JPS6339600A - α−アミラ−ゼアイソザイムの分別測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、α−アミラーゼアイソザイムの新規な分別測
定法に関する。

〔発明の背景〕

生体試料など被検試料、特にヒトの唾液、膵液、血液、
尿中のα−アミラーゼ活性の測定は医学上の診断におい
て重要である。例えば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎におい
ては、血液や尿中のα−アミラーゼ活性は通常の値に比
べて著しい上昇を示す。

更に、例えば血中α−アミラーゼ活性をアイソザイムに
分離して測定することは高アミラーゼ血症の解析や病態
の解明に重要であり、日常臨床検査にも応用されている
。

α−アミラーゼアイソザイムの分離法は現在まで多岐に
わ、たっており、（１）荷電の差による分離、（２）デ
ル濾過法、（３）アフィニティクロマトグラフィーによ
る方法、（４）免疫学的方法、（５）α−アミラーゼイ
ンヒビターによる方法、などがある。

これらの内、現在のところ臨床検査に応用し得るものと
しては、公知文献（臨床病理、臨時増刊第４３号、Ｉｓ
ｏｅｎｚｙｍｅの分析とその意義　１７頁（１９８１）
）にも記載があるように、（１）の荷電の差による分離
を電気泳動法によって行うものと、最近多〈実施される
ようになってきている（５）のアミラーゼインヒビター
による方法がある。

電気泳動法に於て、臨床検査として適しているのはセル
ロースアセテート膜、薄層ポリアクリルアミドケ゛ルを
用いる電気泳動法などがあるが、いずれも測定操作が煩
雑で、しかも測定に長時間を要する欠点がある。

一方、α−アミラーゼインヒビターを用いる方法は、小
麦由来のアミラーゼインヒビターが膵由来α−アミラー
ゼよりも唾液腺由来α−アミラーゼをより強く阻害する
ことを利用して両者の割合を算出する、ものであるが、
現在のところ、膵或は唾液腺由来のα−アミラーゼのい
ずれかを特異的に完全に阻害するインヒビターが見出さ
れていない為、検体中の膵及び唾液腺由来のα−アミラ
ーゼの活性比率を既知の酵素標準液を用いて作成した検
量線から読みとる方法がとられているが、比較的操作も
簡便な為、最近多く使用されるようになってきている。

しかしながら、この方法で膵由来α−アミラーゼと唾液
腺由来α−アミラーゼの活性比率を求めるには、阻害剤
を入れた場合と入れない場合の２回の測定が必要であシ
、操作が煩雑である。

これに対し、本発明者らは、α−アミラーゼによるオリ
ゴ糖誘導体の反応性が、同アインヂイムによって異なシ
、従って生成物の比率が偲アイソザイムによって異なる
ということを先に見出し、これを利用したα−アミラー
ゼアイソザイムの分別測定法に関し、特許出願している
（特開昭６０−３０６９８号、特開昭６０−１００５９
２号）。この方法は、ある種の修飾基即ち螢光性を有す
る修飾基或はＵＶ吸収を有する修飾基をオリが糖に導入
したものを基質として用い、α−アミラーゼの加水分解
作用を受けて生じる分解生成物を、高速液体クロマトグ
ラフィーにより測定することによって、ヒト膵由来のα
−アミラーゼとヒト唾液腺由来α−ハラ−５の分別測定
を行うもの７あり・ｃｈ　　（によシα−アミラーゼア
インデイムの分別測定が従来よりも一段と容易になった
。しかしながら、この方法は特殊な機器を使用しなげれ
ばならず、また、検体の処理能力の点からも若干問題が
あシ、未だ充分満足し得る測定法であるとは言えず、臨
床検査の分野に於て一般に広く普及した分光光度計、螢
光光度計、自動分析装置等への適用が可能で、検体の処
理能力の点でもよシ一層優れたα−アばラーゼアイソザ
イムの分別測定法の出現が待ち望まれていた。

〔発明の目的〕

本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、分
光光度計、螢光光度計、自動分析装置等、臨床検査の分
野に於て広く普及した機器を用いて、極めて容易に、膵
由来α−アミラーゼと唾液腺由来α−アミラーゼの分別
測定を行うことが出来る、α−アミラーゼアイソザイム
活性測定法を提供することを目的とする。

