JPH0411888A - 酢酸菌固定化用担体及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

に産業上の利用分野】 本発明は、酢酸菌の固定化に優れた機能を発揮する固定
化用担体とその製造法に関し、本発明に係る酢酸菌固定
化用担体は、酢酸菌を利用した酢酸の連続ｍ酵、物賀の
変換等に使用される各種の反応器中等での酢酸菌の固定
化に優れた性能を有するものである。 Ｋ従来の技術】 従来、多孔質キトサン成形物を酢酸菌固定化用担体とし
て利用出来ることは、本発明者等が特願平１−４５７８
１号の応用例で開示し、該発明において、多孔質キトサ
ン粒状体を８ｍ液で処理し、架橋処理を行っている。 Ｋ発明が解決しようとする課題】 酢−菌を固定するためには、担体との親和性を高めるこ
とがφ要で、これによって担体中の酢酸菌量を増加させ
ることが可能となり、酢酸菌を利用した物質の変換を行
うための反応器中での使用に優れた性能を示す。 本発明者等が先に開示した多孔質キトサン成形物を酸処
理し、夫々についてヘキサメチレンビス（２，３−１ポ
キシプロピルジメチルアンモニウムクＯライド）、ヘキ
サメチレンジイソシアネート及び４．４′　−ジフェニ
ルメタンジイソシアネートを架橋した多孔質キトサン成
形物では未だ酢酸菌との親和性が低く、従って吸着菌数
も低い欠点があった。 本発明は、多孔質キトサン粒状体に対し、酢酸菌につい
て高い固定化能を具備させることを目的とするものであ
る。

【課題を解決するための手段】

本発明は、多孔質粒状体のキトサンを構成するごラノー
ス環１００構造単位当りフェニル基導入ｉが４〜４５で
、該多孔質粒状体の細孔径が３〜１０μ乳である酢酸菌
固定化用担体に関するものであり、このような酢酸菌固
定化用担体は、低分子量キトサンの酸性水溶液を塩基性
水溶液中で凝固析出させて多孔質キトサン粒状体を得、
次いて酸溶液で処理し、更にフェニルイソシアネートを
反応させることによって得られる。 本発明においては、キトサンとして平均分子量が１０．
０００〜２３０，０００の低分子像キトサンが用いられ
、これを酢酸、ジクロル酢酸、蟻酸等の単独又は混合水
溶液に溶解させ、キトサン酸性水溶液とする。キトサン
酸性水溶液のキトサンの濃度は２〜２０％（重量）の範
囲で自由に選択することかできる。この際、キトサン酸
性水溶液中に、細孔調節剤として水溶性高分子物質であ
るポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等を
単独又は組合せて添加してもよい。該キトサン酸性水溶
液からキトサンを再生して多孔質キトサン粒状体を得る
ためには、例えば孔径０．１〜０．２５ｒｘｍφのノズ
ルより、圧力下で塩基性水溶液中に該キトサン酸性水溶
液を一定量ずつ落下させることにより多孔質キトサン粒
状体が得られる。 塩基性凝固洛中に加える塩基性物質としては、水酸化ナ
トリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリ
ウム、アンモニア、エチレンジアミン等のアルカリ性物
質が用いられ、塩基性溶液とするには、水、又はメタノ
ール、エタノール等の極性を有するアルコール類、又は
水とアルコール類の混合物に上述の塩基性物質を加えて
使用する。得られた水を含む多孔質キトサン粒状体はメ
タノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のア
ルコール類やアクリロニトリル等の極性溶媒を用いて水
を置換する。次いで酸水溶液で該多孔質キトサン粒状体
の表面処理をするが、この際用いられる酸としては、酢
酸、蟻酸、プロピオン酸等の有機酸、又は塩酸、硝酸等
の鉱酸が挙げられ、多孔質キトサン粒状体の表面を酸水
溶液で短時間処理し、次いで酸を充分水洗する。この時
粒状体に水が含まれていれば酸の水溶液を、極性溶媒が
