JPH0410480B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0410480B2 JPH0410480B2 JP58134502A JP13450283A JPH0410480B2 JP H0410480 B2 JPH0410480 B2 JP H0410480B2 JP 58134502 A JP58134502 A JP 58134502A JP 13450283 A JP13450283 A JP 13450283A JP H0410480 B2 JPH0410480 B2 JP H0410480B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- minutes
- lymphocytes
- stable
- human antibody
- human
- Prior art date
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- Expired - Lifetime
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
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- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は新規なヒト抗体産生増強因子およびそ
の製法に関するものである。 更に詳しくは、本発明はヒトリンパ球により産
生され、ヒト抗体のイムノグロブリンIgG、IgM
の産生を増強促進する新規なヒト抗体産生増強因
子およびその製造法に関するものである。 抗体産生を増強、促進する因子としては種々の
報告があるが、中でもＴ細胞やマクロフアージか
ら産生される可溶性因子として、Ｔ細胞増殖因子
（インターロイキン２、IL−２）Ｂ細胞増強因子
（BCGF）、Ｂ細胞分化因子（BCDF）やインター
ロイキンｌ（IL−１）などが知られている。これ
らの作用を有する物質はいずれも分子量15000〜
18000ないし12000〜18000の高分子物質であるこ
とが判つている。 抗原−抗体反応を利用した疾患の治療や予防は
種々の輝やかしい成果をあげてはいるが、中には
未だ解決されていないことも多い。それらの中で
ある種の疾患の場合は抗体産生が充分でない、あ
るいは弱すぎることによつて、治癒に到らない疾
患を数多く知られている。そのような場合抗体産
生を増強促進することができれば望ましい効果を
得るであろうことが期待できよう。そのような疾
患としては、例えばがん、インフルエンザなどが
あげられる。 本発明者らはヒト抗体産生調節機構を研究して
いる過程で、単核細胞からマクロフアージを除去
したリンパ球の内ナイロンウール付着性リンパ球
が抗体産生を著明に増強することを見い出した。
さらに、このナイロンウール付着性リンパ球を培
養してその培養上澄中に低分子量の抗体産生を増
強する物質が存在することを確認し、本作用物質
を採取し、本発明を完成した。 本発明の特徴とする所は下記の点にある。 第１発明 ヒトリンパ球より分離培養し得られたヒト抗体
のイムノグロブリンIgG、IgMの産生を増強促進
するヒト抗体産生増強因子であつて、下記の条件 分子量2000〜4000 透析膜を通過すること、 PH２〜11で安定であること、 30℃で60分、56℃30分、100℃２分の加熱で
安定、−80℃で凍結し37℃にて融解する凍結融
解を６回繰り返す条件で安定であること、 プロテナーゼK37℃、60分処理で失活するこ
と、及び リボヌクレアーゼA37℃、60分処理で安定で
あること、 () Ｔ細胞増殖因子（TCGF）で活性を示さ
ないこと、 () Ｂ細胞増殖因子（BCGF）で活性を示さ
ないこと、 を満足することを特徴とするヒト抗体産生増強
因子。 第２発明 ヒトリンパ球のナイロンウール付着細胞を分離
培養し、培養液を透析し、下記の条件 分子量2000〜4000 透析膜を通過すること、 PH２〜11で安定であること、 30℃で60分、56℃30分、100℃２分の加熱で
安定、−80℃で凍結し37℃にて融解する凍結融
解を６回繰り返す条件で安定であること、 プロテナーゼK37℃、60分処理で失活するこ
と、及び リボヌクレアーゼA37℃、60分処理で安定で
あること、 () Ｔ細胞増殖因子（TCGF）で活性を示さ
ないこと、 () Ｂ細胞増殖因子（BCGF）で活性を示さ
ないこと、 を満足するヒト抗体のイムノグロブリンIgG、
IgMの産生を増強促進する因子を含む透析膜通
過液を得ることを特徴とするヒト抗体産生増強
因子の製造法。 第３発明 ヒトの扁桃より単核細胞を得、単核細胞よりリ
ンパ球を分離し、得られたリンパ球を牛胎児血清
含有培養液に懸濁して、ナイロンウールに混じ、
同じ培養液で溶出してナイロンウール付着リンパ
球区分を得、ナイロンウールより付着したリンパ
球を洗い出した後、遠心分離し、得られたナイロ
ンウール付着性リンパ球を牛胎児血清含有培養液
