として更に極大吸収スペクトルを長波長側にシ
フトさせ相乗的に顕著な発色効果をもたらすことを見い
出し本発明を完成した。　β−シクロデキストリン１分
子に平均３分子以上の塩基性官能基を結合させるための
合成法に関しては、本発明の為に塩基性官能基としてま
ずジエチルアミノエチル基を選び、以下の原理によりそ
のシクロデキストリン結合体を完成した本反応において
１分子のβ−シクロデキストリンに導入されるジエチル
アミノエチル基の分子数はシクロデキストリンとジエチ
ルアミノエチル基のモル比１反応温度１反応時間１反応
ｐＨにより大きく左右されることがわかった。すなわち
、１分子のβ−シクロデキストリンに平均３分子以上の
ジエチルアミノエチル基を結合させる為には、モル比で
β−シクロデキストリンに対しジエチルアミノエチルク
ロリドが望ましくは５以上１反応温度は２０〜７０℃１
反応時間として３０分〜１０時間１反応ｐＨはアルカリ
性に保つことが必要で、特にｐＨ１０以上が望ましい反
応条件であることがわかった。

同様にして、α−１γ−シクロデキストリンのポリＤＥ
ＡＥ結合体が得られる。また、ノエチルアミノエチル基
以外にジメチルアミノエチル、ジメチルアミンプロピル
、アミノエチル基等の結合体も得ることができる。この
ように３分子以上の塩基性官能基で修飾されたシクロデ
キストリン、例えばポリジエチルアミノエチル化α−シ
クロデキストリン（以下ポリＤＥ−αＣＤと略す。）、
ポリジエチルアミノエチル化α−シクロデキストリン（
以下ポリＤＥ−βＣＤと略す。）およびポリジエチルア
ミノエチル化γ−シクロデキストリン（以下ポリＤＥ−
γＣＤと略す。）は意外にも、通常のシクロデキストリ
ンに比べはるかに水によく溶は実用に供し易いものであ
った。現在、特に安価で一般に用いられているβ−シク
ロデキストリンは比較的に水に難溶性でこの性質が臨床
化学検査などにおける実用上の範囲を決めているもので
ある。すなわち、難溶性の目的物質をシクロデキストリ
ンの包接により溶解せしめる時シクロデキストリン自身
の溶解性によりその溶解度が限定されてしまうのである
。具体的には特定酵素の活性を測定するためによ（使用
される合成基質の溶解の場合などである。加水分解酵素
の多くの場合は難溶性のニトロフェノール誘導体が発色
剤として酵素反応の経過観察のために結合されている。

例エバ、前記のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ
ーゼ測定のための合成基質である、４−二トロフェニル
（アルいは２−クロロ−４−ニトロフェニル）−Ｎ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコサミニドの場合、β−シクロデ
キストリンの助けで必要量の溶解が試みられるが、シク
ロデキストリン自身の溶解性の惑さのためその目的を充
分に果たし得ない。それに比し、本発明によるポリＤＥ
−ＣＤ類はたやすく水に溶解させることができ、その包
接能により上記基質等を充分に必要量溶かし得るのでこ
の面においても本発明に実用的価値を付加するものであ
る。

