JPH1081700A - Ｈｔｌｖ‐ｉｉｉ抗体の診断用ペプチド並びにそれらの製造法及び用途 - Google Patents

Ｈｔｌｖ‐ｉｉｉ抗体の診断用ペプチド並びにそれらの製造法及び用途

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JPH1081700A JP9107089A JP10708997A JPH1081700A JP H1081700 A JPH1081700 A JP H1081700A JP 9107089 A JP9107089 A JP 9107089A JP 10708997 A JP10708997 A JP 10708997A JP H1081700 A JPH1081700 A JP H1081700A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ヒトＴ細胞白血病（リンパ性）ウイルス（Ｈ
ＴＬＶ‐III）のある種のペプチド断片が特に同ウイル
ス抗体に対して免疫反応性であり、よって、これらの断
片は免疫診断試験に使用することができる。 【解決手段】 ウイルス表面上のエピトープが免疫学的
診断において果たす役割を調べるために、発明者らは診
断領域を確認することによってヒトＴ細胞白血病ウイル
スIII型（ＨＴＬＶ‐III）のプロウイルスを評価した。
これらの努力は、特に抗ＨＴＬＶ‐III抗体と免疫反応
する特異的ペプチド断片又はその構造物の確認に結びつ
いた。更にこれらの診断用ペプチドを修正して、免疫反
応性の程度を著しく増大させた。次いで、遺伝子工学の
手法によって、これら診断用ペプチドの高発現レベルを
達成することに成功した。これらペプチドの使用を必要
とする診断アッセイも、ＨＴＬＶ‐IIIに対する抗体検
出用として開発された。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、ヒトＴ細胞白血病（リンパ性）ウイルス（Ｈ
ＴＬＶ‐III ）のある種のペプチド断片が特にＨＴＬＶ
‐III 抗体に対して免疫反応性であるという発見に関す
る。したがって、これらの断片はＨＴＬＶ‐III に対す
る抗体検出のための免疫診断試験に使用することができ
る。
【０００２】発明の背景 ヒトＴ細胞白血病（リンパ性）ウイルス（ＨＴＬＶ‐II
I ）は、ＲＮＡ上にその遺伝子コードを有するレトロウ
イルスである。レトロウイルスが宿主細胞に感染した場
合、そのゲノムのＤＮＡコピーはその宿主の染色体中に
組込まれる。数種のレトロウイルスの場合において、Ｄ
ＮＡはプロウイルス（Provirus）として知られる配列の
形で宿主細胞染色体中に組込まれる。レトロウイルス遺
伝子コードのＤＮＡコピーは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリ
メラーゼ、即ち、逆転写酵素と呼ばれるウイルス酵素に
よって合成される。宿主細胞はウイルス遺伝子のＤＮＡ
を転写し、かつウイルスによりコードされたタンパク質
を合成するが、次いでこれらは新しいウイルス中に集合
化される。ＨＴＬＶ‐III ＲＮＡゲノムは他のレトロウ
イルスのものと類似しており、(i) 内部構造（ヌクレオ
カプシド又はコア）タンパク質についてコードするｇａ
ｇ遺伝子、(ii)逆転写酵素についてコードするｐｏｌ遺
伝子、及び(iii) ウイルスのエンベロープ糖タンパク質
についてコードするｅｎｖ遺伝子を少なくとも有する。
ＨＴＬＶ‐III は、ｔａｔ、ｓｏｒ及び３′‐ＯＲＦと
呼ばれる遺伝子を含めて更に遺伝子を有している。
【０００３】ＨＴＬＶ‐III の完全ＤＮＡヌクレオチド
配列は数人の研究者によって文献で報告されている：ラ
トナーら，ネーチャー，第３１３巻，第２７７−２８４
頁，１９８５年〔Ratner et al., Nature, 313 :277-2
84 (1985) 〕；ムージング（Muesing ）ら，ネーチャ
ー，第３１３巻，第４５０−４８５頁，１９８５年；サ
ンチェス‐ペスカドールら，サイエンス，第２２７巻，
第４４−４９２頁，１９８５年〔Sanchez-Pescador et
al., Science, 227 ：44-492 (1985) 〕；及びウェイン
‐ホプシンら，セルズ，第４０巻，第９−１７頁，１９
８５年〔Wain-Hopsin et al., Cells, 40 :9-27 (1985)
〕。
【０００４】他の者は、完全ＨＴＬＶ‐III エンベロー
プタンパク質がＨＴＬＶ‐III ウイルス診断用に使用さ
れうることを示した。アラン（Allan ）ら，サイエン
ス，第２２８巻，第１０９１−１０９４頁，１９８５
年；ベアリン(Barin）ら，サイエンス，第２２８巻，第
１０９４−１０９６頁，１９８５年；及びベロニーズ
（Veronese）ら，サイエンス，第２２９巻，第１４０２
−１４０５頁，１９８５年。ウイルス配列の各部分の分
子クローニングは、ラトナーら，同上；チャンら，バイ
オ／テクノロジー，第３巻，第９０５−９０９頁，１９
８５年〔Chang et al., Bio/Technology, 3 : 905-909
(1985)〕；チャンら，サイエンス，第２２８巻，第９３
−９６頁，１９８５年；及びクロウルら，セル，第４１
巻，第９７９−９８６頁，１９８５年〔Crowl et al.,
Cell, 41: 979-986 (1985)〕に記載されたようにして達
成された。これらのクローンはＨＴＬＶ‐III ウイルス
表面上の潜在的ポリペプチドエピトープの分析用物質を
提供し、免疫系はそれに対する抗体反応を生起しうる。
これらエピトープの確認は、エイズ診断のための感度が
よくかつ迅速な方法の開発にとって重要である。
【０００５】発明の要約 ウイルス表面上のエピトープが免疫学的診断において果
たす役割を調べるために、発明者らは診断領域を確認す
ることによってヒトＴ細胞白血病ウイルスIII型（ＨＴ
ＬＶ‐III ）のプロウイルスを評価した。これらの努力
は、特に抗ＨＴＬＶ-III 抗体と免疫反応する特異的ペ
プチド断片又はその構造物の確認に結びついた。更に発
明者らはこれらの診断用ペプチドを修正して、免疫反応
性の程度を著しく増大させた。次いで発明者らは、遺伝
子工学の手法によって、これら診断用ペプチドの高発現
レベルを達成することに成功した。これらペプチドの使
用を必要とする診断アッセイも、ＨＴＬＶ‐III ウイル
スに対する抗体を含有しているかもしれないサンプルに
おいてＨＴＬＶ‐III に対する抗体検出用として開発さ
れた。
【０００６】定義 以下の記載において、組換えＤＮＡ技術で使用されるい
くつかの用語は頻繁に用いられている。明細書及び請求
の範囲のより明確かつ矛盾のない理解を得るために、か
かる用語で与えられる範囲を含めて、下記定義が与えら
れる。
【０００７】プロモーター 開始コドンの隣に位置す
る、通常遺伝子の５′領域と記載されるＤＮＡ配列。プ
ロモーター領域において、隣接遺伝子（群）の転写が開
始される。
【０００８】遺伝子 ポリペプチド又はタンパク質の組
立て情報を有し、かつ本明細書で用いられているように
５′及び３′末端を含むＤＮＡ配列。
【０００９】構造遺伝子 メッセンジャーＲＮＡに転写
され、次いで特定ポリペプチドに特有のアミノ酸配列に
翻訳されるＤＮＡ配列。典型的には、最初に翻訳される
コドンの第一ヌクレオチドは＋１と表示され、ヌクレオ
チドは構造遺伝子の翻訳領域から３′未翻訳領域にかけ
て正の整数で連続的に表示される。翻訳領域までのプロ
モーター及び調節領域５′におけるヌクレオチドの番号
は、最初に翻訳されるヌクレオチドに隣接する５′ヌク
レオチドが−１と表示されて、負の整数で連続的に続け
られる。
【００１０】作動可能に結合される 本明細書で用いら
れているように、プロモーターが構造遺伝子でコードさ
れたポリペプチドの発現開始をコントロールしているこ
とを意味する。発現 発現とは、構造遺伝子がポリペプ
チドを製造するプロセスのことである。これには、遺伝
子からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写及び
かかるｍＲＮＡからポリペプチド（群）への翻訳が含ま
れる。
【００１１】クローニングビヒクル 宿主細胞中で複製
しうるプラスミドもしくはファージＤＮＡ又は他のＤＮ
Ａ配列のことであって、１つ又は一定数のエンドヌクレ
アーゼ認識部位により特徴づけられ、この部位において
かかるＤＮＡ配列はＤＮＡの必須生物学的機能の損失を
伴うことなく決定可能な形で切断され、形質転換された
細胞の同定用に適した表現型選択マーカーを有してい
る。マーカーは例えばテトラサイクリン耐性又はアンピ
シリン耐性である。“ベクター”という語は時々クロー
ニングビヒクルの意味で用いられることがある。
【００１２】発現ビヒクル クローニングビヒクルと似
ているが、但し通常ある調節配列のコントロール下で宿
主中において所定の構造遺伝子を発現することができる
ビヒクル。かかるビヒクルは挿入遺伝子の発現を促進す
るように作られている。典型的には、遺伝子の調節配列
を有する制限断片は、調節配列を欠く遺伝子をもった制
限断片を有するプラスミドにインビトロで結合せしめら
れる。この新しいＤＮＡ配列の組合せをもつプラスミド
は、次いで調節配列のコントロール下で遺伝子の発現を
促進するような環境のもとで複製される。
【００１３】宿主 複製可能な発現ビヒクルの受容体で
