JPH03290188A - 酵素もしくは微生物固定化用担体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 に産業上の利用分野】 本発明は、脱水乾燥時の担体の収縮率を小さくし、又、
該担体に高い圧縮強度を付与さゼた、酵素もしくは微生
物を固定化するのに優れた性能を具備した担体の製造方
法に関するものである。

Ｋ従来の技術１ 多糖類系の担体はその優れた多孔性と親木性能により固
定化用担体、クロマトグラフィ・−用担体として好適で
あるが、反面、物理的強度が低く、又、含水率が高いの
で脱水乾燥前後の担体の容積変化が極めて大きいもので
あった。本発明者等は、特公昭６３−５４２８６号、特
開昭６３−２８４５３号及び特開昭６３−２０５１４４
号で開示した如く、キ１−サンの多孔質成形物を酵素の
固定化用担体として使用するために各種の架橋剤で官能
基を導入することを研究してきたが、水溶液中で酵素を
固定化し、そのまま水溶液中で酵素反応を行う際には極
めて優れた性能を発揮するが、有機溶剤中で酵素反応を
行う場合には酵素固定化用担体の脱水乾燥操作が必須で
あり、脱水乾燥を行う場合には担体の収縮が著しく、酵
素の発現活性は極めて低いものであった。又、特願平１
−４５７８１！で出願した微生物の固定化用担体は、酵
母や糸状菌の如き比較的大きな微生物を固定化させるの
に好適な細孔を多孔質キ［・サン成形物が具備している
が、担体の空隙率が高く流動層型リアクターでは優れた
性能を発揮するが、カラム充填の固定層型リアクターで
は圧線強度の点で未だ不充分であった。

Ｋ発明が解決しようとする課題】 有機溶剤中での酵素反応の特徴は、脱水縮合反応を行う
酵素の平衡関係を生成物側に移動させることで、反応液
中の水分は厳格に制御されなければならない。一方、酵
素は有機溶剤に不溶であるので、担体に酵素を固定化す
るためには酵素水溶液中に担体を加えて酵素を担体に吸
着固定化した後、脱水乾燥をする操作が必要である。従
って、固定化された酵素の充分なる発現活性を得るため
に、脱水乾燥時の坦体の収縮を出来るだけ小さくする必
要がある。しかし、上述したキトサン系固定化用担体は
、多孔質で酵素や基質の拡散が良好であるうえ親水性を
′具備しているので、吸着された酵素の変性が少なく発
現活性が高いという特徴をもっているが、担体が脱水乾
燥されたとき壊れたり、また著しく収縮をする欠点があ
った。又、微生物固定化用担体として用いたときには、
無機質担体に比較して弾力性があるうえに比重が小さい
ことから流動性に富み、種々の攪拌操作に耐える優れた
性能があるが、微生物が担体内部に入り込める大きさの
細孔径を具備させることで担体内部の空隙率が高くなり
、特に流動層型リアクターでは通液時に生ずる担体の圧
密化が著しいものであった。

本発明は、脱水乾燥操作に対しての担体の収縮率を小さ
くし、又、高い圧縮強度を有する如く改善することを目
的とするものである。

１課題を解決するための手段ｙ 本発明は、低分子量キトサンの酸性水溶液を塩基性水溶
液中で凝固析出させ多孔質キトサン成形物を得、次いで
脂肪族ポリアルコールのグリシジルエーテルを反応させ
、更に官能基を導入する固定化用担体の製造方法におい
て、脂肪族ポリアルコールのグリシジルエーテルを水酸
化カリウムを含むジオキサン中で反応させることを特徴
とする酵素゛もしくは微生物固定化用担体の製造方法で
ある。

