JPH0829097B2 - 線維芽細胞発育因子 - Google Patents
線維芽細胞発育因子Info
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- JPH0829097B2 JPH0829097B2 JP61503569A JP50356986A JPH0829097B2 JP H0829097 B2 JPH0829097 B2 JP H0829097B2 JP 61503569 A JP61503569 A JP 61503569A JP 50356986 A JP50356986 A JP 50356986A JP H0829097 B2 JPH0829097 B2 JP H0829097B2
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- amino acid
- bfgf
- sequence
- growth factor
- fibroblast growth
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
- C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は線維芽細胞発育因子（FGF）、より詳細には
合成法により製造される塩基性FGF（bFGF）に関するも
のであり、これにより哺乳動物FGFの有用性が実質的に
高まるであろう。
合成法により製造される塩基性FGF（bFGF）に関するも
のであり、これにより哺乳動物FGFの有用性が実質的に
高まるであろう。
発明の背景 脳および下垂体は共に培養細胞に対する細胞分裂促進
因子を含有することが知られているが、1974年まではこ
れらと古典的な下垂体ホルモン、たとえばTSH、LH、FS
H、GHおよびACTHとの関係は不明であつた。1974年に下
垂体において線維芽細胞発育因子（FGF）と呼ばれる発
育因子の確認が報告され、これは下垂体ホルモンと異な
ることが示された（デイー・ゴスポダロビイツツ、ネイ
チヤー、249、123−127（1974））。現在ではこの発育
因子は16,415の分子量をもち、塩基性であり（pI9.
6）、かつ正常な２倍体線維芽細胞または株細胞に対す
る有効な細胞分裂促進物質であることが知られている。
酸性の脳FGFの精製については米国特許第4,444,760号明
細書（1984年４月24日）に記載されている。その後の研
究によつてFGFは線維芽細胞のほかに各種の正常な２倍
体の中杯葉由来の細胞および神経冠由来の細胞に対して
も細胞分裂促進性であることが確認された。これには顆
粒球、副腎皮質細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、角膜および
血管の内皮細胞（ウシおよびヒト由来）、血管平滑筋細
胞、および水晶体上皮細胞が含まれる。FGFは血漿補充
培地で培養された線維芽細胞の増殖を支持しうる点で、
血小板由来の発育因子の代替となりうることも示され
た。FGFはそれがウシ血管内皮細胞の増殖を刺激しうる
のと密接に関連して、インビボで毛細血管内皮細胞に対
しても同様な活性をもつ。従つてFGFは血管形成因子で
あると考えられる。
因子を含有することが知られているが、1974年まではこ
れらと古典的な下垂体ホルモン、たとえばTSH、LH、FS
H、GHおよびACTHとの関係は不明であつた。1974年に下
垂体において線維芽細胞発育因子（FGF）と呼ばれる発
育因子の確認が報告され、これは下垂体ホルモンと異な
ることが示された（デイー・ゴスポダロビイツツ、ネイ
チヤー、249、123−127（1974））。現在ではこの発育
因子は16,415の分子量をもち、塩基性であり（pI9.
6）、かつ正常な２倍体線維芽細胞または株細胞に対す
る有効な細胞分裂促進物質であることが知られている。
酸性の脳FGFの精製については米国特許第4,444,760号明
細書（1984年４月24日）に記載されている。その後の研
究によつてFGFは線維芽細胞のほかに各種の正常な２倍
体の中杯葉由来の細胞および神経冠由来の細胞に対して
も細胞分裂促進性であることが確認された。これには顆
粒球、副腎皮質細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、角膜および
血管の内皮細胞（ウシおよびヒト由来）、血管平滑筋細
胞、および水晶体上皮細胞が含まれる。FGFは血漿補充
培地で培養された線維芽細胞の増殖を支持しうる点で、
血小板由来の発育因子の代替となりうることも示され
た。FGFはそれがウシ血管内皮細胞の増殖を刺激しうる
のと密接に関連して、インビボで毛細血管内皮細胞に対
しても同様な活性をもつ。従つてFGFは血管形成因子で
あると考えられる。
哺乳動物の線維芽細胞発育因子（FGF）は逆相高性能
液体クママトグラフイー（RP−HPLC）により、またハパ
リン−セフアロースアフイニテイクロマトグラフイーに
より精製できる。FGFを哺乳動物組織（たとえば脳およ
び／または下垂体組織）から精製するためのこの種の方
法は大規模生産に拡大することが困難であり、従つて純
粋なFGFを合成法により製造することが実質的に哺乳動
物FGFの有用性を高めることになるであろう。
液体クママトグラフイー（RP−HPLC）により、またハパ
リン−セフアロースアフイニテイクロマトグラフイーに
より精製できる。FGFを哺乳動物組織（たとえば脳およ
び／または下垂体組織）から精製するためのこの種の方
法は大規模生産に拡大することが困難であり、従つて純
粋なFGFを合成法により製造することが実質的に哺乳動
物FGFの有用性を高めることになるであろう。
発明の要約 本発明は純粋な塩基性線維芽細胞発育因子（bFGF）、
およびDNA組み換え法その他の適切な方法によりこれを
合成する方法を提供する。bFGFとは後記の配列をもつア
ミノ酸残基146個のポリペプチド、またはその同族体を
意味する。天然分子においてはシステイン残基はいずれ
も互いにジスルフイド結合しておらず、１個または２個
以上のシステイン残基が遊離システイン分子に結合して
いる可能性がきわめて大きいと思われる。しかしシステ
イン残基間に内部ジスルフイド結合がないという証明は
完全に決定的なものではなく、１対または２対のシステ
イン残基が互いに内部結合している可能性もある。いず
れにしろ本発明は結合していないかまたはランダムに結
合した生物活性をもつペプチドを提供する。bFGFはかな
り長鎖のペプチドであるため、アミノ酸残基の段階的付
加を伴う標準的な連鎖延長法と対比してDNA組換え法が
優れた合成法である。抽出および精製は可能であるが、
現時点では商業的に実現可能であるとは考えられない。
従つてbFGFをコードするDNA鎖をたとえばオリゴヌクレ
オチド合成法により入手し、この合成DNA鎖をクローニ
ングベクター内へ、その組換えクローニングベクターが
生体または細胞系に導入された際にその発現が保証され
る適切な位置に挿入する。内部ジスルフイド結合を含ま
ない合成bFGFポリペプチドまたはランダムにジスルフイ
ド結合したものが生物活性を示す。
およびDNA組み換え法その他の適切な方法によりこれを
合成する方法を提供する。bFGFとは後記の配列をもつア
ミノ酸残基146個のポリペプチド、またはその同族体を
意味する。天然分子においてはシステイン残基はいずれ
も互いにジスルフイド結合しておらず、１個または２個
以上のシステイン残基が遊離システイン分子に結合して
いる可能性がきわめて大きいと思われる。しかしシステ
イン残基間に内部ジスルフイド結合がないという証明は
完全に決定的なものではなく、１対または２対のシステ
イン残基が互いに内部結合している可能性もある。いず
れにしろ本発明は結合していないかまたはランダムに結
合した生物活性をもつペプチドを提供する。bFGFはかな
り長鎖のペプチドであるため、アミノ酸残基の段階的付
加を伴う標準的な連鎖延長法と対比してDNA組換え法が
優れた合成法である。抽出および精製は可能であるが、
現時点では商業的に実現可能であるとは考えられない。
従つてbFGFをコードするDNA鎖をたとえばオリゴヌクレ
オチド合成法により入手し、この合成DNA鎖をクローニ
ングベクター内へ、その組換えクローニングベクターが
生体または細胞系に導入された際にその発現が保証され
る適切な位置に挿入する。内部ジスルフイド結合を含ま
ない合成bFGFポリペプチドまたはランダムにジスルフイ
ド結合したものが生物活性を示す。
本発明による薬剤組成物には、薬剤学的に受容できる
液体または固体キヤリヤーに分散したbFGF、bFGF同族
体、bFGFもしくは同族体bFGFの生物活性断片、またはそ
れらの無毒性塩類が含まれる。これらの薬剤組成物は臨
床医学（ヒトおよび動物の双方）において、診断または
治療の目的で短期間または長期間投与することにより使
用できる。bFGFはさらにインビトロ細胞増殖法に有用で
ある。同様に本発明の範囲内にあると考えられるもの
は、一方または両方の末端に追加セグメントが付加され
たペプチド、たとえばペプチドがDNA組換え技術により
調製される場合のベクター構築を考える際に生じるもの
である。ただしこの種の末端セグメントはペプチドの生
物活性を損わないものである。
液体または固体キヤリヤーに分散したbFGF、bFGF同族
体、bFGFもしくは同族体bFGFの生物活性断片、またはそ
れらの無毒性塩類が含まれる。これらの薬剤組成物は臨
床医学（ヒトおよび動物の双方）において、診断または
治療の目的で短期間または長期間投与することにより使
用できる。bFGFはさらにインビトロ細胞増殖法に有用で
