JPH04126085A - ネコ免疫不全ウイルスの遺伝子ｒｎａに相補性を示すｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ネコ免疫不全ウィルスの遺伝子ＲＮＡに相補
性を示すＤＮＡ、該ＤＮＡを含むプラスミド及び発現ベ
クター、該発現ベクターを含有する形質転換体、該形質
転換体を培養して得られる組換え型ネコ免疫不全ウィル
スポリペプチド、並びに該ポリペプチドを含有するネコ
免疫不全ウィルス感染診断用検査薬に関する。

［従来の技術］ 後天性免疫不全症候群（＾ｃｑａｉｒｅｄ　Ｉａｍｎｎ
ｏｄｅｌｉｅｉｅｎｃ７５７ｎｄ＋ｏｍ；ＡＩＤＳ）は
、ヒト免疫不全ウィルス（ＩＩＩＶ　）が引き起こす重
篤な免疫不全症であり、現在では全世界的に広がりつつ
ありその治療法の開発が望まれている。

ＡＩＤＳの原因ウィルスとしてＲＮＡを遺伝子として持
つレトロウィルスであるヒト免疫不全ウィルス１型（Ｈ
ＩＶ−１）が最初に発見、分離され［Ｍ、＾Ｇｒａｎｄ
　　ら、　　Ｐ＋ｏｅ、　Ｎ５ｌｌ、　Ａｃｘｄ、　Ｓ
ｃｉ、、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　、　ｖｏｌ、　Ｈｐ、４
００７．１９８６　］　、また最近においては、パスツ
ール研究所のグループによって、＾ＩＤｓの新しい病因
ウィルスとして西アフリカのＡＩＤＳ患者よりヒト免疫
不全ウィルス２型（）ＩＩＶ−２＋が発見、分離されて
いる［Ｆ、　Ｃ１ｒｙｅｌら、　Ｎ５ｌｕ＋ｅ　（Ｌｏ
ｎｄｏｎ）、　Ｙｏｌ、　３２４．　ｐ６９１、＋９１
１１コ　。

一方、ＡＩＤＳウィルスに類似するレトロウィルスがサ
ルからも発見、分離されている。たとえば、ベンカルザ
ルヨリＳＩＶ−ＭＡＣ［Ｎｔｖｍｉｔｋ　ら、　Ｎｘ１
ｏ＋ｅ（Ｌｏｎ＋１ｏｎ）、Ｖｏｌ、３２６．　　ｐ、
５４８．１９８７］　、またアフリカミドリザルより５
ＩＹ−八ＧＭが発見、分離されている。

ネコにおいては、最近、米国においてペタルマ株が単離
され、その遺伝子のクローニングが報告されたのみであ
る［Ｒ＾、　Ｏｌｍｔｌｅｄ　ら、　Ｐ、　Ｎ、　Ａ、
　Ｓ、　ｐ２４４８　（１９８９）　コ。このウィルス
に感染することにょりその臨床像としては、様々な口内
炎、慢性呼吸器疾患、慢性皮膚疾患、白血球減少、各種
日和見感染症等が報告されている（　ｌ１ｈｉ＋ｌｉら
、Ｉｐｎ、　　］Ｖ＋１．Ｓｅｉ、５０．　３９．　１
９８８）。

このウィルスの抗原性は、ＨＩＶ、５ＩＶＢＩＶ、ＶＭ
Ｖ血清などとは反応しないことが知られている。現在Ｆ
ＩＶ感染症の診断は実験室において抗体の検出により行
なわれているがこの方法は、感染リンパ球を抗原とした
間接蛍光抗体法、精製ウィルスを抗原としたウェスタン
プロット法が行なわれているのみである（　Ｐｅｄ＋ｚ
ｔｎら。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２３５．　７９０．　１９８７）。

［発明が解決しようとする課題］ エイズの原因ウィルスである！（ＩＶにおいては、個々
のウィルス間でその塩基配列が変異しており、その多様
性が見いだされている。このウィルスは場所によりある
いは経時的に変異し、遺伝的な均一性がないため、この
ウィルスに対するワクチンの開発には多くの困難がある
。従って、エイズウィルスについての遺伝子の十分な解
明が望まれている。

ＩＩＩＶ−１，２については、その一部のウィルスにつ
いて全塩基配列が決定されている：Ｂ、　Ｒ，５ｕｒｅ
ｃｂら、　　Ｃｅ１ｌ、Ｖｏｌ、４５．Ｌ６３７（１９
８６）　　；Ｍ、Ｇｕ７ｘｄ＋＋　　らＮ＋ｌｕ＋ｅ　
（Ｌｏｎ６ｏｎ）、　Ｖｏｌ、　３２６．　ｐ、　６６
２　、１９８７）　ｏまた、ＳＩＶ−ＭＡＣ、５ＩＶ−
八ＧＶについても全塩基配列か決定されている［Ｍ、　
Ｆｕｋａ＋ｘｖｓら　Ｎｉｕ＋＋、ｖｏｌ、　３３３．
　Ｎｏ。

６１７２、　　ｐ、４５７ｆ１９８８）：Ｈ，Ｔｏｊｉ
ｍｏ＋ｏ、Ｎｓ＋：ｏ＋＋、ｗｏｌｉ４１Ｎｏ、　６２
４２．　　ｐ、　５３９　（１９８９）コ。しかしなが
ら、ネコ免疫不全ライ／ｌ、　７．　（ＦＩＶ）　ニラ
ｕｌ　テハ、ＦＩＶ−Ｐ＋ｌ＋ｌｕｍ１の全塩基配列が
決定されているに過ぎない［Ｐ、ＮＡ、Ｓ、、Ｖｏｌ、
８６．ｐ、５７４３（１９Ｒ９）コ。

また、上述の公知診断方法では、ネコ免疫不全症候群関
連抗原以外の非特異的な反応を示す抗原をも含んでおり
、このような抗原の非特異的免疫反応によりいわゆる偽
陽性の検体が生じＦＩＶ感染の診断精度が低下するとい
う問題があった。

本発明者らは、ＦＩＶ−７Ｍ２株について研究を重ねた
結果、ＦＩＶ−７Ｍ２株の遺伝子ＲＮＡに相補性を示す
ＤＮＡの全塩基配列を決定することに成功した。そして
この成功により新たなエイズウィルスのワクチン、診断
薬の開発が可能となり得ることを知見し本発明を完成す
るに至った。

本発明の目的は、上記の従来技術の問題点を克服し、Ｆ
ＩＶに対する抗体と特異的に反応する高い抗原性を有す
るポリペプチドの遺伝子工学的生産法を開発すること、
およびこのペプチドを抗原として用いたＦＩＶ感染の診
断において極めて高感度で精度良く診断できる検査薬を
提供することである。

［課題を解決するための手段］ 本発明は、ネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ−７Ｍ２　）
の遺伝子ＲＮＡに相補性を示す、第１図に示される読み
取り枠に従って、ｇａｇ、ｐｏｐ、ｖｉｆ及びｅｎｖ領
域に対応する第１図に示されたアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡを提供する。

本発明のＦＩＶ−７Ｍ２の遺伝子ＲＮＡに相補性を示す
ＤＮＡの単離及びクローニングは、以下のようにして行
なうことができる。

ネコより末梢血を採取し、フィコールを用いた遠心法に
により末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ：Ｐｓｔｉｐｈｓ口
ｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍｏｎｏｎａｅｌｅｘ＋　Ｃｅ１ｌ）
を調製することによりウィルス感染を受けた細胞を得る
。この細胞をコンカナバリン−Ａ１インターロイキン−
２の存在下に培養し、正常ネコより分離したＰＢＭＣと
共に更に培養し、染色体外ＤＮＡを単離することにより
、レトロウィルスのＲＮＡに相補性を持つＤＮＡにより
主として構成される二本鎖ＤＮＡが得られる。ＦＩＶ−
７Ｍ２のＩＩＩＩＡに相補性を示すＤ１１人は、その全
配列中に存在する制限酵素認識部位として、５ＩＣ１部
位を有することが明らかとなり、この制限酵素認識部位
を利用することによって、本発明のＤＮＡのクローニン
グを有刺に実施することができる。

ＰＢＭＣから染色体外ＤＮＡとして得られた本発明のＤ
ＮＡクローニングは、以下のようにして行なうことがで
きる。

得られた染色体外ＤＮＡを制限酵素５ｉｃｌで消化し、
他方同様に５ｔｅ１部位を唯一箇所制限酵素認識部位と
して有するラムダファージベクター、例えば、ラムダザ
ップ等を用いてこれを５ｚｃｌで消化する。