〔発明の構成〕

本発明は、還元末端修飾マルトオリゴ糖誘導体を基質と
して用い、α−アミラーゼの加水分解作用を受けて生じ
る分解生成物に、基質特異性の異なる２種以上の共役酵
素を作用させ、生じる成績体を測定することによって、
ヒト膵由来α−アミラーゼとヒト唾液腺由来α−アミラ
ーゼの分別測定を行うことを特徴とする、α−アミラー
ゼアイソザイムの分別測定法である。

即ち、本発明者らは、α−アミラーゼアイソザイムの、
よシ簡便な測定法を求めて鋭意研究の結果、特定のマル
トオリゴ糖誘導体即ち還元末端修飾マルトオリゴ糖誘導
体を基質とし、α−アミラーゼの加水分解作用を受けて
生じる分解生成物に更に２種以上の基質特異性の異なる
共役酵素を作用させ、生じる成績体を測定することによ
り、ヒト膵由来α−アミラーゼとヒト唾液腺由来α−ア
ミラーゼの分別測定が可能となることを見出し、本発明
を完成するに到った。

本発明は、α−アミラーゼが、還元末端を修飾した即ち
還元末端の水酸基−ＯＨを一０Ｒ１（但し、Ｒ１は有機
残基を示す。）で置換したマルトオリゴ糖誘導体を加水
分解する際の加水分解位置の選択率が、言い換えれば、
分解生成物の生成比率が、アイソザイムの穏類によシ定
まっていることを利用して、その条件下で生成される修
飾グルコース、還元末端修飾マルトース、同トリオース
誘導体、同テトラオース誘導体等の分解生成物のうちの
一つに特異的に作用する共役加水分解酵素と、これら全
てに非特異的に作用する共役加水分解酵素を項次或は夫
々側々に作用させて、化合物ＲＯＨを生成させ、これを
測定することによりα−アミラーゼアイソザイムの分別
測定を行うものである。

即ち、このＲ’−ＯＨを、例えばＲ’−ＯＨがｐ−ニト
ロフェノールの如きニトロフェノール類の場合には、直
接その吸収スペクトルを（例えば４００ｎｍに於ける吸
光度を）測定することによシ、また、Ｒ’−ＯＨが、例
えばフェノール、０−クロロフェノール、２．６−ジク
ロロフェノール、ｐ−メトキシフェノール等の如きニト
ロ基をもたないにトロ基をもっていても良いが）フェノ
ール類或はナフトール類の場合には、カテコールオキシ
ダーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼ又はモノフェノール
オキシダーゼの如き酸化酵素類又はヨウ素酸、過ヨウ素
酸の如き酸化剤を作用させて、４−アミノアンチピリン
、３−メチル−２−ペンゾチアゾリノンヒＰラゾン（Ｍ
ＢＴＨ）等のカプラーとカップリング（酸化縮合）させ
、生成する色素の吸収スペクトルを測定することによシ
、或はＲ−ＯＨがウンベリフェロン、４−メチルウンベ
リフェロンの如＜　５光を有する化合物の場合には、そ
の螢光強度を測定することにより、更にはＲ’−ＯＨが
インドキシルの場合には、酸化されて生成するインジゴ
色素の吸収ス被りトルを測定することによシ、夫々特定
の分解生成物の単位時間当りの生成量Ａとα−アミラー
ゼによシ単位時間当シに分解される全基質量Ｂとを求、
めでその比Ａ／Ｂを算出し、この比率が共存する２種類
のα−アミラーゼアイソザイムの共存比率と直線関係に
あることを利用してα−アミラーゼアイソザイムの分別
測定を行うものである。