ある。同様に本発明の範囲内にあると考えられるもの
は、一方または両方の末端に追加セグメントが付加され
たペプチド、たとえばペプチドがDNA組換え技術により
調製される場合のベクター構築を考える際に生じるもの
である。ただしこの種の末端セグメントはペプチドの生
物活性を損わないものである。
特定の好ましい形態の詳細な説明 本発明は第１の既知の純粋な哺乳動物bFGF、および合
成法によるその製法を提供する。ペプチドを定義するた
めに用いる命名法はシユレーダーおよびリユプケにより
“ペプチド”（アカデミツク・プレス、1965年）に詳述
されたものであり、その際一般的な表示法に従つてＮ末
端の遊離α−アミノ基をもつ残基を左側に示し、Ｃ末端
のα−カルボキシル基をもつ残基を右側に示す。アミノ
酸残基が異性体をもつ場合、表示されているのはＬ型の
アミノ酸である。本発明は、下記の構造を含む哺乳動物
塩基性線維芽細胞発育因子（bFGF）ポリペプチドのアミ
ノ酸配列、または該アミノ酸配列において１−３個のア
ミノ酸が置換されており、かつ線維芽細胞発育因子とし
て生物学的に活性なアミノ酸配列をコードするDNAを提
供する。
成法によるその製法を提供する。ペプチドを定義するた
めに用いる命名法はシユレーダーおよびリユプケにより
“ペプチド”（アカデミツク・プレス、1965年）に詳述
されたものであり、その際一般的な表示法に従つてＮ末
端の遊離α−アミノ基をもつ残基を左側に示し、Ｃ末端
のα−カルボキシル基をもつ残基を右側に示す。アミノ
酸残基が異性体をもつ場合、表示されているのはＬ型の
アミノ酸である。本発明は、下記の構造を含む哺乳動物
塩基性線維芽細胞発育因子（bFGF）ポリペプチドのアミ
ノ酸配列、または該アミノ酸配列において１−３個のア
ミノ酸が置換されており、かつ線維芽細胞発育因子とし
て生物学的に活性なアミノ酸配列をコードするDNAを提
供する。
天然分子のＣ末端がアミド化されているか否かは確実で
ない。この用途のためにはbFGFペプチドは146個のアミ
ノ酸残基配列をもつペプチドおよびその生物活性断片を
構成すると考えるべきである。
ない。この用途のためにはbFGFペプチドは146個のアミ
ノ酸残基配列をもつペプチドおよびその生物活性断片を
構成すると考えるべきである。
現在得られている証明からは連鎖のシステイン残基間
には内部ジスルフイド結合はないという可能性がきわめ
て大きい。しかし２個のシステイン残基が互いに内部ジ
スルフイド結合していてもよく、25位および69位の残基
が内部結合の候補であると思われる。可能性はないと思
われるが、ジスルフイド結合が２対のシステイン残基間
で行われてもよい。また１個または２個以上のシステイ
ン残基（内部ジスルフイド結合に関与しているものをい
ずれも除く）が遊離システインに結合していてもよい。
本発明は各システインが遊離の、あるいはランダムな内
部ジスルフイド結合を、すなわち25位と69位;25位と87
位;25位と92位:69位と87位;69位と92位;87位と92位;25
位と69位＋87位と92位;25位と87位＋69位と92位；およ
び25位と92位＋69位と87位の間でもつ、合成により製造
されたbFGFポリペプチドを包含するものとする。システ
イン残基が結合していないかまたはランダムに結合した
FGFペプチドの混合物は少なくとも若干の生物活性を示
す。bFGFすなわち“塩基性FGF"は9.6の塩基性PIをもつ
（約５の酸性pIをもつ酸性FGFと対比して）。
には内部ジスルフイド結合はないという可能性がきわめ
て大きい。しかし２個のシステイン残基が互いに内部ジ
スルフイド結合していてもよく、25位および69位の残基
が内部結合の候補であると思われる。可能性はないと思
われるが、ジスルフイド結合が２対のシステイン残基間
で行われてもよい。また１個または２個以上のシステイ
ン残基（内部ジスルフイド結合に関与しているものをい
ずれも除く）が遊離システインに結合していてもよい。
本発明は各システインが遊離の、あるいはランダムな内
部ジスルフイド結合を、すなわち25位と69位;25位と87
位;25位と92位:69位と87位;69位と92位;87位と92位;25
位と69位＋87位と92位;25位と87位＋69位と92位；およ
び25位と92位＋69位と87位の間でもつ、合成により製造
されたbFGFポリペプチドを包含するものとする。システ
イン残基が結合していないかまたはランダムに結合した
FGFペプチドの混合物は少なくとも若干の生物活性を示
す。bFGFすなわち“塩基性FGF"は9.6の塩基性PIをもつ
（約５の酸性pIをもつ酸性FGFと対比して）。
いずれにしろDNA組換えにより製造されるbFGFポリペ
プチドは本来生物活性を示す。これは細胞内でbFGFがと
ると推定される三次元構造がレセプターにより認識され
る構造だからであると思われる。この分子が自然の折た
たみにより、また水性媒体との疎水性および親水性相互
作用によりとると推定される三次元構造は、システイン
残基間の目的とする結合または非結合を促進するであろ
う。また細胞内における酵素制御機構も特定のシステイ
ン残基間の結合を阻止することにより、またはジスルフ
イド結合を指示することにより、目的とするジスルフイ
ド結合または非結合が確保されるのを補助するであろ
う。酵素はまた“不適正な”結合を開裂して、分子自体
が再配列し、適正な天然構造をとるのを可能にすると思
われる。内部結合していないシステイン残基は遊離シス
テイン部分にジスルフイド結合していてもよい。分子の
三次元構造はシステイン残基相互のまたは遊離システイ
ンへのランダム結合または非結合が蛋白質分子の生物学
的構造に実質的な影響を与えないものであるとも考えら
れる。
プチドは本来生物活性を示す。これは細胞内でbFGFがと
ると推定される三次元構造がレセプターにより認識され
る構造だからであると思われる。この分子が自然の折た
たみにより、また水性媒体との疎水性および親水性相互
作用によりとると推定される三次元構造は、システイン
残基間の目的とする結合または非結合を促進するであろ
う。また細胞内における酵素制御機構も特定のシステイ
ン残基間の結合を阻止することにより、またはジスルフ
イド結合を指示することにより、目的とするジスルフイ
ド結合または非結合が確保されるのを補助するであろ
う。酵素はまた“不適正な”結合を開裂して、分子自体
が再配列し、適正な天然構造をとるのを可能にすると思
われる。内部結合していないシステイン残基は遊離シス
テイン部分にジスルフイド結合していてもよい。分子の
三次元構造はシステイン残基相互のまたは遊離システイ
ンへのランダム結合または非結合が蛋白質分子の生物学
的構造に実質的な影響を与えないものであるとも考えら
れる。
bFGFアミノ酸残基配列をもつ蛋白質を組換えDNAによ
り合成するためには、bFGFを暗号化する二重鎖DNAを合
成により構成する。bFGFを暗号化するDNA鎖のセグメン
トはもちろん遺伝暗号に従つてデザインされるが、遺伝
暗号の縮重のため、生成物ポリペプチドを暗号化するDN
A鎖を形成するために多様な組合わせのコドンを選ぶこ
とができる。ある特定のコドンがある型の生物において
ポリペプチドの発現にとつてより効果であることが知ら
れており、コドンの選択は組換えベクターの宿主として
使われる予定の種類の生体における発現に最も有効なコ
ドンに従つて行うことが好ましい。しかし適正なコドン
の組合わせであればいずれも、若干効率が劣るとしても
生成物を暗号化するであろう。コドンの選択は考慮され
るベクターの構成にも依存するであろう。合成DNA鎖を
挿入したのちに、制限部位において開裂する制限酵素を
用いてベクターを操作したい場合は、DNA鎖内にこの種
の制限部位を置くのを避ける必要があろう。またこのDN
A鎖を含む組換えベクターにより形質転換される予定の
宿主生物がこのDNA鎖内で開裂する制限酵素を産生する
ことが知られている場合も、DNA鎖内に制限部位を置く
ことを避ける必要がある。
り合成するためには、bFGFを暗号化する二重鎖DNAを合
成により構成する。bFGFを暗号化するDNA鎖のセグメン
トはもちろん遺伝暗号に従つてデザインされるが、遺伝
暗号の縮重のため、生成物ポリペプチドを暗号化するDN
A鎖を形成するために多様な組合わせのコドンを選ぶこ
とができる。ある特定のコドンがある型の生物において
ポリペプチドの発現にとつてより効果であることが知ら
れており、コドンの選択は組換えベクターの宿主として
使われる予定の種類の生体における発現に最も有効なコ
ドンに従つて行うことが好ましい。しかし適正なコドン
の組合わせであればいずれも、若干効率が劣るとしても
生成物を暗号化するであろう。コドンの選択は考慮され
るベクターの構成にも依存するであろう。合成DNA鎖を
挿入したのちに、制限部位において開裂する制限酵素を
用いてベクターを操作したい場合は、DNA鎖内にこの種
の制限部位を置くのを避ける必要があろう。またこのDN
A鎖を含む組換えベクターにより形質転換される予定の
宿主生物がこのDNA鎖内で開裂する制限酵素を産生する
ことが知られている場合も、DNA鎖内に制限部位を置く
ことを避ける必要がある。
合成されるDNA鎖は、bFGF暗号化配列のほかに考慮さ
れるベクター構成に応じて付加的配列を含んでいてもよ
い。一般にDNA鎖はその末端にクローニングベクター内
の制限部位への挿入を容易にするリンカーを含むように
合成される。DNA鎖は融合ポリペプチドの一部としてbFG
Fアミノ酸配列を暗号化すべく構成されていてもよい。
この場合、これは一般に蛋白分解プロセシング部位とし
て作用するアミノ酸残基配列を暗号化する末端配列を含
み、これによりbFGFポリペプチドは融合蛋白質の残部か
ら蛋白質分解により除去されるであろう。
