JPH04125461A - 複合酵素電極 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、試料中のアミノ酸を瞬時に測定できしかも耐
久性に優れた複合酵素電極に関するものである。

（従来の技術） 年々臨床検査や食品分析等で、アミノ酸の分析件数は増
加の一途をたどり１分析の迅速性、簡便性、高倍転性に
対する要求が高まっている中で。

酵素反応を利用した生化学的分析手法は酵素のもつ基質
特異性と反応の速さから上記分野で注目されるようにな
り、多くのアミノ酸の分析項目で酵素が主役を演するよ
うになっている。しかし臨床分野では、生体試料量に制
約があり、その上緊急を要する分析項目もあり、より一
層の迅速性、簡便性に優れ、且つ微小化とともに高価な
酵素の連続使用が可能な経済性に優れたアミノ酸測定用
のバイオセンサに期待が寄せられている。また食品分野
では工程管理や品質管理、あるいはグルタミン酸やアラ
ニンなどのアミノ酸は呈味物質として知られ、味の分析
という観点からもこれらアミノ酸の分析において、迅速
性、簡便性、経済性に優れたアミノ酸測定用のバイオセ
ンサが望まれている。

従来、アミノ酸測定用のバイオセンサとしてはアミノ酸
酸化酵素を直接酸素電極あるいは過酸化水素電極に固定
化した電極（１）、これにより迅速性を改善する目的で
アミノ酸酸化酵素と質量分析計を組み合わせた分析機器
（２）（特開昭６０−５２７６５号公報）、あるいは高
感度化を目指したアミノ酸酸化酵素とアミノ酸脱水素酵
素あるいはアミノ基転移酵素を同時に固定化した電極（
３）（特開昭６０−７３３５４号公報）などがある。

一方グルタミン酸−ピルピン酸トランスアミナーゼとピ
ルビン酸オキシダーゼを電極上に固定化したアラニン測
定用酵素電極（４）（特開昭６２−１６２９５２号公報
）及びグルタミン酸−ピルピン酸トランスアミナーゼと
グルタミン酸オキシダーゼを利用した酵素電極（５）〔
ケミストリー・エクスプレス（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｅ
ｘｐｒｅｓｓ）　５　、　１２５　（１９９０）　）の
開発も試みられている。

（発明が解決しようとする課題） 上記（１）〜（５）のいずれの電極もオキシダーゼを使
用しているため、原理的に溶存酸素量や還元性物質の影
響を受けやすいという欠点を有している。

また迅速性に関しては、（２）のみが１分以内の応答速
度を示し、高感度化に関しては、（３）と（５）のみが
μＭ１度あるいはそれ以下の測定濃度範囲を有している
ものの、迅速性と高感度化及び実質的に有利な耐久性を
同時に保有する実用性に富んだ酵素電極は実現されてい
ない。

本発明は、溶存酸素量や還元性物質の影響を受けず、迅
速に高感度に測定でき、しかも耐久性にすぐれたアミノ
酸測定用の複合酵素電極を提供することを目的としてい
る。

（課題を解決するための手段） 本発明者等は、このような課題を解決すべく鋭意研究を
進めてきたところ、酵素としてジアホラーゼ及びアミノ
酸デヒドロゲナーゼを、多官能基性アルデヒドを有する
架橋剤とともに導電性基体上に固定化した酵素電極が、
驚くほど瞬時に高感度で、しかも長期間にわたってアミ
ノ酸を定量できることを見いだし本発明を完成した。

すなわち１本発明はジアホラーゼとアミノ酸デヒドロゲ
ナーゼを、導電性基体上に多官能基性アルデヒドにより
固定化したことを特徴とする複合酵素電極を要旨とする
ものである。

以下１本発明の詳細な説明する。

本発明に用いられる導電性基体としては９例えばカーボ
ン電極があげられこの電極を陽極とすればよい。このカ
ーボン電極は例えばグラッシーカーボン電極を利用する
のが有利である。

また陰極としては種々の電極１例えば白金電極。

カーボン電極、金電極、パラジウム電極、銀電極などが
あげられ、電位規制用の参照電極としては銀／塩化銀電
極、飽和、甘せう電極などを使用することができる。パ
ラジウム電極、銀電極、銀／塩化銀電極、飽和甘せう電
極などを使用すば、陰極及び参照電極を一体化すること
も可能である。