含まれている場合には該極性溶媒と酸の混合物を用いる
ことが好ましい。酸の濃度としては。 ０．５〜５．０％（重１）のものが使用され、酸処理は
２５℃で１０秒〜５分間行う。しかし、処理条件はキト
サン酸性水溶液の濃度、塩基性凝固浴濃度。 処理に用いる酸の種類と濃度によって粒状体内部の大き
な気孔を表面に具備させるように自由に選択出来る。 上記の酸処理によって得られた多孔質キトサン粒状体は
、表面及びその近傍にある、内部より、より直径の小さ
い細孔径気孔部分が除去されるので、表面から内部に向
って大きな直径の気孔を有するものとなる。 得られた多孔質キトサン粒状体を、メタノール。 エタノール、ジメチルホルムアミド、ジオキサン等の有
機溶媒で水を完全に置換する。次いで、フェニルイソシ
アネートを多孔質キトサン粒状体中のアミン基と室温で
　１〜１０時間架橋反応させ、反応終了後、再び前述の
有機溶媒で未反応のフェニルイソシアネートを除去し、
完全に水洗する。この際のフェニルイソシアネートは多
孔質キトサン粒状体の乾燥重量　１ｇに対し０．０４〜
３．５ｇ添加される。 上記のように、本発明においてはフェニルイソシアネー
トを導入して酢酸菌の固定化用担体を得るのであるが、
フェニルイソシアネートが用いられる理由は、イソシア
ネート基がキトサンの骨格構造中のアミン基との反応性
が高く、しかもフェニル基以外の直鎖状のアルキルに結
合しているイソシアネート基を有する化合物に比べて反
応性が著しく高い。そして疎水基の導入により担体の疎
水性も高まり、酢酸菌との親和性を高める効果があるか
らである。、原料であるキトサンはグルコサミンのみで
なく、Ｎ−アセチルグルコサミンとの共電合体であるこ
とが多く、その比率（脱アセチル化度）は５０〜１００
％である。 フェニル基の導入量は、多孔質粒状体のキトサンを構成
するピラノース環１００構造単位当り　４〜４５である
時に全ｐＨ域で安定であり、酢酸菌を固定化して食酢を
製造する際にも何らの変化を受けることがない。そして
疎水基が導入されているので酢酸菌と担体の親和性が著
しく向上し、固定化操作時の酢酸菌吸着数を顕著に向上
させることができ、増殖菌体を担体表面及び内部で増殖
させるときも閑の保持性に優れた性能を具備する。フェ
ニル基を導入した多孔質キトサン粒状体を酢酸菌固定化
用担体として使用するには、細孔径が３〜１０μｍの範
囲にあると酢酸菌の吸着量が高く、しかも圧縮弾性率の
優れたものが得られる。尚、フェニル基導入量は下記の
実施例に詳述した方法によって求めることかできる。 Ｋ実　施　例】 以下、本発明を、実施例を挙げて詳述するが、本発明は
この範囲に限定されるものではない。 実施例において記載のフェニル基導入量、細孔径、圧縮
弾性率及び酢酸菌吸着数は次の方法により測定した。 フェニル基導入Φ ■　フェニルイソシアネートを反応させて得た多孔質キ
トサン粒状体５（ｌｒｄ！（８容［１）をメスシリンダ
ーで正確に採取し、エタノールで４回置換する。 ■　更にエーテルを用いて４回置換する。 ■　エーテルを抜き取り、真空デシケータ−中でエーテ
ル臭がなくなるまで乾燥させ、その重Φを測定する（八
ｇ）。 ■　別に、フェニルイソシアネートを反応させない多孔
質キトサン粒状体５０−（湿容槽）を、上記■〜■の操
作を行って乾燥型口を測定する＜Ｂｇ）。 ■　ピラノース環１００構造単位当りのフェニル基導入
量を次式で求めた。 フェニル基導入量 ＝　（Ｍｘ　（Ａ−Ｂ）　／　（１１９ｘＢ）　）　ｘ
１００但し、Ｍ：ピラノース環換算の分子ｉて次式より
求めた。 ＤＡＣ：脱アセチル化度（％） １１９：フェニルイソシアネートの分子１１６１：　　
ＤＡＣ１００％時のピラノース環換輝分子量２０３：　
　ＤＡＣ０％時のピラノース環換締分子量細　　孔　　
径 試料を液体窒素中で急冷し、−５０℃、１０’トールの
真空度下で凍結乾燥後、走査型電子穎微鏡で測定した。 Ｆｉ：縮弾性率 レオメータ−ＮＲＭ−２０１０Ｊ−Ｃ１４（不動工業■