れるベクター構成に応じて付加的配列を含んでいてもよ
い。一般にDNA鎖はその末端にクローニングベクター内
の制限部位への挿入を容易にするリンカーを含むように
合成される。DNA鎖は融合ポリペプチドの一部としてbFG
Fアミノ酸配列を暗号化すべく構成されていてもよい。
この場合、これは一般に蛋白分解プロセシング部位とし
て作用するアミノ酸残基配列を暗号化する末端配列を含
み、これによりbFGFポリペプチドは融合蛋白質の残部か
ら蛋白質分解により除去されるであろう。
合成DNA鎖の末端部分には適宜な開始シグナルおよび終
止シグナルが含まれていてもよい。
止シグナルが含まれていてもよい。
bFGF−暗号化DNA鎖を組立てるために、オリゴヌクレ
オチドを常法により、たとえばテイー・マナチスらのコ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・マニユ
アル（コールド・スプリング・ハーバー・ニユーヨー
ク、1982年）（以下CSH）に記載された方法により構成
する。ヌクレオチド残基70個までの長さのセンス（有
意）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を、好ま
しくは自動合成装置、たとえばアプライド・バイオシス
テムズ社、380A型DNA合成装置により合成する。オリゴ
ヌクレオチド鎖はセンスオリゴヌクレオチドとアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの部分がオーバーラツプし、相
補的塩基対間で互いに水素結合により会合し、これによ
り大部分の場合は連鎖間にギヤツプをもつ二重鎖を形成
すべく構成される。次いで連鎖間のギヤツプが埋めら
れ、各鎖のオリゴヌクレオチドが末端同志でヌクレオチ
ドトリホスフエートにより適宜なDNAポリメラーゼの存
在下で、および／またはリガーゼにより結合する。
オチドを常法により、たとえばテイー・マナチスらのコ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・マニユ
アル（コールド・スプリング・ハーバー・ニユーヨー
ク、1982年）（以下CSH）に記載された方法により構成
する。ヌクレオチド残基70個までの長さのセンス（有
意）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を、好ま
しくは自動合成装置、たとえばアプライド・バイオシス
テムズ社、380A型DNA合成装置により合成する。オリゴ
ヌクレオチド鎖はセンスオリゴヌクレオチドとアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの部分がオーバーラツプし、相
補的塩基対間で互いに水素結合により会合し、これによ
り大部分の場合は連鎖間にギヤツプをもつ二重鎖を形成
すべく構成される。次いで連鎖間のギヤツプが埋めら
れ、各鎖のオリゴヌクレオチドが末端同志でヌクレオチ
ドトリホスフエートにより適宜なDNAポリメラーゼの存
在下で、および／またはリガーゼにより結合する。
オリゴヌクレオチド合成により合成DNA鎖を構成する
代わりに、bFGFに対応するcDNAを製造することができ
る。cDNAライブラリーまたは発現ライブラリーは常法に
より逆転写法によつてbFGF産生細胞系由来のメツセンジ
ヤーRNA（mRNA）から調製される。bFGF配列を含むクロ
ーンを選択するためには、FGF蛋白質の部分に対応する
ハイブリダイゼーシヨンプローブ（好ましくは遺伝暗号
の縮重に順応するために混合プローブ）を調製し、この
種の配列を含むクローンの同定に用いる。FGF抗体を用
いる発現ライブラリーのスクリーニング法も単独で、ま
たはハイブリダイゼーシヨンプロービング法と組合わせ
て採用でき、これによりDNAライブラリークローン中のb
FGF暗号化DNA配列の存在を同定または確認する。この種
の方法はたとえば前掲のCHSに教示されている。
代わりに、bFGFに対応するcDNAを製造することができ
る。cDNAライブラリーまたは発現ライブラリーは常法に
より逆転写法によつてbFGF産生細胞系由来のメツセンジ
ヤーRNA（mRNA）から調製される。bFGF配列を含むクロ
ーンを選択するためには、FGF蛋白質の部分に対応する
ハイブリダイゼーシヨンプローブ（好ましくは遺伝暗号
の縮重に順応するために混合プローブ）を調製し、この
種の配列を含むクローンの同定に用いる。FGF抗体を用
いる発現ライブラリーのスクリーニング法も単独で、ま
たはハイブリダイゼーシヨンプロービング法と組合わせ
て採用でき、これによりDNAライブラリークローン中のb
FGF暗号化DNA配列の存在を同定または確認する。この種
の方法はたとえば前掲のCHSに教示されている。
二重鎖bFGF暗号化DNA鎖は特定の適宜なクローニング
ベクター中への挿入を考慮に入れて構成または修飾され
る。組換えられてDNA鎖を取込む予定のクローニングベ
クターは宿主である生物または細胞系におけるその生存
能および発現性に合わせて選ばれ、DNA鎖挿入法はその
宿主に特有の因子に依存する。たとえばDNA鎖を原核細
胞、たとえば大腸菌（E.Coli）に用いるベクター中へ挿
入したい場合は、DNA鎖はプロモーター配列、すなわち
５′側の非翻訳領域内にあるシヤイン−ダルガルノ配列
（またはリボソーム結合部位）およびATG開始コドンの
３′側に挿入されるであろう。ATG開始コドンはシヤイ
ン−ダルガルノ配列から適宜間隔を置いて配置され、暗
号化配列はATG開始コドンを含む適正な読み枠内に配置
される。クローニングベクターは３′側非翻訳領域およ
び翻訳終止部位をも備えている。真核細胞、たとえば酵
母細胞または高等動物から得た細胞系内に挿入するため
には、bFGF暗号化オリゴヌクレオチド配列はキヤツピン
グ部位から適宜間隔を置いて、かつATG開始シグナルを
含む適正な読み枠内に配置される。クローニングベクタ
ーは３′側非翻訳領域および翻訳終止部位をも備えてい
る。
ベクター中への挿入を考慮に入れて構成または修飾され
る。組換えられてDNA鎖を取込む予定のクローニングベ
クターは宿主である生物または細胞系におけるその生存
能および発現性に合わせて選ばれ、DNA鎖挿入法はその
宿主に特有の因子に依存する。たとえばDNA鎖を原核細
胞、たとえば大腸菌（E.Coli）に用いるベクター中へ挿
入したい場合は、DNA鎖はプロモーター配列、すなわち
５′側の非翻訳領域内にあるシヤイン−ダルガルノ配列
（またはリボソーム結合部位）およびATG開始コドンの
３′側に挿入されるであろう。ATG開始コドンはシヤイ
ン−ダルガルノ配列から適宜間隔を置いて配置され、暗
号化配列はATG開始コドンを含む適正な読み枠内に配置
される。クローニングベクターは３′側非翻訳領域およ
び翻訳終止部位をも備えている。真核細胞、たとえば酵
母細胞または高等動物から得た細胞系内に挿入するため
には、bFGF暗号化オリゴヌクレオチド配列はキヤツピン
グ部位から適宜間隔を置いて、かつATG開始シグナルを
含む適正な読み枠内に配置される。クローニングベクタ
ーは３′側非翻訳領域および翻訳終止部位をも備えてい
る。
原核生物形質転換ベクター、たとえばpBR322,pMB9,Co
l El,pCR1,RP4およびラムダフアージが、bFGFを暗号化
しかつ暗号化されたポリペプチドを少なくとも若干は発
現することが実質的に保証される長さのDNA鎖を挿入す
るために用いられる。一般にこの種のベクターはプロモ
ーター、たとえばlacプロモーターに対して適切な位置
にある特異的制限部位をもつべく構成または修飾されて
いる。DNA鎖はこの制限部位内へ適宜なリンカーにより
挿入され、組換えベクターにより形質転換された原核細
胞系におけるbFGFの産生が実質的に保証される。適正な
読み枠を保証するために、種々の長さのリンカーをbFGF
暗号化配列の末端に備えることができる。あるいはIacZ
遺伝子の５′側領域（オペレーター、プロモーター、転
写開始部位、シヤイン−ダルガルノ配列、および翻訳開
始シグナルを含む）、トリプトフアン遺伝子からの制御
領域（trpオペレーター、プロモーター、リボソーム結
合部位および翻訳イニシエーター）、およびこれら２プ
ロモーターを含むtrp−lacもしくは一般にTacプロモー
ターと呼ばれる融合遺伝子などの配列を含むカセツトを
入手し、これに合成DNAを好都合に挿入し、次いでこの
カセツトを選ばれたクローニングベクターに挿入するこ
とができる。
l El,pCR1,RP4およびラムダフアージが、bFGFを暗号化
しかつ暗号化されたポリペプチドを少なくとも若干は発
現することが実質的に保証される長さのDNA鎖を挿入す
るために用いられる。一般にこの種のベクターはプロモ
ーター、たとえばlacプロモーターに対して適切な位置
にある特異的制限部位をもつべく構成または修飾されて
いる。DNA鎖はこの制限部位内へ適宜なリンカーにより
挿入され、組換えベクターにより形質転換された原核細
胞系におけるbFGFの産生が実質的に保証される。適正な
読み枠を保証するために、種々の長さのリンカーをbFGF
暗号化配列の末端に備えることができる。あるいはIacZ
遺伝子の５′側領域（オペレーター、プロモーター、転
写開始部位、シヤイン−ダルガルノ配列、および翻訳開
始シグナルを含む）、トリプトフアン遺伝子からの制御
領域（trpオペレーター、プロモーター、リボソーム結
合部位および翻訳イニシエーター）、およびこれら２プ
ロモーターを含むtrp−lacもしくは一般にTacプロモー
ターと呼ばれる融合遺伝子などの配列を含むカセツトを
入手し、これに合成DNAを好都合に挿入し、次いでこの