消化欲得られる両者のＤＮＡを通常の連結Ｉくソファ−
中でＴ４ＤＮ＾リガーゼ存在下に反応させて結合する。

次いで、得られた反応液を用いて！ｎ　ｖｉｌ＋ｏｄッ
ケージング反応を行ないファージ粒子を構成する。この
ファージ粒子をラムダファージに感染性の大腸菌、たと
えばに−１２株ＬＥ３９２　（＾ＴＣＣ３３５７２）等
に感染させて、寒天培地上に培養しラムダファージの溶
菌プラークを形成させる。このプラークが形成された寒
天培地上にニトロセルロース膜を密着させてラムダファ
ージの一部をニトロセルロース膜上に固定化しブラーク
ツ＼イブラダイゼーション法により、目的とするＦＩＶ
−７Ｍ２のＪｉｌｔ＾に相補性を有するＤＮＡが組み込
まれたファージプラークを同定する。これに用いるプロ
ーブとしては、ＦＩＶＰｅｌｘｌｏｍｘ由来のｇａｇ−
ｐｏｌ遺伝子を含む断片をそれぞれニックトランスレー
ンコン法によりラジオアイソトープにより標識したＤＮ
Ａを使用することができる。このプローブとハイブリダ
イズするファージプラークよりＦＩＶ−７Ｍ２のＲＮ　
Ａに相補性を有するＤＮＡが組み込まれたラムダファー
ジＤＮＡが得られる。このようにして得られるＦＩＶ−
７１１２のＲＮＡに相補性を示すＤＮＡが組み込まれた
ラムダファージＤＮＡ　　（例えば、Ｌ１ｍｂｄｓ２Ａ
Ｐ−ＦＩＶ−７Ｍ２　ＤＮＡ）を更に形質転換可能な大
腸菌１１２株１ト１１１９　［１，１！ｃ＋＋ｉｎｇＧ
ｅｎｅ、　　３３．　１０３　（１９８５）コにクロー
ニングベクターｐＨｃ１１Ｂを用いてサブクローニング
を行なう。即ち、例えば、ラムダ２ＡＰ−Ｆ　ＩＶ−７
Ｍ２を制限酵素５ｘｅｌ’ｔ’消化し、得られる断片を
同様の制限酵素部位を有するプラスミド、例えば、ｐＨ
ｃｌＩ８又はｐＩｌｃＩＩ９　［Ｍ＋＋＋ｉｎｇ　　　
ら　、Ｍｓｔｈｏｄ　　　ｉｎ　　　Ｅｎｚｙ　ＩＮｏ
ｌｏｇ７．Ｖｏｌ、Ｉ５３．　　　Ｈ３−１１１９８７
］等に組み込む。得られるプラスミドを用いて大腸菌を
形質転換しアンピシリン等の抗生物賀耐性をマーカーと
して形質転換体を選択し、形質転換体から通常の方法、
例えばアルカリ抽出法により、目的とするＦＩＶ−７Ｍ
２のＲＮＡに相補性を示すＤＮＡを得ることができる。

このようにして得られたプラスミドを制限酵素Ｓｇｃｌ
で消化することにより、本発明のＦＩＶ−Ｔ１ｉ２のＲ
ＮＡに相補性を示すＤＮＡが得られる。

またこのプラスミドは、ＦＩＶ−７Ｍ２のウィルス構成
蛋白質を発現するための発現ベクターの構築等に用いる
ことができ、かかるプラスミドを提供することも本発明
の目的の一つである。このようなプラスミドとしては、
上記したように　ｐＵＣｌｉｌｌ　１ｍＦＩＶ−７Ｍ２
　（７）ＲＮＡ　ｌ：相補性を示すＩＩＩＩＡが組み込
まれたプラスミド（ｐＦＩＶ−７Ｍ２又ハｐＦＩＶ−ｇ
Ｂ　（Ｎｃ。

１］・第３図参照）以外にも、例えばｐＵｃ１１９等の
ｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ３２２などのｐＢｌｌ系ベ
クター等の通常使用される大腸菌由来のプラスミドにＦ
ＩＶ−７Ｍ２のＲＮＡに相補性を示すＤＮＡを組み込ん
だプラスミドなどが挙げられる。

本発明のＤＮＡの単離及びクローニングは、上記した方
法に限定されず他の通常の方法によっても行なうことが
できる。即ち、例えばネコから採取したリンパ球を培養
し、得られた感染細胞の染色体に組み込まれたＦＩＶ−
７Ｍ２のｌ１ＮＡより通常の方法に従い単離及びクロー
ニングを行なうこともできる。

本発明のＤＮＡが組み込まれたプラスミドｆｐＦＩＶＴ
Ｍ２］を各種の制限酵素Ｄｂ＋Ｉ、Ｂｘｍｔ１１，１ｌ
ｉｎｄｌ［［、ＰＨ３＋ｅｌ、　ＥｅｏＲｌ、　Ｂｇｌ
　ＩＩ　）などによって切断することにより第２図に示
したＦＩＶ−７Ｍ２のＲＮＡに相補性を示すＤＮＡの各
種制限酵素地図を作成した。この制限酵素地図を基にＦ
ＩＶ−７Ｍ２のＤＮＡの各種制限酵素による切断フラグ
メントを調製し、各フラグメントをプラスミドｐＵｃ１
１８．１１９などにサブクローニングし、得られるサブ
クローンを用いて一本鎖ファージＤＮＡを調製し、ＭＩ
３　ジテオキン法［Ｆ、　５ａｎＨｔら。

Ｐ＋ｏｃ、　　Ｎ＋Ｉｌ　　　＾ｃ　！ｄ、ｓｅｉ、、
Ｖｏ１．７４．　　　ｐｊ４６３（１９７７）　コ　　
によって各フラグメントの塩基配列を決定した。

このようにして、ＦＩＶ−７Ｍ２のＲｌｔＡに相補性を
示す本発明ＤＮＡの全塩基配列を決定し、その全塩基配
列を第１図に示した。

本発明で対象とするＤＮＡは、第１図に示されるものに
限定されず、第１図に示した塩基配列と実質的に同様の
作用を示すＤＮＡ、例えば遺伝子コードの縮重に基づく
第１図に示した塩基配列の誘導体、第１図に示した塩基
配列の一部が欠失した又は一部が修飾された誘導体も包
含される。

第１図に示したように、ｒｌＶ−７Ｍ２のＲＮＡに相補
性を示すＤＮＡは、９３２６の塩基対［ｂｐ）からなる
。その遺伝子の構成は、第２図に示したように、レンチ
ウィルスで見られる構成と同じであり、５’ＬＴＲｇＢ
−ｐｏｔ−ｙｉｌ−ｅｎｙ−３ＬＴＲで示される構成を
している。ＦＩＶ−７Ｍ２に特徴的な点は、ｔｎマ領域
の部分に４箇所の小さなオープンリーディレグフレーム
を有することである。これらの構成について以下に説明
する。

１）　Ｌ　Ｔ　Ｒ遺伝子 ＬＴＲ遺伝子は、ウィルス遺伝子の両側に存在しウィル
スの増殖に必須であり、また細胞の染色体ＤＮＡへのイ
ンチグレートに重要な役割を有するもノである。ＦＩＶ
−７Ｍ２　ノＬＴＲ遺伝子は、３６２ｂｐからなり、そ
の構成エレメントは、Ｕ３．Ｒ，Ｕ５であり夫々　２１
５ｂｐ、　７８ｂｐ、　６９ｂｐからなる。ＬＴＲ遺伝
子には、第１図に示したようにプロモーター、ポリＡ付
加フグナル、プライマー結合部位ｆＰＢｓ］　すどが存
在している。

２）ｇａｇ遺伝子 ｇｉｇ遺伝子は、ウィルス粒子の内部構造を構成する蛋
白質の前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子である。

ＦＩＶ−丁Ｍ２のｇａｇ遺伝子は、６３４から１９８０
までのヌクレオチドに相当し　４５０個のアミノ酸をコ
ードしている。１１ｇ遺伝子によりコードされる前駆体
ポリペプチドは、プロツセシングを受けて３つの蛋白質
ｐ　１７．　　ｐ　２ｇ、　　ｐ　１０になる。１１ｇ
遺伝子により通常もっとも大量のウィルス、蛋白質が発
現されるので、かかるウィルス蛋白質に基づいてウィル
ス抗原を検出することができる。従って、ｇｌｔ遺伝子
のＩＩＮＡに相補性を示すＤＮＡは、ウィルスの感染を
診断する検査薬あるいは治療薬の開発に有用である。従
って、本発明は、第１図に記載の本発明ＤＮＡによりコ
ードされるアミノ酸配列のうち、ｇａｇ領域に対応する
アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡも提供
する。