に懸濁せしめ、炭酸ガス気流下35〜38℃にて１〜
７日間培養し、培養物を遠心分離してリンパ球を
除去し、得られた培養液上澄を透析膜を通して透
析し、下記の条件 分子量2000〜4000 透析膜を通過すること、 PH２〜11で安定であること、 30℃で60分、56℃30分、100℃２分の加熱で
安定、−80℃で凍結し37℃にて融解する凍結融
解を６回繰り返す条件で安定であること、 プロテナーゼK37℃、60分処理で失活するこ
と、及び リボヌクレアーゼA37℃、60分処理で安定で
あること、 () Ｔ細胞増殖因子（TCGF）で活性を示さ
ないこと、 () Ｂ細胞増殖因子（BCGF）で活性を示さ
ないこと を満足するヒト抗体のイムノグロブリンの産生
を増強促進する因子を含む透析膜通過液を得る
ことを特徴とすヒト抗体産生増強因子の製造
法。 本発明の因子の製造に当つては、ヒトリンパ球
が扁桃、脾臓、胸線または末梢血より得られた単
核細胞であること、また培養が牛胎児血清含有培
地中、炭酸ガス気流中、35〜38℃で行われるこ
と、及び本発明のヒトリンパ球は単核細胞よりマ
クロフアージを除去して得られたものである。 なお、本発明の因子の製造に当つては、得られ
たヒト抗体の生産増強因子を含む透析膜通過液を
凍結乾燥する工程を含むことを特徴とする。 本発明の目的の一つは、後記する理化学的なら
びに生物学的性質を有するヒト抗体産生増強因子
を提供することにある。 本発明の別の目的の一つは、ヒトリンパ球のナ
イロンウール付着細胞を分離培養し、培養液から
透析膜透過性のヒト抗体産生増強因子を採取する
ことを特徴とするヒト抗体産生増強因子の製造法
を提供することにある。 本発明のヒト抗体産生増強因子（以下、必要に
応じ、本因子という）の製造法につき以下詳述す
る。 本因子の製造にはまず、ヒトリンパ球を培養す
る。ヒトリンパ球を得るには、扁桃を原料として
用いる。扁桃をハサミなどにより細断し、ペニシ
リンやストレプトマイシンを含有させて雑菌の混
入を防止した細胞培養液に懸濁する。この細胞培
養液としては、例えば商品名RPMI−1640（Ｌ−
グルタミン、２−メルカプトエタノールを含む）
として市販されているものを用いる。この細胞培
養液に懸濁した切断組織はガーゼなどで濾過して
組織片を除去し、細胞浮遊液を得る。浮遊液には
フイコール・パク（Ficoll Paque）を加えて単
核細胞層を遠心分離し、この単核細胞浮遊液にシ
リカゲルを加えてマクロフアージを除去し、リン
パ球を得る。リンパ球を牛胎児血清を含む培養液
に懸濁して、ナイロンウールカラムにチヤージす
る。リンパ球付着ナイロンウールカラムを35〜38
℃にて30〜45分間静置培養した後、同じ組成の培
養液にて洗滌して、ナイロンウール付着性リンパ
球とナイロンウール通過性リンパ球に分離する。
ナイロンウール付着性リンパ球は、約４℃に予め
冷却した培養液と該ナイロンウールを接触、混
合、振とうすると、リンパ球が培養液中に剥離し
てくるので、これを遠心分離により分離し、牛胎
児血清含有培養液（Ｌ−グルタミン、メルカプト
エタノールの他に更にペニシリン、ストレプトマ
イシンを含有）中に懸濁し、35〜38℃にて炭酸ガ
ス気流中、１〜７日間静置培養する。この培養に
より培養液中に本因子が生産される。遠心分離に
より細胞を分離して得られる上澄液を透析膜チユ
ーブに入れ、外側より吸引により内容液を滲出さ
せ透析膜通過液を採取する。この透析膜通過液中
には本因子が含まれ、そのままヒト抗体産生増強
因子として使用することができるが、所望によ
り、この透析膜通過液を凍結乾燥することによ
り、ヒト抗体産生増強因子が粉末として得られ
る。 このようにして得られたヒト抗体産生増強因子
は以下の理化学的性状ならびに生物学的性状を有
している。 分子量2000〜4000 〔商品名セフアデツクスＧ−50を用いたゲル濾
過法でグルカゴン（分子量3500）の後に主とし
て溶出〕 透析膜を通過する。 PH２〜11で安定。 30℃で60分、56℃30分、100℃２分の加熱で
安定、−80℃で凍結し37℃にて融解する凍結融
解を６回繰り返したが安定。 プロテナーゼＫ（Proteinase Ｋ、ベーリンガ
ーマンハイム社製）37℃、60分処理で失活す
る。 リボヌクレアーゼＡ（RNase Ａ、ベーリン
ガーマンハイム社製）37℃、60分処理で安定。 () ヒトリンパ球の抗体IgG、IgM産生を増
強促進する。 () Ｔ細胞増殖因子（TCGF）活性を示さな
い。 () Ｂ細胞増殖因子（BCGF）活性を示さな
い。 〔活性測定法〕 96穴平底マイクロプレートにヒト末梢血または
扁桃リンパ球２×105／100μl／well〔ポークウイ
ードマイトーゲン（PWM）2μl／200μl含有〕を
入れ、本因子50μl＋培養液（15％牛胎児血清含有
RPMI−1640培養液）50μl、本因子25μl＋培養液
75μl、対照として培養液100μl、を夫々加えて、
PH7.2〜7.4にて37℃、５％炭酸ガス気流中７日間
培養し、マイクロプレートをそのまま3000rpm、
10分、４℃にて遠心し、上澄をとり、上澄中の