カセツトを選ばれたクローニングベクターに挿入するこ
とができる。
同様に真核生物形質転換ベクター、たとえばクローン
化ウシ乳頭腫ウイルスゲノム、マウスレトロウイルスの
クローン化ゲノム、および真核生物カセツト、たとえば
pSV−2gpt系（ムリガンおよびベルグにより、ネイチヤ
ー277、108−114頁、1979に記載されている）、オカヤ
マ−ベルグクローニング系（モレ・セル・バイオロ（Mo
l.Cell.Biol.）２、161−170、1982）、最近ジエネテイ
ツクス・インステイチユートにより報告された発現クロ
ーニングベクター（サイエンス228、810−815、1985）
が入手でき、これらは形質転換した真核細胞系において
少なくとも若干のbFGF発現を実質的に保証する。
化ウシ乳頭腫ウイルスゲノム、マウスレトロウイルスの
クローン化ゲノム、および真核生物カセツト、たとえば
pSV−2gpt系（ムリガンおよびベルグにより、ネイチヤ
ー277、108−114頁、1979に記載されている）、オカヤ
マ−ベルグクローニング系（モレ・セル・バイオロ（Mo
l.Cell.Biol.）２、161−170、1982）、最近ジエネテイ
ツクス・インステイチユートにより報告された発現クロ
ーニングベクター（サイエンス228、810−815、1985）
が入手でき、これらは形質転換した真核細胞系において
少なくとも若干のbFGF発現を実質的に保証する。
FGFまたは同様な長さのポリペプチドを確実に産生す
るために好都合な方法は、そのポリペプチドをまず遺伝
子暗号化された融合ポリペプチドのセグメントとして調
製することである。この場合、発現ポリペプチドがbFGF
アミノ酸残基配列の側方に位置する酵素プロセシング部
位をもつべくDNA鎖を構成する。bFGF暗号化DNA鎖をたと
えば大腸菌内への挿入のためβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子中へ挿入することができ、この場合発現された融合ポ
リペプチドは次いで蛋白質分解酵素により開裂され、β
−ガラクトシダーゼペプチド配列からbFGFが放出され
る。
るために好都合な方法は、そのポリペプチドをまず遺伝
子暗号化された融合ポリペプチドのセグメントとして調
製することである。この場合、発現ポリペプチドがbFGF
アミノ酸残基配列の側方に位置する酵素プロセシング部
位をもつべくDNA鎖を構成する。bFGF暗号化DNA鎖をたと
えば大腸菌内への挿入のためβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子中へ挿入することができ、この場合発現された融合ポ
リペプチドは次いで蛋白質分解酵素により開裂され、β
−ガラクトシダーゼペプチド配列からbFGFが放出され
る。
bFGF配列が開裂可能な融合ポリペプチドセグメントと
して、たとえばβ−ガラクトシダーゼペプチド配列内に
融合したbFGFペプチド配列として発現されるべくbFGF暗
号化配列を挿入する利点は、bFGF配列が挿入される内性
ポリペプチドが一般に非機能性となり、これにより融合
ペプチドを暗号化するベクターの選択が容易になること
である。
して、たとえばβ−ガラクトシダーゼペプチド配列内に
融合したbFGFペプチド配列として発現されるべくbFGF暗
号化配列を挿入する利点は、bFGF配列が挿入される内性
ポリペプチドが一般に非機能性となり、これにより融合
ペプチドを暗号化するベクターの選択が容易になること
である。
実施例１ ウシの塩基性FGFの構造を下記により決定した。
凍結したウシ下垂体をウエアリングブレンダーにより
５分間、0.15M硫酸アンモニウム（4l/kg・組織）中でホ
モジナイズした。次いでHClを4.5に調整し、ホモジネー
トを２時間激しく攪拌した。遠心分離（18,000×ｇ、30
分間）したのち上清を保持し、上清１当たり230gの硫
酸アンモニウムを添加した。NaOHによりpHを６〜6.5に
調整し、15時間沈殿させた。反応混合物を遠心分離（1
8,000×ｇ、30分間）したのち、上清を保持し、上清１
当たり300gの硫酸アンモニウムを添加し、次いで混合
物を２時間、十分に攪拌した。反応混合物を遠心分離
（18,000×ｇ、30分間）したのち、ペレツトを保持し、
原料組織3Kgからの累積ペレツトを蒸留水200mlに溶解
し、蒸留水20lに対して一夜透析した。次いで透析保持
液のpHを６に調整し、溶液を遠心分離（12,000×ｇ、30
分間）により清澄化した。透析保持液は透析抽出液を構
成する。
５分間、0.15M硫酸アンモニウム（4l/kg・組織）中でホ
モジナイズした。次いでHClを4.5に調整し、ホモジネー
トを２時間激しく攪拌した。遠心分離（18,000×ｇ、30
分間）したのち上清を保持し、上清１当たり230gの硫
酸アンモニウムを添加した。NaOHによりpHを６〜6.5に
調整し、15時間沈殿させた。反応混合物を遠心分離（1
8,000×ｇ、30分間）したのち、上清を保持し、上清１
当たり300gの硫酸アンモニウムを添加し、次いで混合
物を２時間、十分に攪拌した。反応混合物を遠心分離
（18,000×ｇ、30分間）したのち、ペレツトを保持し、
原料組織3Kgからの累積ペレツトを蒸留水200mlに溶解
し、蒸留水20lに対して一夜透析した。次いで透析保持
液のpHを６に調整し、溶液を遠心分離（12,000×ｇ、30
分間）により清澄化した。透析保持液は透析抽出液を構
成する。
次いで、透析および澄明化した抽出液から順次３処理
法により塩基性FGFを単離した。これらのうち２種は前
記のように一般のイオン交換および逆相HPLC精製工程を
伴うものであつた（ピー・ボーレンら、プロシ．ナシヨ
ナル・アカデ・サイ．ユー・エス・エー（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA）81.5364−5368（1984））。第３の方法は
以下にそれらを実施する順序で詳述するように、重要な
精製工程でヘパリン−セフアロースアフイニテイクロマ
トグラフイーを用いる。
法により塩基性FGFを単離した。これらのうち２種は前
記のように一般のイオン交換および逆相HPLC精製工程を
伴うものであつた（ピー・ボーレンら、プロシ．ナシヨ
ナル・アカデ・サイ．ユー・エス・エー（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA）81.5364−5368（1984））。第３の方法は
以下にそれらを実施する順序で詳述するように、重要な
精製工程でヘパリン−セフアロースアフイニテイクロマ
トグラフイーを用いる。
（Ａ）CM−セフアデツクス（C50）イオン交換クロマト
グラフイー カルボキシメチルセフアデツクス（C50）の７×6cmの
カラムを１の50mMリン酸ナトリウム、1.5M塩化ナトリ
ウム（pH6.0）で洗浄し、次いで0.1Mリン酸ナトリウム
（pH6.0）で平衡化した。ウシ下垂体3Kgからの透析抽出
液をカラムに装入し、ａ）NaCl不含、ｂ）0.2M・NaCl含
有およびｃ）0.65M・NaCl含有0.1Mリン酸ナトリウム（p
H6.0）で順次洗浄し、その際それぞれ新たな洗浄を開始
する前にOD280値を最小値に到達させた。18mlずつの画
分を４℃で3ml/分において採取し、ラジオイムノアツセ
イを行つた。
グラフイー カルボキシメチルセフアデツクス（C50）の７×6cmの
カラムを１の50mMリン酸ナトリウム、1.5M塩化ナトリ
ウム（pH6.0）で洗浄し、次いで0.1Mリン酸ナトリウム
（pH6.0）で平衡化した。ウシ下垂体3Kgからの透析抽出
液をカラムに装入し、ａ）NaCl不含、ｂ）0.2M・NaCl含
有およびｃ）0.65M・NaCl含有0.1Mリン酸ナトリウム（p
H6.0）で順次洗浄し、その際それぞれ新たな洗浄を開始
する前にOD280値を最小値に到達させた。18mlずつの画
分を４℃で3ml/分において採取し、ラジオイムノアツセ
イを行つた。
（Ｂ）ヘパリン−セフアロースクロマトグラフイー CM−セフアデツクスクロマトグラフイーよりの0.65M
・NaCl溶出液を、あらかじめ10mMトリス−HCl、0.6M・N
aCl（pH7.0）により室温で平衡化したヘパリン−セフア
ロース（フアルマシア）の３×3cmのカラムに装入し
た。次いでカラムを順次ａ）0.6M・NaClおよびｂ）1.1M
・NaClを含有する10mMトリス−HCl（pH7.0）で洗浄し、
その際各洗浄によりOD280を最小値に到達させた。次い
で1.1M・NaCl100mlおよび2M・NaCl100mlを含有する10mM
トリス−HCl（pH7.0）における連続グラジエントにより
塩基性FGFを溶離した。5mlずつの画分を0.8ml/分で採取
し、ラジオイムノアツセイを行つた。
・NaCl溶出液を、あらかじめ10mMトリス−HCl、0.6M・N
aCl（pH7.0）により室温で平衡化したヘパリン−セフア
ロース（フアルマシア）の３×3cmのカラムに装入し
た。次いでカラムを順次ａ）0.6M・NaClおよびｂ）1.1M
・NaClを含有する10mMトリス−HCl（pH7.0）で洗浄し、
その際各洗浄によりOD280を最小値に到達させた。次い
で1.1M・NaCl100mlおよび2M・NaCl100mlを含有する10mM
トリス−HCl（pH7.0）における連続グラジエントにより
塩基性FGFを溶離した。5mlずつの画分を0.8ml/分で採取
し、ラジオイムノアツセイを行つた。
（Ｃ）逆相液体クロマトグラフイー ヘパリン−セフアロースクロマトグラフイーよりの塩
基性FGFをバイダツク（Vydac）Ｃ−４（0.46×25cm）逆
相カラム（ザ・セパレーシヨンズ・グループ社）上に0.