かかるｇ１ｇ遺伝子のＲＮＡに相補性を示すＤＮＡは、
例えば、Ｓｘ＋１−Ｘｂｔｌなどの制限酵素によって切
りだすことができる。

３）ｐｏｌ遺伝子 ｐａｌ遺伝子は、逆転写酵素をコードする遺伝子であり
１８７５から５２４７までのヌクレオチドに相当し、１
１２４個のアミノ酸をコードしている。また、その塩基
配列のうち１０５ｂｐが１１１遺伝子とオーバーラツプ
している。

４）ｖｉｆ遺伝子 マ百遺伝子は、ＦＩＶ−７Ｍ２遺伝子の中心部に位置し
ており５２４２から５９９４までのヌクレオチドに相当
シ２５１アミノ酸をコードしている。

５）　ｅ　ｎ　ｖ遺伝子 ｅｎマ遺伝子は、ウィルスの感染能を規定するウィルス
粒子の表面の糖蛋白質をコードする遺伝子である。６２
７０から８８３６までのヌクレオチドに相当し、外部糖
蛋白質（ＥＧＰ）　　とトランスメンブレン蛋白＠　（
ＴＭＰ）　との前駆体ポリペプチドをコードしている。

ｅｎマ遺伝子は、ウィルス感染性を決める糖蛋白質をコ
ードするものであり、従ってｅｎｙ遺伝子、すなわちｅ
ｎマ遺伝子のＲＮＡに相補性を有するＤＮＡは、ネコ免
疫不全症候群に対するワクチン、診断薬等を開発するた
めの極めて有用な手段となりえるものである。それゆえ
、本発明はまた、第１図に記載の本発明ＤＮＡによりコ
ードされるアミノ酸配列のうち、ｅｎｖ領域に対応する
アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡも提供
する。ｅｎマ遺伝子のＲＮＡに相補性を示すＤ　Ｎ　１
．は、例えば、制限酵素ＰＨＩなどで消化することによ
りＦＩＶ−７Ｍ２のＤＮＡから切りだすことができる。

本発明はまた、第１図に示される本発明ＤＮＡによって
コードされるポリペプチドの全部または一部をコードす
る塩基配列を有し、必要に応じて５′末端にメチオニン
をコードするコドンを有するＤＮＡが、プロモーターの
下流に存在するベクター内のクローニング部位に導入さ
れて含むことを特徴とする発現ベクターを提供する。ベ
クターとしては、プラスミド、ファージなどの慣用のベ
クターが使用できる。またプロモーターとしては、大腸
菌、ファージ、酵母菌等に由来の慣用のプロモーターが
挙げられ、後述の実施例ではトリプトファン合成酵素オ
ペロン（Ｔ＋ｐＰ）が使用される。

本発明の発現ベクターの作製方法を以下に説明する。こ
こではＦＩＶのｇａｇ領域遺伝子をコードする発現ベク
ターの作製を例示するが、その他の本発明ＤＮＡ又はそ
のＤＮＡ断片の場合にも類似の方法で作製することがで
きる。

プラスミドｐＦＩＶ−（Ｂ　１Ｎｃｏｌｌの作製（第３
図参照）ＦＩＶ−７Ｍ２の遺伝子をコードするプラスミ
ド（ｐＦＩマーＴＭ２）より制限酵素Ｈｉｎｄｍ−Ｅｅ
ｏＲＩを用いて完全に切断後、ｇｉｇの５′側をコード
する７０７塩基対のフラグメントを常法に従い低融点ア
ガロースゲル電気泳動にて分離し、回収した。得られた
フラグメントをクローニングベクターＭ１３１マ１９を
Ｈｉｎｄｌ［［ＥｃｏＲｌにて切断したものと７４−Ｄ
ＮＡリガーゼにて結合し、この反応液を用いて大腸菌に
一１２株ＪＭＩＮを形質転換し、ＬＢ−プレート上にて
白色を呈する形質転換細胞を選択した。得られたクロー
ンがら、アルカリ法によりプラスミドを抽出し、制限酵
素分析によって目的とする組換え体であることを確認し
た。この培養液より常法により一本鎖ＤＮＡを調製した
。

得られた一本鎖ＤＮＡを用いてＦＩＶ−１１ｇの開始コ
ドンの上流に制限酵素認識部位Ｎｅｏｌの導入を、ＴＡ
ＫＡＲＡ　Ｍ＋ＮｔｎＴＭ−Ｇキットを用いてマニュア
ル通りに実施した。−本鎖ＤＮＡとＭ　１３ｍｐ　Ｐ　
（Ｍ　１３ＩＩｐ１８のマルチクローニングサイトを含
むｐｖｕ　ｎ断片を欠失させたファージ）の二本鎖ＤＮ
ＡをＰｙｏ　７１にて消化したものとアニーリングバッ
ファーを混合しＧａｐｐｅｄ−ｄｕｐｌｔｘ　Ｄ、Ｎ＾
を形成させた。この溶液に変異導入用合成オリゴマー（
ｐＣＡＴＴＣＣＣＣＡＴＧＧＴＧＣＴＧＴＡＧＡ）を混
合し、６５℃で１５分間、３７℃で１５分間静置した後
、エクステンンヨンバッファ　ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼを加え２５℃で２時間反応を行った。

その後０．２Ｍ　ＥＤ丁＾（ｐＨ８）を加えて６５℃で
５分間加熱し反応を停止させ、この溶液を用いて大腸菌
ＢＭＨ７１−１８ｍａｌｓを形質転換した。

ＳＯＣ培地と共に１時間培養後、上溝を遠心後回収し、
大腸菌Ｍ　Ｖ　１＋８４培養液と共にＬＢプレートにて
プラークを形成させた。得られたプラークから常法によ
りプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素分析及び塩基配
列の決定により目的のクローンであることを確認した。

得られたプラスミドを制限酵素Ｅ＋ｏＲ１−Ｒｉｎ＋！
ｍ（各８ユニツト）により切断後、低融点アガロースゲ
ル電気泳動法により約０．７Ｋｂのフラグメントを分離
、抽出した。ｐＦＩＶ−７Ｍ２より制限酵素ＥｃｏＲ１
−Ｘｂｘｌにて消化後、常法により低融点アガロースゲ
ル電気泳動法によりｇａｇ遺伝子の後半部分に相当する
１２８７塩基対のフラグメントを抽出した。

得られたフラグメントをクローニングベクター１ｐＢｌ
ｃ＋＋＋＋ｉｐｔ：ＳＫ　（−）］をＥｃｏＲＩ−１ｂ
ｔｌにて切断したベクターと共にＴＡＤＮ人リガーゼに
より結合し、大腸１１に−１２１Ｍ１０９株に形質転換
した。得られた形質転換細胞よりプラスミドＤＮＡを調
製し、制限酵素分析により目的のクローンを選択した。

得らたれプラスミドをＥｃｏＲｌ−Ｈｉｎｄｍにより完
全に消化後、低融点アガロースゲル電気泳動法により分
離、抽出した。得られたフラグメントと先に得たｇａｇ
の５″側−に相当する約０．７ＫｂのフラグメントをＴ
４−ＤＮ人リガーゼにより結合し、大腸菌に−１２１Ｍ
１０９株を形質転換した。

得られた形質転換細胞から常法によりプラスミドを抽出
し、制限酵素分析及び塩基配列の決定により目的のクロ
ーンであることを確認した。得られたプラスミドをｐＦ
ＩＶ−ｇＢ　［Ｎｅｏｌｌ　と命名した。

このプラスミドは大腸菌株に移入され、Ｅ＋ｃｈｃ＋１
ｃｂｉｎ　＋ｏｌｉ　　１Ｍ１０９／ｐＦＩＶ−ｇＩｇ
［Ｎｅｏｌ　　（平成　２年　７月１６日付寄託、微工
研菌寄第１１６１１号）として寄託されている。かかる
プラスミドｐＦＩＶ−ｇｓｇ　１Ｎｃｏｌｌも本発明の
範囲に包含される。

ＦＩＶ−ｇ１ｇ発現用ベクターの作製（第４図参照）ｐ
ＡＴ−Ｔ＋ｐＥ−ＴＧＦ−αＩＩをＥ（ＯＲＩ−３ｌ　
ｌ　ｌにて切断後、常法により低融点アガロースゲル電
気泳動にてベクターフラグメントを分離、精製した。Ｅ
ｃｏＲＩＣｌｊｌ−Ｎｃｏｌ−Ｘｂｚｌ　−Ｓ＋１１部
位を有する合成フラグメン　ト　ｐＡＡＴＴＣＡＴＣＧ
ＡＴＡＣＣＡＴＧＧ丁ＣＴＧＡＡＣＡＣ丁ＣＴＡＧＡＧ
、ｐＴＣＧ＾ＣＴＣＴＡＧＡＧＴＧＴＴＣＡＧＡＣＣＡ
ＴＧＧＴＡＴＣＧＡＴＧをベクターフラグメントと混合
し、Ｔ４−ＤＮ人りガーゼにより結合し、大腸菌Ｋ１２
８８１０１株を形質転換した。得られた形質転換細胞よ
り常法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素分析
により目的とするものであることを確２した。この発現
用プラスミドをｐＡＴ−Ｔ＋ｐＥ−Ｎｅｏと命名した。