本発明に用いられるジアホラーゼとしては、微生物由来
のもの、動物由来のもの等各種のものを使用することが
できるが、中でも最適生育温度が５０°Ｃないし８５°
Ｃである微生物の産生ずるものが好ましい。そのような
微生物としては例えばバチルス・ステアロサーモフィル
ス、バチルス・サーモプロテオリテイクス、バチルス・
アシドカルダリウス等のバチルス属、サーモアクチノマ
イセス属、サーマス属、サーモミクロビウム属等の微生
物があげられる。これらの中でも特に好ましい微生物と
しては、バチルス・ステアロサーモフィルスがあげられ
、その具体例としては、ＡＴＣＣ７９３３，７９５４，
１０１９４，１２９８０ＮＣＡｌ３Ｏ３，ＵＫ５６３株
（微工研菌寄第７２７５号、ＦＥＲＭ　　Ｐ−７２７５
，昭和５８年９月２９日寄託）等がある。

また１本発明に用いられるアミノ酸デヒドロゲナーゼと
しては、微生物由来のもの、動物由来のもの等各種のも
のを使用することができるが、中でも最適温度が５０°
Ｃないし８５°Ｃである微生物の産生ずるものが好まし
い。これら微生物としては、前記したジアホラーゼと同
様な微生物があげられ、これ以外にもロイコノストック
属、酵母等の産生ずるものも好ましい。

これらジアホラーゼとアミノ酸デヒドロゲナーゼは、い
ずれの濃度のものを使用してもよいが好ましくは各々０
．１〜３０重量％濃度の溶液、より好ましくはそれぞれ
０．５〜２０重景％濃度の溶液を導電性基体上に１〜２
００ｇ／ｍ”程度固定化すればよい。

本発明に用いられる多官能基性アルデヒドは。

架橋剤として用いられるものであって１例えば−官能基
性のアルデヒドがあげられる。二官能基性のアルデヒド
としてはグルタルアルデヒドを利用するのが有利であり
、使用する濃度としては０．１〜１０重量％濃度、より
好ましくは０．５〜３重量％濃度がよく、導電性基体上
への滴下量は０．１〜３ｇ／ｍ”程度が好ましい。

本発明において、ジアホラーゼ、アミノ酸デヒドロゲナ
ーゼを、多官能基性アルデヒドからなる架橋剤で導電性
１４体上に固定化するには、各々単独あるいは三者どの
様な組合せで導電性基体上に滴下してもよいが、好まし
くは多官能基性アルデヒドを最後に滴下して、導電性基
体上で三者を均一に混合するのがよい。

本発明の酵素電極を用いてアミノ酸を測定するには１例
えば、上記の電極を、アミノ酸デヒドロゲナーゼの基質
であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
Ｈ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
（ＮＡＤＰＨ）とジアホラーゼのメデイエータを含有す
る緩衝液に浸し、測定試料の添加によって生ずる電極電
流の定常値を測定すればよい。

緩衝液としては２例えば０．０１〜０．５Ｍのリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５〜１０．好ましくはｐＨ７〜９
）を用いればよい。測定温度は０〜６０°Ｃ９好ましく
は２０〜４０°Ｃが用いられる。

ジアホラーゼのメデイエータとしては　フェロセン、フ
ェロセン誘導体、　Ｎ、Ｎ、Ｎ”Ｎ＋−テトラメチルフ
ェニレンジアミン、２，６−シクロロフエノールインド
フエノール、ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレ
ット、ニトロブルーテトラゾリウム。

ビタミンになどのキノン系化合物、それにチトクロムＣ
等があるが、好ましくはフェロセニルメタノールあるい
はフェロセニル−１−エタノールを利用するのが有利で
ある。

上記のような測定方法において１本発明の複合酵素電極
は、応答時間が３０秒以内と驚くほど瞬時に測定ができ
た。

しかも電極上の酵素活性を長時間保持するためにセルロ
ースアセテート膜、ニトロセルロース膜のようなセルロ
ース系膜や、各種の合成高分子膜天然高分子膜等の選択
透過膜で固定化酵素電極を覆うなど２通常一般に行われ
ている固定化酵素膜の安定化を何ら図ることなく、半年
以上の使用にわたって当初の性能を保持する優れた耐久
性を有していた。

またフロータイブの装置に本発明の酵素電極を装備して
、フローインジェクション法で目的のアミノ酸を測定す
ることも可能である。

（実施例） 次に本発明を実施例によって具体的に説明する。

実施例１ 〈電極の作製〉 直径３ｍｍのグラフシーカーボンディスクＧＣ２０（東
海カーボン社製）をサンドペーパーと０．０５μｍ径の
アルミナ粉末で研磨後、超音波洗浄器を用い電極表面を
蒸留水で洗浄した。この電極表面上にジアホラーゼ〔バ
チルス・ステアロサーモフィルス由来（ユニチカ社製）
、６０ｍｇ／ｍＩ！、の酵素液を調製して用いた。］及
びロイシンデヒドロゲナーゼ〔バチルス・ステアロサー
モフィルス由来（ユニチカ社製）１４ｍｇ／ｍｊ！の酵
素液を調製して用いた。〕を各々０．４μ！及び２０μ
ｌ添加して混合後、さらに２重量％のグルタルアルデヒ
ドをマイクロシリンジで０．５μ！滴下して直ちに混合
した。その後室温下で一昼夜放置することによって混合
液中より溶媒を蒸発させて固定化酵素膜を作製した。こ
の電極は使用時以外０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
５）の中に入れ。

