JPH04120095A - カエル由来新規生理活性ペプチド（カエルｃｎｐ） - Google Patents
カエル由来新規生理活性ペプチド（カエルｃｎｐ）Info
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- JPH04120095A JPH04120095A JP2238294A JP23829490A JPH04120095A JP H04120095 A JPH04120095 A JP H04120095A JP 2238294 A JP2238294 A JP 2238294A JP 23829490 A JP23829490 A JP 23829490A JP H04120095 A JPH04120095 A JP H04120095A
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
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- A61P5/42—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones for decreasing, blocking or antagonising the activity of mineralocorticosteroids
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- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、カエル由来のナトリウム利尿作用及び血圧降
下作用を有する新規な生理活性ペプチドに関する。さら
に詳しくはＣ型ナトリウム利尿ペプチドに帰属される新
規生理活性ペプチドの単離・同定及びその利用方法に関
する。
下作用を有する新規な生理活性ペプチドに関する。さら
に詳しくはＣ型ナトリウム利尿ペプチドに帰属される新
規生理活性ペプチドの単離・同定及びその利用方法に関
する。
（従来の技術）
近年、哺乳動物において心房及び脳から、ナトリウム利
尿ペプチド（ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ
；ＮＰ）と呼ばれる種々のペプチドが発見されてきた。
尿ペプチド（ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ
；ＮＰ）と呼ばれる種々のペプチドが発見されてきた。
現在これらＮＰは、アミノ酸−次配列の類似性及びそれ
らの前駆体構造から、３つのタイプ、すなわちＡ型Ｎ
Ｐ （Ａ−ｔｙｐｅ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐ
ｔｉｄｅ；ＡＮＰ）、Ｂ型Ｎ Ｐ （Ｂ−ｔｙｐｅ ｎ
ａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ；ＢＮＰ）及び
Ｃ型Ｎ Ｐ （Ｃ−ｔｙｐｅ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ
ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＮＰ）のいずれかに分類すること
ができる。
らの前駆体構造から、３つのタイプ、すなわちＡ型Ｎ
Ｐ （Ａ−ｔｙｐｅ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐ
ｔｉｄｅ；ＡＮＰ）、Ｂ型Ｎ Ｐ （Ｂ−ｔｙｐｅ ｎ
ａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ；ＢＮＰ）及び
Ｃ型Ｎ Ｐ （Ｃ−ｔｙｐｅ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ
ｐｅｐｔｉｄｅ；ＣＮＰ）のいずれかに分類すること
ができる。
このうち、ＡＮＰ−ＢＮＰは最初それぞれ心房、脳から
単離・同定されたことから、ＡＮＰは心房性ナトリウム
利尿ペプチド（ａｔｒｉａｌ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ
ｐｅｐｔｉｄｅ） 、Ｂ Ｎ Ｐは脳ナトリウム利尿
ペプチド（ｂｒａｉｎ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅ
ｐｔｉｄｅ）とも呼ばれている（Ｍａｔｓｕｏ、Ｈ，ａ
ｎｄ Ｎａｋａｚａｔｏ、Ｈ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、
Ｍｅｔａｂ、 Ｃ１１ｎ、Ｎｏｒｔｈ Ａｍ、、１６．
４３．１９８７； ５ｕｄｏｈ Ｔ、ｅｔ ａｌ、
Ｎａｔｕｒｅ、 ３３２，７８，１９８８） 、しかし
現在、ＡＮＰは心房のみならず、脳にも存在しているこ
と、同様にＢＮＰは脳のみならず心房にも存在してぃる
ことが判り、また、ＡＮＰ−ＢＮＰはナトリウム利尿作
用及び血圧降下作用を示すことから、ＡＮＰ −ＢＮＰ
はいずれも吐乳類の体液及び血圧の恒常性を調節するホ
ルモンとして、また脳においては神経伝達物質として作
用していることが明らかになってきた。
単離・同定されたことから、ＡＮＰは心房性ナトリウム
利尿ペプチド（ａｔｒｉａｌ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ
ｐｅｐｔｉｄｅ） 、Ｂ Ｎ Ｐは脳ナトリウム利尿
ペプチド（ｂｒａｉｎ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅ
ｐｔｉｄｅ）とも呼ばれている（Ｍａｔｓｕｏ、Ｈ，ａ
ｎｄ Ｎａｋａｚａｔｏ、Ｈ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、
Ｍｅｔａｂ、 Ｃ１１ｎ、Ｎｏｒｔｈ Ａｍ、、１６．
４３．１９８７； ５ｕｄｏｈ Ｔ、ｅｔ ａｌ、
Ｎａｔｕｒｅ、 ３３２，７８，１９８８） 、しかし
現在、ＡＮＰは心房のみならず、脳にも存在しているこ
と、同様にＢＮＰは脳のみならず心房にも存在してぃる
ことが判り、また、ＡＮＰ−ＢＮＰはナトリウム利尿作
用及び血圧降下作用を示すことから、ＡＮＰ −ＢＮＰ
はいずれも吐乳類の体液及び血圧の恒常性を調節するホ
ルモンとして、また脳においては神経伝達物質として作
用していることが明らかになってきた。
ＧＮＰはごく最近５ｕｄｏｈらにより、ＡＮＰ−’ＢＮ
Ｐのいずれにも帰属されない新しいタイプのＮＰとして
ブタ脳から単離・同定された（Ｓｕｄｏｈ、Ｔｅｔ ａ
ｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃ
ｏｍｍｕｎ、、里、８６３゜１９９０）。すなわち、Ｇ
ＮＰは２２アミノ酸残基より成り、ＡＮＰ −ＢＮＰと
同様２個のシスティン残基を含んでおり、これが分子内
でジスルフィド結合を形成し、１７アミノ酸残基より構
成された環状構造を持っている。しかもこの環状構造を
形成しているアミノ酸−次配列にはＡＮＰ−ＢＮＰのそ
れらと高い相同性が見いだされた。ＧＮＰの構造上の特
徴はＡＮＰ−ＢＮＰがいずれも上記環状構造のＣ−末端
部分にさらに数個のアミノ酸が付加したいわゆるテイル
構造（ｔａｉｌ構造）を持っているのに対し、ＧＮＰに
はこの構造がない。すなわち、ＣＮＰのＣ−末端はシス
ティン残基で終わっている。このことから、ＧＮＰの構
造はＡＮＰ・ＢＮＰと似ているが、これらとは全く異な
っていることか判り、また、ＣＮＰかナトリウム利尿作
用及び血圧降下作用を示し、かつヒヨコ直腸標本を用い
た弛緩活性でＡＮＰ −ＢＮＰに比べ高い比活性を示す
ことから、ＧＮＰは新しいタイプのＮＰであることが判
った。
Ｐのいずれにも帰属されない新しいタイプのＮＰとして
ブタ脳から単離・同定された（Ｓｕｄｏｈ、Ｔｅｔ ａ
ｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃ
ｏｍｍｕｎ、、里、８６３゜１９９０）。すなわち、Ｇ
ＮＰは２２アミノ酸残基より成り、ＡＮＰ −ＢＮＰと
同様２個のシスティン残基を含んでおり、これが分子内
でジスルフィド結合を形成し、１７アミノ酸残基より構
成された環状構造を持っている。しかもこの環状構造を
形成しているアミノ酸−次配列にはＡＮＰ−ＢＮＰのそ
れらと高い相同性が見いだされた。ＧＮＰの構造上の特
徴はＡＮＰ−ＢＮＰがいずれも上記環状構造のＣ−末端
部分にさらに数個のアミノ酸が付加したいわゆるテイル
構造（ｔａｉｌ構造）を持っているのに対し、ＧＮＰに
はこの構造がない。すなわち、ＣＮＰのＣ−末端はシス
ティン残基で終わっている。このことから、ＧＮＰの構
造はＡＮＰ・ＢＮＰと似ているが、これらとは全く異な
っていることか判り、また、ＣＮＰかナトリウム利尿作
用及び血圧降下作用を示し、かつヒヨコ直腸標本を用い
た弛緩活性でＡＮＰ −ＢＮＰに比べ高い比活性を示す
ことから、ＧＮＰは新しいタイプのＮＰであることが判
った。
以上のことから、現在哺乳動物においては少なくとも３
つの異なったタイプに属する種々のＮＰペプチドか存在
し、これらが体液量及び血圧の恒常性（ホメオスタシス
）の調節に関与していることが判ってきた。なお、現在
までのところＧＮＰの生体内分布及び生理作用の詳細に
ついてはＡＮＰ−ＢＮＰはど明確には判っていない。
つの異なったタイプに属する種々のＮＰペプチドか存在
し、これらが体液量及び血圧の恒常性（ホメオスタシス
）の調節に関与していることが判ってきた。なお、現在
までのところＧＮＰの生体内分布及び生理作用の詳細に
ついてはＡＮＰ−ＢＮＰはど明確には判っていない。
一方、非補乳類を椎動物においても、ＮＰの存在が確認
されている。しかし現在までに、カエルＡＮＰ、ニワト
リＮＰ及びウナギＡＮＰが単離・同定されているだけで
、非唾乳類動物のＮＰに関する情報は哺乳類のそれに比
べ、はるかに少ない（Ｓａｋａｔａ、Ｊ、、Ｋａｎｇａ
ｗａ、に、ａｎｄ Ｍａｔｓｕｏ、Ｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ
。
されている。しかし現在までに、カエルＡＮＰ、ニワト
リＮＰ及びウナギＡＮＰが単離・同定されているだけで
、非唾乳類動物のＮＰに関する情報は哺乳類のそれに比
べ、はるかに少ない（Ｓａｋａｔａ、Ｊ、、Ｋａｎｇａ
ｗａ、に、ａｎｄ Ｍａｔｓｕｏ、Ｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ
。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、１５５．１
３３８−１３４５．１９８８； Ｍｉｙａｔａ、Ａ、、
Ｍｉｎａｍｉｎｏ、Ｎ、、Ｋａｎｇａｗａ、に、ａｎｄ
Ｍａｔｓｕｏ、ＨＢｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、 Ｒｅｓ 、Ｃｏｍｍｕｎ 、 、 １５５ 、１３
３０−１３３７ 、１９８８Ｔａｋｅｉ Ｙ、 Ｔａｋ
ａｈａｓｈｉ、Ａ、、Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｔ、Ｘ、、Ｎ
ａｋａｊｉｍａ、に、ａｎｄ ５ａｋａｋｉｂａｒａ、
Ｓ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏ
ｍｍｕｎ、 １６４，５３７−５４３．１９８９）。
３３８−１３４５．１９８８； Ｍｉｙａｔａ、Ａ、、
Ｍｉｎａｍｉｎｏ、Ｎ、、Ｋａｎｇａｗａ、に、ａｎｄ
Ｍａｔｓｕｏ、ＨＢｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、 Ｒｅｓ 、Ｃｏｍｍｕｎ 、 、 １５５ 、１３
３０−１３３７ 、１９８８Ｔａｋｅｉ Ｙ、 Ｔａｋ
ａｈａｓｈｉ、Ａ、、Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｔ、Ｘ、、Ｎ
ａｋａｊｉｍａ、に、ａｎｄ ５ａｋａｋｉｂａｒａ、
Ｓ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏ
ｍｍｕｎ、 １６４，５３７−５４３．１９８９）。
ところで、哺乳類で見つけ出された生理活性ペプチドと
よく似たペプチドが両棲類から見いだされることがしば
しばある（Ｅｒｓｐａｍｅｒ、Ｖ、ａｎｄ Ｍｅｌｃｈ
ｉｏｒｉ、Ｐ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｓ
ｃｉ、、１．３９１−３９５，１９８ＯＮａｋａｊｉｍ
ａ、Ｔ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｓｃｉ、
、ス、２０２−２０５１９８１）。実際、本発明者らは
、ブタを髄中の未知ペプチドを探索した結果、両棲類で
見いだされたペプチドとよく似たペプチドを見いだすこ
とに成功している（Ｍｉｎａｍｉｎｏ、Ｎ、Ｋａｎｇａ
ｗａ、に、ａｎｄ Ｍａｔｓｕ。
よく似たペプチドが両棲類から見いだされることがしば
しばある（Ｅｒｓｐａｍｅｒ、Ｖ、ａｎｄ Ｍｅｌｃｈ
ｉｏｒｉ、Ｐ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｓ
ｃｉ、、１．３９１−３９５，１９８ＯＮａｋａｊｉｍ
ａ、Ｔ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｓｃｉ、
、ス、２０２−２０５１９８１）。実際、本発明者らは
、ブタを髄中の未知ペプチドを探索した結果、両棲類で
見いだされたペプチドとよく似たペプチドを見いだすこ
とに成功している（Ｍｉｎａｍｉｎｏ、Ｎ、Ｋａｎｇａ
ｗａ、に、ａｎｄ Ｍａｔｓｕ。
、Ｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏ
ｍｍｕｎ、、１１４，５４１−５４８１９８３； Ｍｉ
ｎａｍｉｎｏ、Ｎ、、Ｋａｎｇａｗａ、に、ａｎｄ Ｍ
ａｔｓｕｏ、Ｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒ
ｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、１１９．１４−２０．１９８４
； ＭＬｎａｍｉｎｏ、Ｎ、、５ｕｄｏｈ、Ｔ、Ｋａｎ
ｇａｗａ、に、ａｎｄ Ｍａｔｓｕｏ、Ｈ，Ｐｅｐｔｉ
ｄｅｓ、６（Ｓｕｐｐｌ、３） 、２４５−２４８．１
９８５）。
ｍｍｕｎ、、１１４，５４１−５４８１９８３； Ｍｉ
ｎａｍｉｎｏ、Ｎ、、Ｋａｎｇａｗａ、に、ａｎｄ Ｍ
ａｔｓｕｏ、Ｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒ
ｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、１１９．１４−２０．１９８４
； ＭＬｎａｍｉｎｏ、Ｎ、、５ｕｄｏｈ、Ｔ、Ｋａｎ
ｇａｗａ、に、ａｎｄ Ｍａｔｓｕｏ、Ｈ，Ｐｅｐｔｉ
ｄｅｓ、６（Ｓｕｐｐｌ、３） 、２４５−２４８．１
９８５）。
このことから、両棲類でも吐乳類と同様、今までに知ら
れているカエルＡＮＰ （カエルＡＮＰは吐乳類のＡＮ
Ｐに帰属される）以外に、タイプの異なるＮＰが存在し
ている可能性が高い。しかしながら、現在までに両棲類
からカエルＡＮＰ以外の新規ＮＰを単離・同定した報告
はない。
れているカエルＡＮＰ （カエルＡＮＰは吐乳類のＡＮ
Ｐに帰属される）以外に、タイプの異なるＮＰが存在し
ている可能性が高い。しかしながら、現在までに両棲類
からカエルＡＮＰ以外の新規ＮＰを単離・同定した報告
はない。
（発明が解決しようとする課題）
従って本発明では、両棲類から既に知られているカエル
ＡＮＰ以外の新規ＮＰを単離・同定し、このペプチドを
提供する方法を確立することを目的とする。
ＡＮＰ以外の新規ＮＰを単離・同定し、このペプチドを
提供する方法を確立することを目的とする。
（課題を解決するための手段）
本発明者は、吐乳類のＮＰを単離・精製する際、ヒヨコ
直腸標本を用いた弛緩活性が、比較的簡単でしかも確実
なＮＰの生物活性測定法であったことに着目し、このア
ッセイを指標にカエル脳から新規ＮＰを見いだすことを
計画した。
直腸標本を用いた弛緩活性が、比較的簡単でしかも確実
なＮＰの生物活性測定法であったことに着目し、このア
ッセイを指標にカエル脳から新規ＮＰを見いだすことを
計画した。
本発明では、まず、カエルの脳を適当な酸性溶媒例えば
氷酢酸などの中でホモジネートし、これを出発原料に、
ペプチドの精製に常用される各種精製法を組み合せ、前
記したバイオアッセイを指標に分子量的３０００を示す
ペプチド画分を精製したところ、最終的には第３図に示
すように、ヒヨコ直腸標本を用いたバイオアッセイ系で
弛緩活性を有するペプチドを単一で純粋な状態までに精
製することに成功した。次に、このペプチドの一部を還
元し、このペプチドに含まれるシスティン残基をカルボ
キシメチル化し、このペプチドのアミノ酸組成を求めた
ところこのペプチドは２２個のアミノ酸残基から成るペ
プチドであることが判った。
氷酢酸などの中でホモジネートし、これを出発原料に、
ペプチドの精製に常用される各種精製法を組み合せ、前
記したバイオアッセイを指標に分子量的３０００を示す
ペプチド画分を精製したところ、最終的には第３図に示
すように、ヒヨコ直腸標本を用いたバイオアッセイ系で
弛緩活性を有するペプチドを単一で純粋な状態までに精
製することに成功した。次に、このペプチドの一部を還
元し、このペプチドに含まれるシスティン残基をカルボ
キシメチル化し、このペプチドのアミノ酸組成を求めた
ところこのペプチドは２２個のアミノ酸残基から成るペ
プチドであることが判った。
さらに、このペプチドのアミノ酸−次配列を決定したと
ころ、最終的にこのペプチドは以下に示す構造を有する
新規ペプチドであることを見いだした。
ころ、最終的にこのペプチドは以下に示す構造を有する
新規ペプチドであることを見いだした。
（４）Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＯＨ（式中、（１）と（２）、（
３）と（４）は直接結合しており、６位と２２位のシス
ティン残基（Ｃｙｓ）は分子内でＳ−８結合を形成して
いる。） 以下本明細書において、この新規ペプチドをｆＣＮ Ｐ
（ｆｒｏｇ Ｃ−ｔｙｐｅ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ
ｐｅｐｔｉｄｅ）と称する。
ｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＯＨ（式中、（１）と（２）、（
３）と（４）は直接結合しており、６位と２２位のシス
ティン残基（Ｃｙｓ）は分子内でＳ−８結合を形成して
いる。） 以下本明細書において、この新規ペプチドをｆＣＮ Ｐ
（ｆｒｏｇ Ｃ−ｔｙｐｅ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ
ｐｅｐｔｉｄｅ）と称する。
ｆＣＮＰのアミノ酸−次配列及び構造を、今までに知ら
れている３つのタイプに分類されたＮＰのそれらと比較
したところ（第５図参照）、ｆＣＮＰはＣＮＰに帰属さ
れる新規ペプチドであることが判った。すなわち、ｆＣ
ＮＰはＣＮＰと同様２２アミノ酸残基より構成されてお
り、しかもＧＮＰの構造的特徴に一致してＣ−末端テイ
ル構造を持っていない。また、ｆＣＮＰのアミノ酸−次
配列の相同性をＡＮＰ、ＢＮＰ及びＣＮＰと比べると、
ｆＣＮＰはＧＮＰと最も高い相同性を持っていることが
判った。実際、ｆＣＮＰとＧＮＰのアミノ酸−次配列を
比較すると２２アミノ酸残基のうち、１７アミノ酸残基
が全く同一であった。しかも、残りの異なる５アミノ酸
残基についても、それらアミノ酸残基の性質（アミノ酸