1％トリフルオル酢酸（TFA）／アセトニトリル溶剤系を
用いてポンプ送入し（エフ・エス・エツシユら、メソツ
ズ・イン・エンザイモロ。（Methods in Enzymol.）
（ピー・コン編）103、アカデミツク・プレス・ニユー
ヨーク、72−89頁（1983年））、0.6ml/分で23％から35
％までのアセトニトリルの90分濃度勾配により溶離し
た。3mlずつの画分を室温で採取し、ラジオイムノアツ
セイを行つた。
基性FGFをバイダツク（Vydac）Ｃ−４（0.46×25cm）逆
相カラム（ザ・セパレーシヨンズ・グループ社）上に0.
1％トリフルオル酢酸（TFA）／アセトニトリル溶剤系を
用いてポンプ送入し（エフ・エス・エツシユら、メソツ
ズ・イン・エンザイモロ。（Methods in Enzymol.）
（ピー・コン編）103、アカデミツク・プレス・ニユー
ヨーク、72−89頁（1983年））、0.6ml/分で23％から35
％までのアセトニトリルの90分濃度勾配により溶離し
た。3mlずつの画分を室温で採取し、ラジオイムノアツ
セイを行つた。
塩基性FGFに関する上記ラジオイムノアツセイ（RIA）
においては、塩基性FGFのアミノ末端配列の合成同族体
〔Tyr10〕FGF（１−10）（ウシ血清アルブミンに結合さ
せたもの）に対する抗体を産生させ、次いで塩基性FGF
に関するラジオイムノアツセイの実施に用いた（エー・
ベアードら、レギユラトリー・ペプチズ10、309−317
（1985）の記載に従う。）。
においては、塩基性FGFのアミノ末端配列の合成同族体
〔Tyr10〕FGF（１−10）（ウシ血清アルブミンに結合さ
せたもの）に対する抗体を産生させ、次いで塩基性FGF
に関するラジオイムノアツセイの実施に用いた（エー・
ベアードら、レギユラトリー・ペプチズ10、309−317
（1985）の記載に従う。）。
修飾されていないシステインをアミノ酸分析により定
量するのは不可能であるから、システイン残基を下記の
ように還元および〔14C〕ヨードアセトアミド（ニユー
イングランド・ニユークリアー）によりアルキル化する
か、ある過蟻酸で酸化することにより修飾した。いずれ
の場合も0.1％TFA/アセトニトリル中のFGFを1.5mlのポ
リプロピレン製微量遠心管中でスピード・バツク（Spee
d Vac）真空遠心分離機（サバント社）により、修飾直
前に乾燥させた。
量するのは不可能であるから、システイン残基を下記の
ように還元および〔14C〕ヨードアセトアミド（ニユー
イングランド・ニユークリアー）によりアルキル化する
か、ある過蟻酸で酸化することにより修飾した。いずれ
の場合も0.1％TFA/アセトニトリル中のFGFを1.5mlのポ
リプロピレン製微量遠心管中でスピード・バツク（Spee
d Vac）真空遠心分離機（サバント社）により、修飾直
前に乾燥させた。
システイン残基を放射性標識して後続の開裂反応によ
る断片のいずれがシステイン残基を含むかを判定するの
を可能にするために、システイン残基を還元およびアル
キル化した。乾燥beFGFを0.1mlの脱酸素した0.5Mトリス
−HCl（pH7.7）、10mM・EDTA、6Mグアニジン−HClに溶
解した。ジチオトレイトールを最終濃度５〜10mMになる
まで添加し、37℃で30分間還元を進行させた。総スルフ
ヒドリル基よりも0.5倍モル過剰の〔14C〕ヨードアセト
アミド（24mCi/ミリモル）を添加し、37℃において60分
間、暗所でインキユベーシヨンを行つた。ヨードアセト
アミドよりも大過剰のジチオトレイトールの添加により
アルキル化反応を停止させ、アルキル化FGFを逆相高性
能液体クロマトグラフイーにより精製した。
る断片のいずれがシステイン残基を含むかを判定するの
を可能にするために、システイン残基を還元およびアル
キル化した。乾燥beFGFを0.1mlの脱酸素した0.5Mトリス
−HCl（pH7.7）、10mM・EDTA、6Mグアニジン−HClに溶
解した。ジチオトレイトールを最終濃度５〜10mMになる
まで添加し、37℃で30分間還元を進行させた。総スルフ
ヒドリル基よりも0.5倍モル過剰の〔14C〕ヨードアセト
アミド（24mCi/ミリモル）を添加し、37℃において60分
間、暗所でインキユベーシヨンを行つた。ヨードアセト
アミドよりも大過剰のジチオトレイトールの添加により
アルキル化反応を停止させ、アルキル化FGFを逆相高性
能液体クロマトグラフイーにより精製した。
システインの過蟻酸酸化によりシステインをシステイ
ン酸に変え、蛋白質のシステイン酸含量をアミノ酸分析
により測定することができる。過蟻酸は蒸留した蟻酸9m
lを30％H2O21mlと共に室温で密栓した試験管内において
１時間インキユベートすることにより発生させた。この
溶液0.25mlを用いて乾燥FGF（５〜15モル）を溶解し、
０℃で2.5時間酸化を続行した。蒸留水からの凍結乾燥
を４回行つて、反応の副生物を除去した。
ン酸に変え、蛋白質のシステイン酸含量をアミノ酸分析
により測定することができる。過蟻酸は蒸留した蟻酸9m
lを30％H2O21mlと共に室温で密栓した試験管内において
１時間インキユベートすることにより発生させた。この
溶液0.25mlを用いて乾燥FGF（５〜15モル）を溶解し、
０℃で2.5時間酸化を続行した。蒸留水からの凍結乾燥
を４回行つて、反応の副生物を除去した。
塩基性FGF（システインが上記各方法により修飾され
たもの）を蛋白分解により、また化学的に消化して、後
続の分析（配列分析を含む）のための断片を得た。消化
前にいずれの場合もFGFをポリプロピレン製微量遠心管
中でスピード・バク真空遠心分離機により揮発性RP−HP
LC溶剤から乾燥させた。
たもの）を蛋白分解により、また化学的に消化して、後
続の分析（配列分析を含む）のための断片を得た。消化
前にいずれの場合もFGFをポリプロピレン製微量遠心管
中でスピード・バク真空遠心分離機により揮発性RP−HP
LC溶剤から乾燥させた。
多数のオーバーラツプしたFGF断片を得るために、bFG
F（システインが上記各方法により修飾されたもの）に
つき３種の蛋白分解法による消化を下記に従つて行つ
た。乾燥FGF（１〜５ナノモル）を0.01mlの0.5MトリスH
Cl（pH7.7）、10mM・EDTA、6Mグアニジン−HClに溶解
し、次いで１％NH4HCO3により1mlに希釈した。顎下腺プ
ロテアーゼまたはキモトリプシンを1/50（W/W）の比で
添加し、一方黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureu
s）V8を用いる消化には1:35（モル：モル）比の酵素対
基質を用いた。顎下腺プロテアーゼはアルギニンのＣ末
端で開裂させ、黄色ブドウ球菌V8はグルタミン酸のＣ末
端で開裂させ、キモトリプシンは崇高な芳香族ないしは
疎水性の基をもつ数種のアミノ酸残基のＣ末端で開裂さ
せる。インキユベーシヨンは37℃で一夜行われた。
F（システインが上記各方法により修飾されたもの）に
つき３種の蛋白分解法による消化を下記に従つて行つ
た。乾燥FGF（１〜５ナノモル）を0.01mlの0.5MトリスH
Cl（pH7.7）、10mM・EDTA、6Mグアニジン−HClに溶解
し、次いで１％NH4HCO3により1mlに希釈した。顎下腺プ
ロテアーゼまたはキモトリプシンを1/50（W/W）の比で
添加し、一方黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureu
s）V8を用いる消化には1:35（モル：モル）比の酵素対
基質を用いた。顎下腺プロテアーゼはアルギニンのＣ末
端で開裂させ、黄色ブドウ球菌V8はグルタミン酸のＣ末
端で開裂させ、キモトリプシンは崇高な芳香族ないしは
疎水性の基をもつ数種のアミノ酸残基のＣ末端で開裂さ
せる。インキユベーシヨンは37℃で一夜行われた。
蛋白質をMetのＣ末端で開裂させる臭化シアンによる
消化を下記に従つてbFGF（システインが上記各方法によ
り修飾されたもの）について行つた。乾燥させ、アルキ
ル化したFGF（５〜６ナノモル）を70％蟻酸0.05mlによ
り溶解し、７％蟻酸中の2.9M・Ｎ−メチルメルカプトア
セトアミドの溶液中で37℃において24時間還元した（ア
ール・ハフテンら、メソツズ・イン・エンザイモロ．
（Methods in Enzymol.）（シー・ヒルスおよびエス・
テイマシエフ編）91、アカデミツク・プレス・ニユーヨ
ーク、549−559頁（1983年））。アルキル化され、還元
されたFGFをRR−HPLCにより精製し、スピード・バク真
空遠心分離機で乾燥させ、脱酸素した70％蟻酸0.1mlに
再溶解した。100倍過剰の臭化シアンを添加し、室温で
暗所において一夜インキユベーシヨンを続けた。
消化を下記に従つてbFGF（システインが上記各方法によ
り修飾されたもの）について行つた。乾燥させ、アルキ
ル化したFGF（５〜６ナノモル）を70％蟻酸0.05mlによ
り溶解し、７％蟻酸中の2.9M・Ｎ−メチルメルカプトア
セトアミドの溶液中で37℃において24時間還元した（ア
ール・ハフテンら、メソツズ・イン・エンザイモロ．
（Methods in Enzymol.）（シー・ヒルスおよびエス・
テイマシエフ編）91、アカデミツク・プレス・ニユーヨ
ーク、549−559頁（1983年））。アルキル化され、還元
されたFGFをRR−HPLCにより精製し、スピード・バク真
空遠心分離機で乾燥させ、脱酸素した70％蟻酸0.1mlに
再溶解した。100倍過剰の臭化シアンを添加し、室温で