IgGおよび／またはIgM量（ｎｇ／ml）をELISA
法で測定する。 上記測定法で測定した本因子の各種条件下にお
ける活性を以下に示す。
の製法に関するものである。 更に詳しくは、本発明はヒトリンパ球により産
生され、ヒト抗体のイムノグロブリンIgG、IgM
の産生を増強促進する新規なヒト抗体産生増強因
子およびその製造法に関するものである。 抗体産生を増強、促進する因子としては種々の
報告があるが、中でもＴ細胞やマクロフアージか
ら産生される可溶性因子として、Ｔ細胞増殖因子
（インターロイキン２、IL−２）Ｂ細胞増強因子
（BCGF）、Ｂ細胞分化因子（BCDF）やインター
ロイキンｌ（IL−１）などが知られている。これ
らの作用を有する物質はいずれも分子量15000〜
18000ないし12000〜18000の高分子物質であるこ
とが判つている。 抗原−抗体反応を利用した疾患の治療や予防は
種々の輝やかしい成果をあげてはいるが、中には
未だ解決されていないことも多い。それらの中で
ある種の疾患の場合は抗体産生が充分でない、あ
るいは弱すぎることによつて、治癒に到らない疾
患を数多く知られている。そのような場合抗体産
生を増強促進することができれば望ましい効果を
得るであろうことが期待できよう。そのような疾
患としては、例えばがん、インフルエンザなどが
あげられる。 本発明者らはヒト抗体産生調節機構を研究して
いる過程で、単核細胞からマクロフアージを除去
したリンパ球の内ナイロンウール付着性リンパ球
が抗体産生を著明に増強することを見い出した。
さらに、このナイロンウール付着性リンパ球を培
養してその培養上澄中に低分子量の抗体産生を増
強する物質が存在することを確認し、本作用物質
を採取し、本発明を完成した。 本発明の特徴とする所は下記の点にある。 第１発明 ヒトリンパ球より分離培養し得られたヒト抗体
のイムノグロブリンIgG、IgMの産生を増強促進
するヒト抗体産生増強因子であつて、下記の条件 分子量2000〜4000 透析膜を通過すること、 PH２〜11で安定であること、 30℃で60分、56℃30分、100℃２分の加熱で
安定、−80℃で凍結し37℃にて融解する凍結融
解を６回繰り返す条件で安定であること、 プロテナーゼK37℃、60分処理で失活するこ
と、及び リボヌクレアーゼA37℃、60分処理で安定で
あること、 () Ｔ細胞増殖因子（TCGF）で活性を示さ
ないこと、 () Ｂ細胞増殖因子（BCGF）で活性を示さ
ないこと、 を満足することを特徴とするヒト抗体産生増強
因子。 第２発明 ヒトリンパ球のナイロンウール付着細胞を分離
培養し、培養液を透析し、下記の条件 分子量2000〜4000 透析膜を通過すること、 PH２〜11で安定であること、 30℃で60分、56℃30分、100℃２分の加熱で
安定、−80℃で凍結し37℃にて融解する凍結融
解を６回繰り返す条件で安定であること、 プロテナーゼK37℃、60分処理で失活するこ
と、及び リボヌクレアーゼA37℃、60分処理で安定で
あること、 () Ｔ細胞増殖因子（TCGF）で活性を示さ
ないこと、 () Ｂ細胞増殖因子（BCGF）で活性を示さ
ないこと、 を満足するヒト抗体のイムノグロブリンIgG、
IgMの産生を増強促進する因子を含む透析膜通
過液を得ることを特徴とするヒト抗体産生増強
因子の製造法。 第３発明 ヒトの扁桃より単核細胞を得、単核細胞よりリ
ンパ球を分離し、得られたリンパ球を牛胎児血清
含有培養液に懸濁して、ナイロンウールに混じ、
同じ培養液で溶出してナイロンウール付着リンパ
球区分を得、ナイロンウールより付着したリンパ
球を洗い出した後、遠心分離し、得られたナイロ
ンウール付着性リンパ球を牛胎児血清含有培養液
に懸濁せしめ、炭酸ガス気流下35〜38℃にて１〜
７日間培養し、培養物を遠心分離してリンパ球を
除去し、得られた培養液上澄を透析膜を通して透
析し、下記の条件 分子量2000〜4000 透析膜を通過すること、 PH２〜11で安定であること、 30℃で60分、56℃30分、100℃２分の加熱で
安定、−80℃で凍結し37℃にて融解する凍結融
解を６回繰り返す条件で安定であること、 プロテナーゼK37℃、60分処理で失活するこ
と、及び リボヌクレアーゼA37℃、60分処理で安定で
あること、 () Ｔ細胞増殖因子（TCGF）で活性を示さ
ないこと、 () Ｂ細胞増殖因子（BCGF）で活性を示さ
ないこと を満足するヒト抗体のイムノグロブリンの産生
を増強促進する因子を含む透析膜通過液を得る
ことを特徴とすヒト抗体産生増強因子の製造
法。 本発明の因子の製造に当つては、ヒトリンパ球
が扁桃、脾臓、胸線または末梢血より得られた単
核細胞であること、また培養が牛胎児血清含有培
地中、炭酸ガス気流中、35〜38℃で行われるこ
と、及び本発明のヒトリンパ球は単核細胞よりマ
クロフアージを除去して得られたものである。 なお、本発明の因子の製造に当つては、得られ
たヒト抗体の生産増強因子を含む透析膜通過液を
凍結乾燥する工程を含むことを特徴とする。 本発明の目的の一つは、後記する理化学的なら