あるあらゆる生物。
【００１４】好ましい態様の説明 Ｈ９／ＨＴＬＶ‐III 細胞系由来のＨＴＬＶ‐III プロ
ウイルスに関する完全ＤＮＡヌクレオチド配列及びそれ
から予想されるアミノ酸配列は、テトナーら，ネーチャ
ー，第３１３巻，第２７７−２８４頁，１９８５年に記
載されているが、これは参考のため本明細書に組込まれ
る。Ｈ９細胞系から単離されたクローンＢＨ５及びＢＨ
８が、本発明の出発物質として使用された。Ｈ９／ＨＴ
ＬＶ‐III 細胞系は、ＡＴＣＣ No.ＣＲＬ８５４３と
して米国基準培養寄託機関（American Type Culture Co
llection）に寄託されており、米国特許第４，５２０，
１１３号明細書で総括的に記載されている。ＨＴＬＶ‐
III ウイルスは、永久増殖性ヒトＴ細胞クローンのリゼ
イトを用いて増殖させることもできる。
【００１５】ＢＨ５及びＢＨ８クローンのペプチド断片
についてコードする様々なヌクレオチド配列が、免疫診
断用領域を調べるために評価された。特に免疫反応性で
あるがゆえにエイズ抗体に関する免疫診断に利用できる
ことが発明者らによって発見されたＨＴＬＶ‐III プロ
ウイルスの特定のペプチド断片は、配列が前記ラトナー
らの図１において番号付けされたヌクレオチド配列６５
３−１２１８、２６００−３９１１、２７４３−４２１
１、６６１９−７１９８及び７１９９−８０５２によっ
てコードされている（又はその中に存在している）。こ
れら５つの領域は、本出願の図１５〜１９に示されてい
る。本明細書で用いられているようにかつ適切な位置と
なるように、ヌクレオチド配列の番号は制限エンドヌク
レアーゼクリップ（clip）部位の３′側から始まる第一
ヌクレオチドを基礎としている。
【００１６】好ましいペプチド断片は、ヌクレオチド配
列２６００−３９１１、２７４３−４２１１及び７１９
９−８０５２によってコードされる（又はその中に存在
する）断片である。最も好ましいペプチド断片は７１９
９−８０５２である（又はその一部である）。
【００１７】更に、発明者らは、断片中の疎水性部分に
ついてコードするＤＮＡ配列を削除することが断片の発
現量増加とＨＴＬＶ‐III 抗体に対する高度の免疫反応
性とに繋がることを発見した。疎水性領域は、ＨＴＬＶ
‐III ウイルスの様々なヌクレオチド部分によってコー
ドされた疎水性アミノ酸からなる領域である。好ましい
態様においては、ヌクレオチド配列７１９９−８０５２
によってコードされた免疫原性ペプチド断片の２つの疎
水性領域が削除されていた。これら２つの疎水性領域
は、およそヌクレオチド７３５０−７４１８及びおよそ
ヌクレオチド７８５１−７９１６においてコードされて
いる。
【００１８】更に、本発明者らは、疎水性領域が削除さ
れたペプチド断片のアミノ末端を延長させることが断片
の発現量増加とＨＴＬＶ‐III 抗体に対する高度の免疫
反応性とに繋がることも発見した。このように、他の好
ましい態様においては、ヌクレオチド配列７１９９−８
０５２によってコードされた疎水性二重削除ペプチド断
片のアミノ末端が延長されている。最も好ましい態様に
おいては、ヌクレオチド配列７１９９−８０５２によっ
てコードされた疎水性二重削除ペプチド断片のアミノ末
端は、およそヌクレオチド６８２７におけるＡｈａIII
部位まで延長されている。ＨＴＬＶ‐III のこの部分、
即ちヌクレオチド６８２７−８０５２は、今までに知ら
れていたＨＴＬＶ‐III 単離物中に存在するエンベロー
プ配列のほとんどすべてを含んでいる。この特定のペプ
チド断片はΔＧ‐７１Ａと命名され、このペプチドを発
現するプラスミドを含有した大腸菌（Escherichia col
i）培養物（ＭＺ１）はｐΔＧ７１ＡＣと命名された。
この培養物は１９８６年１月３０日にＡＴＣＣ No.５
３４５５として米国基準培養寄託機関，１２３０１パー
クローン・ドライブ（Parklown Drive），ロックビル
（Rockville ），メリーランド州２０８５２に寄託され
た。この寄託機関は永久寄託と一般人による簡易な入手
性とを保証している。
【００１９】当業者であれば理解されるであろうが、発
現ビヒクルにおいてクローン化されたヌクレオチド配列
の適当な配列調整によって、ペプチド断片の最初の１又
は２個のアミノ酸に関して様々な変換が可能となる。
【００２０】更に、ペプチド断片は、変換が抗ＨＴＬＶ
‐III 抗体に対するペプチドの免疫反応性を高めるので
あれば、挿入、削除及び置換（保存的もしくは非保存的
であれ）のような様々な変換に付すことができる。保存
的置換とは、ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅ
ｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈ
ｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；及びｐｈｅ、ｔｙｒのような組合
せを意味する。
【００２１】ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、コドンと
呼ばれる３個のヌクレオチド群で翻訳される。各コドン
は、合成されたペプチド断片中の１個のアミノ酸に相当
する。読取り枠は、どの３個１組のヌクレオチドがコド
ンとして読取られるかを規制しており、開始コドンＡＵ
Ｇによって決定される。
【００２２】特に重要なものは、下記式のペプチドであ
る： １） Ｈ２Ｎ−−Ｘ−−ＣＯ−−Ｒ１ 〔上記式中、Ｒ１はＣｙｓ−ＣＯ−Ｒ２、ＯＨ、ＯＭ又
は−ＮＲ３Ｒ４である；Ｍは薬学上許容される陽イオン
又は低級（Ｃ１−Ｃ６）分岐鎖もしくは非分岐鎖状アル
キル基である；Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は同一か又は異なっ
ており、水素及び低級（Ｃ１−Ｃ６）分岐鎖もしくは非
分岐鎖状アルキル基からなる群より選択される；Ｘは前
記のようなアミノ酸配列又はペプチド断片である〕； ２） それらの酸付加塩；及び ３） それらの保護された又は一部保護された誘導体。 当業者公知の如く、アミノ酸残基は適当なアミノもしく
はカルボキシル保護基を用いてそれらが保護された形で
又は未保護の形で存在する。有用な陽イオンＭは、アル
カリもしくはアルカリ土類金属の陽イオン（即ち、Ｎ
ａ、Ｋａ、Ｌｉ、 1/2Ｃａ、 1/2Ｂａ等）又はアミノ陽
イオン（即ち、テトラアルキルアンモニウム、トリアル
キルアンモニウム、但しアルキルはＣ１−Ｃ12である）
である。
【００２３】様々な鎖長のペプチドは、遊離アミン（Ｎ
末端）でも又はその酸付加塩の形であってもよい。通常
の酸付加塩はハロゲン化水素酸塩、即ちＨＢｒ、ＨＩ、
又は更に好ましくはＨＣｌの塩である。ＨＴＬＶ‐III
ウイルスのペプチド断片は、宿主細胞中においてプロウ
イルスから得ることができる。その際に、ペプチド断片
は適当な酵素又は化学的方法を用いて天然ウイルスを断
片化することにより得られるであろう。しかしながら、
合成により、例えばメリフィールド，ジャーナル・オブ
・アメリカン・ケミカル・ソサエティ，第８５巻，第２
１４９頁，１９６２年〔Merrifield, Journal ofAmeric
an Chemical Society, 85 :2149(1962)〕並びにスチュ
ワート及びヤング，固相ペプチド合成（フリーマン，サ
ンフランシスコ，１９６９年），第２７−６２頁〔Stew
art and Young in Solid Phase Peptide Synthesis （F
reeman, San Francisco 1969 ）at 27-62〕に記載され
た周知の固相ペプチド合成によりペプチド断片を得るこ
ともできる。
【００２４】ペプチド断片を得る好ましい方法は、遺伝
子工学技術を利用して所望のポリペプチド断片をクロー
ニングすることである。遺伝子工学及び組換えクローン
を用いる利点は２つある。第一の利点は、単離技術又は
合成によりウイルスゲノムを大量に得ることが困難かつ
時間の浪費となることであり、第二の利点は、組換えペ
プチドが診断試験の信頼度を低下させうるヒト抗原をも
っていないことである。ここで、“ペプチド断片”とい
う語は、天然アミノ酸配列、合成配列、及びＨＴＬＶ‐
III ウイルスゲノムのセグメントであるクローン化配列
から発現された断片を含んでいることを意味する。上記
のように診断用ペプチド断片にはいくつかのバリエーシ
ョンがあると当業者には理解されるであろうが、但しこ
れらのペプチドではＨＴＬＶ‐III の抗体に対する免疫
反応性を保持していなければならない。したがって、ペ
プチド断片の鎖長範囲は明確に規定される必要はない。
ペプチド断片のアミノ酸は、免疫反応性の損失を伴わず
に削除又は付加される。しかも、アミノ酸は交換するこ
とができ、例えばバリン等の中性アミノ酸はロイシン等
の他の中性アミノ酸と交換することができる。単離物毎
にもゲノムのバリエーションがある〔例えば、ウォング
‐スタール（Wong-Staal）ら，サイエンス，第２２９
巻，第７５９−７６２頁，１９８５年参照〕。このよう
なバリエーションも本発明のペプチド断片に含まれる、
と理解されたい。
【００２５】遺伝子構造体及びそれらの使用方法は、原
核細胞及び真核細胞の宿主を含めた宿主においてのペプ
チド断片の発現用に利用することができる。原核細胞宿