暗所において一夜インキユベーシヨンを続けた。
修飾されたbFGFおよびそれらの消化断片の逆相高性能
液体クロマトグラフイー精製をブラウンリー（Brownle
e）RP−300逆相カラム（0.46×25cm）および0.1％TFA/
アセトニトリルもしくは0.1％ヘプタフルオル酪酸（HFB
A）／アセトニトリル溶剤系を用いて行つた（エツシユ
ら（1983）前掲）。
液体クロマトグラフイー精製をブラウンリー（Brownle
e）RP−300逆相カラム（0.46×25cm）および0.1％TFA/
アセトニトリルもしくは0.1％ヘプタフルオル酪酸（HFB
A）／アセトニトリル溶剤系を用いて行つた（エツシユ
ら（1983）前掲）。
無傷のbFGFおよびその消化断片のアミノ酸分析および
気相微量配列分析を前記方法により行つた（ピー・ボー
レンら、アナリ．バイオケミ．（Anal.Biochem）126、1
44−152（1982）；エフ・エス・エツシユ、アナリ・バ
イオケミ.136、39−47（1984））。PhNCS−（14C）−カ
ルボキシアミドメチルシステインを配列分析に際し配列
分析器からの残渣の液体シンチレーシヨン計数により同
定した。一定サイクルにおけるシステイン酸の同定をペ
プチドおよびその配列の残部のアミノ酸組成の比較によ
り行つた（エドマン分解により判定）。カルボキシペプ
チダーゼＹはパースから入手され、同製造業者の指示に
従つて使用された。トリチウムの取込みによるカルボキ
シル末端分析を前記により行つた（エツチ・マツオら、
蛋白質配列決定（エス・ビー・ニードルマン編）スプリ
ンガー・フエルラーク、ニユーヨーク、104−113頁（19
79年））。
気相微量配列分析を前記方法により行つた（ピー・ボー
レンら、アナリ．バイオケミ．（Anal.Biochem）126、1
44−152（1982）；エフ・エス・エツシユ、アナリ・バ
イオケミ.136、39−47（1984））。PhNCS−（14C）−カ
ルボキシアミドメチルシステインを配列分析に際し配列
分析器からの残渣の液体シンチレーシヨン計数により同
定した。一定サイクルにおけるシステイン酸の同定をペ
プチドおよびその配列の残部のアミノ酸組成の比較によ
り行つた（エドマン分解により判定）。カルボキシペプ
チダーゼＹはパースから入手され、同製造業者の指示に
従つて使用された。トリチウムの取込みによるカルボキ
シル末端分析を前記により行つた（エツチ・マツオら、
蛋白質配列決定（エス・ビー・ニードルマン編）スプリ
ンガー・フエルラーク、ニユーヨーク、104−113頁（19
79年））。
前記の効率の高い精製法によつて大量の（約30〜60ナ
ノモル／週）高純度塩基性FGFがウシ下垂体から迅速単
離された。この供給源は構造決定作業の助けとなつた。
ヘパリン−セフアロースアフイニテイクロマトグラフイ
ー精製工程により、２種の生物活性および塩基性FGF免
疫反応性細胞分裂促進物質が数千倍に精製された。これ
らは約1.4Mおよび1.95M・NaClにより溶出した。一工程
のRP−HPLCによりそれぞれの場合ペプチドが均質化され
た。NaDodSO4PAGEにより両種について等しい分子量推定
値が得られ、気相微量配列分析により両者は各ポリペプ
チドの少なくともアミノ末端24個の残基全体について等
しいアミノ末端アミノ酸配列をもつことが示された。下
垂体抽出物は1.4M・NaClで溶出する細胞分裂促進物質を
その後溶出する種よりも約15倍多量に与えたので、前者
を後続の構造決定用として選んだ。
ノモル／週）高純度塩基性FGFがウシ下垂体から迅速単
離された。この供給源は構造決定作業の助けとなつた。
ヘパリン−セフアロースアフイニテイクロマトグラフイ
ー精製工程により、２種の生物活性および塩基性FGF免
疫反応性細胞分裂促進物質が数千倍に精製された。これ
らは約1.4Mおよび1.95M・NaClにより溶出した。一工程
のRP−HPLCによりそれぞれの場合ペプチドが均質化され
た。NaDodSO4PAGEにより両種について等しい分子量推定
値が得られ、気相微量配列分析により両者は各ポリペプ
チドの少なくともアミノ末端24個の残基全体について等
しいアミノ末端アミノ酸配列をもつことが示された。下
垂体抽出物は1.4M・NaClで溶出する細胞分裂促進物質を
その後溶出する種よりも約15倍多量に与えたので、前者
を後続の構造決定用として選んだ。
NaDodSO4PAGEはウシ下垂体塩基性FGFにつき16,250±1
000の分子量を示唆した。下記の表１はアール・アール
・ロブら、バイオケミ．（Biochem.）23、6295−6299
（1984）によりウシ脳および視床下部からの陽イオン性
細胞分裂促進物質について得られたアミノ酸組成、なら
びにウシ下垂体からの塩基性FGFについて得た組成デー
タを示す。すべてのデータはアミノ酸146個の構造につ
き正規化されたものである。これらの組成が類似するこ
とは、これらの構造が等しくはないにしても密接な関連
をもつことを示唆する。事実ウシ脳から塩基性FGFが単
離され、そのアミノ末端配列が下垂体由来の分子のもの
と等しいと判定された。
000の分子量を示唆した。下記の表１はアール・アール
・ロブら、バイオケミ．（Biochem.）23、6295−6299
（1984）によりウシ脳および視床下部からの陽イオン性
細胞分裂促進物質について得られたアミノ酸組成、なら
びにウシ下垂体からの塩基性FGFについて得た組成デー
タを示す。すべてのデータはアミノ酸146個の構造につ
き正規化されたものである。これらの組成が類似するこ
とは、これらの構造が等しくはないにしても密接な関連
をもつことを示唆する。事実ウシ脳から塩基性FGFが単
離され、そのアミノ末端配列が下垂体由来の分子のもの
と等しいと判定された。
実施例２ CSH（前掲）に記載される常法により下記組成の合成b
FGF遺伝子を構成する。
FGF遺伝子を構成する。
bFGF暗号化DNA鎖の合成はオーバーラツプした相補的
配列をもつオリゴヌクレオチドをアプライドB10システ
ムズ自動合成装置で合成することにより行われる。
配列をもつオリゴヌクレオチドをアプライドB10システ
ムズ自動合成装置で合成することにより行われる。
オーバーラツプしたオリゴヌクレオチドを融合させて
二重鎖DNAを形成させ、ギヤツプをDNAポリメラーゼおよ
びT4リガーゼにより埋めた。センス（有意）鎖のFGF暗
号化配列の５側に隣接してATG開始シグナルが備えら
れ、これにより発現されたポリペプチドのＮ末端に外来
メチオニンが付加される。bFGF暗号化配列の３′側に隣
接して停止シグナルがある。５′末端にはEco RIオーバ
ーハングがあり、３′末端にはSal Iオーバーハングが
あつて、これにより合成DNA鎖はプラスミドpUC8のEco R
IおよびSal I部位にそのまま挿入可能である（ビエイラ
ら、ジーン14、259−268（1982）に記載）。DNA鎖はpUC
8プラスミド内へアニールされる。ここではこれはATG開
始シグナルおよびシヤイン・ダルガルノ配列がそれらと
プロモーターとの天然の配向および会合を保つた状態
で、β−ガラクトシダーゼプロモーターの制御下に置か
れる。
二重鎖DNAを形成させ、ギヤツプをDNAポリメラーゼおよ
びT4リガーゼにより埋めた。センス（有意）鎖のFGF暗
号化配列の５側に隣接してATG開始シグナルが備えら
れ、これにより発現されたポリペプチドのＮ末端に外来
メチオニンが付加される。bFGF暗号化配列の３′側に隣
接して停止シグナルがある。５′末端にはEco RIオーバ
ーハングがあり、３′末端にはSal Iオーバーハングが
あつて、これにより合成DNA鎖はプラスミドpUC8のEco R
IおよびSal I部位にそのまま挿入可能である（ビエイラ
ら、ジーン14、259−268（1982）に記載）。DNA鎖はpUC
8プラスミド内へアニールされる。ここではこれはATG開
始シグナルおよびシヤイン・ダルガルノ配列がそれらと
プロモーターとの天然の配向および会合を保つた状態
で、β−ガラクトシダーゼプロモーターの制御下に置か
れる。
組換えベクター（bFGFを指令）を塩化カルシウム法に
より大腸菌のDH−１株に形質転換する（CHS.前掲）。
より大腸菌のDH−１株に形質転換する（CHS.前掲）。
形質転換された大腸菌をＬブロス中で培養し、アンピ
シリン耐性菌株を選択する。DNA鎖はそのDNA鎖の蛋白質
生成物を発現すると予期できる配向でプラスミド中に挿
入されたので、アンピシリン耐性コロニーは下垂体から
抽出されたbFGFに対して得られた抗血清との反応性につ
いてスクリーニングされる。これらのコロニーはヘルフ
マンら、プロシ．ナシヨナル・アカデ・サイ・ユーエス
エー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）80、31−35（1983）の
免疫学的方法によりスクリーニングされ、bFGF抗体と陽
性の反応を示すコロニーの特性をさらに調べる。細胞を
それらの培地から分離し、細胞溶解し、それらの上清を
得る。形質転換した細胞からの上清がbFGFに対して産生
された抗体と反応性であることがRIAにより判定され
た。
シリン耐性菌株を選択する。DNA鎖はそのDNA鎖の蛋白質
生成物を発現すると予期できる配向でプラスミド中に挿
入されたので、アンピシリン耐性コロニーは下垂体から
抽出されたbFGFに対して得られた抗血清との反応性につ
いてスクリーニングされる。これらのコロニーはヘルフ
マンら、プロシ．ナシヨナル・アカデ・サイ・ユーエス