残基の塩基性及び疎水性などの性質）は同じであること
が判った。さらに、ｆＣＮＰをラットに投与するとナト
リウム利尿作用及び血圧降下作用を示すことを見いたし
た。
れている３つのタイプに分類されたＮＰのそれらと比較
したところ（第５図参照）、ｆＣＮＰはＣＮＰに帰属さ
れる新規ペプチドであることが判った。すなわち、ｆＣ
ＮＰはＣＮＰと同様２２アミノ酸残基より構成されてお
り、しかもＧＮＰの構造的特徴に一致してＣ−末端テイ
ル構造を持っていない。また、ｆＣＮＰのアミノ酸−次
配列の相同性をＡＮＰ、ＢＮＰ及びＣＮＰと比べると、
ｆＣＮＰはＧＮＰと最も高い相同性を持っていることが
判った。実際、ｆＣＮＰとＧＮＰのアミノ酸−次配列を
比較すると２２アミノ酸残基のうち、１７アミノ酸残基
が全く同一であった。しかも、残りの異なる５アミノ酸
残基についても、それらアミノ酸残基の性質（アミノ酸
残基の塩基性及び疎水性などの性質）は同じであること
が判った。さらに、ｆＣＮＰをラットに投与するとナト
リウム利尿作用及び血圧降下作用を示すことを見いたし
た。
以上のことから、ｆＣＮＰはＧＮＰに帰属される新規ペ
プチドであることが判明し、本発明を完成するに至った
。
プチドであることが判明し、本発明を完成するに至った
。
なお、本発明でｆＣＮＰの構造が開示されたことから、
ｆＣＮＰを得るには本明細書に示したカエルの脳から精
製する方法さらに化学合成を用いる方法以外に、遺伝子
工学的手法を用いてこれを製造することもできる。また
、ｆＣＮＰは顕著なナトリウム利尿作用及び血圧降下作
用を示すことから、これを医薬品へと応用することもで
きる。
ｆＣＮＰを得るには本明細書に示したカエルの脳から精
製する方法さらに化学合成を用いる方法以外に、遺伝子
工学的手法を用いてこれを製造することもできる。また
、ｆＣＮＰは顕著なナトリウム利尿作用及び血圧降下作
用を示すことから、これを医薬品へと応用することもで
きる。
以下実施例により本発明の詳細な説明する。
実施例１．カエル からのｆＣＮＰの
■製
カエル１５７匹から４７ｇの脳を摘出し、細断した後、
プロテアーゼを不活化するために１０容量の沸騰水で８
分間処理した。冷却後氷酢酸を最終濃度がＩＭになるよ
うに加え、この組織をポリトロンミキサーを用いて５分
間ホモジナイズした。次に、このホモシネイトを遠心分
離することによす（１４５００ｘ ｇ 、 ３５分）、
沈澱画分と上清画分に分離し、この上清画分を２容量の
水で希釈し、逆相Ｃ−１８カラムにかけた（９０ｄ、Ｃ
ｈｅｍｃｏ ＬＣ−３ＯＲＢ ５ＰＷ−Ｃ−ＯＤＳ）。
プロテアーゼを不活化するために１０容量の沸騰水で８
分間処理した。冷却後氷酢酸を最終濃度がＩＭになるよ
うに加え、この組織をポリトロンミキサーを用いて５分
間ホモジナイズした。次に、このホモシネイトを遠心分
離することによす（１４５００ｘ ｇ 、 ３５分）、
沈澱画分と上清画分に分離し、この上清画分を２容量の
水で希釈し、逆相Ｃ−１８カラムにかけた（９０ｄ、Ｃ
ｈｅｍｃｏ ＬＣ−３ＯＲＢ ５ＰＷ−Ｃ−ＯＤＳ）。
カラムを０．５Ｍ酢酸で洗浄後、カラムに吸着したペプ
チドを０１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む６０％
アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）で溶出し、この溶出液を
濃縮した。次に、１Ｍ酢酸で平衡化したＳＰ−セファデ
ックスＣ−２５カラム（Ｈ”ｆｏｒｍ、１０ｄ）を用い
たイオン交換クロマトグラフィーにかけた。次に、カラ
ムに吸着したペプチドを１Ｍ酢酸、２Ｍピリジン、及び
２Ｍピリジン−酢酸（ｐＨ５，０）を用いて溶出し、各
溶出液による溶出画分を５Ｐ−Ｉ、５ｐ−ｎ及びｓｐ−
ｍとし、これらをそれぞれ凍結乾燥した。このようにし
て得たｓｐ−ｍ画分４０■（乾燥重量）をセファツデク
スＧ−５０カラム（ｆｉｎｅ、 １．８ｘ１３４ｃｍ
；ファルマシア）を用いたゲル濾過にかけた。第１図に
ゲル濾過の様子を示す。溶媒は１Ｍ酢酸、フラクション
サイズは５．０＋ｄ／チユーブ、流速はＬＯ，Ｏｄ／ｈ
ｒである。第１図中、斜線付きボックスはヒヨコ直腸弛
緩活性を有するフラクション４９−５７を示す。
チドを０１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む６０％
アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）で溶出し、この溶出液を
濃縮した。次に、１Ｍ酢酸で平衡化したＳＰ−セファデ
ックスＣ−２５カラム（Ｈ”ｆｏｒｍ、１０ｄ）を用い
たイオン交換クロマトグラフィーにかけた。次に、カラ
ムに吸着したペプチドを１Ｍ酢酸、２Ｍピリジン、及び
２Ｍピリジン−酢酸（ｐＨ５，０）を用いて溶出し、各
溶出液による溶出画分を５Ｐ−Ｉ、５ｐ−ｎ及びｓｐ−
ｍとし、これらをそれぞれ凍結乾燥した。このようにし
て得たｓｐ−ｍ画分４０■（乾燥重量）をセファツデク
スＧ−５０カラム（ｆｉｎｅ、 １．８ｘ１３４ｃｍ
；ファルマシア）を用いたゲル濾過にかけた。第１図に
ゲル濾過の様子を示す。溶媒は１Ｍ酢酸、フラクション
サイズは５．０＋ｄ／チユーブ、流速はＬＯ，Ｏｄ／ｈ
ｒである。第１図中、斜線付きボックスはヒヨコ直腸弛
緩活性を有するフラクション４９−５７を示す。
この活性フラクションをまとめて凍結乾燥し、さらにＣ
Ｍ陽イオン交換体によるＨＰ’ＬＣカラム（ＴＳＫゲル
ＣＭ−２ＳＷ： ４．６ｘ２５０ｍｍ、Ｔｏｓｏｈ）で
精製した。下記（Ａ）と（Ｂ）の溶媒系を使用し、（Ａ
） ： （Ｂ） ＝５０：５０からＯ：１００の直線濃
度勾配で２０分かけて流速１．０ ＨＩ３分で溶出した
。
Ｍ陽イオン交換体によるＨＰ’ＬＣカラム（ＴＳＫゲル
ＣＭ−２ＳＷ： ４．６ｘ２５０ｍｍ、Ｔｏｓｏｈ）で
精製した。下記（Ａ）と（Ｂ）の溶媒系を使用し、（Ａ
） ： （Ｂ） ＝５０：５０からＯ：１００の直線濃
度勾配で２０分かけて流速１．０ ＨＩ３分で溶出した
。
（Ａ） １０ｍＭ ＨＣＯＯＮＨ４（ｐＨ６，６）、Ｃ
ＨｓＣＮ＝９０：１０（Ｖ／Ｖ）（Ｂ） １．ＯＭ Ｈ
ＣＯＯＮＨ，（ｐＨ６，６）：ＣＨｓＣＮ＝９０：１０
（Ｖ／Ｖ）溶出の様子を第２図に示す。このクロマトグ
ラフィーにおいて、ヒヨコ直腸弛緩活性の大部分は溶出
時間３６−３９分に溶出され、１５−１８分及び２２．
５−２５５分に溶出される画分にも小さいピークが観察
された。
ＨｓＣＮ＝９０：１０（Ｖ／Ｖ）（Ｂ） １．ＯＭ Ｈ
ＣＯＯＮＨ，（ｐＨ６，６）：ＣＨｓＣＮ＝９０：１０
（Ｖ／Ｖ）溶出の様子を第２図に示す。このクロマトグ
