NO844489L - Fremgangsmaate ved fremstilling av nye atriale peptider - Google Patents
Fremgangsmaate ved fremstilling av nye atriale peptiderInfo
- Publication number
- NO844489L NO844489L NO844489A NO844489A NO844489L NO 844489 L NO844489 L NO 844489L NO 844489 A NO844489 A NO 844489A NO 844489 A NO844489 A NO 844489A NO 844489 L NO844489 L NO 844489L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- ser
- peptide
- arg
- production
- phe
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 71
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 21
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 title claims description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 34
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 108010082685 antiarrhythmic peptide Proteins 0.000 claims description 21
- 230000001452 natriuretic effect Effects 0.000 claims description 19
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 17
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 13
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims description 13
- YQAXFVHNHSPUPO-RNJOBUHISA-N 2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s,4r)-1-[(2s)-1-(2-aminoacetyl)pyrrolidine-2-carbonyl]-4-hydroxypyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]propanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1C[C@@H](O)CN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)CN)CCC1 YQAXFVHNHSPUPO-RNJOBUHISA-N 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 11
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 11
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 8
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 6
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 5
- JAWGSPUJAXYXJA-IHRRRGAJSA-N Ser-Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)N)CC1=CC=CC=C1 JAWGSPUJAXYXJA-IHRRRGAJSA-N 0.000 claims description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 4
- 238000011033 desalting Methods 0.000 claims description 4
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims description 4
- JJIHLJJYMXLCOY-BYPYZUCNSA-N N-acetyl-L-serine Chemical group CC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JJIHLJJYMXLCOY-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 28
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 26
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 24
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 20
- 239000002934 diuretic Substances 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 18
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 229950008486 carperitide Drugs 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 15
- 102000002723 Atrial Natriuretic Factor Human genes 0.000 description 14
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 description 14
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 description 13
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 12
- 102400001275 Atriopeptin-2 Human genes 0.000 description 11
- 108010034703 atrial natriuretic factor prohormone (103-125) Proteins 0.000 description 11
- XXPVSJGWOXCVLF-VSJANKAZSA-N atriopeptin ii Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 XXPVSJGWOXCVLF-VSJANKAZSA-N 0.000 description 11
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 11
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 11
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- 102400001287 Atriopeptin-1 Human genes 0.000 description 10
- 108010033590 atrial natriuretic factor prohormone (103-123) Proteins 0.000 description 10
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 10
- 239000000050 smooth muscle relaxant Substances 0.000 description 10
- AYCBRUDZNRVKGK-GWLSAQFNSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(4R,10S,16S,19S,22S,28S,31S,34S,37S,40S,49S,52R)-52-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-19-(3-amino-3-oxopropyl)-49-benzyl-28,37-bis[(2S)-butan-2-yl]-31,40-bis(3-carbamimidamidopropyl)-34-(carboxymethyl)-16-(hydroxymethyl)-22-methyl-10-(2-methylpropyl)-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51-hexadecaoxo-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50-hexadecazacyclotripentacontane-4-carbonyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 AYCBRUDZNRVKGK-GWLSAQFNSA-N 0.000 description 9
- 102400001276 Atriopeptin-3 Human genes 0.000 description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 9
- 108010034646 atrial natriuretic factor prohormone (103-126) Proteins 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 8
- 101500027369 Rattus norvegicus Atriopeptin-3 Proteins 0.000 description 8
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 8
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 8
- 210000002464 muscle smooth vascular Anatomy 0.000 description 8
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 8
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 8
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 7
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 239000002249 anxiolytic agent Substances 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 210000002837 heart atrium Anatomy 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- -1 Phenylthiohydantoin amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 5
- 239000000812 cholinergic antagonist Substances 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 230000001882 diuretic effect Effects 0.000 description 5
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000012495 positive regulation of renal sodium excretion Effects 0.000 description 5
- 230000002048 spasmolytic effect Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N (+-)-Isoprenaline Chemical compound CC(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 4
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- OZILORBBPKKGRI-RYUDHWBXSA-N Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 OZILORBBPKKGRI-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940039009 isoproterenol Drugs 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 108010018625 phenylalanylarginine Proteins 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000008327 renal blood flow Effects 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 3
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 3
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 3
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000819 phase cycle Methods 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 230000002040 relaxant effect Effects 0.000 description 3
- 229940124550 renal vasodilator Drugs 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 230000002883 vasorelaxation effect Effects 0.000 description 3
- UHPQFNXOFFPHJW-UHFFFAOYSA-N (4-methylphenyl)-phenylmethanamine Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C(N)C1=CC=CC=C1 UHPQFNXOFFPHJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 108020001621 Natriuretic Peptide Proteins 0.000 description 2
- 102000004571 Natriuretic peptide Human genes 0.000 description 2
- SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N Nitroglycerin Chemical compound [O-][N+](=O)OCC(O[N+]([O-])=O)CO[N+]([O-])=O SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000006 Nitroglycerin Substances 0.000 description 2
- IWRZUGHCHFZYQZ-UFYCRDLUSA-N Phe-Arg-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 IWRZUGHCHFZYQZ-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 208000004880 Polyuria Diseases 0.000 description 2
- 101500027368 Rattus norvegicus Atriopeptin-2 Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- AIXAANGOTKPUOY-UHFFFAOYSA-N carbachol Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCOC(N)=O AIXAANGOTKPUOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004484 carbachol Drugs 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000035619 diuresis Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000005048 flame photometry Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003711 glyceryl trinitrate Drugs 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 239000000692 natriuretic peptide Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000004648 relaxation of smooth muscle Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 2
- 229920000260 silastic Polymers 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- DMBKPDOAQVGTST-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-3-phenylmethoxypropanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)COCC1=CC=CC=C1 DMBKPDOAQVGTST-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- SOHLZANWVLCPHK-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-4-oxo-4-phenylmethoxybutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(=O)OCC1=CC=CC=C1 SOHLZANWVLCPHK-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- CNBUSIJNWNXLQQ-NSHDSACASA-N (2s)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 CNBUSIJNWNXLQQ-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- WBIIPXYJAMICNU-AWEZNQCLSA-N (2s)-5-[amino-[(4-methylphenyl)sulfonylamino]methylidene]azaniumyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoate Chemical compound CC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C=C1 WBIIPXYJAMICNU-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- QJCNLJWUIOIMMF-YUMQZZPRSA-N (2s,3s)-3-methyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C QJCNLJWUIOIMMF-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VRPJIFMKZZEXLR-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]acetic acid Chemical group CC(C)(C)OC(=O)NCC(O)=O VRPJIFMKZZEXLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 101000957724 Catostomus commersonii Corticoliberin-1 Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 101000757797 Geobacillus stearothermophilus Aminopeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-asparagine Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 101000733766 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Aminopeptidase 2, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 210000002376 aorta thoracic Anatomy 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000000674 effect on sodium Effects 0.000 description 1
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000472 muscarinic agonist Substances 0.000 description 1
- 239000002833 natriuretic agent Substances 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000033904 relaxation of vascular smooth muscle Effects 0.000 description 1
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 1
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår nye atriale peptider med anvendbar natriuretisk aktivitet.
Det er kjent at cellene i det atriale myocardium i pattedyr inneholder utallige membran-bundne lagringsgranuler.
Disse karakteristiske sekretoriske granuler, som er blitt observert i rotter, hunder, katter og humane atria, ligner de som er i de peptid-hormonelle produserende celler. Se DeBold et al., J. Histochem. Cytochem. 26, 1094-1102 (1978). Det er blitt rapportert at rå vevekstrakter fra atrial-myocardium produserer en hurtig og kraftig natriuretisk respons når de injiseres intravenøst i ikke-diuretiske rotter.
Se DeBold et al., Life Sciences 2_8, 89-94 (1981). Delvis rensing av rotte-atriale homogenater med et kort kokningstrinn og fraksjonering på Sephadex (6)ble oppnådd av Trippodo et al., Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 170, 502-508 (1982). Natriuretisk aktititet ble funnet av disse forskere i det totale molekylvektområde på 3.600 til 44.000 dalton og i peptidfraksjoner av både det høyere molekylvektområde på 36.000-44.000 dalton og det lavere molekylvektområde på 3.600-5.500 dalton.