本発明においては、キトサンとして平均分子量が１０，
０００〜２３０，０００の低分子量キトサンが用・いら
れ、該低分子量キトサンを酢酸、ジクロル酢酸。

蟻酸の単独又は混合物の水溶液に溶解させてキトサン酸
性水溶液とする。キトサン酸性水溶液中のキー・サンの
濃度は２〜２０％（重量）の範囲で自由に選択できる。

この際、キトサン酸性水溶液中に細孔調節剤として水溶
性高分子物質であるポリビニルアルコール、ポリエチレ
ングリコール等を単独又は組合せ添加してもかまわない
。該キー・サン酸性水溶液からキー・サンを再生して多
孔質キー・サン成形物を得るためには、例えば孔径０，
１〜０．２５ｍｍφのノズルより圧力下で塩基性水溶液
中に該キトサン酸性水溶液を一定量づつ落下させ凝固再
生させることにより、多孔質キトサン成形物の粒状体が
得られる。塩基性凝固液中に加える塩基性物質としては
、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム
、炭酸カリウム、アンモニア。

エチレンジアミン等のアルカリ性物質が用いられ、塩基
性溶液とするには、水、又はメタノール、エタノール等
の極性を有するアルコール類又は水とアルコール類の混
合物に上述の塩基性物質を加えて使用する。得られた水
を含有する多孔質キトサン成形物は、成形物の表面に更
に大きな直径の細気孔を具現さすためには、必要に応じ
特願平１−４５７８１号で開示した方法による表面処理
を行ってもよい。即ち、得られた多孔質キトサン成形物
を必要に応じメタノール、エタノール、イソプロピルア
ルコール等のアルコール類やアクリロニトリル等の極性
溶媒を用いて水を置換して酸水溶液で表面処理をする。

この際用いられる酸としては酢酸、蟻酸、プロピオン酸
等の有機酸、又は塩酸。

硝酸等の鉱酸が用いられる。酸による表面処理は、成形
物に水が含まれていれば酸の水溶液を、極性溶媒が含ま
れていれば該極性溶媒と酸の混合液を用いることが好ま
しい。酸のｌｌｉ度としては０．５〜５．０％（重量〉
のものが用いられ、処理時間は１０秒〜５分間の短時間
行われ、酸処理後は酸を充分水洗する。

次いで、最終生成物である担体の収縮率を小さくし、高
い圧縮強度を持たせるために多孔質キトサン成形物の水
をジオキサンで置換し、水酸化力リウム水溶液を入れ、
脂肪族ポリアルコールのグリシジルエーテルを加え、多
孔質キトサン成形物と等容積のジオキサン中で反応させ
る。この際の水酸化カリウムは、濃度が０，０１〜３規
定のものをジオキサンに対し１／１００〜１／１０の容
量加える。

本発明に用いられる脂肪族ポリアルコールのグリシジル
エーテルとしては、エチレングリコールジグリシジルエ
ーテル、トリエチレングリコールジグリシジルエーテル
、トリメチレンジグリシジルエーテル、テトラメチレン
グリコールジグリシジルエーテル、ヘキサメチレングリ
コールジグリシジルエーテルなどが挙げられる。多孔質
キ］・サン成形物と脂肪族ポリアルコールのグリシジル
エーテルとの反応は、２０〜９０℃好ましくは２５〜８
０℃の範囲で０．５〜４８時間ゆるやかな攪拌下で行わ
れる。

尚、本発明は、脂肪族ポリアルコールのグリシジルエー
テルを、水酸化カリウムを含むジオキサン中で反応させ
ることを特徴とするが、水酸化カリウムは他のアルカリ
性物質に比べてジオキサンとの溶解性が優れており、ま
た、水酸化カリウムはキトサンＣ−６位の水酸基との反
応性が良く、脂肪族ポリアルコールのグリシジルエーテ
ルとの架橋反応が促進されるという効果がある。

反応終了後ジオキサンで洗浄した後、純水で中性になる
まで洗浄する。この様にして得られた多孔質キトサン底
形物に、更に酵素もしくは微生物を固定化するのに適す
る種々の活性基を含む官能基を導入する。その官能基の
種類としては第１級。