主としては、大腸菌、サルモネラ・チフィムリウム（Sa
lmonella typhimurium ）、セラチア・マルセスセンス
（Serratia marcescens）又はバチルス・スブチリス
（Bacillus subtilis）のような細菌がある。発現用の
好ましい細菌宿主は、ラウテンベルガーら，ジーン・ア
ナライティカル・テクノロジー，第１巻、第６３−６６
頁，１９８４年〔Lautenberger et al., Gene analytic
al Technology,1: 63-66 (1984)〕に記載されているＭ
Ｚ１のような、温度感受性バクテリオファージλＣＩ８
５７遺伝子をもつ大腸菌株である。真核細胞宿主として
は、酵母菌、繊維状真菌及び哺乳動物細胞がある。ペプ
チド断片のＤＮＡ配列は、ワクシニアウイルスのゲノム
に挿入することができる〔マケット・エムら，プロシー
ディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンスＵＳＡ，第７９巻，第７４１５頁，１９８２年(M
ackett，M. et al., Proceeding of National Academy
of Science USA, 79 : 7415 (1982)）；パニカリ・デー
（Panicali, D.）ら，プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７９
巻，第４９２７頁，１９８２年；パニカリ・デーら，プ
ロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンスＵＳＡ，第８０巻，第５３６４頁，１９８
３年；及びスミス・ジー・エル（Smith, G.L. ）ら，ネ
ーチャー、第３０２巻，第４９０頁，１９８３年〕。そ
の際に組換えヴァクシニアウイルスはいずれかの哺乳動
物細胞中で複製を行ない、対象とする断片はエンベロー
プ又は内部ウイルスタンパク質中に出現してくる。昆虫
細胞も断片の複製用に使用しうる〔例えば、スミスら，
モレキュラー・アンド・セル・バイオロジー，第３巻，
第２１５６−２１６５頁，１９８３年（Smith et al.,
Molecular and Cell Biology, 3 : 2156-2165 (1983)）
参照〕。
【００２６】一般に、挿入された遺伝子断片の効果的な
転写を促進し、宿主細胞に親和性の種から得られるプロ
モーター配列含有発現ベクターは、これら宿主と合わせ
て使用される。発現ベクターは、典型的には、複製源、
プロモーター、ターミネーター、及び形質転換細胞での
表現型選択を可能にする特定遺伝子を有している。形質
転換された宿主細胞は、最適の細胞増殖を行ない、しか
もクローン化されたＨＴＬＶ‐III ペプチド断片の最適
の発現を行なわせるために、当業者に公知の手段によっ
て発酵かつ培養させることができる。後述の例５で記載
されているように、ペプチド断片についてコードするク
ローンＨＴＬＶ‐III ウイルス配列の高レベル発現は、
本発明の好ましい操作法に従って行なうことができる。
【００２７】クローンＨＴＬＶ‐III ペプチド断片の発
現後、断片は典型的には当業者に公知の手段によって回
収精製される。細菌が宿主として用いられる場合には、
クローンの高レベルの発現の結果として、不溶性封入体
又は凝集物が通常形成される。発現タンパク質を精製す
るためには、不溶性封入体は可溶化されねばならない。
本発明の好ましい態様において、発現されたペプチド断
片はアミノ基のシトラコニル化誘導プロセスによって精
製されるが、このプロセスは例８で更に詳細に記載され
ている。
【００２８】本発明の精製された免疫原性でかつ診断用
のペプチド断片は、ＨＴＬＶ‐IIIに応答して産生され
た抗体によって特異的に認識される。血液又は組織サン
プル中のＨＴＬＶ‐III 抗体はイムノアッセイにおいて
ペプチド断片を用いて検出することができるが、その際
にペプチドは液相中で用いられるか又は固相担体に結合
せしめられる。しかも、ペプチド断片はウイルスのイム
ノアッセイ向けに様々な方法で検出可能となるよう標識
をつけることができる。本発明のペプチド断片を用いて
ＨＴＬＶ‐III 抗体を検出するための好ましいイムノア
ッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、酵素結合イム
ノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は当業者に公知
の他のアッセイ、例えばイムノフルオレセントアッセ
イ、ケミルミネセントアッセイもしくはバイオミネセン
トアッセイがある。アッセイで特に使用される放射性同
位体としては、 3Ｈ、 125Ｉ、 131Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、14
Ｃ、51Ｃｒ、36Ｃｌ、57Ｃｏ、58Ｃｏ、59Ｆｅ、75Ｓｅ
及び 152Ｅｕがある。
【００２９】放射線標識をすることは１つの選択である
が、別法として、ペプチド配列又はそれに対する抗体
が、当業者に公知の技術により螢光標識、酵素標識、遊
離ラジカル標識、アビジン‐ビオチン標識又はバクテリ
オファージ標識を用いて標識される〔チャード，生物学
の実験技術，“ラジオイムノアッセイ及び関連技術の入
門”，ノース・ホランド・パブリッシング社，１９７８
年（Chard, LaboratoryTechniques in Biology, "An In
troduction to Radioimmunoassay and RelatedTechniqu
es", North Holland Publishing Company (1978)）〕。
代表的な螢光標識としては、イソチオシアン酸フルオレ
セイン、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニ
ン、アロフィコシアニン、ｏ‐フタルアルデヒド及びフ
ルオレサミンがある。
【００３０】代表的な化学ルミネセンス化合物として
は、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウ
ムエステル類、イミダゾール類、アクリジニウム塩類及
びシュウ酸エステル類がある。代表的な生物ルミネセン
ス化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び
エクオリンがある。代表的な酵素としては、アルカリホ
スファターゼ、β‐ガラクトシダーゼ、グルコース‐６
‐リン酸デヒドロゲナーゼ、マレイン酸デヒドロゲナー
ゼ、グルコースオキシダーゼ及びペルオキシダーゼであ
る。
【００３１】酵素アッセイにおける２つの主なタイプ
は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）、及び酵素多重化イムノアッセイ（ＥＭＩＴ）〔サ
イバ社（Syva Corp.）〕としても知られる均一酵素イム
ノアッセイである。ＥＭＩＴ系はトレーサー抗体複合体
による酵素の不活性化に依存しており、したがって活性
は分離工程を必要とせずに測定することができる。本発
明の範囲内に属するイムノアッセイとしては、イムノメ
トリックアッセイ（immunometric assay）及び競合アッ
セイがある。
【００３２】イムノメトリックアッセイとしては、フォ
ワード（forward ）サンドイッチ、逆サンドイッチイム
ノアッセイ及び同時アッセイがある。これら各々の用語
は当業者に十分理解されている。イムノメトリックアッ
セイは、ＨＴＬＶ‐III に対する抗体の検出用として記
載されることになるであろう。これらのアッセイでは、
ペプチド断片は固相担体に結合せしめられ、抗ＩｇＧ抗
体は検出可能なように認識される。
【００３３】フォワードサンドイッチイムノアッセイで
は、ＨＴＬＶ‐III に対する抗体を含有している可能性
があるサンプルは、最初にペプチド断片を有する固相免
疫吸着剤と一緒にインキュベートされる。インキュベー
トは、サンプル中の抗体を固定ペプチド断片に結合させ
るために十分な時間にわたって続けられる。最初のイン
キュベート後、固相免疫吸着剤はインキュベート混合物
から分離され、かつサンプル中に存在している可能性の
ある阻害物質を除去するために洗浄される。次いで、固
定ペプチド断片に結合した固相免疫吸着剤含有抗体は、
被検抗体上の別のドメインを交差反応する可溶性標識抗
体と一緒にわずかな時間インキュベートされる。第二の
インキュベート後、もう１度洗浄が行なわれ、それによ
って固相免疫吸着剤から未結合標識抗体を除去し、かつ
非特異的結合標識抗体を除去する。次いで固相免疫吸着
剤に結合した標識抗体が検出され、検出された標識抗体
量は原サンプル中に存在する抗体量の直接的測定値とみ
なされる。又は、免疫吸着剤複合体を結合しない標識抗
体も検出することができるが、その場合において測定値
はサンプル中に存在する抗原量と反比例する。フォワー
ドサンドイッチアッセイは、例えば米国特許第３，８６
７，５１７号、第４，０１２，２９４号及び第４，３７
６，１１０号明細書に記載されている。
【００３４】逆サンドイッチアッセイでは、ＨＴＬＶ‐
III に対する被検抗体を含有している可能性があるサン
プルは最初に標識抗‐抗体と一緒にインキュベートさ
れ、次いで被検体上の別のドメインと交差反応する固定
ペプチド断片を含有した固相免疫吸着剤がそれに加えら