I en mer nylig publikasjon, DeBold et al., Fed. Proe. 42(3), Abstract 1870, s. 611 (1983), er det beskrevet rensing av et atrialt natriuretisk peptid med en molekylvekt på 5.150 dalton og en sekvens på 4 7 aminosyrer som forskerne betegnet som "Cardionatrin I". Tre ytterligere topper med natriuretisk aktivitet ble erholdt ved væskekromatografi med høy ytelse (HPLC).
I en enda senere publikasjon beskrives delvis rensing
av en atrial natriuretisk faktor fra rotter med en molekylvekt på ca. 3.800 og inneholdende 36 aminosyrerester.
Rotte-atriale ekstrakter er også blitt fraksjonert i lavmolekylære fraksjoner (< 10.000 dalton) og høymolekylære fraksjoner (20.000-30.000 dalton) som begge avspente glattmuskelen in vitro og var kraftige natriuretiske midler når de ble administrert intravenøst til rotter. Se Currie et al., Science 221, 71-73 (1983).
Ifølge oppfinnelsen tilveiebringes nye peptider som utviser anvendbar natriuretisk aktivitet. Disse biologisk aktive peptider har følgende aminosyresekvens: Ri-cys-phe-gly-gly-arg-ile-asp-arg-ile-gly-ala-gln-ser-gly-leu-gly-cys-asn-R2
hvori R1= H, ser, ser-ser, og
R2= OH, ser, ser-phe-arg, ser-phe-arg-tyr,
eller de fysiologisk akseptable salter, estere eller amider derav.
I peptidstrukturen er aminosyrekomponentene angitt ved konvensjonelle forkortelser som følger:
Peptidmaterialene ifølge oppfinnelsen er blitt isolert
i en høyrenset form som ikke eksisterer i rottemyocardium fra hvilket de opprinnelig ble erholdt. Dvs. at de er blitt fremstilt i en form som er hovedsakelig fri for andre peptider, og fri for andre cellulære komponenter og vevbestand-deler. Disse nye atriale peptider utviser fysiologiske karakteristika som antyder at disse er viktige innen den medi-sinske forskning ved undersøkelse av det endocrine system av hjerteatriene når det gjelder humorale midler for avpasning av extracellulært volum, natrium og vaskulær resistens.
I særdeleshet har de nye peptider ifølge oppfinnelsen indikert terapeutisk anvendelse som et diuretisk, natriuretisk, renalt vasodilaterende og glattmuskelrelakserende middel. Dvs. at de utviser en grundig virkning på natrium, urinvolum, renal vasodilasjon og glattmuskeltonus.
Kort angitt er disse nye peptider blitt erholdt ved fraksjonering av rotte-atriale ekstrakter ved gelfiltreringskromatografi under dannelse av en høy- og en lav-molekylær fraksjon hvor begge hadde anvendbar natriuretisk aktivitet. Den lavmolekylære topp ble oppløst ved ionebyttekromatografi i to topper som utviste natriuretisk aktivitet og som enten preferensielt avspente bare intestinale muskelremser (kyllingrectum) eller som avspente både vaskulære (kaninaorta) og intestinale glattmuskelpreparater. Den intestinale glattmuskelrelakserende komponent ble separert i 4 topper og renset til homogenitet ved omvendt fase-væskekromatografi med høy ytelse (HPLC). Sekvensanalyse fastslo strukturen av dette serin-, glycin-rike peptid og viste at de fire biologisk aktive peptider avvek fra hverandre ved mangel på den første og andre aminoterminale serinrest eller mangel på den C-terminale serinrest. Det 21 aminosyrepeptid ble betegnet som atriopeptin I, og de andre tre topper som avspente intestinalremser og var natriuretiske og diuretiske, men som var ineffektive på blodkarremser, ble betegnet som des-ser''"-12 21 atriopeptin I, des-ser , ser -atriopeptin I og des-ser atriopeptin I.
På tilsvarende måte ble den vaskulære glattmuskelrelakserende komponent som var den mer kraftige natriuretiske-diuretiske forbindelse, oppløst i to hovedtopper på HPLC. Overraskende var de aminoterminale 21 aminosyrer av begge kaninaorta-relakseringsmidler homogene med de i det intestinale relakseringsmiddel, men det 23 aminosyrepeptid (angitt som atriopeptin II) utviste en phe-arg, og det
24 aminosyrepeptid (angitt som atriopeptin III) var forlenget med en phe-arg-tyr ved carboxyenden. Denne familie av nært beslektede peptider er antatt å være avledet fra en lignende høymolekylær forløper, og den biologiske selektivitet og styrke av de mindre peptider kan bestemmes ved virkningen
av en begrenset sekvensproteolytisk splitting.
Det kortere 21 aminosyrepeptid (angitt som atriopeptin I) avspenner intestinale men ikke vaskulære glatt-muskler og er natriuretisk og diuretisk in vivo. Det andre peptid (atriopeptin II) inneholdt 23 aminosyrer, dvs. de samme 21 aminosyrer med en C-terminal phe-arg-forlengelse som resulterer i et middel som avspenner både vaskulær og intestinal glattmuskel såvel som å være et kraftig natriuretisk-diuretisk middel in vivo.
Selv om beskrivelsen konkluderer med krav som særlig påpeker og distinkt krevet de trekk som betraktes som å ut-gjøre oppfinnelsen, er det antatt at oppfinnelsen vil bedre bli forstått fra den etterfølgende detaljerte beskrivelse av foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen i forbindelse med de ledsagende tegninger hvori: fig. 1 er en grafisk representasjon som viser den sammenlignende intestinale glattmuskelrelakserende aktivitet (kyllingrectum-avspenning i mm) av de nye atriale peptider i en utførelsesform av oppfinnelsen.
Fig. 2 er en grafisk representasjon som viser den sammenlignende vaskulære glattmuskelrelakserende aktivitet (kaninaorta-avspenning i mm) av de nye atriale peptider i en annen utførelsesform av oppfinnelsen.
Det opprinnelige råmateriale for isolering av peptidene ifølge oppfinnelsen var fryste rottehjerter. Over 2500 slike rottehjerter ble underkastet en sekvens av trinn for isolering av de ønskede peptider. Trinnene for isolering kan kort' beskrives som: a) fremstilling av et råhomogenat av pattedyr-atrialvev og sentrifugering; b) koking av supernatanten og sentrifugering;
c) avsalting av supernatanten ved gelfiltrerings-
(S)
kromatografi på Sephadex G-15 harpiks;
d) gelfiltreringskromatografi av proteinfraksjonen på Sephadex<®>G-75 harpiks; e) ionebytterkromatografi av den lavmolekylære protein-fraksjon på SP-Sephadex® C-25 harpiks; f) væskekromatografi med høy ytelse (HPLC) av de to hovedproteinfraksjoner, og g) gjenvinning av de separerte atriale peptidfraksjoner.
De ovenfor angitte Sephadex® kromatografiharpikser er
velkjente materialer som er tilgjengelige fra Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ.
Biobestemmelser av de isolerte peptider ble foretatt
på kaninaortaremser og på segmenter av kyllingrectum under fysiologisk akseptable betingelser. Kaninaortaremser opprett-holdt i tonus av en kontinuerlig infusjon av norepinefrin utgjorde et pålitelig og følsomt forsøksvev. Anvendelse av isolert carbachol (et muscarinisk middel) trakk sammen kyllingrectumpreparatet, men ga imidlertid en hurtigere og enklere bestemmelse som lettet testingen av et større antall prøver.
Natriuretisk aktivitet av de isolerte peptider ble bestemt ved å injisere intravenøst i rotter og bestemme effekten på fraksjonert natriumutskillelse i urinen.
Disse metoder for bestemmelse av biologisk aktivitet (glattmuskelrelakserende aktivitet og natriuresis) som ut-viklet av en forskningsgruppe ledet av foreliggende opp-finner, er ytterligere beskrevet av Currie et al., Science 221, 71-73 (1983) .
Etterfølgende eksempler illustrerer ytterligere oppfinnelsen uten at det skal forståes at oppfinnelsen er begrenset til disse spesifikke eksempler. I eksemplene angir CRF kyllingrectumfaktor, mens RAF angir kaninaortafaktor.
