JPH0411900A

JPH0411900A - 加水分解酵素の測定方法

Info

Publication number: JPH0411900A
Application number: JP14997090A
Authority: JP
Inventors: Tetsuaki Kawanishi; 徹朗川西; Hiroyuki Asai; 裕之浅井; Hiroshi Suzuki; 宏鈴木
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1990-04-19
Filing date: 1990-06-11
Publication date: 1992-01-16

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、加水分解酵素の測定方法に関する。

〔従来の技術〕

尿中に出現する白血球の量は、腎・尿路感染症の診断の
指針となる。さらに腹膜透析液中の白血球のモニタリン
グは、腹膜炎の早期発見の指針となる。これらの白血球
の検出は従来鏡検によって行われていたが、この方法は
高価な機器を必要とする、長い測定時間を必要とする、
複雑な測定操作を必要とする等の欠点を有している。こ
のような問題点を解決するため、白血球中のエステラー
ゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素を指標とした検出法
が盛んになってきた。この方法では、簡単な操作でしか
も短時間で結果が得られる。また、酵素活性を指標とす
るため崩壊した白血球も検出可能である。すでに（Ａ）
酵素基質としてフェノキシアミノ酸エステルを、顕色剤
としてジアゾニウム塩を含有する、蛋白質分解酵素の検
出法〔特公昭６ｌ−４５９８２）　、（Ｂ）インドキシ
ル−アミノ酸エステルおよびペプチドエステルを色原体
として含有する、エステルおよび蛋白質分解酵素の検出
法〔特公昭５９−３４７５３　、（Ｃ）５−フェニルピ
ロールエステルを用いた加水分解対象物の検出法〔特公
昭８２−４１７１０）が知られている。しかしながらこ
れらの方法においても、使用する試薬が高価である、呈
色安定性に欠ける、感度が悪い等の問題点を有している
。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、本発明の目的は、新規な加水分解酵素の測定方
法を提供することにある。すなわち、被検出物である加
水分解酵素を、特別なあるいは高価な装置を必要とせず
、簡単な操作で迅速かつ高感度でＩＩ定できる方法を提
供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的は、少なくとも１個のチオエステル結合を有す
る基質に被測定加水分解酵素を作用させ、生成するチオ
ール化合物と指示薬とを反応させて呈色させ、該呈色の
強度に関連させて加水分解酵素の量を測定することを特
徴とする加水分解酵素の測定方法により達成される。

本発明はまた、チオール化合物検出のための指示薬が式
（Ｉ）Ｈ（式中Ｘは同一または異なって、アルキルアミノ基、ア
リールアミノ基またはスルホン酸基を示し、Ｒは水素原
子または置換されていてもよい芳香族基を示す）で表される化合物である加水分解酵素の測定方法である
。

本発明はさらに、指示薬が５．５′−ジチオビス（２−
ニトロ安息香酸）である加水分解酵素の測定方法である
。本発明はさらに、加水分解酵素の測定を指示薬呈色の
吸光度測定によってなされる加水分解酵素の測定方法で
ある。

〔作　　用〕

本発明によれば、下記一般式（ｎ）で示されるチオエス
テルを有する基質は、エステラーゼ、プロテアーゼ等の
加水分解酵素の作用によって、次式に示すごとくチオエ
ステル結合が分解されて下記一般式（ｍ）で示される遊
離のチオールを生じる。

Ｒ’−５ＣＯ−Ｙ−４−Ｒ’−ＳＨ＋ＨＯＯＣ−Ｙ（Ｉ
Ｉ）　　　　　　　　（ｍ）上記中Ｒ′およびＹは有機基を示す。

この遊離のチオールの検出は、下式に示すごとく、一般
式（Ｉ）で示されるベンツヒトロールを用いて行うこと
ができる。すなわち、ベンツヒトロール（Ｉ）は測定系
に存在する酸によってカチオン（ｍＶ）となり、極大吸
収波長８０８ｎｓの青色を示す。これに、加水分解酵素
の作用によって生じた遊離のチオール（ｍ）が反応して
複合体（Ｖ）を形成する。この複合体は無色のため、６
０６ｎｓの吸光度の減少を測定することによってチオー
ルを定量することが可能である。