れ、わずかな時間インキュベートが行なわれる。フォワ
ードサンドイッチアッセイに必要な最初の洗浄工程は不
要であるが、第二のインキュベート後には洗浄が行なわ
れる。逆サンドイッチアッセイは、例えば米国特許第
４，０９８，８７６号及び第４，３７６，１１０号明細
書に記載されている。
【００３５】同時サンドイッチアッセイでは、サンプ
ル、ペプチド断片を固定した免疫吸着剤及び被検抗体の
別のドメインに対して特異的な可溶性標識抗体が、１回
のインキュベート工程で同時にインキュベートされる。
同時アッセイではたった１回のインキュベートのみを要
し、洗浄工程を要しない。同時アッセイの適用は非常に
有効な技術であって、簡易操作性、均一性、再現性、ア
ッセイの直線性及び高精度という利点を与える。参考の
ため本明細書に組込まれるデビッド（David ）らの米国
特許第４，３７６，１１０号明細書参照。所謂、遅延型
イムノメトリックアッセイも、例えばチュー（Chu ）、
米国特許第４，２８９，７４７号明細書及びウォルター
ズ（Wolters ）、米国特許第４，３４３，８９６号明細
書に記載されているように、利用することができる。
【００３６】上記アッセイの各々において、抗体含有サ
ンプル、固定ペプチド断片含有の固相免疫吸着剤及び可
溶性標識抗体は、被検抗体を固定ペプチド断片及び可溶
性抗体と結合させるために十分な条件下でかつ十分な時
間にわたってインキュベートされる。一般に、できるだ
け抗体を多く結合させるために十分なインキュベート条
件を整えることが望ましいが、その理由はこれによって
固相への標識抗体の結合量を最大にし、もってシグナル
を増加させることになるからである。勿論、標識抗体及
び固定断片の具体的濃度、インキュベートの温度及び時
間、並びに他のこのようなアッセイ条件は、サンプル中
の抗体濃度、サンプルの性質等をはじめとする各種ファ
クターに応じて変更させることができる。当業者であれ
ば、日常的実験法によって、各々の決定事項に関して実
施可能かつ最適のアッセイ条件を定めることができるで
あろう。
【００３７】今までに使用されておりかつ本発明でも使
用可能な固相免疫吸着剤としては多数のものがある。周
知の免疫吸着剤としては、ガラス、ポリスチレン、紙、
ポリプロピレン、デキストラン、ナイロン及び他の物質
から形成されたビーズ類；かかる物質から形成されるか
又はそれでコーティングされたチューブ類、等がある。
固定されるペプチド断片は、アミドもしくはエステル結
合を介する共有結合等の技術により又は吸着によって、
固相免疫吸着剤に共有結合せしめられるか又は物理的に
結合せしめられる。当業者であれば、ペプチド断片を結
合させるために適した他の多数の担体を知っており、そ
うでないとしても日常的実験法によってそのことを確認
することができるであろう。
【００３８】ホルモン、タンパク質、抗体等のような微
量有機物分子の検出用に使用される一般的な競合的結合
アッセイ技術は、当業者に周知である。チャード，同上
参照。これらいずれの競合的結合アッセイ技術も、ＨＴ
ＬＶ‐III 抗体の検出目的のために利用することができ
る。競合的結合アッセイ、典型的にはラジオイムノアッ
セイ（ＲＩＡ）を実施するためには、ペプチド断片に応
答して産生された標識含有抗体と、試験されるべきＨＴ
ＬＶ‐III 抗体とに対して親和性を有する結合用分子を
加えることが必要である。未知量のＨＴＬＶ‐III 抗体
を含有した少量の液体又は組織サンプルは、産生標識抗
体及び既知量の抗体特異性ペプチド断片の存在下でイン
キュベートされる。
【００３９】凝集アッセイは、ＨＴＬＶ‐III 抗体を検
出するためにも利用可能である。例えば、所望の断片
は、適当な粒子、例えばラテックスビーズ、ゼラチン、
赤血球、ナイロン、リポソーム、金粒子等の上に固定さ
れる。サンプル中に抗体が存在している場合は、沈降反
応に類似した凝集を引き起こし、しかる後比濁法、濁
度、赤外線分光測定法、目視検査、比色法等の方法で検
出することができる。産生抗体は本発明の抗原性ペプチ
ド断片から製造されることが好ましい。試験サンプルと
断片及びトレーサー含有抗体とのインキュベートが終了
した後には、遊離及び結合（免疫複合化）型間でのトレ
ーサー含有分子の分布を調べることが必要である。通
常、但しいつも必ずというわけではないが、そのために
は結合画分が遊離画分から物理的に分離されることを必
要とする。例えば、特異的ペプチド断片はプレートに結
合させることができる。他の様々な技術もかかる目的の
ために利用することができ、各々においてその遊離及び
結合型のトレーサー含有分子間の物理化学的差異を活用
している。通常利用される方法論は、ヤロー，ファーマ
コロジカル・レビュー，第２８巻，第１６１頁，１９７
３年〔Yalow,in Pharmacological Review, 28 : 161 (1
973) 〕に記載されている。これらの技術としては、吸
着、沈降、塩析技術、有機溶媒、電気泳動分離等があ
る。チャード，同上，第４０５−４２２頁参照。
【００４０】前記イムノメトリックアッセイの場合のよ
うに、可溶性抗体は放射線標識、螢光標識、酵素標識、
遊離ラジカル標識又はバクテリオファージ標識のような
いずれかの検出可能な標識で標識することができる。最
も普通には、標識は放射線標識又は酵素標識である。本
発明の免疫原性のペプチド断片は、抗体産生を促進させ
るために用いてもよい。抗体産生を促進させるために
は、ペプチド断片は、当業界で周知でかつ一般的に利用
されている技術を用いて、牛血清アルブミン又はキーホ
ールアオガイ（Keyhole limpet）ヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ）のような担体タンパク質に結合させてもよい。好ま
しくは、担体タンパク質はＫＬＨであって、システイン
残基を介してペプチド断片に結合せしめられる。
【００４１】しかも、ペプチド断片は免疫学的に不活性
又は活性な担体と混合させることができる。免疫応答を
促進又は誘導するフロイント完全アジュバントのような
担体が使用可能である。
【００４２】動物による抗血清生産は周知の技術である
（例えばチャード，同上，第３８５−３９６頁参照）。
動物の選択は、入手し易さと、得られた抗血清量に関す
るおよその必要量との間におけるバランスによって通常
決定される。ヤギ、ロバ及びウマのような大型種が好ま
しいが、その理由は大量の血清が容易に得られるからで
ある。しかしながら、通常高力価の抗血清を産生するウ
サギ又はモルモットのような小型種を用いることも可能
である。通常、抗原物質（ペプチド断片ハプテン‐担体
タンパク質複合体）の皮下注射が動物の免疫系に導入さ
れ、そこで抗体が産生される。適切な抗体の検出は、適
切な標識トレーサー含有分子で抗血清を試験することに
よって行なわれる。トレーサー含有分子と結合する画分
が次いで単離され、必要であれば更に精製される。この
ようにして得られた抗体は次いで、ＨＴＬＶ‐III ウイ
ルス又はその断片を同定かつ定量するための様々なイム
ノアッセイにおいて利用することができる。コーラー
（kohler）及びミルシュタイン（Milstein），ネーチャ
ー，第２５６巻，第４９６頁，１９７５年に記載されて
いるような周知の技術によって製造され、本発明のペプ
チド断片に応答して生成するポリクローナル抗体及びモ
ノクローナル抗体は、いずれもイムノアッセイに利用す
ることができる。
【００４３】ＨＴＬＶ‐III ウイルス又はその一部を検
出するためにイムノメトリックアッセイを利用する場合
には、２種の異なる別個の抗体が要求される。これら抗
体のうち１つは固相担体に結合せしめられ、他は検出可
能に標識される。本質的には、ＨＴＬＶ‐III ウイルス
に対して特異的な２種の異なる抗体は、ウイルスタンパ
ク質上の別々のドメインと交差反応する。１つの態様に
おいて、２種の異なる抗体は本発明の２種の異なるペプ
チド断片を用いて製造することができる。１つが担体に
結合し、他が検出可能に標識された、異なるペプチド断
片に対する抗体は、様々なサンドイッチアッセイで使用
される。あるいは、同一のペプチド断片を用い、ウサギ
及びマウスのような２種の異なる種で抗血清を産生させ
ることによって、ＨＴＬＶ‐III ウイルスに対し特異的
であるものの別々のドメインと交差反応する抗体を製造
することも可能である。
【００４４】更に、本発明のアッセイで使用される物質
は、キットの製造用として申し分なく適している。この
ようなキットは、バイアル、試験管等のような１以上の
容器手段を密な状態で収納できるように仕切られた運搬
手段からなる。各々の上記容器手段は、アッセイに使用
される別々の要素のうちの１つを含有している。例え
ば、上記容器手段の１つは免疫吸着剤結合ペプチド断片
を含有している。かかる断片は、分離用固相免疫吸着剤
に又は直接容器の内壁に結合せしめられる。第二の容器
は、凍結乾燥形又は溶液として検出可能に標識された抗
‐抗体を含有する。
【００４５】運搬手段は、複数の容器を更に収納するこ
ともでき、その容器の各々は別個の既知量の抗体を含有
している。この場合において、これら後者の容器は標準
曲線を作製するために利用することができ、未知量の抗
体含有のサンプルから得られる結果をこの標準曲線にあ
てはめることができる。
【００４６】本発明の実施により、ＨＴＬＶ‐III 抗体