更に本発明の本質である中性ないしは弱酸性条件下での
ニトロフェノール誘導体に対する発色効果を種々の誘導
体を用いて調べた。４−二トロフェノール、２−クロロ
−４−二トロフェノール、５−ニトロサリチル酸、５−
ニトロサリチル酸メチル、２，４−ジニトロフェノール
、３，４−ジニトロフェノール等についてである。驚く
べきことにこれらの中で最も中性ないしは特に弱酸性下
で電離が微弱な、すなわちｐＨ５，０付近においては、
４００　ｎｍ付近での電離性の可視部発色ピークが認め
られない４−ニトロフェノールでさえポ！ｊＤＥ−ＣＤ
類の１％以下の通常濃度の存在下でその４００ｎｍ付近
に大きな新しい電離性の発色ピークを出現させ、ポリＤ
Ｅ−ＣＤ類の作用とその効果が顕著であることが示され
た。通常のシクロデキストリンではこれ程の効果は認め
られない。また、ＤＥの導入が１ないし２分子の場合と
比較しても効果は絶大なるものである。またポリＤＥ−
ＣＤ類は水への溶解性が更に良いため使用量を増やして
効果的な増強ができる。また他のニトロフェノールにつ
いても１％以下の通常濃度でＤＥ−α、ＤＥ−βと比較
して顕著な可視部発色効果が示された。特に２−クロロ
−４−ニトロフェノールは中性ないし酸性下で４−二ト
ロフェノールに比べ、比較的発色がなされ易いものとし
て、最近それを結合させた特定酵素のための合成基質が
供されているが、例えばｐＨ５，０以下で酵素反応を行
う前記のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ等
については、酵素反応の結果そのｐＨで生成する２−ク
ロロ−４−二トロフェ／−ルの４００ｎｍ付近における
電離発色は、未修飾のＣＤの場合は全く不充分で、また
その基質としての溶解度を充分に維持できないため、そ
の生成量を連続モニターできるほどの感度と精度をもた
ない。またＤＥ−ＣＤを用いても改善の余地は残されて
いる。しかるに、ここへのポリＤＥ−ＣＤ類の添加は生
成する２−クロロ−４−二トロフェノールの吸収スペク
トルを完全電離に近いかたちに出現せしめ発色させるの
で、理想的な吠態での当酵素の連続モニター測定が行え
る。

前記の通りポリＤＥ−αＣＤ１ポリＤＥ−βＣＤ及びポ
リＤＥ−γＣＤは充分水に溶は易く、当合成基質の必要
量を反応液に溶解できることと合わせ実用的に著しい効
果を供する。

以上の効果は、同様に、中性付近で反応を行うα−アミ
ラーゼのための合成基質である、４−ニトロフェニル−
マルトへブタオシド、あるいは２−クロロ−４−二トロ
フェニルーマルトヘンタオシド等を用いて生成するニト
ロフェニル誘導体を４００ｎｍ付近で連続モニターする
α−アミラーゼの測定の場合、あるいは、よりｐＨの低
い領域で酵素反応を行わせる酸性ホスファターゼ、グル
コンダーゼ、グルクロニダーゼ、エステラーゼ、アリル
スルファダーゼ等の測定においても、通常のシクロデキ
ストリンに比し、はるかに効果的に使用される。

以上ポリＤＥ−αＣＤ１ポリＤＥ−βＣＤ及びポリＤＥ
−γＣＤについての本発明の効果を述べたが、他の塩基
性官能基を修飾した７クロデキストリン及び他の酵素反
応のためのニトロフェノール誘導体を結合した他の合成
基質を使用する場合においても、本発明の本質は同様で
ある。更にニトロフェノール誘導体の１つである３、４
−ジニトロフェニル基を用いた合成基質による種々酵素
の測定法においては、本発明のポＩＪ　Ｄ　Ｅ　−ＣＤ
との組合せにより、両者の利点が相まって従来にない高
精度な酵素活性測定を供することができる。

以下、実施例により本発明の作用、効果をさらに詳しく
説明する。

実施例−１ボＵ　Ｄ　Ｅ　−ＣＤ類の合成方法１、ポリ
ＤＥ−αＣＤの合成方法 α−シクロデキストリン２．４ｇを４ｍｌの蒸留水に懸
濁させ、攪拌しながら水酸化ナトリウム１．５ｇを含む
４ｍｌの水溶液を滴下する。次にジエチルアミノエチル
クロリド塩酸塩１．４ｇｔ−含む２ｍｌの水溶液を滴下
し、３０℃で３時間反応させる。その後反応液を直径１
．５ｃｍ、高さ５０ｃｍのクロマト管にセファデックス
Ｇ−２５を充填したものを用いてカラムクロマトグラフ
ィにより分子量別に分別し、１．５ｇのＤＥ−αＣＤを
得た。このＤＥ−αＣＤはジエチルアミノエチル基が１
ないし２個結合していることが中和滴定、元素分析、プ
ロトン核磁気共鳴の分析により判明した。次に、このＤ
Ｅ−αＣＤ２　ｇを４ｍｌの蒸留水に懸濁させ、攪拌し
ながら水酸化す）　ＩＪウム１．２ｇを含む４ｍｌの水
溶液を加える。更にジエチルアミンエチルクロリド塩酸
塩２．０ｇを含む２ｍｌの水溶液を滴下し、５０℃で５
時間、反応溶液のｐＨが１１を下回らないように水酸化
ナトリウム溶液を随時添加しながら反応させる。その後
反応液を前述のセファデックスＧ−２５のカラムクロマ
トグラフィにより分子量別に分別し、１．２ｇのポリＤ
Ｅ−αＣＤを得た。このポリＤＥ−αＣＤはジエチルア
ミノエチル基が３ないし４個結合していることが中和滴
定、元素分析の分析により判明した。同様の操作を繰り
返すことにより、ジエチルアミノエチル基の導入個数を
増やすことができる。