Ｈ（ＩＶ）（ｍ）ＳＲ’ （Ｖ）また、遊離のチオール検出は、下式に示すごとく、一般
式（Ｖ［）で示される５、５′−ジチオビス（２−ニト
ロ安息香酸）を用いても行うことができる。すなわち、
遊離のチオール（ｍ）によって５．５′−ジチオビス（
２−ニトロ安息香酸）が還元を受けると、５−メルカプ
ト−２−二トロ安息香酸（■）が生成する。極大吸収波
長４１２ｎｗの吸光度を測定し、これの生成量を知るこ
とによって、チオールの定量ができる。

（Ｖｌ）　　　　　（ｍ）前記の２法は可視領域での呈色変化を有するため、目視
による読み取りで半定量を行うことも可能である。分光
光度計による吸光度測定は、正確な加水分解酵素の定量
を可能とする。

本発明で使用される酵素基質としては、チオエステル結
合を有する化合物であって、測定目的の加水分解酵素の
基質特異性を満足するものであれば、何れも利用できる
。例えば、白血球中の加水分解酵素を検出するためには
、置換あるいは無置換チオフェノールの保護アミノ酸エ
ステルや、置換あるいは無置換ベンジルチオールの保護
アミノ酸エステルが適している。さらに、アミノ酸残基
数２〜６のポリペプチドのアミド結合部位のいずれかが
、チオエステル結合に変わった化合物も基質として適し
ている。

具体的には以下の化合物が利用可能である。

■　（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニルチオ
）ベンゼン ■　４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニル
チオ）トルエン ■　４−（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーＬ−アラニル
チオ）クロロベンゼン ■　４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニル
チオ）アニソール ■　４−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニル
チオ）ニトロベンゼン ■　１．３−ジクロロ−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル
−し−アラニルチオ）ベンゼン ■　４−（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーＬ−アラニル
チオ）アセチルベンゼン ■　（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーＬ−アラニン）ベ
ンジルチオエステル ■　（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーし一アラニン）−
４−メチルベンジルチオエステル［相］　（Ｎ−ｐ−ト
ルエンスルホニル−し−アラニン）−４−クロロベンジ
ルチオエステル■　（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーＬ
−アラニン）−４−メトキシベンジルチオエステル■　
（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニン）−４−
ニトロベンジルチオエステル＠（Ｎ−ｐ−）ルエンスル
ホニルーＬ−アラニン）−２，４−ジクロロベンジルチ
オエステル［有］　（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーＬ
−アラニン）−４−アセチルベンジルチオエステル■　
（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニン）エチル
チオ乳酸エステル＠（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ〜アラニル）−Ｌ
−アラニンエチルチオ乳酸エステル■　（Ｎ−ｐ−トル
エンスルホニル−し−バリン）エチルチオ乳酸エステル＠（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−し−アラニン）エチ
ルチオ乳酸エステル＠（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−し−アラニル）−Ｌ
−バリンエチルチオ乳酸エステル［相］　（Ｎ−ｔ−ブ
トキシカルボニル−し−バリル）−Ｌ−アラニンエチル
チオ乳酸エステルチオール検出のための指示薬としては
、４．４′ビス（ジメチルアミノ）ベンツヒトロール、
４．４′−ビス（ジエチルアミノ）ベンツヒトロール等
の式（１）を有するジフェニルカルピトール誘導体、ま
たは５．５′−ジチオビス（２−二トロ安息香酸）等の
エールマン試薬が用いられる。

実際の加水分解酵素の測定は、該基質と被７１！１定試
料を適当な緩衝液中で反応させた後、チオール検出指示
薬を添加し呈色反応後、溶液の色調変化を目視ないし透
過吸光度の測定によって読ろ取る。

または、最初からチオール検出指示薬を基質と被測定試
料に混合させ、酵素反応と呈色反応を同時に行わせるこ
ともできる。場合によっては、酵素活性化剤や指示薬の
増感剤、あるいは界面活性剤を加えることにより、より
高い感度と正確な測定結果が得られる。例えば、白血球
中の加水分解酵素の活性化剤としては、炭素数８〜１２
の直鎖のアルコールや、炭素数８〜１５の直鎖のエーテ
ル結合を含むアルコールが用いられる。また増感剤とし
ては、例えばジフェニルカルピトール誘導体を指示薬と
して用いた時、グアニジンを反応系に添加することによ
って呈色反応の深色化が可能となる。