ｐＡＴ−丁＋ｐＥ−Ｎｅｏを制限酵素Ｎｅｏ１４ｂｔｌ
　にて消化後、常法によりベクターフラグメントを低融
点アガロースゲル電気泳動により分取した。

先に作製したｐＦＩＶ−ｇＢ　［Ｎｅｏｌｌを上記と同
様に処理し、１５７０塩基対よりなるｇａｇフラグメン
トを同様に調製した。

これらのフラグメントを混合し、Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼ
により結合し、大腸菌Ｋ１２８８１０１株を形質転換し
た。得られた形質転換細胞から常法によりプラスミドを
調製し、制限酵素分析を行い目的とするものであること
を確認した。得られたプラスミドをｐＡＴ−Ｔ＋ｐＥ−
ＦＩＶｇＢと命名した。このプラスミドは大腸菌株に移
入され、Ｅｉｃｂ！ｒｉｃｈ目ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ／
ｐＡＴ−Ｔ＋ｐＥ−ＦＩＶｇ＋ｇ　（平成２年７月１６
日付寄託、微工研菌寄第１１６１３号）として寄託され
ている。

ＦＩＶ−ｚＢ直接発現型ベクターの作製は、以下のよう
に行なう。

ｐＡＴ−Ｔ＋ｐＥ−ＦＩＶｇＢを制限酵素Ｃ１ｇ１にて
切断後、６８℃にて酵素を失活させた後このうちの　１
／１０を用いてＴ４ＤＮＡ　リガーゼにて再結合を行っ
た。この反応液を用いて大腸！ｌＫ１２１１ＢＩＯＩ株
を形質転換し、得られた形質転換細胞から制限酵素分析
により目的とするプラスミドを確認した。得られたプラ
スミドをｐＡＴ−ＦＩＶｇｍｇと命名した。このプラス
ミドは大腸菌株に移入され、Ｅｔｅｈｅ＋１ｅｈｉｚ　
ｃｏｌｉ　ＦＩＢＩＯＩ／ｐＡ丁づｌＶｇＢ　（平成２
年７月１６日付寄託、微工研菌寄第１１６１２号）とし
て寄託されている。

本発明の実施態様により、本発明は発現ベクターとしテ
ｐＡＴ−Ｔ＋ｐＥ−ＦＩＶｇｉｇ及びｐＡＴ−ＦＩＶｇ
Ｂを含む。

本発明は、さらに、上述の本発明発現ベクターで宿主を
形質転換して得られた形質転換体を提供する。宿主とし
ては、大腸菌、枯草菌、酵母などのこの分野で慣用され
る微生物が使用できる。好ましくは、宿主は大腸菌、例
えばＥ、　　ｃｏｌｉ　８８１０１株である。形質転換
は常法に従って行うことができ、例えば大ＩｉＩｍの場
合には、Ｍ＊ｎａ＋ｌらの方法：Ｍｘｎｄ＋ｌ、　Ｍｘ
ａｄ　とＲｉｇ＆、Ａ、、　　Ｉ、Ｌｌ、Ｂｉｏｌ、５
３．　１５９（１９７０）］で実施し得る・。

さらに、本発明形質転換体を以下に示すように、適切な
培地中で培養して組換え型ネコ免疫不全ウィルスポリペ
プチドを得ることができる。従って、本発明は組換え型
ネコ免疫不全ウィルスポリペプチドをも提供するもので
ある。本明細口中、「組換え型ネコ免疫不全ウィルスポ
リペプチド」は、組換え操作で得られた、ＦＩＶポリペ
プチド及びＦＩＶポリペプチドを含むポリペプチドを意
味する。ここで、ＦＩＶポリペプチドは、本発明ＤＮＡ
又はそのＤＮＡ断片によりコードされるポリペプチドを
いう。

ｐＡＴ−ＴｈｐＥ−ＦＩＶｇ墨ｇで大腸菌！１２　ＨＢ
ＩＯＩを形質転換した後、ＬＢ培地中アンピンリン（ｓ
ｏｉ　／　ｍｌ　）存在化３７℃にて一晩培養した。こ
の培！ｌｔｅ、をＭ９ＣＡ培地に加え吸光度が６００　
ａｍにおいて約０３となるまで培養を行いβ−インドー
ルアクリル酸を２０／７５／ｍｕの濃度になるように加
え更に６時間培養を行った。この培養液の一部を遠心に
より菌体を沈殿後、Ｕ、　Ｋ、　Ｌｘｃｍｍｌ　ｉ等の
方法［Ｎ暑１ｕｒｅ、　ｖｏｌ、２２７６１１ＬＨ５ｔ
１９７Ｄ）］に従って調製した試料用緩衝液を加えｌＯ
分間買沸後、１０−２０％のポリアクリルアミドのグラ
ジェントゲルで電気泳動を行った。泳動後、ＨＴｏｖｂ
ｉｎらの方法［Ｐｒｏｅ、　Ｎ＋ｌｌ、　Ａｅｔｄ、　
Ｓｃ［ＩＳＡ、ｌＪ、　　４３５Ｇ−４３５４（１９０
１］に従ってＷｅｓｔｅｒｎブロッティング分析を行っ
た。−次抗体は、ＦＴＶ感染ネコ血清を用い、二次抗体
はＣ＋ｐｐｅｌ　ｘｎ＋ｃｓｆ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）　Ｉ
ＩＲＰを用いた。以上の方法で発現を確認後、菌体を０
．　ＩＭ　Ｔｈ１ｓ　［ｐＨ８，５）中で超音波破砕し
、不溶性画分を遠心により集めた。この両分を１〜７Ｍ
尿素にて抽出後、８Ｍ尿素を、含むｌ０ｍＭ　ＤＴＴ。

ＩＭ　ＮａＣ１，Ｇ、　ＬＭ　Ｔ＋ｉ＋−ＨＣｌ溶液に
て４５℃で６０分間加熱し抽出した。このようにして得
られたＴｈｐＥ−ＦＩＶｇｉｇ融合蛋白質の精製度は約
６０％であった。

得られた前記融合蛋白質は、例えばプロテアーゼ処理も
しくは臭化シアン処理により限定分解を行うことによっ
て、ＦＩＶ−Ｈｇ蛋白賀またはその断片に分離してもよ
い。

あるいは、ｐＡＴ−ＴｈｐＥ−ＦＩＶｇＢと同様に、例
えばＦＩＶ−ｇＢ直接発現型ベクターｐＡＴ−ＦＩＶｇ
Ｂで大腸菌株を形質転換し、ベクターを発現させた場合
には、ＦＩＶ−ｇＢ蛋白質を直接部ることができる。

ＴｈｐＥ−ＦＩＶｇｘｇ融合蛋白質、ｐｌＶ−ｇｇｇ蛋
白質、これらの蛋白質断片などの本発明組換え型ＦＩＶ
ポリペプチドは、ＦＩＶ−１Ｍ株（丁Ｍ１及び７Ｍ２）
感染ネコ血清中のＦＩＶ抗体と高感度、高精度で抗原抗
体反応することが分かった（第５図）。このとき、該ポ
リペプチド抗原はＦ！ＬＶ　（ネコ白血病ウィルス）感
染ネコ血清とは陰性反応（第６図）を示すことから、Ｆ
ＩＶ感染の診断に極めて有効に使用し得る。

従って、本発明はまた、組換え型ネコ免疫不全ウィルス
ポリペプチドを抗原として含有するＦＩＶ感染診断用検
査薬を提供する。

上記のようにして精製したポリペプチドを用いて以下に
示す検査方法を行なう方が良好な結果を示すが、場合に
よっては菌体破砕後の抽出物をそのまま用いてウェスタ
ンプロット法により検出することも可能である。