又はウイルス自体もしくはその一部の存在が生物学的液
体及び組織中で検出される。未知量のＨＴＬＶ‐III 抗
体又はＨＴＬＶ‐III を含有したいかなるサンプルも使
用可能である。通常、サンプルは、液体、例えば尿、唾
液、涙液、髄液、血液、血清等、又は固体もしくは半固
体、例えば組織、糞等である。当業者で公知のように、
ＨＴＬＶ‐III ウイルス及びウイルスに対する抗体は、
Ｔ細胞異常、後天性免疫不全症候群（エイズ，ＡＩＤ
Ｓ）及び前エイズ症状、例えばエイズ関連合併症（ＡＲ
Ｃ）に関与している。更に、ＨＴＬＶ‐III に対する抗
体がヒト又は動物の生物学的液体又は組織の中に存在し
ているかもしれないことも当業者に知られているが、但
しこの場合のヒト又は動物とはエイズ又はＡＲＣにかか
っていないものをいう。
【００４７】本発明のペプチド断片は、ＨＴＬＶ‐III
ウイルスに対するワクチンとしても使用可能である。ペ
プチド断片は、抗体産生を促進させるために、当業者に
一般的に知られているようにして、製造されかつ動物に
投与される。好ましくはヴァクシニアウイルスがＨＴＬ
Ｖ‐III ワクチンの製造のために公知の方法に従い使用
することができる。
【００４８】下記例は、本発明の実施例に際して使用さ
れる物質及び方法を更に詳しく説明するものである。例
はいかなる態様においても発明を制限するものではな
い。例 下記例において、下記のヒト血清は、組換えペプチド断
片の免疫反応性を評価するために使用された。血清は、
エイズもしくはエイズ関連合併症と臨床診断された患者
又はコントロールから得た。各々の血清は、ＨＴＬＶ‐
III ／ＬＡＶｇｐ１６０／１２０抗体に関する基準に基
づき試験した〔エル・ダブル・キッチン（L.W. Kitche
n）ら，ネーチャー，第３１２巻，第３６７−３６９
頁，１９８４年〕。ｇｐ１６０／１２０抗体はいずれの
エイズ患者の血清からも検出されたが、コントロールの
いずれかの血清からも検出されなかった。コントロール
は、エイズの臨床的徴候のない、ほとんどが危険度の低
い個体であった。彼らは、南部、東部、西部の米国都市
及びハイチ出身の男性及び女性の個体；リウマチ因子陽
性人；核抗体（ＡＮＡ）陽性人、経産婦；及び様々な癌
患者であった。エイズ患者は主に同性愛者であったが、
数人の婦人及び子供並びに数例の輸血関連ケースも含ま
れる。エイズ患者はコントロールと同様の地理的分布を
有していた。
【００４９】例１ プラスミドの製造 ｐＪＬＡ１６からのプラスミドｐＪＬＢ０、ｐＪＬＢ１
及びｐＪＬＢ２の製造 図１は、プラスミドｐＪＬＡ１６からのプラスミドｐＪ
ＬＢ０、ｐＪＬＢ１及びｐＪＬＢ２の製造法を示す。プ
ラスミドｐＪＬＡ１６の組立て方は、ローテンベルガー
ら，ジーン・アナリティカル・テクノロジー，第１巻，
第６３−６６頁，１９８４年に記載されている。プラス
ミドｐＪＬＡ１６は、バクテリオファージλＰL プロモ
ーター（ＰL ）、並びにバクテリオファージλＣII遺伝
子由来のシャイン‐ダルガルノ配列及びリーダーペプチ
ドを有している。３つの発現プラスミドベクター、ｐＪ
ＬＢ０、ｐＪＬＢ１及びｐＪＬＢ２を、制限エンドヌク
レアーゼＮｒｕＩによるｐＪＬＡ１６の消化によって製
造した。消化後、長さの異なる３種のＢａｍＨ１リンカ
ーを切断プラスミドに結合させた。このプロセスでは、
各々の翻訳読取り枠におけるＣII細菌性リーダーの末端
に１個のＢａｍＨ１制限部位を配置させる。
【００５０】翻訳ターミネーターをもつプラスミドの製
造 図２において、合成オリゴヌクレオチドを、これは３種
すべての読取り枠中に翻訳ターミネーターを有している
が、まずプラスミドｐＢＲ３２２に組込んでクローニン
グし、次いでＢａｍＨ１クローニング部位の後で３種の
発現ベクターに組込んでシャトル化した。得られたプラ
スミドをｐＪＬＢ０Ｔ、ｐＪＬＢ１Ｔ及びｐＪＬＢ２Ｔ
と命名した。
【００５１】転写リプレッサーを除去したプラスミドの
製造 図３は、ＤＮＡ合成のプライミング（Priming ）に必要
な転写リプレッサーについてコードするプラスミドベク
ター部分の削除法を示す。プラスミドｐＪＬＢ０Ｔ、ｐ
ＪＬＢ１Ｔ及びｐＪＬＢ２Ｔを制限エンドヌクレアーゼ
ＰｖｕII及びＢ ａｌＩで消化した。ブラント末端を結合
し、得られたプラスミドをｐＪＬＢ０ＴＲ、ｐＪＬＢ１
ＴＲ及びｐＪＬＢ２ＴＲと命名した。
【００５２】例２ ｐＬ‐ｃII発現系用の中間クローンの製造 下記プラスミド系ｐＬＣＢＣＯ及びｐＬＣＢＣ００をｐ
ＪＬＡ１６の場合と同様の方法で製造した。これらの製
造法は、シマタケ・エッチ（Shimatake, H. ）ら，ネー
チャー，第２９２巻，第１２８頁，１９８１年；オッペ
ンハイム・エー・ビーら，ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー，第１５８巻，第３２７頁，１９８
２年〔Oppenheim, A.B. et al. Journal of Molecular
Biology,158 : 327 (1982) 〕；ローテンベルガー・ジ
ェイ・エーら，ジーン，第２３巻，第７５頁，１９８３
年〔Lautenberger, J.A. et al., Gene,23: 75(198
3)〕；及び、ローテンベルガー・ジェイ・エーら，ジー
ン・アナリティカル・テクノロジー，第１巻，第６３
頁、１９８４年に記載されている。
【００５３】図４は、ｐＢＲ３２２からのプラスミドΔ
ｐＢＲ２及びΔｐＢＲ４の製造法を示す。プラスミドΔ
ｐＢＲ２において、ＤＮＡ合成開始のリプレッサーは、
制限エンドヌクレアーゼＰｖｕII及びＢａｌIIでｐＢＲ
３２２を消化し、次いでプラスミドを再結合させること
によって除去する。プラスミドΔｐＢＲ４は、制限エン
ドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＢａｌＩで切断してｐＢＲ
３２２からＮｄｅＩ部位を除去することによって製造
し、末端をクレノウ断片でブラント末端化した。ブラン
ト末端を結合し、得られたプラスミドをΔｐＢＲ４と命
名した。
【００５４】図５は、プラスミドΔｐＢＲ４に組込んだ
λｐＬ断片のサブクローニング方法及び得られたプラス
ミドΔｐＢＲ４‐ｐＬを示す。ΔｐＢＲ４‐ｐＬのＨｐ
ａＩ部位は、制限エンドヌクレアーゼＨｐａＩによる消
化とプラスミド及びＰｖｕIIリンカーの結合とによっ
て、ＰｖｕII部位に変換した。
【００５５】図６は、λｃIIシャイン‐ダルガルノ配列
化及びコード化配列をｐＬプロモーターの後にサブクロ
ーニングしてプラスミドΔｐＢＲ４‐ｐＬ‐ｃIIを得る
ことを示す。このプラスミドは、Ｔａｑ１断片としての
発現系の本質的要素の２工程サブクローニングにおいて
使用した。この構造は図７に示されている。次いで、得
られたプラスミドΔｐＢＲ４‐ｐＬ‐ｃII‐ＴａｑＩを
制限エンドヌクレアーゼＢａｍ及びｓａｌＩで切断し
た。消化後、翻訳ポリターミネーターを図８に示されて
いるように加えた。得られたプラスミドをΔｐＢＲ４Ｐ
Ｔ‐ｐＬ‐ｃII‐ＯＳＤと命名した。“ＯＳＤ”とは
“旧シャイン‐ダルガルノ（Old Shine-Dalgarno）”配
列を表わす。“ＯＳＤ”プラスミドを次いでプラスミド
ΔｐＢＲＰＴ‐ｐＬ‐ｃII‐ＮＳＤと同時に修正した
が、後者のプラスミドは図９に示されたように“ＯＳ
Ｄ”プラスミドから製造されたものであって、“新シャ
イン‐ダルガルノ”配列を有している。
【００５６】“ＯＳＤ”及び“ＮＳＤ”プラスミドの発
現配列をそれぞれ図１０で示されたようにプラスミドΔ
ｐＢＲ２に組込んでサブクローニングした。得られたプ
ラスミド上のＣｌａＩ部位をＢａｍＨ１部位に変換した
が、これは発現させるべき遺伝子断片の挿入用として利
用した。ＢａｍＨ１部位は、製造された３種のベクター
の各々において異なる読取り枠中に存在する。プラスミ
ドｐＬＣＢＣＯ、ｐＬＣＢＣ１、及びｐＬＣＢＣ２は新
シャイン‐ダルガルノ配列を有している。プラスミドｐ
ＬＣＢＣ００、ｐＬＣＢＣ１０及びｐＬＣＢＣ２０は上
記プラスミドと同様であるが、元来のｃIIシャイン‐ダ
ルガルノ配列を有している。
【００５７】図１１において、ＢＨ５又はＢＨ８（ＨＴ
ＬＶ‐III サブクローニング；ラトナーら）をランダム
クローニングに供する。この方法では、(1) クローンを
ＡｌｕＩ又はＨａｅIII で部分的に切断し、(2) Ｂａｌ
３１エキソヌクレアーゼ（約１０ｂｐ）を用いる。“ラ
ンダム”は大きさのＤＮＡ断片は、読取り枠に関してラ
ンダムに終結していた。
【００５８】図１３において、制限部位は、切断部位の
３′側に位置する最初のヌクレオチドから番号が付され
ている。
【００５９】図１８及び図１９における＊印は、ＨＴＬ
Ｖ‐III 配列によって完全にコードされている最初のコ
ドンのうち第一塩基を示す。ＨＴＬＶ‐III 配列と発現
ベクターの配列との結合によって生じるコドンは、ＨＴ
ＬＶ‐III 自体に存在するコドンと同一であってもよい
し、そうでなくともよい。図１８において、クローンＦ
の配列６９８７−７００１は“ｎ”として示されてい
る。これらのヌクレオチドは、ＢＨ１０と比べてＢＨ８
では削除されている。この領域におけるＢＨ８の現実の
配列はＴＴＧＧＡＧＴＡであり、即ちヌクレオチド６９
８６の次にヌクレオチド７００２が続いている。ｎは、
ラトナーらにより公表された配列と一致する番号付けを
保持するために記入されている。