ラフィーにおいて、ヒヨコ直腸弛緩活性の大部分は溶出
時間３６−３９分に溶出され、１５−１８分及び２２．
５−２５５分に溶出される画分にも小さいピークが観察
された。
３６−３９分に溶出されたヒヨコ直腸弛緩活性フラクシ
ョンをケムコソルブ（ｃｈｅｍｃｏｓｏｒｂ） ３０Ｄ
Ｓ−Ｈカラム（８，Ｏｘ７５ｍｍ、 ｃｈｅｍｃｏ）に
よる逆相ＨＰＬＣでさらに精製した。下記（Ａ）と（Ｂ
）の溶媒系を使用し、（Ａ）から（Ｂ）への直線濃度勾
配で１２０分かけて流速２．０ ｄ／分で溶出した。
ョンをケムコソルブ（ｃｈｅｍｃｏｓｏｒｂ） ３０Ｄ
Ｓ−Ｈカラム（８，Ｏｘ７５ｍｍ、 ｃｈｅｍｃｏ）に
よる逆相ＨＰＬＣでさらに精製した。下記（Ａ）と（Ｂ
）の溶媒系を使用し、（Ａ）から（Ｂ）への直線濃度勾
配で１２０分かけて流速２．０ ｄ／分で溶出した。
（Ａ） Ｈ２Ｏ：ＣＨ，ＣＮ：１０％ＴＦＡ＝９０ ：
１０ ： １ （Ｖ／Ｖ）（Ｂ） Ｈ２Ｏ：ＣＨ３Ｃ
Ｎ：１０％ＴＦＡ＝４０：６叶１ （Ｖ／Ｖ）溶出の様
子を第３図に示す。ヒヨコ直腸弛緩活性は図中の黒いボ
ックス部分のみに観察された。
１０ ： １ （Ｖ／Ｖ）（Ｂ） Ｈ２Ｏ：ＣＨ３Ｃ
Ｎ：１０％ＴＦＡ＝４０：６叶１ （Ｖ／Ｖ）溶出の様
子を第３図に示す。ヒヨコ直腸弛緩活性は図中の黒いボ
ックス部分のみに観察された。
本発明におけるｆＣＮＰの最終精製は、この活性フラク
ションをさらにμｍボンダスフェア（Ｂ。
ションをさらにμｍボンダスフェア（Ｂ。
ｎｄａｓｐｈｅｒｅ） Ｃ−１８（３，９ｘ１５０ｍｍ
、 ３００ Ａ、ｆａｔｅｒｓ）を用いた逆相ＨＰＬＣ
に供することにより、実質的に純粋なペプチドとして得
ることができた。
、 ３００ Ａ、ｆａｔｅｒｓ）を用いた逆相ＨＰＬＣ
に供することにより、実質的に純粋なペプチドとして得
ることができた。
なお、後記アミノ酸分析の結果に基づいて計算したｆＣ
ＮＰの収量は９２０ｐｍｏｌであった。
ＮＰの収量は９２０ｐｍｏｌであった。
実施例２．ｆＣＮＰの 浩°定
Ａ、ｆＣＮＰのＳ−カルボキシメチル
実施例１で得たｆＣＮＰを０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
バッファー （ｐＨ８，５）中２０ｍＭのジチオスレイ
トール（ＤＴＴ ）を用い、３７℃、４時間反応させ、
次いで６０ｍＭのヨード酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ
ｍｏｎｏｉｏｄｏａｃｅｔｉｅ ａｃｉｄ）を加え２
０分間処理することにより、ｆＣＮＰのＳ−力ルボキシ
メチル体すなわち（Ｒ’ ＣＭ）ｆＣＮＰを得た。
バッファー （ｐＨ８，５）中２０ｍＭのジチオスレイ
トール（ＤＴＴ ）を用い、３７℃、４時間反応させ、
次いで６０ｍＭのヨード酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ
ｍｏｎｏｉｏｄｏａｃｅｔｉｅ ａｃｉｄ）を加え２
０分間処理することにより、ｆＣＮＰのＳ−力ルボキシ
メチル体すなわち（Ｒ’ ＣＭ）ｆＣＮＰを得た。
この（ＲＣＭ）ｆＣＮＰを、μｍポンダスフェア（Ｂｏ
ｎｄａｓｐｈｅｒｅ） Ｃ−１８（３，９ｘ１５０ｍｍ
、 ３００Ａ、Ｗａｔｅｒｓ）を用いた逆相ＨＰＬＣに
供し、０．１％ＴＦＡ中のアセトニトリル１０−６０％
の直線勾配により、流速１．０ｄ／分で６０分間溶出す
ることにより精製した。
ｎｄａｓｐｈｅｒｅ） Ｃ−１８（３，９ｘ１５０ｍｍ
、 ３００Ａ、Ｗａｔｅｒｓ）を用いた逆相ＨＰＬＣに
供し、０．１％ＴＦＡ中のアセトニトリル１０−６０％
の直線勾配により、流速１．０ｄ／分で６０分間溶出す
ることにより精製した。
Ｂ、 ＲＣＭ ｆＣＮＰのアミノ の 定実施
例２のＡで得た（ＲＯＭ）ｆＣＮＰ約２００ｐ！１１０
１を、まず０．１％フェノールと００２％の２−メルカ
プトエタノールを含んだ６Ｎ塩酸で１１０℃、２０時間
処理することにより（ＲＯＭ）ｆＣＮＰを完全水解した
。次にこのサンプルを日立Ｌ−８３．５７ミノ酸分析機
を用いて（ＲＣＭ）ｆＣＮＰのアミノ酸組成を求めたと
ころ、第１表に示す値が得られ、この結果ｆＣＮＰは２
個のシスティン残基を含む２２個のアミノ酸残基より成
るペプチドであることが判った。
例２のＡで得た（ＲＯＭ）ｆＣＮＰ約２００ｐ！１１０
１を、まず０．１％フェノールと００２％の２−メルカ
プトエタノールを含んだ６Ｎ塩酸で１１０℃、２０時間
処理することにより（ＲＯＭ）ｆＣＮＰを完全水解した
。次にこのサンプルを日立Ｌ−８３．５７ミノ酸分析機
を用いて（ＲＣＭ）ｆＣＮＰのアミノ酸組成を求めたと
ころ、第１表に示す値が得られ、この結果ｆＣＮＰは２
個のシスティン残基を含む２２個のアミノ酸残基より成
るペプチドであることが判った。
第１表は（ＲＯＭ）ｆＣＮＰのアミノ酸組成を示す。な
お、０内の数値は測定値に最も近い整数を示し、ＣｍＣ
ｙｓはＳ−カルボキシメチルシスティンを示す。
お、０内の数値は測定値に最も近い整数を示し、ＣｍＣ
ｙｓはＳ−カルボキシメチルシスティンを示す。
第１表
（ＲＯＭ）
ＣＮＰ
１．１８
１．０２
１．８７
合計
Ｃ，ＲＣＭ ｆＣＮＰのアミノ − 配 の固定
実施例２のＡで作製した（ＲＣＭ）ｆＣＮＰ約２００ｐ
ｍｏｌを用い、アミノ酸配列自動分析機（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７０Ａ／１２０Ａ）に供
し、エドマン分解法によりアミノ酸−次配列を分析した
結果、第４図に示す結果か得られた。同図中、各アミノ
酸は一文字表記で表され、ＣｍはＳ−カルボキシメチル
システィン残基を示す。この結果に基づいて（ＲＯＭ）
ｆＣＮＰのアミノ酸−次配列が決定された（第５図参照
）。
ｍｏｌを用い、アミノ酸配列自動分析機（Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７０Ａ／１２０Ａ）に供
し、エドマン分解法によりアミノ酸−次配列を分析した
結果、第４図に示す結果か得られた。同図中、各アミノ
酸は一文字表記で表され、ＣｍはＳ−カルボキシメチル
システィン残基を示す。この結果に基づいて（ＲＯＭ）
ｆＣＮＰのアミノ酸−次配列が決定された（第５図参照
）。
Ｄ、ｆＣＮＰの 合 びＳ−８合 の同定
実施例２のＣで決定したアミノ酸−次配列を基にｆＣＮ
Ｐをペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ ４３０Ａ）を用いた固相合成法で合成した。な
お、合成の際システィン残基のＳＨ保護基として４−メ
チルベンジル（４−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌ）基を用