本発明に於て用いられる還元末端修飾マルトオリゴ糖誘
導体としては、グルコース数が好ましくは４〜７、よυ
好ましくは５又は６の直鎖オリゴ糖誘導体で、その還元
末端水酸基−ＯＨが一０Ｒ１（但し、Ｒ１は有機残基を
示す。）で置換されたものが（但し、Ｒ３−Ｒ６は水素
、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、カル
ボキシル基、スルホン基又はハロケ゛ン等を表わし、夫
々同じであっても異なっていても良く、また　Ｒ３とＲ
５又はＲ４とＲ６とが結合して芳香環を形成していても
良い。Ｒ７は水素、低級アルコキシ基、）１０ダン又は
ニトロ基等を表わす。また、Ｒ８は水素、メチル基又は
トリフルオロメ、チル基を表わし　Ｒ９は水素又はノ・
ログンを表わす。）で示される有機残基等が代表的な良
いフェノキシ基又は、置換基を有していても良いナフト
キシ基としては、オリが糖の還元末端に結合し、グルコ
アミラーゼ、（ａ、ｃ、３．２．ｔ、３．’：］、α−
グルコシダーゼ［：Ｅ、Ｃ，３，２，１，２０］、β−
グルコシダーゼ〔ｚ、ｃ、３．、ｚ、１．２１．〕、イ
ンマルターゼ［ＥＥ、Ｃ，３，２，１，１０二又はβ−
アミラーゼ［ＦＥ、Ｃ，３，２，１，２’、’：］等の
作用を受けて加水分解され得るものであり、更に、氷解
後は、ニトロフェノール類の如くそれ自体可視部に吸収
を有するものか、又はカテコールオキシダーゼ、ラッカ
ーゼ、チロシナーゼ又はモノフェノールオキシダーゼ等
の酸化酵素の作用を受けてカプラーとカップリングして
色素を生ずるか、或は酸化剤によシカプラーとカップリ
ングして色素を生ずるものであればいずれにても良い。

このような条件を満足するＲ１の具体例としては、例え
ば、ｐ−ニトロフェニル基、ｍ−ニトロフェニル基、Ｏ
−り゛ロロフェニル基、ｐ−’ｔロロフェニル基、　２
．６−ジクロロフェニル基、Ｏ−メトキシフェニル基、
ｐ−メトキシフェニル基、０−メチルフェニル基、０−
、ｌ’フルボキシフェニル基、０−スルホフェニル基、
１−１−メチル基、２−スルホ−１−ナフチル基、２−
カルボキシ−１−ナフチル基等が挙げられるが、これら
に限定されない。

としては　Ｒ８が水素のウンベリフェリル基又はＲ８が
メチル基の４−メチルウンベリフェリル基又はＲ８がト
リフルオロメチル基の４−トリフルオロメチルウンベリ
フェリル基等が挙げられる。

る置換基を有していても良いインドキシル基の具体例と
しては、例えば、インドキシル基、５−ブロモインドキ
シル基、４−クロロ−３−ブロモイソｒキシル、基等が
挙げられる。

還元末端修飾基の修飾位置は１位がより一般的であるが
、特にこれに限定されるものではなく、例えば、６位の
水酸基にリン酸がついたものなども本発明の基質として
充分使用し得る。

本発明に係るマルトオリゴ糖誘導体の非還元末端は、修
飾がなされていても、なされていなくてもよい。非還元
末端グルコースの修飾基としては、例えば、２−ピリジ
ルアミン基、３−ピリジルアミン基等の如く螢光性を有
する置換基、アニリノ基、メチルアニリノ基、ヒドロキ
シアニリノ基。

カルボキシフェニルアミノ基の如（ＵＶ吸収を有する置
換基、メトキシ基、エトキシ基等のアルコキシ基、カル
ボキシメトキシ基、ヒドロヤシエトキシ基等の置換アル
コキシ基、塩素、臭素等の）・ロケ９ン原子、又はアミ
ノ基等が一般的なものとして挙げられるが、例えば、非
還元末端グルコースの６位の−ＣＨ２０Ｈ基が−ＣＯＯ
Ｈ基で置き換ったグルクロン酸、同じく６位の−ＣＩＩ
２０Ｈ基が−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ２゜もの、４位の一〇Ｈ基
と６位の−ＣＨ２０Ｈ基とで４．６−〇−ベンジリデン
、４．６−０−メチレン、４，６−〇−エチリデン、４
．６−０−イソプロピリデン等の如き環状構造を形成し
ているものも全く同様に本発明の目的に使用し得ること
は言うまでもない。

これら本発明に係る還元末端修飾マルトオリゴ糖は、非
還元末端が修飾されていないものならば、例えば、カー
ポハイドレイト　リサーチ、並。

３５９−３６８　（１９６８）等に記載の方法に従い、
また、非還元末端が修飾されているものは、例えば、特
開昭６０−５４３．９５号公報、特開昭６０−２３７９
９８　　−号公報、特開昭６１−８３１９５号公報等に
記載の方法に従い容易に合成することができるので、こ
のようにして合成したものを用いることで足りる。