【００６０】例３ ランダムクローニング及び直接クローニングの方法 発現用クローンは、ランダムクローニング法及び直接ク
ローニング法を利用して製造した。ランダムクローニング法 ランダムクローニング法の場合では、２種のＨＴＬＶ‐
III サブクローンＢＨ５及びＢＨ８のＤＮＡをＡｌｕＩ
又はＨａｅIII で部分的に消化し、得られた断片の末端
をＢａｌ３１エキソヌクレアーゼでの簡単な消化によっ
て読取り枠に関してランダム化させた。次いで、これら
の断片をプラスミドｐＯＲＦ１〔ウェインストック（We
instock ）ら，プロシーディング・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス，第８０巻，第４４３２
‐４４３６頁，１９８３年〕のＳｍａ１部位に組込んで
クローニングした。（ｐＯＲＦ１及びｐＯＲＦ２は、米
国基準培養寄託機関にそれぞれＡＴＣＣ No.３９１４
７及び３９１４５として寄託されている。）ｐＯＲＦ１
は、ＯＭＰプロモーター、リーダーペプチド、ポリリン
カー及びβ‐ガラクトシダーゼについてコードするＤＮ
Ａ配列を有している。ランダムクローニング法に関して
は図１１に示されている。β‐ガラクトシダーゼに関す
る読取り枠は、ＯＭＰ‐リーダーペプチドのものとは異
なっている。機能的β‐ｇａｌ（Ｘ‐ｇａｌプレート上
に青色コロニーとして示される）は、開環された読取り
枠を有しかつＯＭＰ＋β‐ｇａｌ枠を新たに組込んだＤ
ＮＡ断片がクローニングされた場合にのみ、製造され
る。このクローンＤＮＡでコードされたタンパク質も、
ＯＭＰ‐β‐ｇａｌ三部分融合タンパク質の一部として
発現されさねばならない。
【００６１】Ｓｍａ１消化ｐＯＲＦ１に組込んでクロー
ニングされるランダム化断片で形質転換された大腸菌宿
主ＭＨ３０００を、Ｘ‐ｇａｌプレート上で増殖させ
た。青色及び白色のコロニーが出現したが、青色コロニ
ーを選択した。タンパク質抽出物は、青色コロニーから
得た。５つの陽性クローンは、エイズ患者血清のウエス
ターンブロット（Western blot）分析によるタンパク質
抽出物の評価後に得られた。ＢａｍＨＩ断片をこれら５
つのクローンの各々から単離し、該断片をｐＪＬＢ０に
組込んでクローニングした。このクローンから産生され
るタンパク質をエイズ患者血清を用いるウエスターンイ
ムノブロット法により分析した。
【００６２】直接クローニング法 直接クローニング法の場合では、更に２種のサブクロー
ンがＢＨ８ヌクレオチド５９２４−８５９２のＫｐｎ１
断片をＰＵＣ１９に組込んでサブクローニングすること
により製造された〔ヤニッシュ‐ペロン（Yanish- Perr
on）ら，ジーン，第２６巻，第１０１−１０６頁，１９
８３年（ＰＵＣ１９は米国基準培養寄託機関にＡＴＣＣ
No.３７２５４として寄託されている〕。得られたサ
ブクローンの１つであるＨ３ｅｎｖ１は、ＢＨ８のＫｐ
ｎ１部位たる５９２９番目のヌクレオチドの隣にＰＵＣ
１９のＢａｍＨ１部位を有し、Ｈ３ｅｎｖ２はもう１つ
のＫｐｎ１部位たる８５９７番目のヌクレオチドの隣に
ＢａｍＨ１部位を有する。直接クローニング法は図１２
に示されている。
【００６３】いくつかの制限断片を、ＢａｍＨ１及び／
又はＢａｌIIによるＨ３ｅｎｖ１、Ｈ３ｅｎｖ２及びＢ
Ｈ８の消化後に単離した。これらの制限断片は図１３に
示されている。これらの断片を、適切な読取り枠配列の
ために適切にｐＪＬＢ０Ｔ、ｐＪＬＢ１Ｔ又はｐＪＬＢ
２Ｔに組込んでクローニングした。翻訳は、クローンＣ
及びＤの場合がＨＴＬＶ終結コドンにより終結し、他の
すべてのクローンの場合はポリターミネーターの位置で
終結した。タンパク質発現性及び免疫反応性は、ゲル電
気泳動及びウエスターンブロット法によって分析され
た。
【００６４】例４ 免疫反応性ＨＴＬＶ‐III発現用クローン 第１表は、ｐＪＬプラスミド系の適切なベクターでＨＴ
ＬＶ‐III ペプチドを発現させるためにクローニングさ
れたＨＴＬＶ‐III ヌクレオチド断片を掲載している。
発現用クローンから製造されたペプチドを、ヒト患者血
清からのＨＴＬＶ‐III ウイルスの抗体に対する免疫反
応性に関してスクリーニングした。エンベロープ（ｅｎ
ｖ）クローンＡ及びＥから発現したタンパク質との免疫
反応性は最も強い試験血清においてほとんど検出できな
かったため、これらのクローンをそれ以上試験しなかっ
た。クローンＢ、Ｃ及びＤは、宿主細胞たる大腸菌に対
して極めて高毒性であった。これらのクローンから発現
したＨＴＬＶ‐III タンパク質は最も強い血清において
ほとんど検出しえなかったため、それらをそれ以上試験
しなかった。
【００６５】
【表１】
【００６６】第１表は、ヒト患者血清中のＨＴＬＶ‐II
I ウイルスの抗体に対する免疫反応性に関する各種クロ
ーンから発現されたタンパク質のスクリーニング結果を
示す。第１欄はクローン名を表わし、第２欄は発現され
たペプチド断片についてコードするヌクレオチド配列を
表わす。第３欄は、クローン製造のためのクローニング
法及び出発物質を示す。第４欄において、（＋）の記号
は発現タンパク質がＨＴＬＶ‐III 陽性血清パネルに対
する免疫反応性に関してスクリーニングされたことを示
し、一方（−）記号の発現タンパク質は、高力価エイズ
血清に対する低免疫反応性のために又は宿主細菌に対す
る極度の毒性のためにスクリーニングされなかった。最
後の欄は、クローンが形質転換宿主細胞に対して毒性が
あったことを示し、ここでも、（＋）の記号は宿主細胞
に対する毒性があったことを示し、一方（−）の記号は
クローンが宿主細胞に対して毒性がなかったことを示
す。
【００６７】例５ ＨＴＬＶ‐IIIクローンの血清評価 ５つの発現用クローン（ｇａｇ、ｐｏｌ１、ｐｏｌ２、
ｅｎｖＦ及びｅｎｖＧ）からのＨＴＬＶ‐III ペプチド
を、ヒト血清中におけるＨＴＬＶ‐III ウイルスの抗体
に対するそれらの検出能に関して試験した。これらのク
ローンは第１表に示されており、実験結果は第２表に掲
載されている。被験血清には、エイズＨＴＬＶ‐III ウ
イルスに対して陽性の血清（＋）及びエイズＨＴＬＶ‐
III ウイルスに対して陰性の血清（−）の双方があっ
た。すべての血清をラジオイムノ沈降に基づき特徴付け
た。クローンはウエスターンブロット法により分析し
た。エイズＨＴＬＶ‐III 抗体を含まない血清はいずれ
もクローンと反応しなかった。しかしながら、エイズＨ
ＴＬＶ‐III 抗体に対して陽性のすべての血清はエンベ
ロープ（ｅｎｖ）Ｇクローンと反応した。
【００６８】
【００６９】５つの発現用クローン（ｇａｇ、ｐｏｌ
１、ｐｏｌ２、ｅｎｖＦ及びｅｎｖＧ）からのＨＴＬＶ
‐III ペプチドを、ヒト血清中におけるＨＴＬＶ‐III
ウイルスの抗体に対するそれらの検出能に関して試験し
た。評価された発現用クローンは第１欄に示されている
が、これは第１表の第１欄及び第２欄で既に記載された
ものである。
【００７０】第２欄において、（＋）の記号が後に付さ
れた第一の数値は、ＨＴＬＶ‐IIIの抗体に関して陽性
であることが既知の被検患者血清数である。（−）の記
号が後に付された第二の数値は、陰性であることが既知
の、即ちＨＴＬＶ‐III に対する抗体を含有していなか
った被験血清数である。
【００７１】第３欄は、ＨＴＬＶ‐III の抗体を検出す
る場合におけるペプチドの特異性及び感受性の双方を示
す。最良の結果は、クローンｅｎｖＧの場合に示され、
この場合において９１例すべての被験陽性血清は真に陽
性の結果を示し、８７例すべての被験陰性血清は真に陰
性の結果を示した。これに次ぐ２つの最良の結果はクロ
ーンｐｏｌ１及びｐｏｌ２で示される。これらのクロー
ンにおいて、１７例の被験陽性血清の中で、真の陽性結
果は１４の試験例で得られ、一方偽陰性結果は３つの試
験例で得られた。陰性血清はいずれも真の陰性結果を与
えた。第１のクローンのｇａｇにおいて、５８例の被験
陽性血清中で真の陽性結果は３３の試験例で得られ、一
方偽陰性結果は２５の試験例で得られた。陰性血清はい
ずれも真の陰性結果を与えた。第４のクローンのｅｎｖ
Ｆも同様の結果を与えた。
【００７２】例６ 発現量増加のための修正 クローンＧの発現レベルを高めるために、以下の２つの
異なるアプローチを採択した：i)クローンＧタンパク質
の２つの疎水性領域についてコードするＤＮＡを削除す
る；ii) 高レベルで発現させる別のＨＴＬＶ‐III 配列
にクローンＧ配列を融合させる。クローンＧはＨＴＬＶ
‐III ヌクレオチド７１９９−８０５２を有する。２つ
の疎水性領域は、ほぼ７３５０−７４１８（５′）及び
７８５１−７９１６（３′）でコードされている。３′
疎水性領域は、ＢａｍＨ１でＨ３ｅｎｖ１を直線化し、
かつＢａｌ３１エキソヌクレアーゼでヌクレオチド約２
００個を除去することによって削除した。ＢａｍＨ１リ
ンカーを加え、プラスミドをＤＮＡリガーゼで再環化さ
せた。クローンを選択し、Ｇ‐８、Ｇ‐１２、Ｇ‐２
９、Ｇ‐４４、Ｇ‐４２、Ｇ‐４６、Ｇ‐５６、Ｇ‐７
１、Ｇ‐７９、Ｇ‐８２及びＧ‐８４と命名した。新し
い３′末端部位は地図化されたが、７５００‐７９００
の間に位置していた。これらのクローン由来のＨＴＬＶ
‐III 配列を発現ベクターｐＪＬＢ２Ｔに組込んでサブ
クローニングし、発現レベルを測定した。
【００７３】５′疎水性領域は、オリゴヌクレオチド
５′‐ＴＴＧＴＣＴＧＧＣＣＴＧＴＣＣＴＡＴＴＣＣＣ
ＡＣ‐３′を用いたＭ‐１３部位の突然変異誘発によっ