い、ＨＦを用いて完全脱保護した後、ｆＣＮＰの６．２
２位のシスティン残基のＳＨ基をフェリシアン化カリウ
ム［ＫｓＦｅ（ＣＮ）ｓ］で処理することにより分子内
Ｓ−８結合を形成させた。このようにして合成したｆＣ
ＮＰは、アミノ酸分析、アミノ酸−次配列の解析を行い
その構造を確認した。さらに、この化学合成したｆＣＮ
Ｐと実施例１で得た天然由来のｆＣＮＰは、ＨＰＬＣの
溶出時間が完全に一致し、合成ｆＣＮＰもヒヨコ直腸弛
緩活性を示したことから、最終的にｆＣＮＰの構造は、
（４）Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＯＨ（式中、（１）と（２）、（
３）と（４）は直接結合しており、６位と２２位のシス
ティン残基（Ｃｙｓ）は分子内でＳ−８結合を形成して
いる。）であると決定した。
Ｐをペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ ４３０Ａ）を用いた固相合成法で合成した。な
お、合成の際システィン残基のＳＨ保護基として４−メ
チルベンジル（４−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌ）基を用
い、ＨＦを用いて完全脱保護した後、ｆＣＮＰの６．２
２位のシスティン残基のＳＨ基をフェリシアン化カリウ
ム［ＫｓＦｅ（ＣＮ）ｓ］で処理することにより分子内
Ｓ−８結合を形成させた。このようにして合成したｆＣ
ＮＰは、アミノ酸分析、アミノ酸−次配列の解析を行い
その構造を確認した。さらに、この化学合成したｆＣＮ
Ｐと実施例１で得た天然由来のｆＣＮＰは、ＨＰＬＣの
溶出時間が完全に一致し、合成ｆＣＮＰもヒヨコ直腸弛
緩活性を示したことから、最終的にｆＣＮＰの構造は、
（４）Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＯＨ（式中、（１）と（２）、（
３）と（４）は直接結合しており、６位と２２位のシス
ティン残基（Ｃｙｓ）は分子内でＳ−８結合を形成して
いる。）であると決定した。
ヒヨコ直腸弛緩活性はＫａｎｇａｗａ等及びＣｕｒｒｉ
ｅ等の方法（Ｋａｎｇａｗａ、に、ａｎｄ Ｍａｔｓｕ
ｏ、Ｈ，、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、
Ｃｏｍｍｕｎ、、１１８．１３１−１３９，１９８４；
Ｃｕｒｒｉｅ、Ｍ、Ｇ、 、Ｇｅ１ｌｅｒ 、Ｄ 、
Ｍ、 、Ｃｏ１ｅ 、 Ｂ、Ｒ、、Ｂｏｙｌａｒ 、Ｊ
、Ｇ 、 、 Ｙｕｓｈｅｎｇ 。
ｅ等の方法（Ｋａｎｇａｗａ、に、ａｎｄ Ｍａｔｓｕ
ｏ、Ｈ，、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、
Ｃｏｍｍｕｎ、、１１８．１３１−１３９，１９８４；
Ｃｕｒｒｉｅ、Ｍ、Ｇ、 、Ｇｅ１ｌｅｒ 、Ｄ 、
Ｍ、 、Ｃｏ１ｅ 、 Ｂ、Ｒ、、Ｂｏｙｌａｒ 、Ｊ
、Ｇ 、 、 Ｙｕｓｈｅｎｇ 。
Ｗ、 、Ｈｏｒｍｂｅｒｇ、Ｓ、Ｗ、ａｎｄ Ｎｅｅｄ
ｌｅｍａｎ、Ｐ、 、５ｃｉｅｎｃｅ、２２１７１−７
３．１９８３）に従い測定した。測定値は６回の繰り返
しの平均である。その結果を第２表に示す。この測定法
でｆＣＮＰはα−ｈＡＮＰ及びｆＡＮＰ−２１に比べ各
々約３倍〜約７倍高い活性を示した。なお、ｆＣＮＰは
、類似ペプチドにとって利尿作用等の生物活性を発揮す
るために重要と考えられていたＣ−末端のテール配列（
ＷａｔａｎａｂｅＴ、Ｘ、 、Ｎｏｄａ、Ｙ、 、Ｃｈ
ｉｎｏ、Ｎ、 、Ｎ１５ｈｉｕｃｈｉ 、 Ｙ、 、Ｋ
ｕｍｕｒａ 、Ｔ、５ａｋａｋｉｂａｒａ、Ｓ、ａｎｄ
Ｉｍａｉ、Ｍ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ。
ｌｅｍａｎ、Ｐ、 、５ｃｉｅｎｃｅ、２２１７１−７
３．１９８３）に従い測定した。測定値は６回の繰り返
しの平均である。その結果を第２表に示す。この測定法
でｆＣＮＰはα−ｈＡＮＰ及びｆＡＮＰ−２１に比べ各
々約３倍〜約７倍高い活性を示した。なお、ｆＣＮＰは
、類似ペプチドにとって利尿作用等の生物活性を発揮す
るために重要と考えられていたＣ−末端のテール配列（
ＷａｔａｎａｂｅＴ、Ｘ、 、Ｎｏｄａ、Ｙ、 、Ｃｈ
ｉｎｏ、Ｎ、 、Ｎ１５ｈｉｕｃｈｉ 、 Ｙ、 、Ｋ
ｕｍｕｒａ 、Ｔ、５ａｋａｋｉｂａｒａ、Ｓ、ａｎｄ
Ｉｍａｉ、Ｍ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ。
１４７．４９−５７．１９８８） カ欠失しテいルが、
ｐＣＮＰ （ブタ由来ＧＮＰ）と匹敵する強い直腸弛緩
活性を保持していた。
ｐＣＮＰ （ブタ由来ＧＮＰ）と匹敵する強い直腸弛緩
活性を保持していた。
第２表
利尿ペプチド
相対活性
αｈＡＮＰ １００ｆＣＮＰ
３２１ｆＡＮＰ−２１４７ ｆＡＮＰ−２４３，７ ｐＣＮＰ ４７２ ｐＢＮＰ−２６２７０ 相対活性はαｈＡＮＰの活性を１００として等モル量の
ペプチドの活性である。
３２１ｆＡＮＰ−２１４７ ｆＡＮＰ−２４３，７ ｐＣＮＰ ４７２ ｐＢＮＰ−２６２７０ 相対活性はαｈＡＮＰの活性を１００として等モル量の
ペプチドの活性である。
Ｂ、ｆＣＮＰのナトリウム 用 び血庄屋
ｆＣＮＰの利尿作用については、Ｋａｎｇａｗａ等及び
５ｕｄｏｈ等の方法に従い測定した（Ｋａｎｇａｗａ
ｅｔ ａｌ 、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒ
ｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ 、 、 １１８ 、１３１−１３
９ 、１９８４；５ｕｄｏｈ、Ｔ、、Ｋａｎｇａｗａ、
に、、Ｍｉｎａｍｉｎｏ、Ｎ、 ａｎｄ Ｍａｔｓｕｏ
、Ｈ，、Ｎａｔｕｒｅ、３３２．７８−８１．１９８８
） 、すなわち、雄性ＳＤラット（体重３００−４００
ｇ ）にベンドパルビタール５０■／ｋｇを腹腔的投
与し、麻酔し、気道確保のため気管カニユーレ（ＰＥ−
２４０クレイ・アダムス社製）を施す。股動脈に血圧測
定用のカニユーレ（ＰＥ−５０）を挿入し、また、股静
脈に挿入したカニユーレ（ＰＥ−１０）を通じてリンゲ
ル液を１．８Ｎ１／ｈｒの速度で定常注入する。シラス
ティックチューブ（内径０，０２インチ、外径０．０３
フインチ、ダウコーニング社製）の膀胱カニユーレより
試験管内に採尿し、この採尿は被験物質を投与する１５
分間と投与後５分間ずつ１５分後まで及びその後経時的
に行った。この試料の量そして試料中の電解質濃度を比