次に上記方法により得られたポリペプチドを抗原に用い
てＦＩＶ感染ネコを診断するための検査薬について述べ
る。

この検査薬は、ポリペプチドを抗原として、被検液中か
らこの抗原と抗原−抗体反応を生じるｇａｇに対する抗
体を検出することでＦＩＶ感染を診断するものである。

この被検液にはＦＩＶへの感染の診断を望むネコから常
法により血液を採取し分離された血漿または血清、ある
いは、これを適当な緩衝液により希釈したものを用いる
。

ＦＩＬｇｇｇ蛋白質ニヨルＥＬＩＳＡを用イタＦＩＶ−
１Ｂ抗体の検出法は、以下のように行う。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡ用マイクロプレートに１５．２ｔ１９　
／　ｍｌの濃度の丁＋ｐＥ−ＦＩＶｇａｇ蛋白質（抗原
）を５０埒、／　ｖｔ　ｌ　ｌずつ分注し、４℃にて一
晩放置する。抗原を捨てた後ＰＢＳにて洗浄後、３％ゼ
ラチン／ＰＢＳ溶液を０．１　ｍｌ／ｗｅｌ１分注し室
温で１時間放置する。更にＴＰＢＳ溶液にて洗浄し、抗
体希釈液にて希釈したネコ血清を加え、室温で１時間放
置する。丁ＰＢＳ溶液にて２回洗浄後、二次抗体として
ｒｎｔｉ−ｃｌｔｇＧ　ＩＩＲＰを用い５０／＃／ｙｅ
ｌｌずつ分注する。丁ＰＢＳにて洗浄後発色液を加え、
１時間静置した後、吸光度を波長４１５ｎｍにて測定す
る。

このような方法以外にも、抗原−抗体反応によって生じ
る不溶性担体粒子上の凝集反応を検出する方法が挙げら
れる。精製度が不十分な場合にはウェスタンプロット法
により検出することが望ましい。

本発明により、 １）　Ｆｉ１’−７Ｍ２の遺伝子ＲＮＡに相補性を示す
ＤＮＡの全塩基配列から推定される、ＦＩＬ丁Ｍ２が作
る蛋白質のアミノ酸配列により、診断用検査薬、治療薬
、ワクチンなどの開発に有用な蛋白質の合成が可能とな
った ２）　ＦＩＶ−７Ｍ２の遺伝子ＲＮＡに相補性を示すＤ
ＩＩＡを含むプラスミドに基づきＦＩＶ−７Ｍ２のウィ
ルス構成蛋白質を発現するための発現ベクターを構築す
ることができた ３）　ｒｎｔ遺伝子のＤＮＡによりネコ免疫不全症候群
に対するワクチン、診断用検査薬等の開発が可能となっ
た。同様に％　ｇ１ｇ遺伝子のＤＮＡによってもワクチ
ン、診断用検査薬等の開発が可能となった。

以下の実施例により、本発明を更に詳細に説明する。

［実施例コ 酵素、ＤＮＡ 各種制限酵素は、宝酒造、日本ンーン、ファルマシアよ
り購入したものを用い、酵素反応に用いる緩衝液は、１
０倍濃度のものを調製した。滅菌は、オートクレーブに
より行なった。各緩衝液の組成は、制限酵素に添附され
ている説明書を基本的に採用した。

ＴｄＤＮ人りガーゼは、ファルマシアのものを使用し、
反応用緩衝液は、５０ｍＭ　ｌ−リス塩酸（ｐＨ７，５
）　。

１０ｍＭ塩化マグネシウム、　　１ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍ
Ｍ＾丁Ｐとなるようにして、１６℃にて一晩反応した。

クローニング用ファージベクターは、Ｓｌｌｌｌｅｇｅ
ｎｅ社製のラムダＸＡＰを用いた。

クローニング用プラスミドとしては、宝酒造製のｐＵｃ
ｌｌＬ　１１９を用いた。

塩基配列決定用のベクターとしては、ファルマシア製の
Ｍ１３ｍｐ１８．１９を用いた。

ｎ　ｙｉ！ｔｏパッケージングには、Ｓｔ＋［ＢＣｎｃ
社製の、ＧｉＢｐｔｅｋを使用した。

染色体外ＤＮＡの抽出 ウィルスに感染している、ネコ末梢血単核球を、ｌＯｎ
／ｍｌ濃度になるようにコンカナバリンＡを加え１０％
胎児血清１００ｕ／ｍｌのヒト組み換えインターロイキ
ン２を含むＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地にて７２時間培
養を行なう。

ハートらの方法［］、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．，２６．　３
６５（１９６７）］に従って、染色体外ＤＮ＾ｆＥｘｆ
＋＋ｃｈ＋ｏｍｏ＋ｏｍｇｌ　ＤＮＡ）を、調製した。

１０７細胞に対して染色体外ＤＮＡ、０．６％ＳＤＳ、
　ｌｏｍＭ　ＥＤＴＡ　ｆｐＨ７，５）　１ｍｌを加え
、ゆっくり回転して攪拌を行なう、４℃で８時間放置後
、１７０００　ｇで３０分間遠心し、上溝を得る。この
溶液を、さらにプロナーゼに処理し、フェノール処理を
行ない、エタノール沈澱を２回繰り返したものについて
、以後の実験に用いた。

染色体外ＤＮＡ中の制限酵素認識部位の検出クローニン
グを行なうに当たって、染色体外ＤＮＡ中に唯一存在す
る制限酵素の切断部位を検出するために、染色体外ＤＮ
ＡをＸ　ｂｒ　Ｉ、ＰＩＩＩ、Ｈｉｎｄｌ［［、Ｐｉｌ
ｌ、５ｌ（Ｉの５種類の制限酵素によって切断し、０７
％アガロースゲル電気泳動を行なった。このゲルをサザ
ーン法により、ニトロセルロースフィルターに転写し、
ハイブリダイゼーションを行なった。プローブは、ＦＩ
Ｖ−Ｐｅ＋！１１株由来の、Ｈｇ−ｐｏｌ領域を含む、
４キロベースのＤＮＡをニックトランスレーション法に
より、３２−Ｐでアイソトープラベルしたものを、使用
した。

ニックトランスレーションは、アマジャム社製のキット
を用い、非活性として、１ｘｌＯ７ｅｐｍ／■ＤＮＡを
有するプローブを得た。ハイブリダイゼーションは、３
０％ホルムアミド、６！ＳＳＣ、５ｘＤｔ山＋ｄｌ’ｓ
、０．５％ＳＤＳ存在下、Ｉ！１０６ｃｐ＋＋／＊とな
るようにプローブを加えて、４２℃で１８時間行なった
。洗浄の条件としては、２！ＳＳＣ／　０．１％ＳＤＳ
で５０度、３０分後、　０．５ｒＳＳＣ１０，１％５Ｄ
Ｓ１．−７．５０℃１５分間行なった。このフィルター
を一７０’Ｃで、−晩露出させ現像した。この結果より
、染色体外ＤＮＡは５ｘｃｌにて一箇所切断させること
が示された。

染色体外ＤＮＡライブラリーの作製 染色体ＤＮＡ（２ｍｇ）を制限酵素Ｓｘ＋Ｉ　（１０ｕ
ｎｉｌ）にて完全に切断後、反応液を、等量のフェノー
ル／クロロホルム（１：　１）混液にて２回抽出を行な
い、２等量のエタノールを加え、−８０’Ｃ１３０分間
放置後、遠心によりＤＮＡを沈澱として得た。

沈澱を、２０ｍ１のＴ　Ｅ　（ｐＨ８，０）に溶解し、
１１５量、４　ｍｌ　（４００量ｇ）に、１２ＡＰ　（
Ｓｔｅｌ）　　１　ｍｇを加え、全量を１０ｍ１になる
ようにして、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼと一晩反応した。こ
の反応液の半量を用いて１ｎマｉｔ＋ｏパツケ一ジング
反応を行なった。得られたパッケージング反応液０５ｍ
１より一部を採り、１０倍、１００倍希釈したものを用
いて、タイトレージョンを行なった。タイトレージョン
は、指示菌として、大腸菌に一１２株ＬＥ３９２を用い
た。軟寒天培地中に塩化マグネシウムを含むＬＢ培地に
て一晩培養した、指示菌を加え希釈したファージ溶液を
加えＬＢ培地に重層し３７℃で一晩培養した。出現した
プラーク数を数えて、このライブラリーのタイターとし
た。

ファージライブラリーのスクリーニングＦＩＶ−ＴＭ２
　＋７）　Ｄ　Ｎ　Ａを有す６７７−’；　（５ムダ２
ＡＰ−Ｆ　ＩＶ−丁Ｍ２）のスクリーニングは、得られ
たファージライブラリーよりブラークハイプリダイゼー
シジン法により行なった。１枚のプレートについて、約
５千個のファージプラークが出現するようにまき、合計
５万個のプラークについて、行なった。

ニトロセルロースフィルターにプラークを写し取り、常
法に従って、プラークハイブリダイゼーションを行なっ
た。プローブとしては、ＦＩＶ−ＰＮｘｌｕｍａ株由来
のｇｉｇ−ｐｏｌ領域をコードする　２７キロベースフ
ラグメントを、ニツクトランスレーンジン法によりアソ
トープラベルしたものを用いた。ハイブリダイゼーショ
ンの条件は前に記したものと同様の方法にて行なった。