Eksempel 1
Metoder
Avspenning av glattmuskel in vitro
Biobestemmelse. Spiralremser av brystaorta fra kanin og segmenter av kyllingrectum under 1 g strekk ble kontinuerlig perfusert med 10 ml/min oxygenert Krebs-Henseleit løsning (37°). Hviletonus ble fremkalt med enten 2 x 10 ^ M
— 8
norepinefrin (aorta) eller 2 x 10 M carbachol (rectum). Effektene av testsubstansene ble deretter bestemt ved påfør-ing med mikropipetter til strømmen av medium som strømmet
over vevene, under anvendelse av nitroglycerin (aorta) og isoproterenol (rectura) som standarder. Kolonnefraksjoner ble frysetørket og residuet oppløst i fosfatbufret saltvann for biobestemmelse.
Natriuresis. Den natriuretiske aktivitet av ekstrakter ble bestemt i 250-300 g Sprague-Dawley hannrotter under dial-urethan-anestesi. Et silastic blærekateter over skambenet ble anbragt for urinoppsamling, og et halevenekateter ble anvendt for infusjon av 0,225% NaCl i 5% dextroseløsning med 38^ul/min. Etter en ekvilibreringsperiode på 1 time ble to 10 minutters (min) urinoppsamlinger (grunnlinjebestemm-else) foretatt etterfulgt av en hurtig intravenøs injeksjon av testsubstansen og tre ytterligere 10 minutters urinoppsamlinger. Etter 1 times re-ekvilibreringsperiode ble et andre sett av oppsamlinger med en annen injeksjon av test-forbindelsene utført. Urinvolumet ble bestemt ved veiing i tarerte beholdere. Natriumkonsentrasjon ble målt ved flammefotometri.
Fremstilling og rensing av kyilingrectumfaktor ( CRF) og kaninaortafaktor ( RAF)
Homogenater ble fremstilt fra fryst atrialvev i 30 g mengder avledet fra 200 rotter ved dispergering i 10 vol/vekt vev av fosfatbufret saltvann i en 0,946 1 Waring blander (1 min) etterfulgt av "Polytron" PT20ST (20 sekunder) ved maksimal hastighet. Suspensjonene ble sentrifugert i 10 minutter ved 200 x g. Etter varmebehandling (10 ml aliquoter i 18 x- 150 mm testrør nedsenket 10 min i et kokende vannbad) ble denne supernatant sentrifugert igjen ved 12.000 x g i 10 min. Eddiksyre (iseddik) ble deretter tilsatt til super-natantvæsken til 0,5 M, og den resulterende suspensjon ble klaret ved en sluttsentrifugering (27.000 x g i 15 min). Supernatanten ble kromatografert på en G-15 Sephadex(*R* )kolonne (3 x 36 cm) i 0,5 M eddiksyre ved 600 ml/time, og proteinfraksjonen ble konsentrert ved frysetørking. Det kombinerte materiale avledet fra 600 rotter, ble deretter oppløst i 0,5 M eddiksyre og ble tilført til en 5 x 90 cm G-75 Sephadex® kolonne og eluert med 0,5 M eddiksyre med 96 ml/t. Biologisk aktivitet (glattmuskelrelakserende aktivitet og natriuresis) ble bestemt ved den tidligere beskrevne bestemm-elsesmetodologi beskrevet av Currie et al., Science 221, 71-73 (1983) i to topper: en høymolekylær (20.000 til 30.000) og en lavmolekylær (mindre enn 10.000) fraksjon.
Ytterligere rensing av den lavmolekylære fraksjon ble oppnådd ved ionebytterkromatografi. Det kombinerte materiale fra 1.200 rotter ble påført til en kolonne av SP-Sephadex<®>C-25 (20 g, tørrvekt, som utgjorde en 5 x 7 cm kolonne) i 25 mM ammoniumacetat/500 mM eddiksyre. Kromatogrammet ble fremkalt ved påføring av en lineær gradient av ammoniumacetat økende med 23,4 mM/time i en strømningshastighet på 96 ml/t, hvor eddiksyren ble holdt ved 500mil. Biologisk aktivitet ble bare funnet i to hovedfraksjoner: en, angitt som topp CRF (eluert ved 150 mM ammoniumacetat), som inneholdt kyllingrectum-relakserende faktor (CRF), og den andre, angitt som topp RAP (ved 270 mM ammoniumacetat), som inneholdt kaninaorta-relakserende faktor (RAF). Begge fraksjoner var an-riket med natriuretisk aktivitet.
Det sluttelige rensetrinn ble utført med HPLC med UV-overvåkning ved 215 nm. CRF- og RAF-fraksjoner fra SP-Sephadex^ kolonnen ble lyofilisert gjentatte ganger-for å fjerne flyktige materialer, oppløst på nytt i 0,1% trifluoreddiksyre, hvoretter HPLC ble kjørt på en "Brownlee" RP-300 Aquopore kolonne (4,6 mm x 25 cm) under anvendelse av følg-ende gradienter ved 1,0 ml/min. CRF: 0—^10%A over 3,8 minutter og deretter 10%A—»14,8%A over 60 minutter og 14,8%A—»16,4%A over 100 minutter. Tre topper med CRF-aktivitet ble eluert ved 113,8 minutter. RAF: 0—»16%A over 3,6 minutter og deretter 16%A—>22,4%A over 80 minutter. Et bånd med RAF-aktivitet ble eluert ved 48,8 min. I alle til-feller var løsningsmidel A=0,1% trifluoreddiksyre/aceto-ni.tril, B=0,1% trifluoreddiksyre/vann. De bioaktive fraksjoner ble reinjisert på en "Vydac" kolonne ( C^ q, 300 Å pore-størrelse, 4,6 mm x 25 cm) syre eluert med 1,0 ml/min under anvendelse av en gradient på 0—»50%C over 50 min. CRF-prøven ble oppløst i en hovedtopp (CRF-I, 29,3 min) og to mindre topper (CRF-II & -III, 29,5, 29,7 min). RAF-prøven ga en hovedtopp (RAF-I, 31,0 min) og en mindre topp (RAF-II, 31,5 min). Produktene ble lyofilisért og utviste når de ble lagret ved -20°C, en god stabilitet.
Edman- nedbrytning. De ovenfor isolerte polypeptider ble sekvensnedbrutt under anvendelse av en Applied Bio-systems Model 470A gassfasesekvenser som beskrevet av Hunkapiler - et al., Methods in Enzymol. _91 (1), kapittel 36, Academic Press, N.Y., 1983. Flere modifikasjoner innbefattet utelatelse av benzen som et av de anvendte løsningsmidler,
og erstatning av methanol med acetonitril som løsningsmiddel 4 i systemet. I tillegg var det anvendte omdannelsesreagens (reagens 4) 25% trifluoreddiksyre (i H20 v/v).
Koplingstider ble redusert til 600 sek totalt, mens splittingstider ble bibeholdt ved 850 sek. 30 eller flere sykluser ble fullført i hvert forsøk med en nedbrytning hver for CRF (665 pmol produksjonsutbytte), redusert/alkylert CRF (600 pmol) og RAF (1178 pmol). Fenylthiohydantoin-aminosyrer ble identifisert under anvendelse av væskekromatografi med høy ytelse som tilpasset fra Hunkapiler and Hood, Methods in Enzymol. Sl (1), kapittel 43, Academic Press, N.Y., 1983. Gjennomsnittlige gjentatte utbytteverdier på 91% ble bestemt for de aminosyrederivater som ble bedømt å være av interesse for nøyaktig kvantifisering.