較することにより、及び血圧の変化により被験物質の作
用を測定した。
５ｕｄｏｈ等の方法に従い測定した（Ｋａｎｇａｗａ
ｅｔ ａｌ 、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒ
ｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ 、 、 １１８ 、１３１−１３
９ 、１９８４；５ｕｄｏｈ、Ｔ、、Ｋａｎｇａｗａ、
に、、Ｍｉｎａｍｉｎｏ、Ｎ、 ａｎｄ Ｍａｔｓｕｏ
、Ｈ，、Ｎａｔｕｒｅ、３３２．７８−８１．１９８８
） 、すなわち、雄性ＳＤラット（体重３００−４００
ｇ ）にベンドパルビタール５０■／ｋｇを腹腔的投
与し、麻酔し、気道確保のため気管カニユーレ（ＰＥ−
２４０クレイ・アダムス社製）を施す。股動脈に血圧測
定用のカニユーレ（ＰＥ−５０）を挿入し、また、股静
脈に挿入したカニユーレ（ＰＥ−１０）を通じてリンゲ
ル液を１．８Ｎ１／ｈｒの速度で定常注入する。シラス
ティックチューブ（内径０，０２インチ、外径０．０３
フインチ、ダウコーニング社製）の膀胱カニユーレより
試験管内に採尿し、この採尿は被験物質を投与する１５
分間と投与後５分間ずつ１５分後まで及びその後経時的
に行った。この試料の量そして試料中の電解質濃度を比
較することにより、及び血圧の変化により被験物質の作
用を測定した。
なお、被験物質ｆＣＮＰは、その所定量を０．ＩＮ酢酸
に溶解した後、１／１０容量の１３Ｍトリス溶液で中和
する。これを５０μｌの滅菌生理水で希釈し、頚静脈か
ら投与した。この結果、第３表に示すように、ｆＣＮＰ
はナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を示すことが判
り、さらに、これらの作用は用量依存的に増大すること
が判った。
に溶解した後、１／１０容量の１３Ｍトリス溶液で中和
する。これを５０μｌの滅菌生理水で希釈し、頚静脈か
ら投与した。この結果、第３表に示すように、ｆＣＮＰ
はナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を示すことが判
り、さらに、これらの作用は用量依存的に増大すること
が判った。
第３表に、ｆＣＮＰのナトリウム利尿作用及び血圧降下
作用をα−ｈＡＮＰと比較して示す。
作用をα−ｈＡＮＰと比較して示す。
第３表
α−ｈＡＮＰ ３．０４６１±５１
５７２±８４ ２９１±１９４４５±６７なお、第３表
中、利尿及びナトリウム利尿応答は、麻酔ラットへペプ
チドを静脈注射する前及び後に、各１５分間の尿サンプ
ルを集め、尿量、Ｎａ＋、Ｋ＋及びＣＩ−の排泄量の変
化の％（平均上標準誤差）として示した。各ペプチドに
３匹のラットを用いた。
中、利尿及びナトリウム利尿応答は、麻酔ラットへペプ
チドを静脈注射する前及び後に、各１５分間の尿サンプ
ルを集め、尿量、Ｎａ＋、Ｋ＋及びＣＩ−の排泄量の変
化の％（平均上標準誤差）として示した。各ペプチドに
３匹のラットを用いた。
ｆＣＮＰの利尿及びナトリウム利尿作用は、α−ｈＡＮ
Ｐに比べて、約１００分の１程度に低かった。ｆＣＮＰ
はまた、麻酔ラットに投与したところ弱い血圧降下作用
も示した。典型的実験において、１０ｎｍｏｌのｆＣＮ
Ｐは、心収縮期の血圧を約３゜分間にわたって２５−３
２５−３Ｏ低下させた。これらの結果はｐＣＮＰの結果
（Ｓｕｄｏｈ、Ｔ、 、Ｍｉｎａｍｉｎｏ、Ｎ、 、Ｋ
ａｎｇａｗａ、に、 ａｎｄ Ｍａｔｓｕｏ、Ｈ，、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、ＲｅｓＣｏｍｍｕｎ、
、１６８，８６３−８７０．１９９０）と非常に類似し
ている。
Ｐに比べて、約１００分の１程度に低かった。ｆＣＮＰ
はまた、麻酔ラットに投与したところ弱い血圧降下作用
も示した。典型的実験において、１０ｎｍｏｌのｆＣＮ
Ｐは、心収縮期の血圧を約３゜分間にわたって２５−３
２５−３Ｏ低下させた。これらの結果はｐＣＮＰの結果
（Ｓｕｄｏｈ、Ｔ、 、Ｍｉｎａｍｉｎｏ、Ｎ、 、Ｋ
ａｎｇａｗａ、に、 ａｎｄ Ｍａｔｓｕｏ、Ｈ，、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、ＲｅｓＣｏｍｍｕｎ、
、１６８，８６３−８７０．１９９０）と非常に類似し
ている。
（発明の効果）
以上のように、本発明者は、カエルの脳よりヒヨコ直腸
弛緩活性を指標として新規生理活性ペプチド（ｆＣＮＰ
）を単離・同定することに成功すると共に、このペプチ
ドがナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を示すことを
見いだし、このペプチドがＧＮＰに帰属される新規ペプ
チドであることを明らかにした。
弛緩活性を指標として新規生理活性ペプチド（ｆＣＮＰ
）を単離・同定することに成功すると共に、このペプチ
ドがナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を示すことを
見いだし、このペプチドがＧＮＰに帰属される新規ペプ
チドであることを明らかにした。
本発明でｆＣＮＰが単離・同定されたことにより、カエ
ルと哺乳類ではＡＮＰを共有するのみならずＧＮＰをも
共有していることが判明した。このことは、ＡＮＰ及び
ＧＮＰが進化の初期の過程から体液量及び血圧の恒常性
を調節するのに重要な役割を果たしているペプチドであ
ることを示唆している。
ルと哺乳類ではＡＮＰを共有するのみならずＧＮＰをも
共有していることが判明した。このことは、ＡＮＰ及び
ＧＮＰが進化の初期の過程から体液量及び血圧の恒常性
を調節するのに重要な役割を果たしているペプチドであ
ることを示唆している。
また、本発明で特に注目すべきことは、ｆＣＮＰの脳内
組織濃度が５０ｐｍｏｌ／ ｇ組織湿重量と高くこの濃
度が哺乳類ＡＮＰ及びＢＮＰの脳内濃度よりはるかに高
いことである。このことは、現在のところｆＣＮＰの心
房における存在量が判っていないか、ＧＮＰがおもに脳
内において神経伝達系に作用し、生体内の体液量及び血
圧の恒常性の調節に関与していることを示唆している（
なお、先にも述へたが、咽乳動物ではＡＮＰ−ＢＮＰは
脳及び心房にも存在しているが、その存在量は心房が圧
倒的に高いことが判っている。また、ブタの脳において
は、ＧＮＰの存在量はＢＮＰとほぼ同程度であり、ＡＮ
Ｐと比べると約２０倍量存在している）。さらには、本
発明によりｆＣＮＰの構造か明らかになったことから、
このアミノ酸−次配列を先に本発明者らにより明らかに
されたブタ脳由来ＣＮＰ （ｐＣＮＰ）と比較すればＧ