製）を用いて直径６．０顕φ、深さ１０Ｍのサンプルア
ダプターに試料を詰め、直径５．５Ｍφの棒で２ｃａ＋
＃ｌｉｎの速さで４Ｍ押し込んだときの圧縮弾性率を測
定した。 酢酸菌吸着数 ■　グルコース、ポリペプトン、酵母エキスからなるＰ
ＧＹＭ地にエラ。ノールを２％となるように加えた培地
３０−にアセトバクターアセチｔＡｃｅｔ。 ｂａｃｔｅｒ　ａｃｅｔｉ　、　ＩＦＯ−３８２３）を
Ｍ菌し、３０°Ｃで２４時間振盪培養を行う。 ■　この＠養懸濁液４ｉを、予め滅菌しておいた試料に
加え、４℃で　ＩＲ間振罎し吸着させる。 ■　０＆着終了後、上清を１００厩取り、４．０００倍
希釈し、そのうらの１００７を取って予め用意しておい
た平板培地に塗抹して４８時間培養後、出現したコロニ
ー数をカウントする。吸着前の培養懸濁液については、
８．０００倍希釈して同様の操作でコロニー数をカウン
トしておく。 ■　吸着前後の細胞数の差から吸着数を鋒出する。 実施例１゜ 脱アセチル化度７６％、平均分子量ｂｉ、ｏｏｏのキト
サン６０ｇとポリエチレングリコール（分子量２０，０
００、和光糾薬工業■製＞　　ｉｏｏｇを６％酢酸に溶
解し、総量が１　、０００ｄとなるようにした。該酸性
水溶液を、５．５％水酸化ナトリウム、　２０％エタノ
ール、　７４．５％水よりなる混合液中に孔径０．２５
ｒＲ１ｎφのノズルから一定量ずつ落下させ凝固再生し
た後、中性になるまで充分水洗して平均粒径約１．２ｍ
＋φ。 細孔径０．２μｍ、圧縮弾性率２．５ｘ　１０６ｄｙｎ
／ｃａ＋の多孔質キトサン粒状体９５０ｄを得た。該多
孔質キトサン粒状体の付着水を吸引濾過で除去後、０．
５％酢酸水溶液１℃中に２５℃で３０秒間浸漬処理を行
った。これの細孔径は５μｍ、圧縮弾性率は１．３ｘ　
１０６ｄｙｎ／ｃｍであった。 該粒状体１００〆（湿害Ｉ）を秤量し乾燥後、乾燥重量
を測定したところ７．３ｇであった。次いで夫々　１０
０ｒｄ〈湿害量＞を５本採取し夫々についてジメチルホ
ルムアミドで水分を置換し、フェニルイソシアネート０
．４７９．　２．３７　ｇ、４．７３　ｇ。 ９．４６９及び２３．６５９を添加し３０分間反応させ
た。 反応後、未醍応のフェニルイソシアネートをジメチルホ
ルムアミドで完全に除去、置換し、その後水洗し酢酸菌
固定化用担体５種類（試料１〜５）を得た。 試料１〜５のフェニル基導入吊、圧縮弾性率。 細孔径を測定し、その結果を第１表に示した。又、酢酸
菌ＩＦＯ−３８２３をグルコース、ポリペプトン、酵母
エキスを含むＰＧＹ培地３０−に植菌後、３０℃、２４
時間、１２０回転／分で振盪培養した培養懸濁液４−に
対し、試料１〜５を夫々各２厩加え、５０℃で１時間酢
酸菌を吸着させて吸着菌数を測定し第１表に示した。 以下余白 第１表 第１表の結果より、フェニル基の導入量に応じて酢酸菌
の吸着数か増加する一方、細孔径はフェニル基の導入に
よる変化はないか、フェニル基導入により圧縮弾性率が
かなり向上し、酢酸菌固定化用担体として優れたもので
あることか明らかである。 実施例２゜ 脱アセチル化度８０％、平均分子ｍ５２．ｏｏｏのキト
サン１３０ｇにポリエチレングリコール（平均分子母２
０，０００、和光＠！薬工業■製）　　２００ｇを添加
し、総組が２　、０００ｄになるようにして６％酢酸水
溶液に溶解した。該酸性水溶液を、５％水酸化ナトリウ
ム、３０％エタノール、６５％水よりなる混合溶液中に
孔径０．２５１ｍφのノズルより一定Φずつ落下させ凝
固再生させた後、中性になるまで充分水洗し、平均粒径
約１．０．、ψの多孔質キトサン粒状体１．９６０−を
得た。次いて得られた多孔質キトサン粒状体各４００ｄ
（況容橘）を３本採取し、夫々付着水を吸引濾過除去し
、酢酸水溶液の各０．１゜０．２５及び０５％溶液５０
０ｄ中で２５℃、３０秒間処理し中性になるまで水洗し
た。水洗後の多孔質ギトサン粒状体の湿害積は夫々３９