得られたシグナル陽性を示すプラークを単一なプラーク
として得られるまでこの操作を繰り返し行なった。

クローン化されたＦＩＶ−７Ｍ２のサブクローニングハ
イブリダイゼーシランにて陽性を示す単一プラークをプ
レートからかき取り硫酸マグネシウムを含むＬＢ培地に
て３７℃、８時間培養した。得られた培養液にクロロホ
ルム１滴を加えて、激しく攪拌し、３０００　ｇにて１
０分間遠心を行なった。得られた上清に３Ｍ緩衝液（５
０ｍＭ　Ｔ＋１ｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，０）１０ｍＭ　
　Ｍｇｃ１２１０．２％Ｇ山１ｉｎ）を等量加え、ＤＮ
Ｉ＋ｅを加え、室温で３０分間放置する。この溶液に２
０％Ｐ　Ｅ　Ｇ　６０００７２．５Ｍ塩化ナトリウム溶
液半等量加え、水中にて１時間放置した後、　＋ｏｏｏ
ｃｇにて遠心した。得られたファージの沈澱を０３ｍ１
の３Ｍ緩衝液に懸濁し、等量のクロロフォルムを加えて
良く混ぜ合わせ、遠心し、水層を分離した。この操作を
繰り返し、ポリエチレングリコールを除去した。水層に
、最終濃度５ｍＭとなるようにＥＤＴＡ及び、２５１１
Ｍとなるように塩化ナトリウムを加えた後に、フェノー
ル抽出を行なった。この操作を、再度繰り返し、エタノ
ール沈澱によりＤＮＡを回収した。以上のようにして得
られた、＋２ＡＰ−ＦＩＶ−７Ｍ２ＤＮＡを、制限酵素
Ｓ＋ｃｌにて切断後、低融点アガロースゲル電気泳動で
、９５キロベースのフラグメントを分離しＤＮＡを抽出
した。得られたＤＮＡフラグメントをｐＴｌｃｌｌｇ　
（Ｓｔｃｌ）　２０ｎｇと混合しりガーゼ溶液存在下、
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを加え１６℃にて一晩反応した。

この反応液を用いて、大腸菌に一１２株ＩＭＩ０９　を
形質転換し、ＸＧ−／ｖｐプレート（ＬＢ−プレート中
、　　０．００４％　Ｘ−ｇｇｌ、　　Ｏ，１ｍＭ　Ｉ
ＰＴＧ５０／４Ｆ／ｍｌ　＋ｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）にて
、選択し得られた形質転換細胞より、アルカリ法にてプ
ラスミドＤＮＡを調製した。

塩基配列の決定 得られた制限酵素地図を基にして、各制限酵素の切断フ
ラグメントを低融点アガロースゲル電気泳動により分離
し常法により回収した。得られたフラグメントをＭ１３
ｍｐ　１８．１９の各領域にクローニングした。各フラ
グメントを持つ組換え体の形質転換細胞（Ｅ、＋ｏｌｉ
　１Ｍ１０３．１０９）をＬＢ培地にて、−晩培養しこ
の培養液１　ｍｌを遠心した上清を集めた。これに２０
％Ｐ　Ｅ　Ｇ　６０００／２．５Ｍ　ＮＩＣ＋を加え、
室温にて放置後、遠心しファージ粒子を沈澱として得た
。沈澱をＴＢＳ緩衝液に懸濁しフェノール抽出を行ない
、エタノール沈澱により一本鎖ＤＮＡを得た。これをＴ
ＥＳ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔ＋ｉ＋−ＨＣｌ　ｐＨ７、５
１０，１１℃Ｍ　ＥＤＴＡ／１０ｍＭ　ＮｉＣ１）に溶
解しシーフェンシング反応に用いた。

シーフェンシング反応は、宝酒造のジデオキンンークエ
ンシングキットもしくは５ｌｒｓｌＢｅｎｅ性のシーク
エナーゼキットを用い、プライマーとしては、Ｍ１３ブ
ライマー（１７塩基）を用い、　［α３２Ｐｌ　ｄｃ丁
Ｐにて標識を行なった。配列解読用のゲルは、４０又は
６０国の長さのものを用い、尿素存在下、６又は８％ア
クリルアミド、ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭＴ＋ｉ＋　８９
　ｇ＋Ｍホウ酸、　　２ｍＭ　ＥＤＴＡ）により泳動を
行なった。泳動は、３０００Ｖで行ない、泳動後ゲルを
乾燥しＫｏｄｔｃｋＸ線フィルム（ＸＲ−５）にて露光
後、現像した。得られたデータは、Ｉｎ１ｅｌｌｉＧｅ
ｎＰｔｉｃｓＩｎｃ：Ｂｉｏｎのプログラムを用いて処
理した。

ＦＩＶ−ｇａｇの開始コドン上流への制限酵素認識部位
の導入 Ｆ　Ｉ　Ｖ−７Ｍ２の遺伝子をコードするプラスミドｐ
ＦＩＶＴＭ２（１９）より制限酵素１（ｉｎｄＩ［［−
ＥｃｏＲＩ　　（各８ユニツト）を用いて完全に切断後
、ｇａｇの５゛側をコードする７０７塩基対のフラグメ
ントを常法に従い低融点アガロースゲル電気泳動にて分
離し、回収した。得られたフラグメントをクローニング
ベクターＭ１３１ｙ１９をＨｉｎｄｌｌｌ　−ＥｅｏＲ
Ｉにて切断したものと７４−ＤＮＡリガーゼにて結合し
、この反応液を用いて大腸菌に一１２株ＪＭ１０９を形
質転換し、ＬＢ−プレート上にて白色を呈する形質転換
細胞を選択した。得られたクローンから、アルカリ法に
よりプラスミドを抽出し、制限酵素分析によって目的と
する組換え体であることを確認した。この培養液より乗
法により一本鎖ＤＮＡを調製した。

得られた一本鎖ＤＮＡを用いてＦＩＶ−１１ｇの開始コ
ドンの上流に制限酵素認識部位Ｎｃｏｌの導入を、ＴＡ
ＫＡＲＡ　ＭｏｌｔｎＴＭ−Ｇキット（宝酒造）を用イ
テマニュアル通りに実施した。−本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆＯ
，２ｐｍｏｌ）と、Ｍ１３ｍｐＰ　（Ｍ１３ｍｐ　１８
のマルチクローニングサイトを含むＰマａＩ［断片を欠
失させたファージ）の−本鎖ＤＮＡをＰｙｕＩＩにて消
化したもの（０２ｕ９）とアニーリングバッフｙ−（２
００ｍＭ　Ｔ＋ｉ＋−ｔｌｃｉ、　　ｐＨ８１００ｍＭ
　　ＭｇＣｌ２　、　　５ＭｍＭ　　ＮＩＣ１，ｌ０ｍ
１Ｊ　　Ｄ丁Ｄ　　　（１ｍ）を混合し、滅菌水を加え
て全量を１０■にした。これを１００℃３分、６５℃ｌ
Ｏ分静置しＧｒｐｐｅｄ−ｄｏｐｌ＋ｔＤＮ＾を形成さ
せた。この溶液に変異導入用合成オリゴ７−　（ｐＣＡ
丁ＴＣＣＣＣＡＴＧＧＴＧＣＴＧＴＡＧＡ）　ｌ　ｐｍ
ｏｌを混合し、６５℃１５分、３７℃１５分静置した後
、エクステンションバ・ソファ　（５０ｍＭ　丁＋ｉ＋
−ＨＣｌ、　　ｐＨ８，６ｈＭＣＨ３Ｃ００Ｎ！、　　
　　５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　、　　５ｍＭ　　Ｄ丁Ｔ、
　　　ＩｍＭ　　ＮＡＤ、０．５１１１Ｍ　　ｄＡＴＰ
、　　（１，５ＩＩＭ　　ｄＧＴＰ、　　０．５ＩＩＭ
　　ｄｃＴＰ、　　０．５ｄ　　ｄＴＴＰ　　）２５ｍ
ｌ、　　ＤＮＡリガーゼ（６０ユニツト）１丁４　ＤＮ
Ａポリメラーゼ（１ユニツト）を加え２５℃２時間反応
を行った。その後０．２Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＦＩ８）　
３ｍｌを加えて６５℃５分加熱し反応を停止させ、この
溶液を用いて大腸ＦＩ　ＢＭｔ１７１−１８ｍｕｔＳを
形質転換した。ＳＯＣ培地と共に１時間培養後、上清を
遠心後回収し、大腸菌ＭＶＩＩ８４培養液と共にＬＢプ
レートにてプラークを形成させた。得られたプラークか
ら常法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素分析
及び塩基配列の決定により目的のクローンであることを
確認した。得られたプラスミド（１１Ｉ９）を制限酵素
ＥｅｏＲ１−Ｈｉｎｄｌ［［（各８ユニツト）により切
断後、低融点アガロースゲル電気泳動法により約０．７
Ｋｂのフラグメントを分離、抽出した。