エー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）80、31−35（1983）の
免疫学的方法によりスクリーニングされ、bFGF抗体と陽
性の反応を示すコロニーの特性をさらに調べる。細胞を
それらの培地から分離し、細胞溶解し、それらの上清を
得る。形質転換した細胞からの上清がbFGFに対して産生
された抗体と反応性であることがRIAにより判定され
た。
細胞上清100mlを得て、これから前記に従いヘパリン
−セフアロースを用いてbFGFを精製する。総蛋白質に対
して98重量％まで精製されたFGF約0.01mgが得られる。
−セフアロースを用いてbFGFを精製する。総蛋白質に対
して98重量％まで精製されたFGF約0.01mgが得られる。
外来Ｎ末端メチオニン残基を含む合成bFGFの生物活性
を、この合成bFGFが培養中の成牛大動脈弓内皮細胞の増
殖を促進する効力により生物活性試験する（ジエイ・セ
ル・バイオロ．（J.Cell Biol.）97、1677−1685（198
3）の記載に従う）。要約すると細胞（３〜10継代）を
２×103個／皿の密度でプラスチツク製培養皿に接種
し、10％子牛血清を補充したダルベツコの改良イーグル
培地（DMEM）で培養する。被験試料を10-1〜10-3の希釈
度で０日目および２日目に皿に添加する。４日目に各３
枚の皿をトリプシン処理し、クールター計数器で計数す
る。バツクグラウンド水準は通常は細胞105個／皿であ
るが、最適濃度の発育因子を与えられたものは５〜８×
105個に及ぶ細胞を含有しうる。効力検定のために対数
応答曲線を作成した。この目的のために0.5％ウシ血清
アルブミン（BSA）/DMEM中に希釈した原液希釈液（10-1
〜10-5）の10μｌアリコートを添加した（３重試験）。
を、この合成bFGFが培養中の成牛大動脈弓内皮細胞の増
殖を促進する効力により生物活性試験する（ジエイ・セ
ル・バイオロ．（J.Cell Biol.）97、1677−1685（198
3）の記載に従う）。要約すると細胞（３〜10継代）を
２×103個／皿の密度でプラスチツク製培養皿に接種
し、10％子牛血清を補充したダルベツコの改良イーグル
培地（DMEM）で培養する。被験試料を10-1〜10-3の希釈
度で０日目および２日目に皿に添加する。４日目に各３
枚の皿をトリプシン処理し、クールター計数器で計数す
る。バツクグラウンド水準は通常は細胞105個／皿であ
るが、最適濃度の発育因子を与えられたものは５〜８×
105個に及ぶ細胞を含有しうる。効力検定のために対数
応答曲線を作成した。この目的のために0.5％ウシ血清
アルブミン（BSA）/DMEM中に希釈した原液希釈液（10-1
〜10-5）の10μｌアリコートを添加した（３重試験）。
合成bFGFの生物（細胞分裂促進）活性は実質的に天然
の精製bFGFのものに等しい。
の精製bFGFのものに等しい。
余分なＮ末端残基は臭化シアンまたはイソチオシアン
酸フエニルで化学的に部分消化したのち無水の強酸（た
とえばトリフルオル酢酸）で処理することにより除去で
きる。しかしこの処理は内部Met残基を攻撃し；天然蛋
白質構造をもつbFGFを若干は生成するが生物活性蛋白質
の総量を実質的に減少させる。
酸フエニルで化学的に部分消化したのち無水の強酸（た
とえばトリフルオル酢酸）で処理することにより除去で
きる。しかしこの処理は内部Met残基を攻撃し；天然蛋
白質構造をもつbFGFを若干は生成するが生物活性蛋白質
の総量を実質的に減少させる。
実施例３ 実施例２のbFGF産生大腸菌クローンの１種において増
幅されたプラスミドbFGFを単離し、Eco RIおよびSal I
により開裂させる。この消化されたプラスミドをアガロ
ースゲル上で電気泳動し、増幅されたbFGF挿入体を分離
および採取する。この挿入体をプラスミドpYEpに挿入す
る。これは大腸菌およびビール酵母菌（Saccharomyces
cerevisiae）の双方を形質転換するために使用できるシ
ヤトルベクターである。合成DNA鎖をここに挿入するこ
とによりATGシグナルからの適正な読み枠内において、
キヤツプ部位に対し適正な間隔を保つた状態でこのDNA
配列が確実にプロモーターの制御下に置かれる。このシ
ヤトルベクターを用いてURA3を形質転換する。これはオ
ラテートモノホスフエートデカルボキシラーゼ遺伝子が
除かれたビール酵母菌の一菌株である。
幅されたプラスミドbFGFを単離し、Eco RIおよびSal I
により開裂させる。この消化されたプラスミドをアガロ
ースゲル上で電気泳動し、増幅されたbFGF挿入体を分離
および採取する。この挿入体をプラスミドpYEpに挿入す
る。これは大腸菌およびビール酵母菌（Saccharomyces
cerevisiae）の双方を形質転換するために使用できるシ
ヤトルベクターである。合成DNA鎖をここに挿入するこ
とによりATGシグナルからの適正な読み枠内において、
キヤツプ部位に対し適正な間隔を保つた状態でこのDNA
配列が確実にプロモーターの制御下に置かれる。このシ
ヤトルベクターを用いてURA3を形質転換する。これはオ
ラテートモノホスフエートデカルボキシラーゼ遺伝子が
除かれたビール酵母菌の一菌株である。
この形質転換した酵母を培地中で増殖させ対数増殖に
到達させる。酵母をその培地から分離し、細胞溶解物を
調製する。プールした細胞溶解物はbFGFに対して産生さ
れた抗体と反応性であることがRIAにより判定された。
これはbFGFペプチドセグメントを含むペプチドが酵母細
胞内に発現されたことを証明する。
到達させる。酵母をその培地から分離し、細胞溶解物を
調製する。プールした細胞溶解物はbFGFに対して産生さ
れた抗体と反応性であることがRIAにより判定された。
これはbFGFペプチドセグメントを含むペプチドが酵母細
胞内に発現されたことを証明する。
本発明はポリペプチドを提供し、この重要な物質を生
物学的用途および治療用として利用できるものにする。
bFGFの調製は原核細胞系および真核細胞系の双方におい
て行うことができる。bFGF合成は細菌または酵母いずれ
かの細胞系を用いて容易に証明されるが、合成遺伝子は
高等動物の細胞、たとえば哺乳動物腫瘍細胞において発
現させるために挿入可能でなければならない。この種の
哺乳動物細胞はたとえば宿主動物において腹腔内腫瘍と
して増殖させ、bFGFを腹腔内液から採取することができ
る。
物学的用途および治療用として利用できるものにする。
bFGFの調製は原核細胞系および真核細胞系の双方におい
て行うことができる。bFGF合成は細菌または酵母いずれ
かの細胞系を用いて容易に証明されるが、合成遺伝子は
高等動物の細胞、たとえば哺乳動物腫瘍細胞において発
現させるために挿入可能でなければならない。この種の
哺乳動物細胞はたとえば宿主動物において腹腔内腫瘍と
して増殖させ、bFGFを腹腔内液から採取することができ
る。
上記各実施例はbFGFを組換えDNA法により合成できる
ことを証明しているが、これらの例は最高のbFGF産生を
示すことを意味するものではない。今後、より有効なク
ローニングベクターおよび宿主細胞系を選択することに
よつてbFGFの収率が高まると期待される。真核細胞およ
び原核細胞の双方につき既知の遺伝子増幅法を採用して
bFGFの産生を高めることができる。宿主細胞系から培地
中への遺伝子暗号化ポリペプチドの分泌も、合成FGFを
大量に得る際に重要な要素であると考えられる。
ことを証明しているが、これらの例は最高のbFGF産生を
示すことを意味するものではない。今後、より有効なク
ローニングベクターおよび宿主細胞系を選択することに
よつてbFGFの収率が高まると期待される。真核細胞およ
び原核細胞の双方につき既知の遺伝子増幅法を採用して
bFGFの産生を高めることができる。宿主細胞系から培地
中への遺伝子暗号化ポリペプチドの分泌も、合成FGFを
大量に得る際に重要な要素であると考えられる。
FGFは妥当な長さのペプチドセグメントを調製するた
めの古典的合成法および／または固相合成法によつても
合成できる。次いでこれらのセグメントを適宜互いに結
合させて、目的とする残基146個の分子を製造すること
ができる。
めの古典的合成法および／または固相合成法によつても
合成できる。次いでこれらのセグメントを適宜互いに結
合させて、目的とする残基146個の分子を製造すること
ができる。
前記の脳および下垂体FGF製剤は一次および二次間充
識ならびに神経外胚葉に由来する組織から誘導された多
種多様な正常２倍体培養細胞に対して細胞増殖促進作用
を示す。これらには家兎軟骨細胞、ウシ顆粒層細胞およ
び副腎皮質細胞、ウシ角膜内皮細胞、ウシ副腎皮質細胞
およびヒト臍帯内皮細胞に由来する毛細管内皮細胞が含
まれる。
識ならびに神経外胚葉に由来する組織から誘導された多
種多様な正常２倍体培養細胞に対して細胞増殖促進作用
を示す。これらには家兎軟骨細胞、ウシ顆粒層細胞およ
び副腎皮質細胞、ウシ角膜内皮細胞、ウシ副腎皮質細胞
およびヒト臍帯内皮細胞に由来する毛細管内皮細胞が含
まれる。
bFGFペプチドは培養細胞系、たとえば組換えDNA法に
より形質転換されて他の有用なポリペプチドを産生する
細胞系のインビトロ増殖を促進するために有用な生物材
料である。
より形質転換されて他の有用なポリペプチドを産生する
細胞系のインビトロ増殖を促進するために有用な生物材
料である。
さらにbFGFはたとえばハムスターのほおのう内または
ひよこ漿尿膜内に移植した場合、血管形成応答を引き出