びに生物学的性質を有するヒト抗体産生増強因子
を提供することにある。 本発明の別の目的の一つは、ヒトリンパ球のナ
イロンウール付着細胞を分離培養し、培養液から
透析膜透過性のヒト抗体産生増強因子を採取する
ことを特徴とするヒト抗体産生増強因子の製造法
を提供することにある。 本発明のヒト抗体産生増強因子（以下、必要に
応じ、本因子という）の製造法につき以下詳述す
る。 本因子の製造にはまず、ヒトリンパ球を培養す
る。ヒトリンパ球を得るには、扁桃を原料として
用いる。扁桃をハサミなどにより細断し、ペニシ
リンやストレプトマイシンを含有させて雑菌の混
入を防止した細胞培養液に懸濁する。この細胞培
養液としては、例えば商品名RPMI−1640（Ｌ−
グルタミン、２−メルカプトエタノールを含む）
として市販されているものを用いる。この細胞培
養液に懸濁した切断組織はガーゼなどで濾過して
組織片を除去し、細胞浮遊液を得る。浮遊液には
フイコール・パク（Ficoll Paque）を加えて単
核細胞層を遠心分離し、この単核細胞浮遊液にシ
リカゲルを加えてマクロフアージを除去し、リン
パ球を得る。リンパ球を牛胎児血清を含む培養液
に懸濁して、ナイロンウールカラムにチヤージす
る。リンパ球付着ナイロンウールカラムを35〜38
℃にて30〜45分間静置培養した後、同じ組成の培
養液にて洗滌して、ナイロンウール付着性リンパ
球とナイロンウール通過性リンパ球に分離する。
ナイロンウール付着性リンパ球は、約４℃に予め
冷却した培養液と該ナイロンウールを接触、混
合、振とうすると、リンパ球が培養液中に剥離し
てくるので、これを遠心分離により分離し、牛胎
児血清含有培養液（Ｌ−グルタミン、メルカプト
エタノールの他に更にペニシリン、ストレプトマ
イシンを含有）中に懸濁し、35〜38℃にて炭酸ガ
ス気流中、１〜７日間静置培養する。この培養に
より培養液中に本因子が生産される。遠心分離に
より細胞を分離して得られる上澄液を透析膜チユ
ーブに入れ、外側より吸引により内容液を滲出さ
せ透析膜通過液を採取する。この透析膜通過液中
には本因子が含まれ、そのままヒト抗体産生増強
因子として使用することができるが、所望によ
り、この透析膜通過液を凍結乾燥することによ
り、ヒト抗体産生増強因子が粉末として得られ
る。 このようにして得られたヒト抗体産生増強因子
は以下の理化学的性状ならびに生物学的性状を有
している。 分子量2000〜4000 〔商品名セフアデツクスＧ−50を用いたゲル濾
過法でグルカゴン（分子量3500）の後に主とし
て溶出〕 透析膜を通過する。 PH２〜11で安定。 30℃で60分、56℃30分、100℃２分の加熱で
安定、−80℃で凍結し37℃にて融解する凍結融
解を６回繰り返したが安定。 プロテナーゼＫ（Proteinase Ｋ、ベーリンガ
ーマンハイム社製）37℃、60分処理で失活す
る。 リボヌクレアーゼＡ（RNase Ａ、ベーリン
ガーマンハイム社製）37℃、60分処理で安定。 () ヒトリンパ球の抗体IgG、IgM産生を増
強促進する。 () Ｔ細胞増殖因子（TCGF）活性を示さな
い。 () Ｂ細胞増殖因子（BCGF）活性を示さな
い。 〔活性測定法〕 96穴平底マイクロプレートにヒト末梢血または
扁桃リンパ球２×105／100μl／well〔ポークウイ
ードマイトーゲン（PWM）2μl／200μl含有〕を
入れ、本因子50μl＋培養液（15％牛胎児血清含有
RPMI−1640培養液）50μl、本因子25μl＋培養液
75μl、対照として培養液100μl、を夫々加えて、
PH7.2〜7.4にて37℃、５％炭酸ガス気流中７日間
培養し、マイクロプレートをそのまま3000rpm、
10分、４℃にて遠心し、上澄をとり、上澄中の
IgGおよび／またはIgM量（ｎｇ／ml）をELISA
法で測定する。 上記測定法で測定した本因子の各種条件下にお
ける活性を以下に示す。
【表】
【表】
本因子溶液を2N−HClでPH２、又、2N−
NaOHでPH11に夫々調製し、放置後、中和、活
性を測定した。その結果、いずれのPHにおいても
安定であつた。
NaOHでPH11に夫々調製し、放置後、中和、活
性を測定した。その結果、いずれのPHにおいても
安定であつた。
【表】
−80℃フリーザーにて凍結、37℃温水にて融解
を６回繰り返して活性を測定 以上のように本因子は熱に極めて安定である。
を６回繰り返して活性を測定 以上のように本因子は熱に極めて安定である。
【表】
以上示したように、本発明の因子は強力なヒト
抗体産生増強作用を有し、透析膜を通過し、たん
白分解酵素（Proteinase Ｋ）処理により活性を
減少し、RNase処理に対し安定であり、熱、PH
に対しても通常の範囲では安定であつて、従来知
られている抗体産生促進因子とは全く異つた新規
なヒト抗体産生増強因子である。 本発明のヒト抗体産生増強因子は、遺伝子工業
的手法、即ち組換えDNA技術により微生物に本
因子産生DNAを組込んで生産させることも可能
であろうし、また細胞融合技術により生産させる
ことも可能であつて、これらの方法により製造さ