本発明に係る共役酵素としては、α−アミラーゼの加水
分解作用を受けて生じる分解生成物のうちの１つに特異
的に作用するものとして、例えば、１位修飾基がα結合
している修飾グルコースに特異的に作用するイソマルタ
ーゼ（Ｅ、Ｃ，３，２，１，１０，）、還元末端修、飾
マルトース誘導体に特異的に作用するβ−アミラーゼ（
ｇ、ｃ、３．２．１．２．）、１位修飾基がβ結合して
いる修飾グルコースに特異的に作用するβ−グルコシダ
ーゼ（Ｅ、Ｃ，３，２，１，２１、）などが挙げられ、
非特異的に作用するものとして、グルコアミラーゼ（Ｅ
、Ｃ，３，２，１，３，）やα−グルコシダーゼ（Ｅ、
Ｃ，３，２，１，２０，）などが挙げられるが、本願明
細吉の主旨に反するものでなければこれらに制限される
ものではない。

不発明を実施するには、まず、基質となる還元末端修飾
マルトオリゴ糖誘導体と、α−アミラーゼの作用を受け
て同誘導体から生じる分解生成物のうちの１つに特異的
に作用する酵素とを含有する第１液と、これら分解生成
物に非特異的に作用する酵素を含有する第２液を準備す
る。これらの液に検体試料を添加して、特定の分解生成
物の単位時間当シの生成量Ａとα−アミラーゼにより単
位時間当シに分解される全基質量Ｂとを求める。

Ａ、！：Ｂを求める際には、第１液と第２液に、各各検
体試料を添加して別、々に求めても（但し、この場合に
は第２液中にも第１液と同じ基質を添加する。）、また
、第１液に検体試料を添加してＡを求めた後、更に第２
液を追加添加してＰを求めても（但し、この場合には液
量補正等を行う必要がある。）、いずれの方法を用いて
もよい。

求めたＡとＢから、Ａ／Ｂ値を計算し、予め、既知試料
を用いて作成しておいたＡ／Ｂ値とα−アミラーゼ゛ア
イソザイム、例えばヒト膵型α−アミラーゼの活性比率
との検量線から、検体試料中のヒト膵型α−アミラーゼ
の活性比率を求め、この値とＢから求められるα−アミ
ラーゼの総括性値を用いて必要に応じて試料中のヒト膵
型又は／及びヒト唾液腺型α−アミラーゼの活性値を求
めることが出来る。

本発明に於て、基質として用いるマルトオリゴ糖誘導体
の濃度は特に限定されるものではないが、通常約０．１
〜１０ｍＭが好ましく用いられる。

本発明の測定対象となる試料は、α−アミラーゼを含有
する検体なら何れを用いてもよく、例えば生体成分とし
て血液、血清、尿等があげられる。

共役酵素のグルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β
−グルコシダーゼ、イソマルターゼ、β−アミラーゼ等
の起源、由来は、特に限定されるものではなく、例えば
動物、植物、微生物由来のものがいずれも利用出来る。

これら共役酵素の使用量は通常０．５〜５０単位／　ｍ
ｌ　Ｊ好ましくは２〜２０単位／ｍｌである。

また、本発明を実施する測定条件として、反応温度は特
に限定されないが、好ましくは約２５〜４０℃でアシ、
反応時間は目的によシ自由に選択出来る。

至適μとしては特に限定されないが、ｐＨ約６〜８が好
ましい例である。至適ＰＨを維持する緩衝剤は自由に選
択でき、例えば、リン酸塩、トリス（・・イドロキシメ
チノリアミノメタンー塩酸、グツドの緩衝剤などが任意
に選ばれる。

更にα−アミラーゼの賦活剤として、例えば塩化ナトリ
ウム、塩化カルシウム、塩化カリウム等が使用される。

共役酵素の作用によシ遊離したフェノール類又はナフト
−、ル類とカップリング（酸化縮合）させるカプラーと
しては、４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−ペ
ンゾチアゾリノンヒＰラゾン（ＭＢＴＨ）、ｐ−アミノ
−Ｎ、Ｎ−ノエチルアニリン等が挙げられるが、これら
に限定されるものではない。フェノール類又はナフトー
ル類とカプラーとをカップリング（酸化縮合）させる為
の酸化酵素としては、ラッカーゼ、カテコールオキシダ
ーゼ、チロシナーゼ又はモノフェノールオキシダーゼ等
が挙げられるが、これらは例えば、動物、植物、微生物
由来のものが、いずれも利用出来、通常０．２〜１０単
位／ｍ１１好ましくは０，５〜４単位／−の範囲で使用
される。また、カップリング（酸化縮合）させる為の酸
化剤としては、ヨウ素酸又は／及びその塩、過ヨウ素酸
又は／及びその塩、過酸化水素等が挙げられるが、これ
らに限定されない。