第２級、第３級、第４級のアンモニウム基等の陰イオン
交換基；スルホン酸基、カルボン酸基等の陽イオン交換
基：イミノジ酢酸基、アミドオキシム基、チオール基、
ジチオカルバミン基等のキレート配位基；及び芳香族や
脂肪族アルキル等の疎水性基が挙げられる。これらをキ
トサンの残存アミン基もしくは水酸基に反応させるため
に用いられる試薬としては、上述の官能基を含むハロゲ
ン化アルキル、エポキシド、イソシアネート、ｍ無水物
、アルデヒド、ケトン、及びカルボン酸、スルホン酸の
酸ハロゲン化物等が挙げられる。

Ｋ実　施　例】 以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発
明は実施例記載の範囲に限定されるものではない。尚ミ
圧縮弾性率、比表面積、細孔径。

脱水乾燥後の乾燥担体容積は次の方法により測定した。

圧縮弾性率 レオメータ−ＮＲＨ−２０１０Ｊ−ＣＷ　（不動工業＠
Ｊ製）を用いて直径６．０ｍｔｎφ、深さｉｏｒＲｍの
サンプルアダプターに試料を詰め、直径５．５．ｍφの
棒を２ｃｍ／ｍｉｎの速度で４ｒＲｎ押し込んだときの
圧縮弾性率を測定した。

比表面積 試料を液体窒素中で急冷し一５０℃、　１ｏ−７１−−
ルの真空度下で凍結粒゛燥後、比表面積測定装置を用い
てＢＥＴ法で測定した。

細　　孔　　径 試料を液体窒素中で急冷し一５０℃、　１ｏ−７トール
の真空度下で凍結乾燥後、走査型電子顕微鏡で測定した
。

脱水乾燥後の乾燥担体容積 試料１０蔵が含有する水をアセトンで置換し、デシケー
タ中で自然乾燥後の容積で示した。

実施例１゜ 脱アセデル化度８０％、平均分子１５２，０００のキト
サン３５０ｇを３．５％酢酸水溶液４，６５０ｇに溶解
した。該溶液を、８％水酸化ナトリウム、２０％エタノ
ール、７２％水よりなる混合溶液中に孔径０．２５ｍｍ
φノズルから一定量づつ落下させ凝固再生させた後、中
性になるまで充分水洗して、平均粒径約１．２ｍｍφ、
圧縮弾性率１．　ｌｘ　１０６ｄｙｎ／ｃ＃１．比表面
積７０ＴＩｔ、、／ｇ、細孔径０．２μの多孔質キトサ
ン粒状体５文（湿潤）（試料へ）を得た。

得られた多孔質キトサン粒状体１℃（渭潤）を採取し、
これに含まれている水をジオキサンで充分置換した後、
９００ｄのジオキサンに０．５Ｎ−水酸化カリウム１０
０−を加えた溶液を加え攪拌した。

更にエチレングリコールジグリシジルエーテル３３、０
　ｇを加え、７０℃で３時間反応させた。反応終了１、
充分水洗し圧縮弾性率７．　Ｏｘ　１０６ｄｙｎ／ｃｉ
　。

　０ 比表面積８２ＴＩｔ／ｇ、細孔径０．１μの容積５１〇
−（湿潤）の担体く試料Ｂ〉を得た。

得られた試″ＩＡＢについて以下に記述する１、Ｉ［及
び■の方法により官能基の導入を行った。

■、試料Ｂの１００ｄ　（湿潤〉に１５％水酸化ナトリ
ウム水溶液を１００−加え、室温で１時間攪拌した。液
を除去した後、ジオキサン１００ｍｅと塩酸２−クロル
トリエチルアミン１２．９ｇとトリエチルアミン７．６
ｇを加え、８０℃で３時間ゆるやかに攪拌しながら反応
させ、終了後純水で充分水洗し、容＠　１０１ｄ　（湿
潤）の担体（試料１）を得た。