れた本因子も本発明の範囲に含まれる。 以下に本発明の実施例をあげるが、本発明はこ
の実施例に制限されるものではない。 実施例 ヒト扁桃２コを、ペニシリン1000u／ml、スト
レプトマイシン1000μｇ／ml含有RPMI−1640培
養液中にてハサミで細切し、２〜３重にしたガー
ゼで濾過して扁桃細胞を得た。リン酸緩衝液にて
４℃、10分、３回洗滌を繰り返し、夫々遠心
1500rpmで細胞を分離して後RPMI−1640培養液
20ml中に浮遊した。夫々約３mlを６本の遠沈管に
分注し、１本につきフイコール・パク（Ficoll−
Paque）（比重1.077）2.5mlを加え、2200rpm、18
℃20分遠心し、単核細胞層を分離させた。単核細
胞層（１本につき約２ml）をすいとり、リン酸緩
衝液８ml（遠沈管１本につき）を加えて１回目は
1800rpm、２回目、３回目は1500rpmで４℃、10
分間遠沈洗浄し、単核細胞を得た。遠沈管６本分
の細胞を合わせて、１本の遠沈管に入れ（培養液
で遠沈管を順次洗滌していつて合わせる。）10％
ヒトAB血清含有RPMI−1640培養液に浮遊させ
た。これに1/10量のシリカ懸濁液を加え、37℃に
て60分間、15分毎に振とうを加えて培養した。
（この操作によつて単核細胞中のマクロフアージ
がシリカを貧食する）フイコール・パク（Ficoll
−Paque）2.5mlを加え、2200rpmにて18℃、20分
間遠心分離し、リンパ球を分離させた。リンパ球
層をすいとり、１回目は1800rpm、２回目、３回
目は1500rpmで４℃、10分間、リン酸緩衝液にて
洗滌を繰返した。沈澱したリンパ球を10％牛胎児
血清含有RPMI−1640培養液５mlに懸濁し、予め
同じ培養液で洗滌したナイロンウールカラム（１
ｇを10ml用注射筒の10mlの位置までつめる）に注
入した。そのまま注射筒を横にして、37℃にて30
〜45分間静置培養した。ナイロンウールカラムを
予め37℃に加温した10％牛胎児血清含有RPMI−
1640培養液40mlで洗い流し（注射筒の先に19G注
射針をつけて流速量を調節する。）ナイロンウー
ル付着性リンパ球とナイロンウール通過性リンパ
球に分離した。ナイロンウールをとり出し、試験
管内に入れ、４℃に冷却したRPMI−1640培養液
（１回目は20ml、２回目、３回目は10mlずつ）を
加えて棒でよくかきまぜて、ナイロンウール付着
性リンパ球をナイロンウールから剥離させた。リ
ンパ球浮遊液を集め（約40ml）別の遠沈管に移し
て、1500rpm10分間４℃にて遠心した。15％牛胎
児血清含有RPMI−1640培養液（２ｍＭ Ｌ−グ
ルタミン、５×10-5M2−メルカプトエタノール、
100単位／mlペニシリン、100μｇ／mlストレプト
マイシンを含有する。）にナイロンウール付着性
リンパ球を懸濁した。懸濁リンパ球は血球計算盤
にてトリパンプルー染色（死亡細胞のみが染色さ
れる）をして生細胞だけを数え、細胞数を２×
106個／mlに調節した。このリンパ球懸濁液を組
織培養用フラスコに入れ37℃にて５％炭酸ガス培
養器内で、５日間静置培養した。培養後、遠沈管
に培養液を移し、3000rpm15分４℃にて遠心分離
し、上澄液を得た。この上澄液をセルロース膜透
析チユーブに入れ、チユーブを吸引ビンの中に入
れて、４℃にて１夜吸引した。透析膜を通過して
外に出て来た培養液を、除菌のためのミリポアフ
イルター（0.45μ）を通して、ヒト抗体産生増強
因子を含有する液体を得た。このものは前述した
IgG、IgM産生促進作用を有する。この液体を凍
結乾燥してヒト抗体産生増強因子粉末たん白とし
て10mgを得た。
抗体産生増強作用を有し、透析膜を通過し、たん
白分解酵素（Proteinase Ｋ）処理により活性を
減少し、RNase処理に対し安定であり、熱、PH
に対しても通常の範囲では安定であつて、従来知
られている抗体産生促進因子とは全く異つた新規
なヒト抗体産生増強因子である。 本発明のヒト抗体産生増強因子は、遺伝子工業
的手法、即ち組換えDNA技術により微生物に本
因子産生DNAを組込んで生産させることも可能
であろうし、また細胞融合技術により生産させる
ことも可能であつて、これらの方法により製造さ
れた本因子も本発明の範囲に含まれる。 以下に本発明の実施例をあげるが、本発明はこ
の実施例に制限されるものではない。 実施例 ヒト扁桃２コを、ペニシリン1000u／ml、スト
レプトマイシン1000μｇ／ml含有RPMI−1640培
養液中にてハサミで細切し、２〜３重にしたガー
ゼで濾過して扁桃細胞を得た。リン酸緩衝液にて
４℃、10分、３回洗滌を繰り返し、夫々遠心
1500rpmで細胞を分離して後RPMI−1640培養液
20ml中に浮遊した。夫々約３mlを６本の遠沈管に
分注し、１本につきフイコール・パク（Ficoll−
Paque）（比重1.077）2.5mlを加え、2200rpm、18
℃20分遠心し、単核細胞層を分離させた。単核細
胞層（１本につき約２ml）をすいとり、リン酸緩
衝液８ml（遠沈管１本につき）を加えて１回目は