４°Ｃで保存した。

〈電気化学的測定〉 上記電極とポテンシオスタット（北斗電気社製モデル）
ＩＡＢ−１５１）　、それにＸ−Ｙレコーダ（グラフチ
ック社製モデルＷＸ４３０９６　）とを用い、３電極方
式を組み基礎液として０．０５ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ
７，５）を用い、磁気回転子は電極の真下的１ｍｍの位
置で溶液を攪拌させた（８００ｒｐｍ以上）。

電極電位は銀／塩化銀を基準にして測定し、その時の温
度は３０°Ｃに調節した。

〈ロイシンの測定〉 上記のように作成したジアホラーゼ及びロイシンデヒド
ロゲナーゼ固定化グラッシーカーボン電極をＮＡＤＨｏ
、５ｍＭとフェロセニルメチルアルコール０．１ｍＭを
含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）にいれ電極電
位を０．２ｖに固定した。この緩衝液中にロイシンを添
加し定常状態に達した（約３０秒）後、酸化電流値を測
定した。この定常状態における酸化電流１ｓｔ（残余電
流を補正しである）のロイシン濃度依存性を第１図に示
す。

第１図は、ＮＡＤＨとジアホラーゼのメデイエータであ
るフェロセニルメチルアルコールを含む緩衝液中の０．
２Ｖ印加時における定常電流１ｓｔ（縦軸）と被測定液
中のロイシン濃度（横軸）との関係を示すグラフで、第
１図から明らかなごとく定常電流１ｓｔはロイシン濃度
５０μＭまで良好な直線性が得られ、検出限界は２μＭ
であった。第２図は、５０μＭ濃度のロイシンを１７０
日にわたって１１０回測定した時の再現性を示すもので
。

変動係数が５％以内と、非常に再現性及び耐久性に優れ
ていた。

実施例２ 実施例１で作成したロイシン測定用複合酵素型極を用い
て大尿中のロイシンを定量した。その結果を表１に示す
。表１にはロイシンデヒドロゲナーゼを用いて分光学的
な方法（従来法）で測定した値も同時に示したが、よい
一致を見た。

表１０人尿中のＬ−ロイシン量 実施例３ 実施例１のグラフシーカーボンディスクにジアホラーゼ
〔パ゛チルス・ステアロサーモフィルス由来（ユニチカ
社製）、６０ｍｇ／ｍβの酵素液を調製して用いた。〕
及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ〔生肝臓由来（オリ
エンタル酵母社製）２０ｍｇ／ｍｊ２の酵素液を調製し
て用いた。〕を各々０．９μｌ及び２０μ！添加して混
合後、さらに１重量％のグルグルアルデヒドをマイクロ
シリンジで０．５μ！滴下し、その後実施例１と同様に
してグルタミン酸測定用酵素電極を作製した。この電極
を用いて実施例１と同様にして醤油中のグルタミン酸量
を測定しく測定時間３０秒以内）。

表２にその結果を示す。なお比較のためにアミノ酸分析
計（日立アミノ酸アナライザー）で測定した結果も同時
に示すが、測定値は両者よく一致していた。

表２．醤油中のし一グルタミン酸量 （発明の効果） 本発明の複合酵素電極は、ジアホラーゼとアミノ酸デヒ
ドロゲナーゼを、多官能基性アルデヒドを介して導電性
基体上に固定した電極で、目的のアミノ酸を高感度で瞬
時に測定ができ、しかも初期の性能を半年以上も保持し
ていることがらこれによって分析の自動化、高速化が可
能となる。また本発明の電極は構造が簡単なことから、
各アミノ酸に特異的なアミノ酸デヒドロゲナーゼを用い
ることで多数のアミノ酸測定用微小電極の作製も可能で
、試料の微量化及び微小領域への利用が達成されうる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＮＡＤＨとフェロセニルメチルアルコールを
含む緩衝液中の０．２Ｖ印加時における定常電流Ｉｓｔ
と被測定液中のロイシン濃度との関係を示すグラフであ
る。第２図は９本発明の複合酵素電極の再現性と耐久性
を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ジアホラーゼとアミノ酸デヒドロゲナーゼを、導
   電性基体上に多官能基性アルデヒドにより固定化したこ
   とを特徴とする複合酵素電極。