Den ovenfor beskrevne metode tilveiebringer den sekvens av trinn som følges ved rensing av 1.200 rottehjerter. For å bestemme en relativ biologisk aktivitet ble den relakserende aktivitet av de atriale ekstrakter sammenlignet med en nitroglycerin standardkurve på blodkarremser (kaninaorta) og med isoproterenol på intestinalremser (kyllingrectum). Det opprinnelige råhomogenat av rotte-atria var for forurenset for å bestemme totalaktivitet. Et 10 minutters kokningstrinn lettet rensingen ved eliminering av en stor del av protein før avsalting på Sephadex^G-15-kolonnen. Den lavmolekylære fraksjon erholdt fra gelfiltreringskolonnen, ble ytterligere separert på ionebytterkolonnen basert på forskjeller i preferensiell spasmolytisk aktivitet av de forskjellige fraksjoner. Testing av en lO^ul aliquot av hver fraksjon viste således nærvær av to peptider, hvor en av disse preferensielt avspente intestinal-glattmuskelen og en ved lav dose preferensielt avspente blodkarremsen. En fullstendig dose-responsanalyse av begge topper indikerte imidlertid at den kyllingrectum-relakserende komponent utviste en uttalt selektivitet slik at til og med en høy dose av dette peptid ikke var aktivt som et blodkarrelakserende middel. På den annen side ga den andre topp en konsentrasjonsavhengig avspenning av både den intestinale og vaskulære remse. Toppen med den preferensielle selektivitet, dvs. den kyllingrectum-relakserende komponent, som også utviste natriuretisk-diuretisk aktivitet in vivo, ble ytterligere undersøkt som her beskrevet.
Den lyofiliserte kyllingrectum-aktive faktor (CRF) erholdt fra SPSephadex-^-kolonnen, ble fraksjonert ved omvendt fase ("Brownlee" C18) HPLC. CRF ble separert i tre hovedfraksjoner (I-III). Hver fraksjon ble lyofilisert og rekromatografert på HPLC på en "Vydac"-kolonne (C-^g, 300 Å porestørrelse). Det ble således erholdt 60^ug protein av CRF-I, 25/Ug CRF-II og 25^ug CRF-III. CRF-I ble kvantifisert som en glattmuskelrelakserende komponent og ga en konsentrasjonsavhengig avspenning, men avspente ikke på forhånd sammen-trukne aortaremsér. Intravenøs administrering av CRF-1 protein ga en økning i urin-natriumkonsentrasjonen.
Den rensede CRF-I prøve ble analysert ved gassfase-sekvensanalyse. Sekvensene av de nært beslektede lavmolekylære, spasmolytiske/natriuretiske peptider som bestemt i dette eksempel 1, er vist i etterfølgende tabell 1. Peptidene utviste et større antall av serin og glycinrester. CRF-II og CRF-III mangler én eller to aminoterminale serinrester tilstedeværende i CRF-I, hvilket antyder at disse er aminopeptidase-splittingsprodukter. Den intestinale reseptorerkjennelse synes å være tolerant overfor tap ved aminoenden da CRF-II og III er fullt ut biologisk aktive.
Det rensede lavmolekylære peptid angitt som RAF-I som utviste en preferensiell avspenning av vaskulær glattmuskel, ble ytterligere anlaysert med gassfase-sekvensanalysatoren. Ganske overraskende er sekvensen av de opprinnelige 21 aminosyrer av RAF-I nøyaktig den samme som de som ble observert for CRF-I. Hovedforskjellen i peptidene blir i carboxyl-enden. RAF-I er et kraftig vaskulært glattmuskelrelakserende middel in vitro og en selektiv renalvasodilator in vivo. RAF-I synes også å være betraktelig mer kraftig som natriuretisk substans enn CRF-I. Det sistnevnte peptid krever større doser og gir variabel in vivo-respons.
RAF-I og CRF-I kan lett differensieres ved ladning
(på ionebyttekromatografi) og mobilitet på omvendt fase HPLC. Carbbxy-endesekvensen av peptidene foreskriver deres biologiske spesifisitet. Den forkortede carboxyende på CRF-I begrenser dets biologiske aktivitet til avspenning av intes-tlnal glattmuskel og svak natriuretisk aktivitet. Dette peptid avspenner ikke isolerte blodkarremser og reduserer heller ikke renal resistens in vivo. På den annen side innbefatter den forlengede carboxyende i RAF-I de strukturelle trekk som er nødvendige for vaskulær reseptorerkjennelse og for initier-ing av natriuresis og diuresis. Den homogene art av de 21 aminoterminale aminosyrer i CRF og RAF indikerer sterkt at disse kan være avledet fra samme forløperpeptid. Aminopep-
tidasesplitting av minst de opprinnelige to serinrester vil ikke radikalt gå på bekostning av biologisk aktivitet. Imidlertid synes stedet for angrep på carboxydelen av det atriale peptid å bestemme den endelige biologiske respons.
Det proteolytiske enzym tilveiebringer et ideelt sted for regulering av de fysiologiske virkninger av disse spasmolytiske (natriuretiske) peptider.
Eksempel 2
Materialer og metoder
Rensingsprosedyre
1.400 fryste rotteatrier (Biotrol, Indianapolis, IN)
ble avskåret fremmedvev (153 g våtvekt), ble homogenisert i 10 volumer fosfatbufret saltvann i nærvær av fenylmethyl-sulfonylfluorid (l^ug/ml, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) og ble sentrifugert ved 2.500 x g i 10 minutter. Supernatanten ble oppdelt i 10 ml aliquoter og ble nedsenket i et 100°C bad i 10 minutter og sentrifugert ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4°C. Supernatanten ble justert til 0,5 M eddiksyre og tilført til en Sephadex® G-15 kolonne (8 x 36 cm) og ble eluert med 0,5 M eddiksyre (600 ml/time). Kolonneavløpet ble lyofilisert og rekonstituert i 0,5 M eddiksyre, ble tilført til en Sephadex® G-75 kolonne (5 x 90 cm) og ble eluert med 0,5 M eddiksyre med 9 6 ml/time.
Den lyofiliserte lavmolekylære fraksjon fra G-75-kolonnen ble tilført til SP-Sephadex^ C-25 (20 g gel, 5 x 7 cm kolonne) i 25 mM ammoniumacetat/O,5 M eddiksyre og ble eluert med en lineær gradient av ammoniumacetat (23,4 mM/time ved 96 ml/time) i 0,5 M eddiksyre. To biologisk aktive fraksjoner eluert til 160 mM som avspente intestinale muskelremser, men ikke vaskulære glattmuskelremser og den andre til 270 mM avspente både vaskulære og intestinale forsøksremser. Etter lyofilisering ble de lavmolekylære topper individuelt renset ved omvendt fase-høytrykksvæskekromatografi på en "Brownlee" RP-300 aquapore-kolonne (4,6 mm x 25 cm) under anvendelse av en blanding av løsningsmiddel (A) (0,1% trifluoreddiksyre/ acetonitril) og B (0,1% trifluoreddiksyre/vann) med 1,0 ml/min.