1800rpm、２回目、３回目は1500rpmで４℃、10
分間遠沈洗浄し、単核細胞を得た。遠沈管６本分
の細胞を合わせて、１本の遠沈管に入れ（培養液
で遠沈管を順次洗滌していつて合わせる。）10％
ヒトAB血清含有RPMI−1640培養液に浮遊させ
た。これに1/10量のシリカ懸濁液を加え、37℃に
て60分間、15分毎に振とうを加えて培養した。
（この操作によつて単核細胞中のマクロフアージ
がシリカを貧食する）フイコール・パク（Ficoll
−Paque）2.5mlを加え、2200rpmにて18℃、20分
間遠心分離し、リンパ球を分離させた。リンパ球
層をすいとり、１回目は1800rpm、２回目、３回
目は1500rpmで４℃、10分間、リン酸緩衝液にて
洗滌を繰返した。沈澱したリンパ球を10％牛胎児
血清含有RPMI−1640培養液５mlに懸濁し、予め
同じ培養液で洗滌したナイロンウールカラム（１
ｇを10ml用注射筒の10mlの位置までつめる）に注
入した。そのまま注射筒を横にして、37℃にて30
〜45分間静置培養した。ナイロンウールカラムを
予め37℃に加温した10％牛胎児血清含有RPMI−
1640培養液40mlで洗い流し（注射筒の先に19G注
射針をつけて流速量を調節する。）ナイロンウー
ル付着性リンパ球とナイロンウール通過性リンパ
球に分離した。ナイロンウールをとり出し、試験
管内に入れ、４℃に冷却したRPMI−1640培養液
（１回目は20ml、２回目、３回目は10mlずつ）を
加えて棒でよくかきまぜて、ナイロンウール付着
性リンパ球をナイロンウールから剥離させた。リ
ンパ球浮遊液を集め（約40ml）別の遠沈管に移し
て、1500rpm10分間４℃にて遠心した。15％牛胎
児血清含有RPMI−1640培養液（２ｍＭ Ｌ−グ
ルタミン、５×10-5M2−メルカプトエタノール、
100単位／mlペニシリン、100μｇ／mlストレプト
マイシンを含有する。）にナイロンウール付着性
リンパ球を懸濁した。懸濁リンパ球は血球計算盤
にてトリパンプルー染色（死亡細胞のみが染色さ
れる）をして生細胞だけを数え、細胞数を２×
106個／mlに調節した。このリンパ球懸濁液を組
織培養用フラスコに入れ37℃にて５％炭酸ガス培
養器内で、５日間静置培養した。培養後、遠沈管
に培養液を移し、3000rpm15分４℃にて遠心分離
し、上澄液を得た。この上澄液をセルロース膜透
析チユーブに入れ、チユーブを吸引ビンの中に入
れて、４℃にて１夜吸引した。透析膜を通過して
外に出て来た培養液を、除菌のためのミリポアフ
イルター（0.45μ）を通して、ヒト抗体産生増強
因子を含有する液体を得た。このものは前述した
IgG、IgM産生促進作用を有する。この液体を凍
結乾燥してヒト抗体産生増強因子粉末たん白とし
て10mgを得た。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒトリンパ球より分離培養し得られたヒト抗
体のイムノグロブリンIgG、IgMの産生を増強促
進するヒト抗体産生増強因子であつて、下記の条
件 分子量2000〜4000 透析膜を通過すること、 PH２〜11で安定であること、 30℃で60分、56℃30分、100℃２分の加熱で
安定、−80℃で凍結し37℃にて融解する凍結融
解を６回繰り返す条件で安定であること、 プロテナーゼK37℃、60分処理で失活するこ
と、及び リボヌクレアーゼA37℃、60分処理で安定で
あること、 () Ｔ細胞増殖因子（TCGF）活性を示さな
いこと、 () Ｂ細胞増殖因子（BCGF）活性を示さな
いこと を満足することを特徴とするヒト抗体産生増強
因子。 ２ ヒトリンパ球のナイロンウール付着細胞を分
離培養し、培養液を透析し、下記の条件 分子量2000〜4000 透析膜を通過すること、 PH２〜11で安定であること、 30℃60分、56℃30分、100℃２分の加熱で安
定、−80℃で凍結し37℃にて融解する凍結融解
を６回繰り返す条件で安定であること、 プロテナーゼK37℃、60分処理で失活するこ
と、及び リボヌクレアーゼA37℃、60分処理で安定で
あること、 () Ｔ細胞増殖因子（TCGF）活性を示さな
いこと、 () Ｂ細胞増殖因子（BCGF）活性を示さな
いこと を満足するヒト抗体のイムノグロブリンIgG、
IgMの産生を増強促進する因子を含む透析膜通
過液を得ることを特徴とするヒト抗体産生増強
因子の製造法。 ３ ヒトリンパ球が扁桃、脾臓、胸線または末梢
血より得られた単核細胞である特許請求の範囲第
２項記載のヒト抗体産生増強因子の製造法。 ４ 培養が牛胎児血清含有培地中、炭酸ガス気流
中、35〜38℃で行われることを特徴とする特許請
求の範囲第２項または第３項記載のヒト抗体産生
増強因子の製造法。 ５ ヒトリンパ球は単核細胞よりマクロフアージ
を除去して得られたものである特許請求の範囲第
２項ないし第４項の何れかに記載のヒト抗体産生
増強因子の製造法。 ６ ヒトの扁桃より単核細胞を得、単核細胞より
リンパ球を分離し、得られたリンパ球を牛胎児血