更に、本発明の測定法に於ては、検出を遊離してくるニ
トロフェノール類若しくはインジゴ色素類の吸収スペク
トルを測定するか、若しくは遊離してくるフェノール類
又はナフトール類を４−アミノアンチピリン、ＭＢＴＨ
等と酸化カップリングし、その色素の吸収スペクトルを
測定するか、又は遊離してくるウンベリフェロン類の螢
光強度を測定することによるレイトアッセイにより行う
ので、検体中に共存するグルコース、マシレトース等の
糖類や、アスコルビン酸、ビリルビン等の還元性物質の
影響を殆ど受けない。

また、本発明の測定法は自動分析装置への適応性も良く
、必要に応じて用手法、自動分析のいずれにて行うも可
である。

以下に実施例を示すが、本発明はこれら実施例により何
ら限定されるものではない。

〔実施例〕

実施例ｘ、　　ｐ−ニドａフェニル　０−６−ジオキシ
６、−　（：　（２−ピリジル）アミノ〕−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル−（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラ
ノシルー（１→４）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー
（１→４）−ｏ−α−Ｄ−ゲルコピ　　□ラノシル（１
→４）−α−Ｄ−グルコピラノシＰ（以下、ＦＧ５Ｐと
略記する。）を用いた分別測定。

（試料の調製） ■第１液 ＦＧ５Ｐ２６ｒｎ９とインマルターゼ２５単位を５０ｒ
ｎｌの０．０８Ｍ３．３−ジメチルグルタル酸−ＮａＯ
Ｈ緩衝液（ｐＨ６，９、２０ｍ　ｍｏｌ／ｌ　のＮａＣ
ｌを含む。）で溶解し調製した。

■第２液 ＦＧ５Ｐ　２６　Ｉｎ９とα−グルコシダーゼ１１５０
単位をｓｏｎｇの０．０８Ｍ３．３−ジメチルグルタル
酸−ＮａＯＨ緩衝液（Ｐ”　６．９　、２０　ｍｍｏＡ
！ＡのＮａＣ２を含む。）　　′で溶解し調製した。

■酵素試料液 ヒト唾液腺型α−アミラーゼ（シグマ社製）とヒト膵液
から調製したヒト膵型α−アミラーゼを各々５．５単位
／ｉに調製後、３：１．１：１，１：３の比で混合した
。

（測定方法） ３０℃に予備加温した第１液又は第２液３００μｌに５
０μｌの酵素試料液を加え、よく混合後、３０℃に保温
し、この反応液の４００　ｎｍに於ける吸光度の経時変
化を、第１液を使用する際には第１液に精製水５０μノ
を加えよく混合したものを、第２液を使用する際には第
２液に精製水５０μｌを加えよく混合したものを盲検と
して測定した。

（測定結果） 第１図及び第２図に吸光度の経時変化を示す。

第１図はヒト膵型α−アミラーゼを、また、第２図はヒ
ト唾液腺型α−アミラーゼを夫々含有する酵素試料液を
各々試料とした場合の結果で、点線（・・・・・・）は
第１液を、実線（−）は第２液を用いた結果を夫々示す
。

第１図及び第２図から明らかなように、ヒト唾液腺型α
−アミラーゼとヒト膵型α−アミラーゼとで、第１液と
の反応では吸光度の経時変化が異なるのに対して、第２
液との反応では差がみられないことがわかる。

また、各酵素試料液を第１液又は第゛２液と反応させ、
第１液中での吸光度の経時変化率（ΔＥ１／ｍ１ｎ）と
第２液中での吸光度の経時変化率（ΔＥ２７ｍｉｎ）を
アミラーゼの活性比率との関係を第３図に示した。

とヒト膵型α−アミラーゼの活性比率との間には良好な
直線関係が得られた。

実施例２．　９−二トロフェニル　０−２−（０−カル
ボキシメチル）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４
）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシルー（１→４）−〇−
α−Ｄ−グルコピラノシル（１→４）−〇−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシド
（以下、２０ＭＧ　５　Ｐと略記する。）を用いた分別
測定。