Den fraksjon som ble eluert fra SP-Sephadex<®>-kolonnen ved 160 mM ammoniumacetat, ble kjørt med 0 til 10% A over 3,8 minutter, deretter 10 til 14,8% A over 60 minutter og deretter 14,8 til 16,4% A over 100 minutter. Atriopeptin I ble eluert til 15,6% A, des-ser^-atriopeptin I ble eluert til 15,7% A, des-ser 1 , ser 2-atriopeptin I ble eluert til
21
15,7% A og des-ser -atriopeptin I til 15,8% A. Den SP-Sephadex^ fraksjon som ble eluert ved 270 mM, ble separert på den samme gradient på HPLC hvor atriopeptin II ble gjenvunnet fra en gradient på 0-16% A i løpet av 5,8 minutter og 16 til 22% i 80 minutter ved 19,6% A, og atriopeptin III til 21,1% A. De bioaktive fraksjoner ble på nytt påført til en "Vydac" octadecasilyl-kolonne (300Å porestørrelse, 4,6 mm x 25 cm)
og eluert til 1,0 ml/min under anvendelse av en blanding av løsningsmiddel A (0,05% trifluoreddiksyre i acetonitril) og B (0,05% trifluoreddiksyre i vann) under anvendelse av en gradient fra 0 til 30% over 30 minutter. Atriopeptin I frem-kom ved 29,5% A, des-ser^-atriopeptin I ved 29,7% A, des-ser''",
2 21
ser -atriopeptin I ved 29,7% A, des-ser -atriopeptin I ved 29,9% A, atriopeptin II ved 31,5% A og atriopeptin III ved 32% A fra en gradient på 10 til 35% over 25 minutter. Poly-peptidene ble sekvensnedbrutt under anvendelse av en Bio-system modell 470 A gassfase-sekvensanalysator som beskrevet i eksempel 1. 30 eller flere sykluser ble fullført i hvert forsøk med en nedbrytning hver for: det reduserte og alkyl-erte atriopeptin I (600 pmol produksjonsutbytte) , des-ser^"-atriopeptin I (660 pmol), des-ser 21-atriopeptin I (520 pmol), des-ser 1 , ser 2-atriopeptin I (6 50 pmol), atriopeptin II
(1200 pmol) og atriopeptin III (850 pmol). Atriopeptinene ble redusert og alkylert ved oppløsning av peptidet
(0,5-5 nmol) i 90^ul 2% SDS (natriumdodecylsulfat) i 0,4 M tris-acetat (pH 9,0), lO^ul 100 mM dithiothreitol ble tilsatt, reaksjonsblandingen ble spylt med nitrogen, ble forseglet og inkubert ved 37°C i 60 minutter. Deretter ble 20^ul av en frisk løsning av 120 mM jodacetamid (som var blitt omkrystallisert tre ganger) tilsatt, blandingen ble spylt med nitrogen, forseglet og inkubert ved romtemperatur i 10 minutter og deretter overført til et kokt dialyserør og dialysert
mot 0,1% SDS i 2 timer og redialysert over natten etterfulgt av lyofilisering. Fenylthiohydantoin-aminosyrer ble identifisert under anvendelse av væskekromatografi med høy ytelse som beskrevet i eksempel 1. Midlere gjentatte syklusutbytter var større enn 90% for hver syklus hvis signal muliggjorde nøyaktig kvantivisering. Proteinkonsentrasjonen av de rensede peptider ble bestemt ved metoden ifølge Lowry et al., J. Biol. Chem. 193, 265-276 (1951) . Glattmuskel-bestemmelses-teknikken ble utført som beskrevet av Currie et al., Science 221, 71-73 (1983). Kort angitt ble spiralformede remser av kanin-brystaorta og kyllingrectum kontinuerlig super-perfusert med 10 ml/min med oxygenert Krebs-Henseleit-medium (37°C). For å påvise relakserende substanser ble en hviletonus fremkalt ved infusering av de vaskulære glattmuskel-— 8
preparater med norepinefrin (2 x 10 M).
Den natriuretiske-diuretiske bestemmelse (U-N. a V % av grunnlinjekontroll) ble utført på 250-300 g Sprague-Dawley rotter bedøvet med 0,4 ml dial-urethan. Et silastic-kateter ble anbragt i blæren for urinoppsamling, og et halevenekateter ble anvendt for infusjon av 0,225% NaCl i 5% dextrose til 38^,ul/min. Etter en ekvilibreringsperiode på 1 time ble to 10 minutters urinoppsamlinger foretatt etterfulgt av hurtig intravenøs injeksjon av testsubstansen hvoretter 3 ytterligere 10 minutters urinoppsamlinger ble foretatt. Urlnvolumet ble bestemt ved veiing i tarerte beholdere. Natriumkonsentrasjonen ble målt ved flammefotometri.
Resultater
Renseprotokollen anvendt for å fremstille peptider
rene nok for sekvensanalyse, er vist i tabell 2. Det opprinnelige råhomogenat av rotteatria er for forurenset for å bestemme total biologisk aktivitet. Et 10 minutters koke-trinn lettet rensingen ved eliminering av en stor del av
(lb
protein før avsalting på Sephadex^G-15-kolonnen. Den lavmolekylære fraksjon erholdt fra gelfiltreringskolonnen, ble ytterligere separert på ionebytterkolonnen basert på forskjeller i nettoladning og i preferensiell spasmolytisk
aktivitet av de forskjellige fraksjoner. Testing av aliquoter av hver fraksjon viste således nærvær av to hovedpeptid-fraksjoner hvor en preferensielt avspente den intestinale glattmuskel og en som ved lave doser avspente både blodkar og intestinalrem.se. Den lyofiliserte kyllingrectum-aktive faktor erholdt fra SP-Sephadex^-kolonnen, ble fraksjonert ved omvendt fase ("Brownlee" Clg) HPLC i 4 fraksjoner. På lignende måte ble også den topp som utviste vaskulær avspennings-aktivitet, oppløst i to hovedtopper (atriopeptin II og III). Hver fraksjon ble lyofilisert og rekromatografert ved HPLC
på en "Vydac"-kolonne og gjennomgikk sekvensanalyse. Sekvensene av de nært beslektede, lavmolekylære spasmolytiske/natriuretiske peptider som bestemt i dette eksempel nr. 2, er vist i tabell 3. Peptidene utviste et stort antall av serin-og glycinrester og inneholdt en indre disulfidring. De fire peptider som selektivt virket på intestinal-glattmuskel, men ikke vaskulær-glattmuskel, avvek fra hverandre på grunn av mangel på en eller to serinrester ved aminoenden, eller mangel på en C-terminal serinrest. Peptidene som var kraftige vaskulære glattmuskelrelakserende midler såvel som intestinale spasmolytiske midler, inneholdt en carboxyl-endeforlengelse med phe-arg eller en phe-arg-tyr i atriopeptin II og III.
En kvantitativ sammenligning av den biologiske aktivitet av de forskjellige atriale peptider indikerer at intestinal-reseptorerkjennelsen er tolerant overfor tap på aminoenden
1 12
da des-ser -atriopeptin I og des-ser , ser -atriopeptin er aktive peptider. Mangel på en phe-arg-carboxyforlengelse ute-lukker imidlertid vaso-relakserende aktivitet og reduserer delvis in vivo-natriuretisk-diuretisk aktivitet. Styrken av atriopeptin II og III in vitro og in vivo er sammenlignbare, hvilket antyder at ytterligere forlengelse av C-enden utover arg ikke ytterligere påvirke aktiviteten i vesentlig grad.
Fig. 1 og 2 illustrerer denne kvantitative sammenligning av den biologiske aktivitet av disse atriale peptider ved bestemmelsesmetodene som gjør bruk av kyllingrectum og kaninaorta som tidligere beskrevet.
Tabell 2. Rensing av 153 g vev (atrier fra 1.400 rottehjerter) . Den biologiske aktivitet ble sammenlignet på intestinale glattmuskel- (kyllingrectum) remser. Kvantifisering oppnådd ved utførelse av dose-responskurver med hvert peptid i sammenligning med responsen overfor en standardkurve oppnådd med isoproterenol (intestinalrelakserende komponent). En enhet av aktivitet ble satt til å være lik 1 ng isoproterenol .
^Blanding av des-ser^-AP I og des-ser<1>, ser<2->AP I. AP = atriopeptin
u = enheter
De atriale peptider ble testet in vivo i rotter med hensyn til natriuretisk styrke etter intravenøs injeksjon av 2^ug av de 6 peptider. Atriopeptin II og III var like kraftige og noe mer aktive enn atriopeptin I. Ytterligere^forkortelse av den 21 aminosyrelengde av peptidet ved tap av seriner enten ved N- eller C-enden resulterte i en reduksjon av natriuretisk-diuretisk styrke. Resultatene av denne in vivo-testing er angitt i etterfølgende tabell 4.
Tabell 4. Sammenlignende effektivitet av atriale peptider som.natriuretiske-diuretiske substanser in vivo. U^aV-datåene er presentert som % av de stabile grunnlinje-verdier erholdt umiddelbart før injeksjon av peptidet. Grunn-linje UNaV var 0,21 - 0,05^u ekvivalenter/min.
A 1 12
Blanding av des-ser -AP I og des-ser , ser -AP I.
NS = ikke signifikant
I isolert, perfusert rottenyre fremkalte atriopeptin II og atriopeptin III en konsentrasjonsavhengig renal vasodilasjon. Peptidene som mangler phe-arg C-enden (dvs. atriopeptin I-familien av peptidene), var meget mindre aktive renale vasodilatorer.
Forskjellige andre eksempler og modifikasjoner av de foregående eksempler vil være innlysende for fagmannen etter å ha satt seg inn i foreliggende beskrivelse uten å avvike fra oppfinnelsens ramme, og det skal foreståes at alle slike eksempler eller modifikasjoner er innbefattet innen rammen for de medfølgende krav. Således er variasjoner i lengde og sammensetning av endegruppene (F^eller R2) av peptidene eller i de individuelle aminosyrer av peptidene som ikke ugunstig eller skadelig påvirker deres biologiske aktivitet som her definert, innbefattet innen rammen for de medfølgende krav.