ＮＰの構造活性相関を研究することができる。
組織濃度が５０ｐｍｏｌ／ ｇ組織湿重量と高くこの濃
度が哺乳類ＡＮＰ及びＢＮＰの脳内濃度よりはるかに高
いことである。このことは、現在のところｆＣＮＰの心
房における存在量が判っていないか、ＧＮＰがおもに脳
内において神経伝達系に作用し、生体内の体液量及び血
圧の恒常性の調節に関与していることを示唆している（
なお、先にも述へたが、咽乳動物ではＡＮＰ−ＢＮＰは
脳及び心房にも存在しているが、その存在量は心房が圧
倒的に高いことが判っている。また、ブタの脳において
は、ＧＮＰの存在量はＢＮＰとほぼ同程度であり、ＡＮ
Ｐと比べると約２０倍量存在している）。さらには、本
発明によりｆＣＮＰの構造か明らかになったことから、
このアミノ酸−次配列を先に本発明者らにより明らかに
されたブタ脳由来ＣＮＰ （ｐＣＮＰ）と比較すればＧ
ＮＰの構造活性相関を研究することができる。
以上のことから、本発明はＧＮＰの生理的役割、ひいて
は生体内における体液量及び血圧の恒常性を調節するメ
カニズムを解明する上で、大いに貢献するものである。
は生体内における体液量及び血圧の恒常性を調節するメ
カニズムを解明する上で、大いに貢献するものである。
第１図は、カエル脳からの抽出物（ＳＰ−Ｉ［［分画を
さらにセファデックスＧ−５０で分画したときの、溶出
経過及び各フラクションのヒヨコ直腸弛緩活性を示す図
である。 第２図は、第１図のセファデックスＧ−５０で溶出した
活性フラクションを、ＣＭイオン交換ＨＰＬＣでさらに
精製したときの溶出経過及び各フラクションのヒヨコ直
腸弛緩活性を示す図である。 第３図は、第２図のＣＭイオン交換ＨＰＬＣで３６−３
９分目に溶出されたヒヨコ直腸弛緩活性フラクションを
ケムコソルブ（ｃｈｅｍｃｏｓｏｒｂ） ３０ＤＳ−Ｈ
カラムによる逆相ＨＰＬＣでさらに精製したときの様子
を示す図である。 第４図は、（ＲＯＭ）ｆＣＮＰのエドマン分解における
各サイクルのＰＴＨ−アミノ酸の収率及びアミノ酸配列
を示す図である。 第５図は、各種ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰのアミノ酸−次
配列及びこれらのペプチドのアミノ酸−次配列の相同性
を示す図である。
さらにセファデックスＧ−５０で分画したときの、溶出
経過及び各フラクションのヒヨコ直腸弛緩活性を示す図
である。 第２図は、第１図のセファデックスＧ−５０で溶出した
活性フラクションを、ＣＭイオン交換ＨＰＬＣでさらに
精製したときの溶出経過及び各フラクションのヒヨコ直
腸弛緩活性を示す図である。 第３図は、第２図のＣＭイオン交換ＨＰＬＣで３６−３
９分目に溶出されたヒヨコ直腸弛緩活性フラクションを
ケムコソルブ（ｃｈｅｍｃｏｓｏｒｂ） ３０ＤＳ−Ｈ
カラムによる逆相ＨＰＬＣでさらに精製したときの様子
を示す図である。 第４図は、（ＲＯＭ）ｆＣＮＰのエドマン分解における
各サイクルのＰＴＨ−アミノ酸の収率及びアミノ酸配列
を示す図である。 第５図は、各種ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＣＮＰのアミノ酸−次
配列及びこれらのペプチドのアミノ酸−次配列の相同性
を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 下記の構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、（１）と（２）、（３）と（４）は直接結合し
ており、６位と２２位のシステイン残基（Ｃｙｓ）は分
子内でＳ−Ｓ結合を形成している。）を有する新規生理
活性ペプチド及びその酸付加塩。
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|---|---|---|---|
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| EP91115079A EP0475290B1 (en) | 1990-09-07 | 1991-09-06 | A novel biologically active peptide derived from frog (frog CNP) |
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| AT91115079T ATE175211T1 (de) | 1990-09-07 | 1991-09-06 | Neues, biologisch aktives, vom frosch stammendes peptid (frosch-cnp) |
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| GR990400722T GR3029632T3 (en) | 1990-09-07 | 1999-03-09 | A novel biologically active peptide derived from frog (frog CNP) |
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| EP4291224A4 (en) | 2021-02-12 | 2025-01-01 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Alkaline phosphatase polypeptides and methods of use thereof |
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-
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1999
- 1999-03-09 GR GR990400722T patent/GR3029632T3/el unknown
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|---|---|---|---|---|
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| WO2005094889A1 (ja) | 2004-03-31 | 2005-10-13 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 関節炎症治療剤又は予防剤 |
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