２、ポリＤＥ−βＣＤの合成方法 前述の合成法１において、α−シクロデキストリンにか
え、β−ンクロデキストリンを使用し同様の操作により
、ポリＤＥ−βＣＤを合成した。

３、ポリＤＥ−γＣＤの合成方法 前述の合成法１において、α−シクロデキストリンにか
え、γ−ンクロデキストリンを使用し同様の操作により
、ポリＤＥ−γＣＤを合成した。

実施例−２各ポリＤＥ−ＣＤ類の４−二トロフェノール
に対する可視部発色効果 ｐＨ５，０の２０ｍＭ酢酸緩衝液中における４ニトロフ
エノールの４００ｎｍにおける吸光度を、シクロデキス
トリン無添加、１％ＤＥ−ＣＤ添加、実施例１で合成し
た各ポＩＪ　Ｄ　Ｅ　−ＣＤを１％添加のそれぞれを比
較検討した結果を表１に示す。

同様にして４−二トロフェノール以外の２−クロロ−４
−二トロフェノール、２．４−ジニトロフェノール、５
−ニトロサリチル酸、５−ニトロサリチル酸メチルにつ
いて吸光度の増加が認められた。

表１ 実施例−３ＤＥ導入数によるｐＫへの効果実施例１の２
で合成したジエチルアミノエチル基の結合個数の異なる
ＤＥ−βＣＤ及びポリＤＥ−βＣＤのそれぞれの濃度が
１％となる２５ｍＭコハク酸緩衝液を調製した。そして
この各緩衝液中での３，４−ジニトロフェノールのｐＫ
を測定した結果を表２に示す。

（以下余白） 表２ （ＤＥ導入数は、中和滴定法による計算値）実施例−４
酵素反応への応用 以下の操作により、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ニダーゼ活性を測定した。

（１）試薬の調製 ＠３，４−ノニトロフェニルーＮ− アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド：　１．２ｍＭ・コ
ハク酸緩衝液（ｐＨ６，０）　　：２５ｍＭ・各ポリＤ
Ｅ−βＣＤ　　　　　　　　：１％（２）操作法及び結
果 Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ液（ングマ
社製ヒト胎盤の酵素で、活性値を５０Ｕ／１に調製）１
００μｍに、３７℃で５分間加温した試薬３ｍｌを加え
反応させ、試薬ブランクを対照に５分間当たりの４００
ｎｍにおける吸光度変化を測定した。

その結果を表３に示す。

表３ ［発明の効果コ 以上から明らかな如く、本発明によれば塩基性官能基を
少なくとも３分子以上結合したシクロデキストリン跣導
体は、ニトロフェノール誘導体の可視部における発色を
著しく増強する効果ををし、ニトロフェノール誘導体を
結合した合成基質を用いる各種の酵素活性測定方法に応
用するとき、特にレート分析の精度を格段に向上させる
という効果を有する。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記式の構造を有する塩基性官能基を少なくとも
   ３分子共有結合させたシクロデキストリン誘導体。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ炭素数１〜３個の低級アル
   キル基もしくは水素であって、ｎは１〜３の整数を表す
   。）
2. （２）下記式の構造を有する塩基性官能基を少なくとも
   ３分子共有結合させたシクロデキストリン誘導体を用い
   て、ニトロフェノール誘導体を包接するすることを特徴
   とする発色方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ炭素数１〜３個の低級アル
   キル基もしくは水素であって、ｎは１〜３の整数を表す
   。）