て削除した。このオリゴはヌクレオチド７３３８−７３
４９及び７４１９−７４３０と相補的であって、コドン
２３個の削除に繋がる。削除されたＤＮＡ配列はｂｐ７
３５０−７４１８である。適切に組立てられたクローン
（ΔＧ）であるか否かはハイブリッド形成及びＤＮＡ配
列決定によって確認し、発現レベルを測定した。
【００７４】二重削除体はＧ‐８及びＧ‐７１の間から
も製造した。Ｇ‐８及びＧ‐７１は、３′末端部位（７
８４０±２０及び７８１０±２０）が３′疎水性ドメイ
ンの開始部の近くに位置していることから選択された。
これらの二重削除体をΔＧ‐８及びΔＧ‐７１と命名
し、それらの発現レベルを測定した。
【００７５】クローンＧは、６８２７番目のヌクレオチ
ドのＡｈａIII 部位まで５′方向に延長させた。Ｂａｍ
Ｈ１リンカーをＡｈａIII 部位に加え、発現性を分析し
た（Ｇ‐Ａ）。Ａｈａ延長体の二重削除体を製造し、発
現性を分析した（ΔＧ‐７１Ａ及びΔＧ‐８Ａ）。クロ
ーンΔＧ‐７１Ａでコードされたアミノ酸配列が決定さ
れ、図２１に示されている。クローンΔＧ‐７１Ａでコ
ードされた現実のアミノ酸配列は、約ｂｐ６８２７−６
９３６、６９５２−７３４９、７４１９−７８０２であ
って、ｂｐ６９３７−６９５１及び７３５０−７４１８
の領域が除かれている。アミノ酸ペプチド配列は下記の
とおりである：
【００７６】
【化８】
【００７７】
【化９】
【００７８】ΔＧ‐７１Ａ及びΔＧ‐８Ａをｅｎｖ‐ｐ
ｏｌ及びｐｏｌ‐ｅｎｖ融合体のようにｐｏｌ発現用ク
ローン５７‐２と融合させた。全構造体からのＨＴＬＶ
‐III ＤＮＡ断片をｐＪＬ発現ベクター系のプラスミド
に組込んでサブクローニングした。大腸菌宿主ＭＺ１を
用いてペプチド断片を発現させた。次いでΔＧ‐７１Ａ
のＨＴＬＶ‐III 配列をクローニングし、３種の発現ベ
クターｐＪＬＢＯＴ、ｐＬＣＢＣＯ及びｐＬＣＢＣＯＯ
において発現させた。これらのクローンをｐ‐ΔＧ７１
Ａ８、ｐ‐ΔＧ７１ＡＣＮ及びｐ‐ΔＧ７１ＡＣと命名
した。３種すべてのクローンは、ΔＧ‐７１Ａに関して
第３表に示された発現量と同レベルで同一のタンパク質
を製造した。ｐ‐ΔＧ７１ＡＣは、細菌宿主ＭＺ１に組
込んでＡＴＣＣに寄託されている。
【００７９】製造されかつ分析されたすべての構造体は
図１４に示されている。相対的発現量は第３表に示され
ている。最大の発現量は、クローンΔＧ‐８、ΔＧ‐７
１、ΔＧ‐８Ａ及びΔＧ‐７１Ａで確認された。
【００８０】要約すると、１個の削除又はＡｈａ延長で
はいずれも発現レベルを有意に高めることはなかった。
しかしながら、二重削除体（ΔＧ‐７１及びΔＧ‐８）
及びこれら二重削除体のＡｈａ延長体はいずれも発現レ
ベルを著しく高めた。ｐｏｌ‐ΔＧ‐７１融合体は、わ
ずかに検出しうるほどタンパク質レベルを高めたにすぎ
なかった。
【００８１】 第３表 発現レベルのまとめ＊ 評価された発現量 （総細菌タンパク クローン 質中の％） Ｇ、Ｇ‐８、Ｇ‐１２、Ｇ‐２９ ＜０．０２％ Ｇ‐４４、Ｇ‐４２、Ｇ‐４６、 Ｇ‐５６、Ｇ‐７１、Ｇ‐７９、 Ｇ‐８２、Ｇ‐８４、ΔＧ、ＧＡ、ΔＧ‐Ａ ΔＧ‐８、ΔＧ‐７１ ５−１０％ ΔＧ‐８Ａ、ΔＧ‐７１Ａ ΔＧ‐７１Ａ：ｐｏｌ ＜０．００５％ｐｏｌ：ΔＧ‐７１Ａ ＊ 上記クローンの地図に関しては図１４を参照せよ
【００８２】例７ クローンの免疫反応性 すべてのクローンの免疫反応性を下記のように試験し
た。細菌培養物をＡ550 ＝０．４となるまでＬブロス中
３２℃で増殖させた。次いで培養物を４２℃で１時間増
殖させた。Ａ550 の値を読み、細菌を遠心分離により回
収した。ＳＤＳゲル含有緩衝液を加え（Ａ550 ＝０．５
の時点で１．５mlにつき０．１ml）、サンプルを沸騰水
浴中に５分間おいた。タンパク質をＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロース上
にブロットし、エイズ患者の高力価血清、または、スク
リーニング目的のためにラジオイムノ沈降法によってＨ
ＴＬＶ‐III 抗体に関してそれぞれ別個に分析した血清
と反応させることにより分析した。
【００８３】例８ タンパク質精製 細菌中で所望のタンパク質を高レベル発現させた場合、
不溶性封入体又は凝集物が形成されることが典型的であ
る。発現された組換えタンパク質を精製するためには、
これらタンパク質の溶解度が高められねばならない。Ｈ
ＴＬＶ‐III 発現用クローンｐ‐ΔＧ７１Ａ８又はｐ‐
ΔＧ７１ＡＣからの組換えタンパク質ΔＧ‐７１Ａを溶
解させ、下記のように精製した。大腸菌ΔＧ７１Ａの培
養物をＡ550 ＝０．５となるまでＬＢブロス中３２℃増
殖させた。ＨＴＬＶ‐III 抗原の発現は培養温度を４２
℃に高めて誘導し、４２℃で９０分間インキュベートし
た。細胞を４０００×ｇで３０分間の遠心分離により回
収し、ＴＢＳで一度洗浄し、１ｍＭ ＰＭＳＦ、５０ｍ
Ｍ ＤＴＴ、０．２％トリトンＸ‐１００及び１０ｍＭ
ＥＤＴＡを含有するｐＨ８．５の５０ｍＭトリスＨＣ
ｌに再懸濁した。次いで細胞をリゾチームでの酵素的消
化及び簡単な超音波処理によって溶解させた。発現した
抗原は不溶性凝集物として存在し、５０００×ｇで３０
分間の遠心分離によって回収することができた。これら
の凝集物を弱い洗剤及び６Ｍ尿素で数回洗浄した。タン
パク質凝集物を１％β‐メルカプトエタノールを含有す
るｐＨ８．５の５０ｍＭトリスＨＣｌ中に８Ｍ尿素で溶
解させた。遊離スルフヒドリル基を室温において１０倍
過剰のヨード酢酸でアルキル化した。アルキル化抗原の
部分的精製は、８Ｍ尿素の存在下で操作されるセファロ
ース６Ｂ‐ＣＬカラムでのゲル瀘過によって実施した。
【００８４】次いで、部分的精製抗原を８Ｍ尿素を含有
するｐＨ８．５のホウ酸緩衝液中においてシトラコニル
化させた。これは、室温で９０分間５０倍モル過剰のシ
トラコン酸無水物で抗原調製物を処理することによって
実施した。シトラコニル化サンプルをｐＨ８．５の０．
１Ｍホウ酸緩衝液に対して大量に透析し、抗原を同一の
緩衝液で平衡化しかつ溶離したフラクトゲル（Fractoge
l ）カラムでのゲル瀘過によって更に精製した。シトラ
コニル化抗原は、分子量３５，０００のタンパク質標準
の溶出位置に相当する位置でカラムから溶出したが、こ
のことは抗原が可溶性一量体分子としてこの緩衝液系中
に存在していることを示していた。他のタンパク質汚染
物質を含有しない画分をプールし、ＥＬＩＳＡ用に使用
した。シトラコニル化抗原は微量滴定プレート上に吸着
させることができたが、固定された抗原はアミノ基の脱
保護化後においてＨＴＬＶ‐III 抗体に対する免疫反応
性を保持していた。固定された抗原のシトラコニル化ア
ミノ基は、各ウェル中への０．１Ｎ酢酸の添加によって
加水分解することができた。酵素結合イムノアッセイ
（ＥＬＩＳＡ）では、同一のアッセイ条件下で脱保護化
タンパク質に関して得られるより高い吸光度から判断す
ると、脱保護化分子の免疫反応性が保護化（シトラコニ
ル化）分子の場合よりも著しく高いことを示した。
【００８５】例９ ＥＬＩＳＡ法の開発 組換えタンパク質以外にＥＬＩＳＡ法の開発で用いられ
たすべての物質は、オルト・ダイアグノスティクス・シ
ステムズ社（Ortho Diagnostics Systems, Inc. ）から
入手した。精製されたΔＧ‐７１ＡをｐＨ８．５の０．
０５ＭトリスＨＣｌ中２Ｍグアニジン塩酸の存在下で最
終タンパク質濃度３．０μｇ／mlに調整した。この抗原
溶液の一部（０．１ml）を４℃で１６時間かけてイムロ
ンII（Immulon II）微量滴定ウェルに結合させた。残っ
たタンパク質溶液をすて、ウェルを２Ｍグアニジン塩酸
で洗浄し、非特異的結合部位を３７℃で２時間１０％Ｂ
ＳＡ ０．１mlに接触させてブロックした。血清を除去
し、ウェルを０．０５％ツイーン２０（Tween 20）含有
ＰＢＳで５回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）と結合したマウスモノクローナル抗ヒトＩｇ
Ｇを加え、３７℃で１時間かけて結合させた。二次抗体
を除去し、ウェルを洗浄し、ｏ‐フェニレンジアミン塩
酸（ＯＰＤ）含有基質溶液を加え、結合ＨＲＰと１５〜
３０分間反応させた。反応を４Ｎ Ｈ２ＳＯ４の添加に
より停止させ、Ａ490 の値をダイナテック(Dynatech）
微量滴定プレートリーダー（reader）で読取った。
【００８６】第４表は、上記方法により得られたＥＬＩ
ＳＡ結果をまとめたものである。そこでは、エイズ及び
コントロールのＥＬＩＳＡ吸光度値が重複せずかつ試験
再現性が許容されうるものであることを示している。カ
ットオフ値を０．３とした場合、このサンプル群では偽
陽性又は偽陰性がなかったであろう。精製された組換え
タンパク質ΔＧ‐７１Ａ及び上記操作を利用して抗ＨＴ
ＬＶ‐III サンプルも同様に試験したが、米国病理学大
学（College of American Pathologists）の基準（セッ
トＷＭ‐Ｂ）に従った。非感染者の血清で希釈されたＨ
ＴＬＶ‐III 感染者のサンプルが３例あった。これら３
つのサンプルは、３回の別々のケースにおいて０．７
０、０．６０及び０．９４以上のＯＤ値を与えた。２例
の陰性サンプルでは０．０４及び０．０６であった。こ
のように、組換えタンパク質ＥＬＩＳＡでは陽性サンプ
ルを容易に確認することができた。
【００８７】
【表２】 ＊ヒト血清はコンサルタントから入手し、ＨＴＬＶ‐II