さらに界面活性剤として、アルキルスルホン酸塩、ポリ
エチレングリコール、スパン、トウィーン等を用いるこ
とができる。

反応は溶液中で行う他、反応に必要な試薬を担体に含有
させた試験具を用いることによって、測定に要する操作
がより簡便となる。この場合、被測定試料に試験具を含
浸させた後、試験具の色調変化を目視ないし反射吸光度
の測定によって読み取る。この方法は、尿検体のルーチ
ン検査等に有用である。

次に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明する。

〔実施例１〕２５ｍＭ基質のジメチルスルホキシド溶液１０ｍに、検
体９０ｍを加え、３７℃で１０分間反応させた。２．０
Ｍのグアニジンを含有する０、２Ｍボラックスー塩酸緩
衝液（ｐｔｌ＝　６．０）　１００ｍ１に、２．５ｓＭ
　４．４’−ビス（ジメチルアミノ）ベンツヒトロール
のアセトン溶液１．０２ｍ１を添加した指示薬溶液を予
め調製しておき、酵素反応液の溶液にこれを９．８ｍｌ
を加え、室温で２０分放置後、６０６ｎｓ透過吸光度を
測定した。

測定は分光光度計Ｕ　−２０００（日立製作新製）を用
いて行った。検体としては、ヒト末梢血より常法にて単
離した顆粒球画分のＰＢＳ懸濁液を用いた。

各種基質を用いて行った測定結果を表１に、基質として
（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーＬ−アラニルチオ）ベ
ンゼンを用い、種々の濃度の検体を測定し得られた検量
線を第１図に示す。

〔実施例２〕指示薬として、５．５’−ジチオビス（２−ニトロ安息
香酸）を用い、実施例１と同様の実験を行った。吸光度
測定は４１２ｎ１で行った。基質として（Ｎ−ｐ−）ル
エンスルホニルーＬ−アラニルチオ）ベンゼンを用い、
種々の濃度の検体を測定し得られた検量線を第２図に示
す。

〔実施例３〕濾紙（アトバンチツクに５１４Ａ　）を、２００ｍＭボ
ラックスー塩酸緩衝液（ａｌｌ−６，０）を含有する水
溶液に含浸し、６０℃で５０分通風乾燥した。更にこの
濾紙を、２．０ｍＭ基質、０．３ｄ　４．４’−ビス（
ジメチルアミノ）ベンツヒトロール、２％エチレングリ
コールモノヘキシルエーテルを含有するアセトン溶液に
含浸し、４０℃で２０分通風乾燥した。これを、５×５
１■角に切断し、検体を滴下して１分後の呈色変化を試
験紙表面の６０６ｎｓの反射吸光度を測定することによ
り観察した。測定は大塚電子製のＭ　ＣＰ　Ｄ　−２０
０を用いて測定した。測定結果を表２に示した。また、
基質として（Ｎ−ｐ−）ルエンスルホニルーし一アラニ
ルチオ）ベンゼンを用い、種々の濃度の検体を測定し得
られた検量線を第３図に示す。

〔実施例４〕指示薬を４，４′〜ビス（ジメチルアミノ）ベンツヒト
ロールから５．５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸
）に変えて、実施例３と同様の実験を行った。吸光度測
定は４１２ｎ−で行った。基質として（Ｎ−ｐ−）ルエ
ンスルホニルーＬ−アラニルチオ）ベンゼンを用い、種
々の濃度の検体を測定し得られた検量線を第４図に示す
。

４、

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第４図は、実施例１乃至実施例４においてそれぞれ得られる検量線を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）少なくとも１個のチオエステル結合を有する基質
に被測定加水分解酵素を作用させ、生成するチオール化
合物と指示薬とを反応させて呈色させ、該呈色の強度に
関連させて加水分解酵素の量を測定することを特徴とす
る加水分解酵素の測定方法。
（２）前記指示薬が式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼ （ I ）（式中Ｘは同一または異なって、アルキルアミノ基、ア
リールアミノ基またはスルホン酸基を示し、Ｒは水素原
子または置換されていてもよい芳香族基を示す）で表される化合物である請求項１に記載の測定方法。
（３）指示薬が５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息
香酸）である請求項１に記載の測定方法。
（４）加水分解酵素の測定が指示薬呈色の吸光度測定に
よってなされる請求項１乃至３のいずれかの項に記載の
測定方法。