清含有培養液に懸濁して、ナイロンウールに混
じ、同じ培養液で溶出してナイロンウール付着リ
ンバ球区分を得、ナイロンウールより付着したリ
ンパ球を洗い出した後、遠心分離し、得られたナ
イロンウール付着性リンパ球を牛胎児血清含有培
養液に懸濁せしめ、炭酸ガス気流下35〜38℃にて
１〜７日間培養し、培養物を遠心分離してリンパ
球を除去し、得られた培養液上澄を透析膜を通し
て透析し、下記の条件 分子量2000〜4000 透析膜を通過すること、 PH２〜11で安定であること、 30℃60分、56℃30分、100℃２分の加熱で安
定、−80℃で凍結し37℃にて融解する凍結融解
を６回繰り返す条件で安定であること、 プロテナーゼK37℃、60分処理で失活するこ
と、及び リボヌクレアーゼA37℃、60分処理で安定で
あること、 () Ｔ細胞増殖因子（TCGF）で活性を示さ
ないこと、 () Ｂ細胞増殖因子（BCGF）で活性を示さ
ないこと を満足するヒト抗体のイムノグロブリンの産生
を増強促進する因子を含む透析膜通過液を得る
ことを特徴とするヒト抗体産生増強因子の製造
法。 ７ ヒトリンパ球のナイロンウール付着細胞を分
離培養する工程と、培養液を透析し、ヒト抗体の
イムノグロブリンIgG、IgMの産生を増強促進す
る因子であつて、分子量2000〜4000のものを含む
透析膜通過液を得る工程と、得られたヒト抗体の
産生増強因子を含む透析膜通過液を凍結乾燥する
工程の結合を特徴とする特許請求の範囲第６項記
載のヒト抗体産生増強因子の製造法。 ８ ヒトの扁桃より単核細胞を得、単核細胞より
リンパ球を分離し、得られたリンパ球を牛胎児血
清含有培養液に懸濁して、ナイロンウールに混
じ、同じ培養液で溶出してナイロンウール付着リ
ンパ球区分を得、ナイロンウールより付着したリ
ンパ球を洗い出した後、遠心分離し、得られたナ
イロンウール付着性リンパ球を牛胎児血清含有培
養液に懸濁せしめ、炭酸ガス気流下35〜38℃にて
１〜７日間培養し、培養物を遠心分離してリンパ
球を除去し、得られた培養液上澄を透析膜を通し
て透析し、下記条件 分子量2000〜4000 透析膜を通過すること、 PH２〜11で安定であること、 30℃60分、56℃30分、100℃２分の加熱で安
定、−80℃で凍結し37℃にて融解する凍結融解
を６回繰り返す条件で安定であること、 プロテナーゼK37℃、60分処理で失活するこ
と、及び リボヌクレアーゼA37℃、60分処理で安定で
あること、 () Ｔ細胞増殖因子（TCGF）で活性を示さ
ないこと、 () Ｂ細胞増殖因子（BCGF）で活性を示さ
ないこと を満足するヒト抗体のイムノグロブリンの産生
を増強促進する因子を含む透析膜通過液を得る
工程と、得られた透析膜通過液を凍結乾燥する
工程との結合を特徴とする特許請求の範囲第６
項記載のヒト抗体産生増強因子の製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58134502A JPS6028935A (ja) | 1983-07-25 | 1983-07-25 | 新規ヒト抗体産生増強因子およびその製造法 |
| CA000445898A CA1225958A (en) | 1983-07-25 | 1984-01-23 | Augmenting factors for human antibody production and process for preparing the same |
| FR8401057A FR2549726B1 (fr) | 1983-07-25 | 1984-01-24 | Facteurs augmentant la formation d'anticorps humains et procede pour leur preparation |
| US06/573,616 US4594245A (en) | 1983-07-25 | 1984-01-25 | Augmenting factors for human antibody production and process for peparing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58134502A JPS6028935A (ja) | 1983-07-25 | 1983-07-25 | 新規ヒト抗体産生増強因子およびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6028935A JPS6028935A (ja) | 1985-02-14 |
| JPH0410480B2 true JPH0410480B2 (ja) | 1992-02-25 |
Family
ID=15129820
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58134502A Granted JPS6028935A (ja) | 1983-07-25 | 1983-07-25 | 新規ヒト抗体産生増強因子およびその製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4594245A (ja) |