６ｄ　、　　２６８ａｔｅ　。 ２４４ｉであった。得られた粒状体１００彪の乾燥重量
を測定したところ夫々７．６ｆｊ、　　７．０９．　６
．９９であった。次に夫々粒状体１００ｄ　（湿害積）
についてジメチルホルムアミドで水を置換し夫々にフェ
ニルイソシアネート６．５ｇ、　　４．５ｇ、　　４．
Ｏｇを添加し、室温で１時間反応させ試料６〜８を得た
。 得られた試料６〜８について実施例１と同様にフェニル
基導入Φ、圧縮弾性率、細孔径を測定し、その結果を第
２表に示した。又、実施例１と同様に酢酸菌を吸着させ
て、その酢酸菌の吸着数を測定し、その結果を第２表に
示した。 第２表 以下余白 第２表から明らかな如く、細孔径が３μｍ以下であると
フェニル基導入量がほぼ同一であっても酢酸菌の吸着数
が著しく低いことか明らかでおる。 実施例３゜ 脱アセチル化度７８％、平均分子量５０．０００のキト
サン１２０９とポリエチレングリコール（分子ｉ２０、
０００、和光純薬工業■製＞　　２００９を６％酢酸に
溶解し総僅が２，０００ｄとなるようにした。該酸性水
溶液を５．５％水酸化ナトリウム、３０％エタノール、
　６４．５％水よりなる混合液中に孔径０．２５　ｒｍ
φのノズルから一定量ずつ落下させ凝固再生させた後、
中性になるまで充分水洗して平均粒径１．Ｏｍφの多孔
質キトサン粒状体１，９２０ｄ　（湿害量）を得た。次
いで得られた多孔質キトサン粒状体を失々４００ｄ（１
ｍ容積）を３本採取し、付着している水分を吸引濾過除
去後、酢酸水溶液の各０．５゜１．０．　５．０％水溶
′８５０ｏｄ中で２５℃、　３０秒間処理し中性になる
まで水洗したところ、夫々の湿害積は２６０ｄ　、　　
２４２ｄ　、　　２１０＋ｄ！であった。得られた粒状
体から夫々　１００ｄを採取し乾燥φ吊を測定したとこ
ろ、夫々　７．５ｇ、　　７．２ｇ、　　６．８ｇであ
った。 次に得られた粒状体より夫々　１ｏｏ７　（況容積）を
採取し、ジメチルホルムアミドで水を置換し、フェニル
イソシアネートを夫々４．５ｇ、　　４．０ｇ。 ４、Ｏｇを添加し、室温で１時間反応させた後、未及応
のフェニルイソシアネートをジメチルホルムアミドで置
換し、その後充分水洗し、試料９〜１１を得た。得られ
た試料について実施例１と同様にフェニル基導入Φ、圧
縮弾性率、細孔径を測定し、その結果を第３表に示した
。又、実施例１と同様に酢酸菌を吸着させてその酢酸菌
の吸着数を測定し、その結果を第３表に示した。 以下余白 第３表 第３表から明らかなように細孔径が１５μｍを超えると
フェニル基を導入しても圧縮弾性率の著しい低下が認め
られる。 Ｋ発明の効果】 本光明は、低分子量キトサンの酸性水溶液を塩基性水溶
液中で成型し、これを酸溶液で処理し、更にフェニルイ
ソシアネートを反応させることにより、多孔質粒状体の
キトサンを構成するピラノース環１００構造単位当りの
フェニル基導入量を４〜４５とすると共に、多孔質粒状
体の孔径を３〜１０μ乳の特定範囲とすることにより、
担体に要求される圧縮弾性率を高めると共に、酢酸菌の
＠着量を従来の担体く特願平１−４５７８１号記載）よ
りも数倍増加せしめることが可能となったものであり、
本光明によれば優れた酢酸菌固定化用担体を得ることが
できる。 特許出願人　　富士紡績株式会社 代理人　弁理士　　　大　野　克　躬 代理人　弁理士　　　大　野　令　子

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、多孔質粒状体のキトサンを構成するピラノース環１
   ００構造単位当りのフェニル基導入量が４〜４５で、該
   多孔質粒状体の細孔径が３〜１０μｍであることを特徴
   とする酢酸菌固定化用担体。 ２、低分子量キトサンの酸性水溶液を塩基性水溶液中で
   凝固析出させて多孔質キトサン粒状体を得、次いで酸溶
   液で処理し、更にフェニルイソシアネートを反応させる
   ことを特徴とする酢酸菌固定化用担体の製造法。