For å illustrerer slike andre eksempler og modifikasjoner i endegruppene og de individuelle aminosyrer i peptidene tilveiebringes følgende ytterligere eksempler.
Eksempel 3
Syntetiske humane atriale peptider ble fremstilt som svarer til rotte-atriopeptin II og III i foregående eksempel 2. Disse humane atriopeptiner hadde aminosyresekvensen av foregående generelle formel med det unntak at aminosyren i 8-stilling er methionin istedenfor isoleucin slik som i rotte-atriopeptin. Kangawa et al., Biochem. and Biophys. Res. Commun. 118(1), s. 131-139, 13. jan., 1984, beskriver rensing av et 28-aminosyres peptid fra humant atrialt ekstrakt som har natriuretisk, diuretisk og vasorelakserende aktivitet. Aminosyresekvensen i angitte peptid er identisk med aminosyresekvensen av et tilsvarende 28-aminosyres peptid fra rotte-atrialt ekstrakt (Cardionatrin I) beskrevet av Flynn et al., Ibid., 117(3), s. 859-865, 28. des., 1983, bortsett fra erstatning av en isoleucinrest med methionin. Således ble de syntetiske humane atriopeptiner II og III ifølge oppfinnelsen med 23 og 24 aminosyrer (humant AP-II og AP-III) fremstilt med sekvenser som følger:
Atriopeptinmolekylene ble syntetisert på 1% tverrbundne polystyrenbærere ved den klassiske fast-fasemetode ifølge Merrifield. Se Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-54
(1963) og Science 150, 178-85 (1965); Stewart og Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman&Co.,
San Francisco, 196 9, og oppsummeringskapitlet av Merrifield
i Advances in Enzymology 3_2, s. 221-296, F. F. Nold, Ed., Interscience Publishers, New York, 1969, og Erickson and Merrifield, The Proteins, vol. 2, s. 255 (forf. Neurath og Hill), Academic Press, New York, 1976. En standard syntetisk syklus er avbildet i tabell 5. Generelt varierte koplingsgradene av Boc-aminosyre (med den N-beskyttende gruppe t-butyloxycarbonyl) med den voksende peptidkjede av-hengig av arten av substratet slik at peptidharpiksen ble overvåket ved ninhydrin-farvereaksjonstest for å bestemme når reaksjonen var fullført. I det tilfelle at reaksjonen var ufullstendig etter kopling over natten ble harpiksen rekoplet med en ny ladning av Boc-aminosyre og koplingsmidlet dicyclohexylcarbodiimid (DCC). N-beskyttede aminosyrer anvendt ved syntesen, var Boc-Ser(Bzl), Boc-Cys(4-MeBzl), Boc-Phe, Boc-Gly, Boc-Arg(Tos), Boc-Ile, Boc-Met, Boc-Asp(OBzl), Boc-Ala, Boc-Gln, Boc-Leu, Boc-Asn, Boc-Tyr-(2,6-diClBzl), og harpiksene var klormethylert polystyren for peptidsyrer og 4-methylbenzhydrylamin for peptidamider.
Peptidene ble avbeskyttet og fjernet fra harpiksen ved en to-trinns HF-prosedyre som beskrevet av Tam et al., Tetra-hedron Letters 1982, s. 2939, og ble renset ved kromatografi under middels trykk under anvendelse av en "Vydac" omvendt fasekolonne og eluert med en gradient av 5 til 50% acetonitril i vann (begge løsningsmidler bufret med 0,1% trifluoreddiksyre) . Renheten av peptidet ble overvåket ved analytisk omvendt fase-HPLC på en "Vydac"-kolonne. Peptidene ble oxydativt cyklisert (disulfiddannelse mellom cysteinrestene) ved omrøring av det rensede peptid i kontakt med luft i ammoniumacetatbuffer med pH 8,3. Cykliseringsforløpet ble overvåket ved analytisk HPLC, og når cykliseringen var full-ført, ble peptidet renset på en kolonne av middels trykk som ovenfor beskrevet. Det sluttelige produkt ble lyofilisert fra 30% eddiksyre. Strukturen på produktene ble fastslått ved aminosyreanalyse og ved gassfase-mikrosekvensering. Produktene var rene som fastslått ved HPLC under to forskjellige kolonnebetingelser.
Aktiviteten av de humane atriopeptinprodukter ble bestemt ved in vitro-bestemmelse på vaskulær glattmuskel (kaninaorta) og ved in vivo-bestemmelse på hunder hvor glattmuskel-avspenning og diurese og natriurese ble overvåket. Resultatene med de humane atriopeptinprodukter sammenlignet med resultatene med de tilsvarende rotte-atriopeptinprodukter (rotte-atriopeptin III 1,0) er oppført i tabell 6.
De N-beskyttede aminsyrer- anvendt ved den ovenfor beskrevne fastfase-peptidsyntese, er definert som følger:
Boe - Ser (Bzl) = t-Boc-O-benzyl-L-serin
Boe - Cys (4-MeBzl) = t-Boc-S-4-methylbenzyl-L-cystein
Boe - Phe = t-Boc-L-fenylalanin
Boe - Gly = t-Boc-glycin
Boe - Arg(Tos) = t-Boc-N^-tosyl-L-arginin
Boe - Ile = t-Boc-L-isoleucin
Boe - Met = t-Boc-L-methionin
Boe - Asp(OBzl) = t-Boc-L-aspartinsyre-(3-benzylester
Boe - Ala = t-Boc-L-alanin
Boe - Gin = t-Boc-L-glutamin
Boe - Leu - t-Boc-L-leucin
Boe - Asn = t-Boc-L-asparagin
Boc-Tyr(2,6-diClBzl) = t-Boc-0-2,6-diklor-benzyl-L-tyrosin
I nyrefunksjonstestene på hunder ble pentobarbitol-bedøvede bastardhunder underkastet intrarenal arterie-injeksjon av atriopeptinene i mengder på 5 og 3Cyug pr. kg kroppsvekt pr. minutt. Rotte-atriopeptin II og III og human AP III fremkalte en konsentrasjonsavhengig økning i både renal blodstrømning (under anvendelse av en elektromag-netisk strømningssonde) og natriumutskillelse (UNaV), mens atriopeptin I var relativt inaktivt. I kontrollstandarden (rotte-atriopeptin III = 1,0) var den dose som var nødvendig for å fremkalle en økning av renal blodstrømning på 15 ml/min og en økning i natriumutskillelse på 200% ca. 3 nanomol.
Kaninaorta-avspenningstesten ble utført som beskrevet i eksempel 1 og 2 og den publiserte prosedyre ifølge Currie et al., Science 221, 71-73 (1983), under anvendelse som rotte-atriopeptin III = 1,0 som kontroll.
Eksempel 4
Et syntetisk atrialt peptid ble fremstilt ved den klassiske fastfase-metode ifølge Merrifield som beskrevet i eksempel 3 med det unntak at det manglet en serinrest ved aminoenden, og at aminosyrene i 8-og 14-stilling var isoleucin og glutaminsyre istedenfor methionin og glutamin. I denne syntese ble ekvivalente mengder av det N-t-Boc-beskyttede isoleucin og glutaminsyre anvendt istedenfor det N-t-Boc-beskyttede methionin og glutamin i aminosyre-koplings-sekvensen ved 8- og 14-stilling, og koplingssyklusen ble av-kortet for å stryke den første serinrest ved aminoenden. Således hadde det syntetiske atriale peptid ifølge dette eksempel, [des-ser<1>, glu<14>]atriopeptin II, følgende sekvens:
Ved kaninaorta-avspenningstesten hadde dette atriale peptid en verdi på 0,2 i forhold til 1,0-verdien for rotte-atriopeptin III som kontrollstandard.
Eksempel 5
Et syntetisk atrialt peptid ble fremstilt ved den klassiske fastfase-metode ifølge Merrifield som beskrevet i eksempel 3, med det unntak at aminosyren i 8-stilling var isoleucin istedenfor methionin, og at OH-gruppen i carboxyenden var erstattet med amino (NI^)-gruppen. For å oppnå peptid-amidderivatet ble 1% tverrbundet 4-methylbenzhydrylamin anvendt som den faste fasebærerharpiks ifølge Merrifield i dette eksempel. Således hadde det syntetiske atriale peptid ifølge dette eksempel, atriopeptin-II-amid, følgende sekvens:
Når dette atriale peptid ble biologisk testet som beskrevet i eksempel 3, hadde det en verdi på 3,0 i kaninaorta-avspenningstesten og en verdi på 5,0 i både den renale blod-strømningstest på hunder og urinstrømningstest på hunder i forhold til 1,0-verdiene for rotte-atriopeptin III som kontrollstandard.