■、試料Ｂの１００ｄ　（湿１）に含まれる水をジメチ
ルホルムアミドで充分置換後、ヘキサメチレンジイソシ
アナート８ｇを加え、室温で２時間反応させ、終了後ジ
メチルホルムアミドで未反応のへキサメチレンジイソシ
アナートを除去し、イオン交換水で充分水洗し、容積９
９ｄ（湿潤〉の担体（試料２）を得た。

■、試料Ｂの１００ｄ　（湿潤）に含まれる水をジメ　
１　− チルホルムアミドで充分置換後、４，４′　−ジフェニ
ルメタンジイソシアナート８ｇを加え、室温で１時間反
応させた。反応終了後ジメチルホルムアミドで未反応の
４，４′　−ジフェニルメタンジイソシアナートを除去
し、イオン交換水充分水洗し、容量９８ｄ（湿ｆｌ！Ｉ
）の担体（試料３）を得た。

試料１．　２．　３の夫々について圧縮弾性率、比表面
積、細孔径、脱水乾燥後の乾燥担体容積を測定し、その
結果を第１表に示した。

比較例１゜ 実施例１と同様の操作で得られた試料Ａの１℃（湿潤）
に含まれる水をジオキサンで充分置換後、１／ｌのジオ
キサンを加え、水酸化カリウムを全く添加することなし
に、エチレングリコールジグリシジルエーテル３３．０
ｇを加え、７０℃で３時間反応させた。反応終了後充分
水洗し圧縮弾性率２．８×１０６ｄｙｎ／ｃｎ、比表面
積８０ＴＩｔ、７ｇ、細孔径０．２μの容積６９０ｄ　
（湿潤）の担体（試ｎＣ）を得た。得られた試料Ｃにつ
いて夫々　１ｏｏｙ　＜湿潤）を３本２ 採取し夫々について実施例１に記述した１、ＩＩ及び■
の官能基の導入処理を行い、夫々容積１０１−（湿潤）
（試料４）、容積９５ｄ　（湿潤）（試料５）、容積９
５ｄ（湿潤）（試料　６）を得た。得られた試料４．　
５．　６について圧縮弾性率、比表面積。

細孔径、脱水乾燥後の担体容積を測定し、その結果を第
１表に示した。

第１表 以下余白 ３ ４ 第１表の結果より明らかな如く、脂肪族ポリアルコール
のグリシジルエーテルを反応さす際に、水酸化カリウム
を使用しなかった試料４．　５．　６については圧縮弾
性率、乾燥担体容積（乾燥時の担体の収縮を防止する）
が本願発明の方法によって得られたものよりも劣ってい
ることが明らかである。

実施例２゜ 脱アセチル化度７８％、平均分子ｆｉ１２，０００のキ
Ｉ・サン７００ｇと、ポリエチレングリコール（分子量
２９．０００　　和光ｌＫ！薬工業■製）１００ｇを、
総量が１０℃になる如く３％酢酸水溶液に溶解した。該
溶液を、２．５％アンモニア、２０％エタノール、　７
７．５％水からなる混合溶液中に孔径０．２５．ｍφノ
ズルから一定量づつ落下させ凝固再生させた後、中性に
なるまで充分水洗して平均粒径約１．２ｆｆｉｌφの多
孔質キトサン粒状体１０℃〈湿潤容積〉を得た。得られ
た多孔質キトサン粒状体５℃（温潤）を採取し、これに
含まれている水を吸引濾過で除去後、０．５％酢酸水溶
液５℃中に２５℃で３０秒間浸漬処理した５ 後、直ちに中性になるまで水洗を行い、圧縮弾性率０．
　Ｑｘ　１０６ｄｙｎ／ｃｍ　、比表面積２０．５Ｔｄ
、／　ｇ、　ｌＩＩ孔径２０μの多孔質キトサン粒状体
３，９００ｄ　（湿潤容積）（試料Ｄ）を得た。得られ
た多孔質キトサン粒状体１℃（湿潤）を採取し、これに
含まれている水をジオキサンで充分置換した後、９０（
ｌｄのジオキサンに０．５Ｎ−水酸化カリウム１００−
を加えた溶液を加え、攪拌した。更にエチレングリコー
ルジグリシジルエーテル２８９を加え、７０°Ｃで３時
間反応させた。反応終了後、充分水洗し圧縮弾性率１．
５ｘ　１０６ｄＶｎ／ｃＩＩ、比表面積２６ＴＩＬ／ｇ
、細孔径１６μの担体６００ｍ　（湿潤容積）（試料Ｅ
）を得た。