ＦｒＶ−ｇａｇ遺伝子の作製 ｐＦＩＶ−７Ｍ２　Ｆ２４）より制限酵素ＥｃｏＲＩ−
Ｘｂｔｌ　（各８ユニツト）にて消化後、常法により低
融点アガロースゲル電気泳動法によりｇａｇ遺伝子の後
半部分に相当する１２８７塩基対のフラグメントを抽出
した。得られたフラグメントをクローニングベクター　
（Ｓ１口ＩＢ＋ｎｅ社のｐＢｌｎｅ＋ｅ＋ｉｐｌ：５Ｋ
（−））をＥｅｏＲＩＸｂｒｌにて切断したベクター（
５０ｎ　ｇ）と共にＴ４　ＤＮＡリガーゼにより結合し
、大腸菌に−１２１Ｍ！０９株に形質転換した。得られ
た形質転換細胞よりプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵
素分析により目的のクローンを選択した。得られたプラ
スミド（１鱈）を［ｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ［［（各８ユ
ニツト）により完全に消化後、低融点アガロースゲル電
気泳動法により分離、抽出した。得られたフラグメント
と先に得たｇ！ｇの５′側に相当する約０．７Ｋｂのフ
ラグメントをＴ４ＤＮＡ　リガーゼにより結合し、大腸
菌に−１２１Ｍ１０９株を形質転換した。得られた形質
転換細胞から常法によりプラスミドを抽出し、制限酵素
分析及び塩基配列の決定により目的のクローンであるこ
とを確認した。得られたプラスミドをｐＦＩＶ−ｇｘｇ
［ＮｃｏＩｌと命名した。

ＦＩＶ−ｇａｇ発現用ベクターの作製 ｐＡＴ−Ｔ＋ｐＥ−ＴＧＦ−α■（特願昭６３−２８９
（ｌｆｔ参照）（１ｐｇ　）　Ｅ　ｃＯＲｌ　−Ｓ　ｉ
　ｌ　Ｉ　（各８ユニツト）にて切断後、常法により低
融点アガロースゲル電気泳動にてベクターフラグメント
を分離、精製した。Ｅ＋ｏＲ１−ＣＩ！Ｎｃｏｌ−Ｘｂ
ｉｌ　−５ｅ１１部位を有する合成フラグメントｐＡＡ
Ｔ丁Ｃ＾丁ＣＧＡＴＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＧＡＡＣＡＣ
ＴＣＴＡＧＡＧ、　　　ｐ丁ＣＧ人ＣＴＣＴＡＧＡＧＴ
Ｇ丁ＴＣＡＧＡＣＣＡＴＧＧ丁Ａ丁ＣＧＡＴＧ、　　各
１８．５ｎｇをベクターフラグメントと混合し、Ｔ４−
ＤＮＡリガーゼにより結合し、大腸菌ＫＩ２　Ｈ８１０
１株を形質転換した。

得られた形質転換細胞より常法によりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、制限酵素分析により目的とするものであるこ
とを確認した。この発現用プラスミドをｐＡＴ−Ｔｒｐ
Ｅ−Ｎｅｏと命名した。ｐＡＴ−ＴｒｐＥ−Ｎｅｏ　（
１ｕ９）を制限酵素Ｎｃｏｌ−Ｘｂ＊Ｉ　（各８ユ＝ツ
ト）　Ｉｌ：テ消化後、常法によりベクターフラグメン
トを低融点アガロースゲル電気泳動により分取した。先
に作製しりｐＦＩＶ−ｇＢ　ＣＮｅｏｌ］　　（１１）
を上記間１１：　処理し、１５７０塩基対よりなるｇａ
ｇフラグメントを同様に調製した。これらのフラグメン
トを混合し、丁４　ＤＮＡリガーゼにより結合し、大腸
菌Ｋ１２１　Ｈ８１０１株を形質転換した。得られた形
質転換細胞から常法によりプラスミドを調製し、制限酵
素分析を行い目的とするものであることを確認した。得
られたプラスミドをｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＦＩＶｇｘｇ　
と命名した。

ＦＴＶ−ｇａｇ直接発現型ベクターの作製ｐＡＴ−Ｔ＋
ｐＥ−ＦＩＶｇａｇ（４００ｎｇ）を制限酵素Ｃｌ＊ｌ
（８ユニツト）にて切断後、６８℃にて酵素を失活させ
た後このうちの１７１０を用いてＴ４　ＤＮＡリガーゼ
にて再結合を行った。この反応液を用いて大腸菌Ｋ１２
１１ＢＩＯＩ株を形質転換し、得られた形質転換細胞か
ら制限酵素分析により目的とするプラスミドを確認した
。得られたプラスミドをｐＡＴづｌＶｇＢと命名した。

ＴｒｐＥ−ＦＩＶｇａｇ融合蛋白質融合蛋白質製発現Ｔ
−丁＋ｐＥ−ＦＩＶｇ１ｇで大腸菌ＫＩ２　ＨＢＩＯＩ
を形質転換したのち、ＬＢ培地中アンピシリン（５０埒
／ｍｌ）存在下３７℃にて一晩培養した。この培養液（
ｌｏｍｌ）をＫ９　ＣＡ培地（６，４ｍＭ　Ｌ　　ＨＰ
Ｏ４、０，０５％ＮｌＣｌ。

０１％　Ｎ）Ｉ　　Ｃ１，２ｍ１Ｊ　１１ｇ５ｏ　　、
　　０．２％グルコース０、　ｌｌｌＩＭ　ＣｌＣｌ　
　　　０．２％カザミノ酸）（１４りに加え吸収度が６
００　ｎｍにおいて約０３となるまで培養を行いβ−イ
ンドールアクリル酸を２０　ＩＩＩ　／　ｍｌの濃度に
なるように加え更に６時間培養を行った。この培養液の
一部を遠心により菌体を沈殿後、Ｕ、ＫＬａｅｍｍｌｉ
　　等　［Ｎｘ１ｎ＋＋、　　Ｖｏｌ、２２７．　６８
０−６１１５（１９７０）コの方法に従って調製した試
料用緩衝液を加え１０分間煮沸後、１０−２０％のポリ
アクリルアミドのグラジェントゲルで電気泳動を行った
。泳動後、■Ｔｏｖｂ　ｉ　ｎ等［Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、［
ＩＳＡ、７６、　４３５０−４３５４　　（１９７９）
］の方法に従ってＷｅｉｌｅ＋ｎブロッティング分析を
行った。−次抗体は、ＦＴＶ感染ネコ血清を用い、二次
抗体はＣｘｐｐｅ１社のｔｎｌｉ−ｃ＋ｌ　ＩｇＧ（Ｈ
＋Ｌ）　ＩＩＲＰを用いた。以上の方法で発現を確認後
、菌体を０１Ｍ　Ｔ＋ｉ＋　（ｐＨ８，５）中で超音波
破砕し、不溶性画分を遠心により集めた。この画分を１
−７Ｍ尿素にて抽出後、８Ｍ尿素を含む１０ｍＭ　ＤＴ
Ｔ、　　ＩＭ　ＮａＣｌ　Ｏ，１Ｍ　Ｔｒ目−ＨＣｌ溶
液にて４５℃６０分間加熱し抽出した。このようにして
得られたＴｒｐＥ−ＦＩＶｇＢ蛋白質の精製度は約６０
％であった。

同様に、Ｆｌｌ’−ｇａｇ直接発現型ベク９−　ｐＡＴ
−ＦＩＶｇｉｇで大腸菌株を形質転換し、ベクターを発
現させた場合には、ＦＩＹ−ｇ＊ｇ蛋白質が得られた。

ＦＩＶ−ｇａｇ蛋白質によるＦＴＶ−ｇａｇ抗体ＥＬＩ
ＳＡ用マイクロプレート（ＮｕｎＣ−１℃ｍｕｎｏ　ｐ
ｌｔｌｔＭｓｘｉｏ＋ｐ　Ｆ９６）に１５．２ｕ９／ｍ
ｌの濃度のＴ＋ｐＥ−ＦＩＶｇ＋ｇ蛋白質（抗原）を５
０成／ウエルずつ分注し、４℃にて一晩放置する。抗原
を捨てた後ＰＢＳにて洗浄後、３％ゼラチン／ＰＢＳ溶
液を０．１ｍｌ／ウェル分注し室温で１時間放置する。