Eksempel 6
Et syntetisk atrialt peptid ble fremstilt ved den klassiske fastfase-metode ifølge Merrifield som beskrevet i eksempel 5, med det unntak at serinresten i aminoenden ble erstattet med acetylserin. For å oppnå dette acetylpeptid-derivat ble renset atriopeptin-III-amid ifølge eksempel 5 om-satt med N-hydroxysuccinimidesteren av eddiksyre i vandig NH^HCO-j-buf f er ved pH 8, og det resulterende acetylerte produkt ble renset ved omvendt fase-HPLC. Således hadde det syntetiske atriale peptid ifølge dette eksempel, acetyl- atriopeptin-II-amid, følgende sekvens:
Når dette atriale peptid ble biologisk testet som beskrevet i eksempel 3, hadde det en verdi på 3,0 i kaninaorta-avspenningstesten og en verdi på 5,0 i både renal blodstrøm-ningstest på hunder og urinstrømningstest på hunder i forhold til 1,0-verdien for rotte-atriopeptin III som kontrollstandard.
Claims (9)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av et peptid med kraftig natriuretisk aktivitet omfattende følgende aminosyresekvens:
R^ -cys-phe-gly-gly-arg-ile-asp-arg-ile-
gly-ala-gln-ser-gly-leu-gly-cys-asn-R2
hvori R^ = H, ser, ser-ser, og
R2 = OH, ser, ser-phe-arg, ser-phe-arg-tyr,
eller fysiologisk akseptable salter, estere eller amider derav, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn:
a) fremstilling av et råhomogenat av pattedyratriale vev og sentrifugering;
b) kokning av supernatanten og sentrifugering;
c) avsalting av supernatanten ved gelfiltreringskromatografi på Sephadex <®> G-15 harpiks;
d) gelfiltreringskromatografi av proteinfraksjonen på SephadeiS)G-75 harpiks;
e) ionebyttekromatografi av den lavmolekylære protein-fraksjon på SP-Sephadex^C-25 harpiks;
f) væskekromatografi med høy ytelse av de to hovedproteinfraksjoner; og
g) gjenvinning av de separerte atriale peptidfraksjoner.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av et peptid hvori R-^ er ser-ser og R2 er ser, eller hvori R1 er ser og R2 er ser.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av et peptid hvori R^ er H og R2 er ser, eller hvori R^ er ser-ser og <R>2 er OH.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av et peptid hvori R^ er ser-ser og R2 er ser-phe-arg, eller hvori R1 er ser-ser og R2 er ser-phe-arg-tyr.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 4 for fremstilling av et peptid hvori ile i aminosyrestilling 8 er erstattet med met.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 4 for fremstilling av et peptid hvori ile i aminosyrestilling 8 er erstattet med met.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av et peptid hvori er ser, R2 er ser-phe-arg, og hvori gin er erstattet med glu.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 4 for fremstilling av et peptid hvori OH-gruppen i carboxyenden er erstattet med en aminogruppe.
9. Fremgangsmåte ifølge krav 8 for fremstilling av et peptid hvori serinresten ved aminoenden er erstattet med acetylserin.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US55137283A | 1983-11-10 | 1983-11-10 | |
| US06/569,684 US4496544A (en) | 1983-11-10 | 1984-01-10 | Atrial Peptides |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO844489L true NO844489L (no) | 1985-05-13 |
Family
ID=27069747
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO844489A NO844489L (no) | 1983-11-10 | 1984-11-09 | Fremgangsmaate ved fremstilling av nye atriale peptider |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4496544A (no) |
| EP (1) | EP0142487B1 (no) |
| JP (1) | JPH0672156B2 (no) |
| AU (1) | AU566235B2 (no) |
| DE (1) | DE3480930D1 (no) |
| DK (1) | DK533484A (no) |
| ES (1) | ES8606390A1 (no) |
| FI (1) | FI83661C (no) |
| GR (1) | GR80905B (no) |
| IE (1) | IE58819B1 (no) |
| IL (1) | IL73466A (no) |
| NO (1) | NO844489L (no) |
Families Citing this family (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0116784B1 (en) * | 1982-02-22 | 1992-06-10 | Queen's University At Kingston | Atrial natriuretic factor |
| AU572173B2 (en) * | 1983-08-29 | 1988-05-05 | Institut De Recherches Cliniques De Montreal | Natriuretic factors |
| JPS60136596A (ja) * | 1983-12-26 | 1985-07-20 | Suntory Ltd | ペプチド及びこれを有効成分とする利尿剤 |
| US4952561A (en) * | 1984-02-07 | 1990-08-28 | Merck & Co., Inc. | Cardiac atrial peptides |
| JPH0794473B2 (ja) * | 1984-03-02 | 1995-10-11 | サントリー株式会社 | 新規なペプチド及びこれを有効成分とする利尿剤 |
| US5212286A (en) * | 1984-04-19 | 1993-05-18 | Scios Nova Inc. | Atrial natriuretic/vasodilator peptide compounds |
| DE3588006T2 (de) * | 1984-04-19 | 1995-08-10 | Scios Nova Inc | Atrielle natriumuretische/gefässerweiterende polypeptide. |
| US4618600A (en) * | 1984-04-19 | 1986-10-21 | Biotechnology Research Associates, J.V. | Novel polypeptide diuretic/vasodilators |
| WO1985004872A1 (en) * | 1984-04-24 | 1985-11-07 | The Salk Institute For Biological Studies | Atrial peptide analogs |
| JPH0672157B2 (ja) * | 1984-08-29 | 1994-09-14 | 味の素株式会社 | 新規ペプチド |
| US4652549A (en) * | 1985-01-22 | 1987-03-24 | Merck & Co., Inc. | Cardiac anti-hypertrophic agents |
| US5087564A (en) * | 1985-06-20 | 1992-02-11 | Monsanto Company | Release of recombinant peptides from polypeptides using V8 endopeptidase |
| FI872959A7 (fi) * | 1985-11-05 | 1987-07-03 | California Biotechnology Inc | Natriureettisen vaikutuksen omaavien sydämen eteispeptidien analogeja . |
| JP3042782B2 (ja) * | 1985-11-05 | 2000-05-22 | サイオス インコーポレイテッド | 心房性ナトリウム尿排泄亢進ペプチド類似化合物 |
| US4757048A (en) * | 1985-11-05 | 1988-07-12 | Biotechnology Research Associates J.V. | Synthetic analogs of atrial natriuretic peptides |
| DE3614833A1 (de) * | 1986-01-16 | 1987-07-23 | Hoechst Ag | Peptide mit vasorelaxierender, natriuretischer und diuretischer wirkung, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende mittel und ihre verwendung |
| US4716147A (en) * | 1986-03-27 | 1987-12-29 | Monsanto Company | Synthetic airial peptides |
| US4721704A (en) * | 1986-05-09 | 1988-01-26 | Peninsula Laboratories, Inc. | Potent synthetic atrial peptide analogs |
| EP0246795A3 (en) * | 1986-05-20 | 1990-04-04 | Advanced Peptide Development Limited | Synthetic natriuretic peptides |
| US4740499A (en) * | 1986-07-28 | 1988-04-26 | Monsanto Company | Method of enhancing the bioactivity of atrial peptides |
| US5565606A (en) * | 1986-10-21 | 1996-10-15 | Hoechst Aktiengesellschaft | Synthesis of peptide aminoalkylamides and peptide hydrazides by the solid-phase method |
| DE3723551A1 (de) * | 1987-07-16 | 1989-01-26 | Hoechst Ag | Peptide mit vasorelaxierender, natriuretischer und diuretischer wirkung, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende mittel und ihre verwendung |
| US4804650A (en) * | 1986-10-28 | 1989-02-14 | Biotechnology Research Associates, J.V. | Analogs of atrial natriuretic peptides |
| US5500230A (en) * | 1987-01-23 | 1996-03-19 | The General Hospital Corporation | Method for treatment of glaucoma with nitrogen containing guanylate cyclase activators |