| JP (1) | JPS6028935A (ja) |
| CA (1) | CA1225958A (ja) |
| FR (1) | FR2549726B1 (ja) |
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| US4689224A (en) * | 1985-10-07 | 1987-08-25 | Neogen Corporation | Method for administering vaccines containing equine leukokines and compositions therefor |
| EP0295605B1 (en) * | 1987-06-12 | 1994-09-07 | Tosoh Corporation | Antibody production-stimulating factor derived from human B lymphoblastoid cell and process for producing antibody by using said stimulating factor |
| AU7256994A (en) * | 1993-07-09 | 1995-02-06 | Private Biologicals Corporation | Compositions for and methods of treating cancer and autoimmune diseases |
| US20020044942A1 (en) * | 2000-09-18 | 2002-04-18 | Chisolm Biological Laboratory, Llc | Transfer factor composition and process for producing same |
Family Cites Families (6)
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|---|---|---|---|---|
| US4001080A (en) * | 1972-10-20 | 1977-01-04 | Piktor Limited | Production of immunological materials |
| GB1443948A (en) * | 1972-10-20 | 1976-07-28 | Piktor Ltd | Production of immunological material |
| US4132776A (en) * | 1978-02-15 | 1979-01-02 | University Patents, Inc. | Delivery of immunologically active components of transfer factor |
| US4390623A (en) * | 1980-10-02 | 1983-06-28 | Hooper Trading Company | Serum-free and mitogen-free T-cell growth factor and process for making same |
| EP0049611B2 (en) * | 1980-10-02 | 1993-12-08 | Hooper Trading Co. N.V. | A T-cell growth factor, and a process of producing the same |
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-
1983
- 1983-07-25 JP JP58134502A patent/JPS6028935A/ja active Granted
-
1984
- 1984-01-23 CA CA000445898A patent/CA1225958A/en not_active Expired
- 1984-01-24 FR FR8401057A patent/FR2549726B1/fr not_active Expired
- 1984-01-25 US US06/573,616 patent/US4594245A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4594245A (en) | 1986-06-10 |
| CA1225958A (en) | 1987-08-25 |
| FR2549726A1 (fr) | 1985-02-01 |
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| FR2549726B1 (fr) | 1988-06-10 |
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