（試液の調製） ■第１液 ２０ＭＧ５Ｐ　１５０■とイソマルターゼ３０単位を５
０ｍ１の０．０５Ｍ［：２−　（Ｎ−モｈホ！Ｊ　／）
エタン、ｚ、ルホン酸〕（以下ＭＥＳと略記する。）−
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６、９、１ｍ　ｍｏｌ／ｌのＣａ
　Ｃｌ３を含有。）で°溶解し調製した。

■第２液 α−グルコシダーゼ２５００単位、グルコアミラーゼ１
２５０単位を５０ｒｒＬｌの０．０５ＭＭｇ５−ＮａＯ
Ｈ緩衝液（ｐＨ６，９、１ｍ　ｍｏｌ／ｌのＣａ　Ｃ１
０を含有。）で溶解し調製した。

■酵素試料液 実施例１．の酵素試料液と同様に調製した。

（測定方法） ３０℃に予備加温した第１液３００μノに５０１１１の
酵素試料液を加えよく混合後、３０℃に保温し、この反
応液の４００　ｎｍに於ける吸光度の経時変化率（ΔＥ
Ｖｍｉｎ）ｆ、測定した。更に、３０℃に予備加温した
第２液６０μｌを添加し、よく混合した。この混合液を
３０℃に保温し、第２液添加２分後からの吸光度の経時
変化率（ΔＥ４／ｍｉｎ　）を測定した。

次式に従って、変数Ｍを求めた。

（測定結果） 第４図にヒト膵型α−アミラーゼの活性比率と変数Ｍと
の関係を示す。

第４図か、ら明らかなように、ヒト膵型α−アミラーゼ
の活性比率と変数Ｍの間には良好な直線関係が得られた
。

〔発明の効果〕

以上述べた如く、本発明は新規なα−アミラーゼアイソ
ザイムの分別測定法を提供するものであシ、本発明の方
法によれば、臨床検査の分野に於て汎用されている分光
光度計、螢光光度計を用いて、極めて容易に且つ精度良
く測定を行うことが可能であシ、更に自動分析機への応
用も容易に行える等の顕著な効果を奏するものであり、
斯業に貢献するところ大なるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１に於て得られた、ヒト膵型α−アミラ
ーゼ試料液と第１液又は第２液との反応時の吸光度の経
時変化を示し、横軸の各時間（分）について得られた吸
光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものである
。点線（・・・・・・）は第１液を、また実線（−）は
第２液を用いた時の結果を夫々示す。、 第２図は実施例１に於て得られた、ヒト唾液腺型α−ア
ミラーゼ試料液と第１液又は第２液との反応時の吸光度
の経時変化を示し、横軸の各時間（ｊ＋）について得ら
れた吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだもの
である。点線（・・・・・・）は第１液を、また実線（
−）は第２液を用いた時の結果を夫々示す。 第３図は実施例１に於て得られた検量線を示し、横軸の
試料液中のヒト膵型α−アミラーゼの活性比率に対して
、第１液中での吸光度の経時変化率（ΔＥ１／１ｎｉｎ
　）と第２液中での吸光度の経時変化率プロットした点
を結んだものである。 第４図は実施例２に於て得られた検量線を示し、横軸の
試料液中のヒト膵型α−アミラーゼの活性比率に対して
、第１液中での吸光度の経時変化率（ΔＥ−ｉｎ　）と
第２液添加２分後以降の吸光度の経時変化率（ΔＥ４Ａ
ｉｎ）を用いて次式から算出した変を縦軸に沿ってプロ
ットした点金結んだものである。 特許出願人　　和光純薬工業株式会社 、１１　図 Ｄ　　　　　、Ｓ−７０７５ 時間（ガ） ｉＪ２図 峙　聞（＃） ５３　図 ０　　　　２５　　　　　Ｓｏ　　　　　７５　　　　
　ｆｏ。 ヒ）−＃型ｏ（−了ミラー七゛の活姓比辛（’ｌ）あ　
４　図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）還元末端修飾マルトオリゴ糖誘導体を基質として
   用い、α−アミラーゼの加水分解作用を受けて生じる分
   解生成物に、基質特異性の異なる２種以上の共役酵素を
   作用させ、生じる成績体を測定することによって、ヒト
   膵由来のα−アミラーゼとヒト唾液腺由来のα−アミラ
   ーゼの分別測定を行うことを特徴とする、α−アミラー
   ゼアイソザイムの分別測定法。