得られた試料Ｅについて夫々　１００ｄ　（湿潤）を３
本採取し実施例１に記述した■、■及び■の方法により
官能基の導入を行い、■の処理で容積１００ｄ（湿潤）
の担体（試料７）、■の処理で容積９９−（湿潤）の担
体（試料８〉及び■の処理で容積９８ｄ　（湿潤）担体
（試料９〉を得た。試料７゜８．９の夫々について圧縮
弾性率、比表面積、細孔径、脱水乾燥後の乾燥担体容積
を測定し、その　１６− 結果を第２表に示した。

比較例２゜ 実施例２と同様の操作で得られた試料りの１℃（湿潤）
に含まれる水をジオキサンで充分置換後、１℃のジオキ
サンを加え、水酸化カリウムを全く添加することなしに
、エチレングリコールジグリシジルエーテル２８ｇを加
え、７０℃で３時間反応させた。反応終了後充分水洗し
、圧縮弾性率３，２×１０６ｄｙｎ／ｃｄ、比表面積３
０ｒｄ、／９．細孔径１９μの容積８１０ｄ　＜湿潤）
の担体（試料Ｆ）を得た。

得られた試料Ｆについて夫々１００ｍ　＜湿潤）を３本
採取し、夫々について実施例１に記述した■。

■及び■の官能基の導入処理を行い、夫々容積１００ｄ
　（湿潤）（試料１０）、容積９９−（湿潤）〈試料１
１）、容積９６ｄ（湿潤）（試料１２〉を得た。

得られた試料１０．１１．１２について、圧縮弾性率。

表面積、細孔径、脱水乾燥後の乾燥担体容積を測定し、
その結果を第２表に示した。

第２表 １７ ８ 第２表の結果から明らかな如く、細孔径が第１表の数値
より大きいにも拘らず実施例２の本発明の方法による担
体は高い圧縮弾性率を有し、乾燥担体容積においても優
れていることが明らかである。

Ｋ発明の効果】 本発明の製造方法による酵素もしくは微生物固定化用担
体は、カラム充填時の充填圧や担体の乾燥操作に対し高
い安定性を具備しており、非水系での酵素反応用固定化
担体として極めて優れた性能を発揮する。又、酵母や糸
状菌等の微生物を固定化するのに適した大きな細孔径を
具備させても圧縮に対する高い強度があり、固定化微生
物の流動層型リアクターとしての反復繰り返し使用や長
期連続使用、更には充填型リアクターへの利用にも極め
て優れた固定化用担体である。

手続補正書輸発） １６　　事件の表示 平成辱弁 ２年　特許願　第　９１５４０号 ２、発明の名称 酵素もしくは微生物固定化用担体の製造方法３、補正を
する者 事件との関係 住　　所 氏　　名

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、低分子量キトサンの酸性水溶液を塩基性水溶液中で
   凝固析出させ多孔質キトサン成形物を得、次いで脂肪族
   ポリアルコールのグリシジルエーテルを反応させ、更に
   官能基を導入する固定化用担体の製造方法において、脂
   肪族ポリアルコールのグリシジルエーテルを水酸化カリ
   ウムを含むジオキサン中で反応させることを特徴とする
   酵素もしくは微生物固定化用担体の製造方法。