| EP0583821B1 (en) * | 1987-01-23 | 2000-03-29 | The General Hospital Corporation | Hydralazine as topical treatment for glaucoma |
| IT1216865B (it) | 1987-02-03 | 1990-03-14 | Eniricerche Spa | Derivato argininico, procedimento per la sua preparazione e suo impiego nelle sintesi peptidiche. |
| DE3881467T2 (de) * | 1987-10-09 | 1993-10-21 | Agency Ind Science Techn | Vasokonstriktor-Peptid. |
| US4935492A (en) * | 1987-12-24 | 1990-06-19 | California Biotechnology Inc. | Cyclic analogs of atrial natriuretic peptides |
| US5047397A (en) * | 1988-08-26 | 1991-09-10 | California Biotechnology Inc. | Linear analogs of atrial natriuretic peptides |
| US5114923A (en) * | 1988-05-31 | 1992-05-19 | California Biotechnology Inc. | Recombinant techniques for production of novel natriuretic and vasodilator peptides |
| CA1339210C (en) * | 1988-05-31 | 1997-08-05 | John Lewicki | Recombinant techniques for production of novel natriuretic and vasodilator peptides |
| JP2801079B2 (ja) * | 1990-11-14 | 1998-09-21 | サントリー株式会社 | Ａｎｐ関連新規ペプチド |
| JP2809533B2 (ja) * | 1991-01-31 | 1998-10-08 | 壽之 松尾 | Ｃｎｐ類似体ペプチド |
| US6525022B1 (en) | 1993-11-12 | 2003-02-25 | Genentech, Inc. | Receptor specific atrial natriuretic peptides |
| US5846932A (en) * | 1993-11-12 | 1998-12-08 | Genentech, Inc. | Receptor specific atrial natriuretic peptides |
| US5665704A (en) * | 1993-11-12 | 1997-09-09 | Genentech, Inc. | Receptor specific atrial natriuretic peptides |
| US5486519A (en) * | 1994-08-22 | 1996-01-23 | Greenwald; James E. | Method for treatment of acute renal failure |
| US5521191A (en) * | 1994-10-17 | 1996-05-28 | Washington University | Method for treatment of arterial stenosis |
| US20060177870A1 (en) * | 2003-04-28 | 2006-08-10 | Ciphergen Biosystems, Inc | Immunoassays |
| WO2005000095A2 (en) * | 2003-06-20 | 2005-01-06 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Isoforms of brain natriuretic peptide |
| EP2004633A4 (en) * | 2006-03-30 | 2009-08-26 | Palatin Technologies Inc | LINEAR NATRIURETIC PEPTIDE CONSTRUCTS |
| CA2647143A1 (en) * | 2006-03-30 | 2007-10-11 | Palatin Technologies, Inc. | Cyclic natriuretic peptide constructs |
| US8580746B2 (en) | 2006-03-30 | 2013-11-12 | Palatin Technologies, Inc. | Amide linkage cyclic natriuretic peptide constructs |
| CN101501067B (zh) * | 2006-08-08 | 2013-01-16 | 梅约医学教育与研究基金会 | 利尿和利尿钠的多肽 |
| WO2009036448A2 (en) * | 2007-09-15 | 2009-03-19 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Natriuretic peptide receptor-c agonists |
| CN103906761B (zh) | 2011-08-30 | 2016-12-21 | 梅约医学教育与研究基金会 | 利钠多肽 |
| WO2013103896A1 (en) | 2012-01-06 | 2013-07-11 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Treating cardiovascular or renal diseases |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA846084B (en) * | 1983-08-29 | 1985-05-29 | Montreal Inst Rech Cliniques | Natriuretic factors |
-
1984
- 1984-01-10 US US06/569,684 patent/US4496544A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-08 ES ES537520A patent/ES8606390A1/es not_active Expired
- 1984-11-09 IE IE288184A patent/IE58819B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-11-09 GR GR80905A patent/GR80905B/el unknown
- 1984-11-09 JP JP59236542A patent/JPH0672156B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-09 DK DK533484A patent/DK533484A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-11-09 NO NO844489A patent/NO844489L/no unknown
- 1984-11-09 DE DE8484870149T patent/DE3480930D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-09 AU AU35252/84A patent/AU566235B2/en not_active Ceased
- 1984-11-09 EP EP84870149A patent/EP0142487B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-09 IL IL73466A patent/IL73466A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-11-09 FI FI844424A patent/FI83661C/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0142487B1 (en) | 1990-01-03 |
| FI83661B (fi) | 1991-04-30 |
| DK533484A (da) | 1985-05-11 |
| FI83661C (fi) | 1991-08-12 |
| US4496544A (en) | 1985-01-29 |
| IE842881L (en) | 1985-05-10 |
| AU566235B2 (en) | 1987-10-15 |
| IL73466A0 (en) | 1985-02-28 |
| EP0142487A3 (en) | 1986-04-30 |
| ES8606390A1 (es) | 1986-04-01 |
| AU3525284A (en) | 1985-05-16 |
| FI844424A0 (fi) | 1984-11-09 |
| EP0142487A2 (en) | 1985-05-22 |
| DE3480930D1 (de) | 1990-02-08 |
| FI844424L (fi) | 1985-05-11 |
| JPS60214797A (ja) | 1985-10-28 |
| GR80905B (en) | 1985-04-02 |
| IE58819B1 (en) | 1993-11-17 |
| ES537520A0 (es) | 1986-04-01 |
| JPH0672156B2 (ja) | 1994-09-14 |
| DK533484D0 (da) | 1984-11-09 |
| IL73466A (en) | 1989-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO844489L (no) | Fremgangsmaate ved fremstilling av nye atriale peptider | |
| Kangawa et al. | Structural identification of β-and γ-human atrial natriuretic polypeptides | |
| Sudoh et al. | Brain natriuretic peptide-32: N-terminal six amino acid extended form of brain natriuretic peptide identified in porcine brain | |
| US4508712A (en) | Atrial peptide | |
| Kangawa et al. | Purification and complete amino acid sequence of α-human atrial natriuretic polypeptide (α-hANP) | |
| Forssmann et al. | The auricular myocardiocytes of the heart constitute an endocrine organ characterization of a porcine cardiac peptide hormone, cardiodilatin-126 | |
| DK2402369T3 (en) | Peptide fragments for inducing synthesis of extracellular matrix proteins | |
| US4935492A (en) | Cyclic analogs of atrial natriuretic peptides | |
| St-Pierre et al. | Synthesis of peptides by the solid-phase method. 6. Neurotensin, fragments, and analogs | |
| EP0289287A2 (en) | Amyloid peptides | |
| US20030171536A1 (en) | Process for preparing cardiodilatin fragments; highly purified cardiodilatin fragments and intermediate products for the preparation of same | |
| US5336759A (en) | Biologically active peptide derived from frog (frog CNP) | |
| WO1994020534A1 (en) | Vasonatrin peptide and analogs thereof | |
| JPH06500311A (ja) | ヒスチジン置換されたヒト成長ホルモン放出因子類縁体 | |
| AU614738B2 (en) | New cardiodilatin fragment, process for preparing same and use thereof | |
| DE3782073T2 (de) | Synthetische atriale peptide. | |
| US4557864A (en) | Atrial peptides | |
| JP2002511067A (ja) | 環式ｃｒｆアゴニスト | |
| Zhang et al. | Role of the intra-A-chain disulfide bond of insulin-like peptide 3 in binding and activation of its receptor, RXFP2 | |
| Takei et al. | Eel ventricular natriuretic peptide: isolation of a low molecular size form and characterization of plasma form by homologous radioimmunoassay | |
| US4732972A (en) | Polypeptides having growth hormone releasing activity | |
| US5262521A (en) | Isolated atrial peptide-degrading enzyme and novel compounds useful as inhibitors thereof | |
| JP3042782B2 (ja) | 心房性ナトリウム尿排泄亢進ペプチド類似化合物 | |
| JPH02223593A (ja) | ヒトカルパスタチン様ポリペプチド | |
| JPH04321699A (ja) | 新規な利尿ペプチド |