しうることが研究によつて示された。従つて実質的に純
粋なbFGFペプチドは潜在的に治療上の有用性をもつ。
ひよこ漿尿膜内に移植した場合、血管形成応答を引き出
しうることが研究によつて示された。従つて実質的に純
粋なbFGFペプチドは潜在的に治療上の有用性をもつ。
実質的に純粋なFGFポリペプチドは、哺乳動物組織
（たとえばウシ下垂体から抽出されたFGFポリペプチド
よりも著しく高い純度をもつものが日常的に得られる。
FGFポリペプチドは正常な哺乳動物組織のごくわずかな
成分を構成しているにすぎないので、同様に存在する他
の天然ポリペプチドに比べてきわめて不純な形で存在す
るにすぎない。たとえば組換えDNA技術を採用すると、
この異種ポリペプチドを総蛋白質に対して天然のFGFポ
リペプチドが哺乳動物組織中に存在する割合よりも著し
く高い割合で細胞物質内またはそれらの分泌物中に産生
する生物または細胞系を作り出すことができる。この種
の合成FGFポリペプチドが単離される原料は実質的によ
り高い濃度の異種ポリペプチドを含むので、精製技術に
よつてより高純度のFGFポリペプチド画分をかなり簡単
に得ることができる。たとえば前記の精製技術を用い
て、少なくとも約98％の純度（総蛋白質に対して）のbF
GFポリペプチドを日常的に得ることができる。以下これ
を実質的に純粋であるとする。
（たとえばウシ下垂体から抽出されたFGFポリペプチド
よりも著しく高い純度をもつものが日常的に得られる。
FGFポリペプチドは正常な哺乳動物組織のごくわずかな
成分を構成しているにすぎないので、同様に存在する他
の天然ポリペプチドに比べてきわめて不純な形で存在す
るにすぎない。たとえば組換えDNA技術を採用すると、
この異種ポリペプチドを総蛋白質に対して天然のFGFポ
リペプチドが哺乳動物組織中に存在する割合よりも著し
く高い割合で細胞物質内またはそれらの分泌物中に産生
する生物または細胞系を作り出すことができる。この種
の合成FGFポリペプチドが単離される原料は実質的によ
り高い濃度の異種ポリペプチドを含むので、精製技術に
よつてより高純度のFGFポリペプチド画分をかなり簡単
に得ることができる。たとえば前記の精製技術を用い
て、少なくとも約98％の純度（総蛋白質に対して）のbF
GFポリペプチドを日常的に得ることができる。以下これ
を実質的に純粋であるとする。
実質的に純粋な合成bFGFまたはその無毒性塩類は、薬
剤組成物を形成する薬剤学的に受容できるキヤリヤーと
合わせて哺乳動物（ヒトを含む）に静脈内、皮下、筋肉
内または経口的に投与できる。必要量は処置すべき個々
の症状、その症状の程度、および目的とする処置の期間
に応じて異なるであろう。
剤組成物を形成する薬剤学的に受容できるキヤリヤーと
合わせて哺乳動物（ヒトを含む）に静脈内、皮下、筋肉
内または経口的に投与できる。必要量は処置すべき個々
の症状、その症状の程度、および目的とする処置の期間
に応じて異なるであろう。
この種のペプチドはしばしば薬剤学的に受容できる無
毒性塩類、たとえば酸付加塩、または亜鉛、鉄などとの
金属錯体（これらはこの用途のためには塩類であるとみ
なされる）の形で投与される。この種の酸付加塩の具体
例は塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイ
ン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸
塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などで
ある。有効成分を錠剤の形で投与したい場合、錠剤は結
合剤、たとえばトラガカント、コーンスターチまたはゼ
ラチン；崩解剤、たとえばアルギニン酸；ならびに滑沢
剤、たとえばステアリン酸マグネシウムを含有しうる。
液状での投与が望ましい場合は、甘味剤および／または
香味剤を使用することができ、等張の食塩液中、リン酸
塩緩衝液中などにおいて静脈内投与することができる。
毒性塩類、たとえば酸付加塩、または亜鉛、鉄などとの
金属錯体（これらはこの用途のためには塩類であるとみ
なされる）の形で投与される。この種の酸付加塩の具体
例は塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイ
ン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸
塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などで
ある。有効成分を錠剤の形で投与したい場合、錠剤は結
合剤、たとえばトラガカント、コーンスターチまたはゼ
ラチン；崩解剤、たとえばアルギニン酸；ならびに滑沢
剤、たとえばステアリン酸マグネシウムを含有しうる。
液状での投与が望ましい場合は、甘味剤および／または
香味剤を使用することができ、等張の食塩液中、リン酸
塩緩衝液中などにおいて静脈内投与することができる。
これらのペプチドは医師の指導のもとに投与すべきで
あり、薬剤組成物は通常は一般の薬剤学的に受容できる
キヤリヤーと組合わせてこれらのペプチドを含有するで
あろう。
あり、薬剤組成物は通常は一般の薬剤学的に受容できる
キヤリヤーと組合わせてこれらのペプチドを含有するで
あろう。
本発明を現在本発明者らが知る最良の形態をなす好ま
しい実施態様に関連して記述したが、当業者には種々の
変更および修正が自明であることは理解されるであろ
う。たとえば残基146個のペプチド全体の代わりに生物
活性断片、たとえばbFGF（24−120）−OHおよびbFGF（2
0−110）−NH2を用いることができる。
しい実施態様に関連して記述したが、当業者には種々の
変更および修正が自明であることは理解されるであろ
う。たとえば残基146個のペプチド全体の代わりに生物
活性断片、たとえばbFGF（24−120）−OHおよびbFGF（2
0−110）−NH2を用いることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ボーレン，ペーター スイス連邦ツェーハー‐8610 ウスター, フーンリアッカーヴェーク ３ (72)発明者 ゴスポダロウィッツ，デニス・ジャージィ アメリカ合衆国カリフォルニア州94127, サン・フランシスコ，メイウッド・ドライ ブ 215 (72)発明者 リング，ニコラス・チャイ‐クワン アメリカ合衆国カリフォルニア州92122, サン・ディエゴ，ブローチ・ストリート 5324
Claims (6)
- 【請求項１】次式： の146アミノ酸残基を含む哺乳動物塩基性線維芽細胞発
育因子（bFGF）ポリペプチドのアミノ酸配列、または該
アミノ酸配列において１−３個のアミノ酸が置換されて
おり、かつ線維芽細胞発育因子として生物学的に活性な
ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするDNA。 - 【請求項２】次の146アミノ酸残基配列： または該アミノ酸配列の残基１−19の領域もしくは残基
111−146の領域もしくはこれらの領域の双方において１
−３個のアミノ酸が置換されているアミノ酸残基配列を
コードする、特許請求の範囲第１項に記載のDNA。 - 【請求項３】次の146アミノ酸残基配列： のＮ末端側に延長された類似体を含み、かつ線維芽細胞
発育因子としての生物学的活性を有するbFGFポリペプチ
ドのアミノ酸残基配列をコードするDNA。 - 【請求項４】次の146アミノ酸残基配列： のＮ末端側が短縮され、かつ線維芽細胞発育因子として
の生物学的活性を有するフラグメントをコードするDN
A。 - 【請求項５】（１）次の配列： の146アミノ酸残基を含む哺乳動物塩基性線維芽細胞発
育因子（bFGF）ポリペプチドのアミノ酸配列、または該
アミノ酸配列において１−３個のアミノ酸置換されてお
り、かつ線維芽細胞発育因子として生物学的に活性なポ
リペプチドのアミノ酸配列をコードするDNA; （２）上記の146アミノ酸残基配列のＮ末端側に延長さ
れた類似体を含み、かつ線維芽細胞発育因子としての生
物学的活性を有するbFGFポリペプチドのアミノ酸残基配
列をコードするDNA;および （３）上記の146アミノ酸残基配列のＮ末端側が短縮さ
れ、かつ線維芽細胞発育因子としての生物学的活性を有
するフラグメントをコードするDNA; からなる群より選択されるDNA配列を含むクローニング
または発現ベクター。 - 【請求項６】（１）次の配列： の146アミノ酸残基を含む哺乳動物塩基性線維芽細胞発
育因子（bFGF）ポリペプチドのアミノ酸配列、または該
アミノ酸配列において１−３個のアミノ酸が置換されて
おり、かつ線維芽細胞発育因子として生物学的に活性な
ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするDNA; （２）上記の146アミノ酸残基配列のＮ末端側に延長さ
れた類似体を含み、かつ線維芽細胞発育因子としての生
物学的活性を有するbFGFポリペプチドのアミノ酸残基配
列をコードするDNA;および （３）上記の146アミノ酸残基配列のＮ末端側が短縮さ
れ、かつ線維芽細胞発育因子としての生物学的活性を有
するフラグメントをコードするDNA; からなる群より選択されるDNA配列を含むクローニング
または発現ベクターにより形質転換され、コードされる
bFGFポリペプチドを発現しうる細菌または酵母。
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