更にＴＰＢＳ溶液（Ｏｕ５％Ｔｖｅ＋ｎ／ＰＢＳ）　ｌ
ニーて洗浄し、抗体希釈液（５０ｍＭ　Ｎ！　　Ｃｏ　
　、　　５０ｍＭ　ＮｔＨＣＯ３，ＰＨ９，６）にて希
釈したネコ血清を加え、室温で１時間放置する。

ＴＰＢＳ溶液にて２回洗浄後、二次抗体としてａｎｔｉ
−ｃｉｌ　ＩｇＧ　ＨＲＰを用い５０成／ウエルずつ分
注する。ＴＰＢＳにて洗浄後発色液を加え、１時間静置
した後、吸光度を波長４１５　ｎｍにて測定する。以上
のようにして、ＦＩＶ−ＴＭ株を実験感染したネコの血
清を用いて測定した結果、第５図に示すように接種前、
接種後３週間、８週間後に於て抗体価の上昇が見られた
。

ＦＩＶ、ＦｅＬＶ感染血清での交差反応性を確認するた
めに、ＦＩＶ（−）、　　Ｆｔ、ＬＪｆ＋）ネ−を血清
、ＦＩＶ（＋）、　　Ｆｅ１２（−）ネコ血清、　ＦＩ
Ｖｆ；）、　　ＦｅＬＶ（＋）ネコ血清を用いて測定し
た結果を第６図に示したが、ＦＩＶ（＋）血清において
は、陽性の結果を示すが、ＦＩＶ（−）　Ｆ＋Ｉｊ’（
＋）においては陰性でありこの診断薬はＦｅＬＶ感染血
清との交差は見られないことが示された。

［発明の効果］ 以上に詳述した本発明で提供されるＦＩＶ−７Ｍ２の遺
伝子ＲＮＡに相補性を示すＤＮＡ及びＦＮ’−７Ｍ２の
遺伝子ＲＮＡに相補性を示すＤＮＡの一部でそのｔｎマ
、２１ｇ遺伝子にそれぞれ相当するＤＮＡは、これを発
現させることによって、ネコ免疫不全症候群の診断用検
査薬、治療薬等の開発に有用なＦＴＶポリペプチドを得
ることができた。

このポリペプチドは、特に、ＦＩＶに対する抗体と特異
的に反応する良好な抗原となることから、ＦＩＶ感染ネ
コの診断用検査薬として使用できる。

また、他の非特異的免疫反応を生ずる抗原を含んでいな
いためＦＸＶに感染していないにも関わらず陽性として
の結果を生じるいわゆる偽陽性の検体を生じることなく
ＦＩＶ感染の診断を行なうことができる。従って、本発
明による診断薬は、ＦＩＶ感染ネコの早期発見、感染防
止を行なうことができ産業上の利用価値は極めて大きい
ものである。

さらにまた、ネコ免疫不全ウィルス研究の有用性という
点でＨＩＶ、！ＭＶ遺伝子の核酸配列の比較よりこれら
のウィルス群の変異、進化のパターンを予測することが
でき、ワクチン開発において重要な知見を得ることが可
能であるということが挙げられる。また、ヒト免疫不全
症候群の感染から発症への機序の解析を実験的に可能と
するためこのウィルスＤＮＡを用いた系は、ワクチン開
発、治療法開発、の動物実験モデルとして利用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ネコ免疫不全ウィルス［ＦＩＶ−７Ｍ２）の
ＲＮＡに相補性を示すＤＮＡの全塩基配列及びこの環基
配列から推定される、（ａｇ、　ｐｏｌ、　ｖｉ！及び
ｅｎマ領域に対応するアミノ酸配列を示し、また第２図
は、ＦＩＶ−７Ｍ２のＲＮＡに相補性を示すＤＮＡの制
限酵素地図と遺伝子構成を示す。 第３図は、ＦＩＶ−ｇａｇ遺伝子をコードするプラスミ
ドｐＦＩＶ−ｇＢ　［Ｎ＋ａｌｌの構築手順を示し、ま
た第４図は、ＦＩＶ−ｇａｇ発現用ベクターｐ八丁へ丁
＋ｐＥ−ＦＩＶｇｘｇ及びＦＩＶ−ｇｘｇ直接発現型ベ
ク９−　ｐＡＴ−ＦＩＶｇｔｇ（７）構築手順を示す。 図中、＾ｍｐはアンピシリン耐性遺伝子を、またヤは複
製開始点をそれぞれ示す。 第５図は、ＦＩＶ−ｇＢ発現蛋白質を抗原として用いる
、ＦＩＶ−ＴＭ株接種前後のネコ血清中ＮＬｇａｇ抗体
のＥＬＩＳ＾測定結果を示し、図（＾）はＦＩＶ−７Ｍ
１株を、また図ｆｉｔ）はＦＩＶ−丁Ｍ２株を夫々接種
した場合である。さらに、第６図は、ＦＩＶ又はＦ＋Ｌ
Ｖ感染ネコ血清とＦＩＬｇｘｇ発現蛋白質との交差反応
性をＥＬＩＳ＾で分析した結果を示す。 ？（）　　０５［＋　　ＮＱ　　ｕＱ　　Ｏ４＋　　？
（ロ０　へ＜　　ｗａ　　。ｃ″Ｓ　：て　二足　号淀
　に臣　繋蓋　蕎冒　；已　＝＄壮０ν　　＜Ｏにシ　
　Ｉ＋の　　べ心 Ｉ＋ａｌ　　　ｅＷ　　　ｅ−ｍ　　　Ｑ＞　　　（Ｊ
Ａ＜Σ　　　　＜＜　　　　じリ　　　　←υ　　　　
ＱくＵ　ヨ３　ｌ　ミニ　ビデ く島　　Ｉ＋ω　　　Ｑ− く−υ−Ｑ■ ミー 図面の浄書（内容に変更なし） 第３図 第４図 しａｌ 第５図 （Ａ） （Ｂ） ｆＥｌ−遺０希釈 手続補正書 （方式ン 平成２年１１月７２日 ２、発明の名称 ネコ免疫不全ウィルスの遺伝子ＲＮＡに相補性を示すＤ
ＮＡ ３゜ 補正をする者 事件との関係

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）ネコ免疫不全ウィルスの遺伝子ＲＮＡに相補性を
   示すＤＮＡであって、下記の図に示される読み取り枠に
   従って、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ及びｅｎｖ領域に対応
   する下記の図に示されたアミノ酸配列をコードする塩基
   配列を含むＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】
2. （２）ネコ免疫不全ウィルスの遺伝子ＲＮＡのｇａｇ遺
   伝子に相補性を示すＤＮＡであって、請求項１記載のＤ
   ＮＡによりコードされるアミノ酸配列のうち、ｇａｇ領
   域に対応するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む
   ＤＮＡ。
3. （３）ネコ免疫不全ウィルスの遺伝子ＲＮＡのｅｎｖ遺
   伝子に相補性を示すＤＮＡであって、請求項１記載のＤ
   ＮＡによりコードされるアミノ酸配列のうち、ｅｎｖ領
   域に対応するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む
   ＤＮＡ。
4. （４）請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡを含
   むプラスミド。
5. （５）プラスミドがｐＦＩＶ−ＴＭ２又はｐＦＩＶ−ｇ
   ａｇ［ＮｃｏＩ］である請求項４に記載のプラスミド。
6. （６）請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡによ
   ってコードされるポリペプチドの全部又は一部をコード
   する塩基配列を有し、必要に応じて５′末端にメチオニ
   ンをコードするコドンを有するＤＮＡが、プロモーター
   の下流に存在するベクター内のクローニング部位に導入
   されて含むことを特徴とする発現ベクター。
7. （７）発現ベクターがプラスミドである請求項６に記載
   の発現ベクター。
8. （８）プラスミドがｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＦＩＶｇａｇ又
   はｐＡＴ−ＦＩＶｇａｇである請求項５に記載の発現ベ
   クター。
9. （９）請求項６〜８のいずれか一項に記載の発現ベクタ
   ーで宿主を形質転換して得られた形質転換体。
10. （１０）宿主が大腸菌である請求項９に記載の形質転換
    体。
11. （１１）大腸菌がＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１株である請求
    項１０に記載の形質転換体。
12. （１２）請求項９〜１１のいずれか一項に記載の形質転
    換体を培養し、蓄積して得られる組換え型ネコ免疫不全
    ウィルスポリペプチド。
13. （１３）請求項１２に記載の組換え型ネコ免疫不全ウィ
    ルスポリペプチドを抗原として含有するネコ免疫不全ウ
    ィルス感染診断用検査薬。