I ／ＬＡＶｇｐ１６０／１２０抗体に関する基準に基づ
き〔エル・ダブリュー・キッチンら，ネーチャー，第３
１２巻，第３６７−３６９頁，１９８４年〕、及び例９
で述べたＥＬＩＳＡ試験によってΔＧ７１Ａとの反応性
に関して試験した。アッセイ結果が得られた後、その基
準は破られた。
【００８８】上記方法で更に血清を試験したところ、数
例のコントロールサンプルでは非常に高いＡ490 読取り
値（例えば０．６０）を示した。これらのサンプルは、
ラジオイムノ沈降またはウイルスを用いたウエスターン
・ブロットによるとＨＴＬＶ‐III ＬＡＶ抗体を示さ
ず、しかも低リスクの個体から得られたものであった。
したがって、改良法が開発された。ｐＨ８．０の６Ｍグ
アニジン塩酸、５０ｍＭトリス中の精製ΔＧ‐７１Ａを
ｐＨ８．０の２Ｍグアニジン塩酸、５０ｍＭトリスで３
μｇ／mlに希釈し、１００μＬをポリスチレンウェル
〔例えば、イムロンIIウェル（ダイナテック）〕に加え
た。抗原を４〜３７℃で３０分間〜８週間（通常１８時
間）かけて吸着させた。抗原溶液をウェルから除去し、
ｐＨ７．３の１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）及び４〜
１０％正常ヤギ血清（ＮＲＧ）（好ましくは５％）中の
０．１５Ｍ ＮａＣｌ １００μＬ／ウェルを加えた。
次いでウェルを３０〜３９℃で３０分間〜５時間、好ま
しくは２時間インキュベートした。ＰＢＳ及びＮＲＧ溶
液を除去し、ｐＨ８．０の１０ ｍＭ ＥＤＴＡ、１０
ｍＭトリス中の０．５〜１．５ＭＮａＣｌ １００μＬ
／ウェルを加えた。血清５μＬを加え、１８〜３９℃
（好ましくは３７℃）で１５分間〜３時間（好ましくは
１時間）インキュベートした。ウェルを吸引して液体除
去し、脱イオン水中の０．０５％ツイーン２０で４〜５
回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（オルト）で
複合化されたマウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ １０
０μＬを各ウェルに加え、２０〜３９℃で１５分間〜１
時間インキュベートした。ウェルを空にし、脱イオン水
中の０．０５％ツイーン２０で４〜５回洗浄した。クエ
ン酸リン酸緩衝液中のｏ‐フェニレンジアミン・２ＨＣ
ｌ基質（オルト）（１００μＬ）を加え、２０〜２２℃
で３０分間反応させた。硫酸（４Ｎ溶液２５μＬ）を加
え、Ａ490 値をダイナテック微量滴定プレートリーダー
で読んだ。コントロール２２３例及びエイズサンプル１
２０例の結果は図２０に示されている。最大のコントロ
ール値は０．２５で、最低のエイズサンプル値は０．４
９であった。したがって、コントロール及びエイズサン
プル間に重複はなかった。例９で用いられたすべての血
清はこのセットに含まれている。コントロール群の平均
標準偏差は０．０５±０．０５であった。コントロール
群には、市販ウイルス抗原ＥＬＩＳＡで偽陽性のサンプ
ルが含まれていた。更に重要なことには、ウイルスとの
ラジオイムノ沈降及びウエスターン・ブロットでＨＴＬ
Ｖ‐III ／ＬＡＶ抗体陽性であると確認された少なくと
も１０例のエイズサンプルがあり、これらはウイルスＥ
ＬＩＳＡによると陰性であったにもかかわらず（サンプ
ル５例はＯＤが０．０５未満で、１０例すべてのサンプ
ルは０．１５未満であった）、組換えＥＬＩＳＡでは陽
性であった（１０例すべてのサンプルは０．４９以上の
吸光度であった）。
【００８９】例１０ シトラコニル化組換えタンパク質による微量滴定プレー
トのコーティング及び脱ブロッキング後におけるＥＬＩ
ＳＡでの利用 Ｓ‐アルキル化又は遊離メルカプトシトラコニル化組換
えＨＴＬＶ‐III 抗原（ｐＨ９．０の２５〜５０ｍＭホ
ウ酸ナトリウム緩衝液中１０μｇタンパク質／mlで５０
μＬ）をポリスチレン微量滴定プレートの各ウェルに加
え、次いで等容量のｐＨ５．５〜５．６の０．１５Ｍク
エン酸ナトリウム緩衝液を加えた。プレートは、アミノ
基からシトラコニル基を完全に加水分解させるために十
分に長い時間をかけてインキュベートした（３７℃で１
６時間又は２５℃で２４時間、遊離アミノ基に関する標
準ＴＮＢＳ試験によって決定される）。反応混合物を吸
引除去後、吸着された組換えタンパク質及びポリスチレ
ン表面自体の非特異的結合部位は、０．０６％ツイーン
２０洗剤含有のｐＨ７．６のＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）純
粋牛血清アルブミン溶液で各ウェルをインキュベートす
ることによりブロックした。溶液を吸引除去し、ウェル
を風乾した。ｐＨ７．６のＰＢＳ緩衝液で適当に希釈さ
れた患者血清の一部をウェルに加え、３７℃で１時間イ
ンキュベートした。過剰の液体を吸引除去し、菌体をｐ
Ｈ７．６のＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。次いで、西洋
ワサビペルオキシダーゼ複合化抗ヒトＩｇＧを加えた。
プレートをインキュベートし、洗浄し、ペルオキシダー
ゼ、発色原及びｏ‐フェニレンジアミン塩酸を加えた。
５５０ｎｍの吸光度を微量滴定プレート分光測定器（ダ
イナテックＭＲ６００）測定した。結果（第５表）は、
すべての ＨＴＬＶ‐III 陽性サンプル（エル・ダブル
・キッチンら，ネーチャー，第３１２巻，第１６６頁，
１９８４年に従いイムノブロット及びラジオイムノ沈降
アッセイによって確認された）が０．４１以上のＥＬＩ
ＳＡ吸光度であるが、６例を除くすべてのサンプルが
１．００以上であることを示した。すべてのＨＴＬＶ‐
III 陰性サンプル、即ちバックグランド吸光度は読取り
値が０．２４未満であった。したがって、カットオフＥ
ＬＩＳＡ読取り値を０．３０と設定した場合には、脱シ
トラコニル化組換えＨＴＬＶ‐III ／ＬＡＶ抗原による
ＥＬＩＳＡ試験は１００％正確であった。
【００９０】組換えＨＴＬＶ‐III タンパク質抗原の脱
シトラコニル化がイムノアッセイでそれらを利用する前
でなければならぬという必要性は、図２１〜２２で証明
される。シトラコニル化組換えＨＴＬＶ‐III タンパク
質抗原の脱ブロッキングは、その免疫反応性の十分な発
現のために必要であったが、しかしながら、シトラコニ
ル化タンパク質であってもＥＬＩＳＡ試験において若干
活性を有することは明らかである。
【００９１】 第５表 ヒト血清中のＨＴＬＶ‐III抗体に関するＥＬＩＳＡアッセイ 患者血清 コントロール血清 サンプル ＥＬＩＳＡ サンプル ＥＬＩＳＡ 読取り値 読取り値 ＣＤＣ−１ ２．１０ ＣＤＣ−３０ ０．１９ ＣＤＣ−５ ２．１０ ＷＭ−７ ０．１２ ＣＤＣ−６ １．９２ ＷＭ−９ ０．１１ ＣＤＣ−８ ２．１０ Ｂ８００ ０．１３ ＣＤＣ−９ １．９８ Ｂ８０５ ０．２２ ＣＤＣ−１１ ２．１０ Ｆ７６８ ０．２１ ＣＤＣ−１３ ２．１０ ＳＫ２−１３ ０．０７ ＣＤＣ−１８ ２．０１ ＵＳＡ−１２ ０．０８ ＣＤＣ−２０ ２．１０ ００８７ ０．２３ ＷＭ−６ １．００ Ａ３４８ ０．１８ ＷＭ−１０ ０．６６ ＳＫ４−ＮＲＰ ０．１９ Ｐ−７ ２．１０ ７６０Ｃ ０．２４ Ｐ−８ ２．１０ Ｎ１ ０．０４ Ｐ−９ ２．１０ Ｎ３ ０．１０ Ｐ−１０ ２．１０ Ｎ１１ ０．０７ ＳＫ２−１５ １．８６ Ｎ１５ ０．０２ ＳＫ２−１１ ２．１０ Ｎ７３ ０．１６ ＳＫ２−１２ ２．１０ Ｎ７５ ０．２９ ＳＫ２−１７ ０．６５ Ｎ８２ ０．０７ ＳＫ３−２ ０．７５ Ｎ８９ ０．０２ ＳＫ３−４ ２．１０ Ｎ１２６ ０．２４ ＳＫ３−５ ０．４１ ＰＬ−４ ０．００ ＳＫ３−９ １．２７ ＯＲＮＥＧ ０．０１ ＳＫ３−１０ ２．１０ ７５−４０８０−０ ０．１３ ＳＫ４−１４ ２．１０ ＨＮ−１４４ ０．０４ ＳＦ−６ １．９７ ２７−０１１２−５ ０．０６ ＵＳＡ−４ ２．１０ ２４−２１７０９ ０．０９ ＵＳＡ−１１ ２．１０ ７５−１９０５−１ ０．０５ ８−０７０７−３ ２．０３ ５４−２３３３−０ ０．０３ １０１−５４５１６ １．４６ ＨＲ−２０１ ０．００ １０７−２１６０３ １．５８ ５８−０８９１−０ ０．０６ ０００２ ０．７３ ＨＲ−４１６ ０．１０ ００５７ ０．８５ ＨＲ−４７３ ０．０９ ０１８９ ２．１０ １７−１１４８−０ ０．２３ ＲＣ １．７０ ２−１３６２−９ ０．０３ＤＲＰＯＳ １．００
【００９２】例１１ ＨＴＬＶ‐IIIエイズウイルスタンパク質の抗体に関す
るラテックス凝集試験 シトラコニル化組換えＨＴＬＶ‐III ペプチド抗原を、
ｐＨ９．０の重炭酸ナトリウム緩衝液中のラテックスビ
ーズ（直径０．６μのビーズの２．５％懸濁液）に、２
５℃で一定に静かに攪拌しながら１６時間インキュベー
トすることにより物理的に吸着させた。次いでシトラコ
ニル基を、ｐＨ４．０の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
による２５℃で１６時間の吸着タンパク質の処理によっ
て除去した。抗原被覆ラテックスビーズを低速での簡単
な遠心分離によって回収し、次いで非特異的結合部位を
ブロックするためにｐＨ７．６のＰＢＳ緩衝液中の１％
牛血清アルブミン‐０．０６％ツイーン２０に再懸濁し
た。再懸濁されたビーズの最終濃度は０．６％であっ
た。被覆ビーズを４℃で保存した。
【００９３】抗体に関する試験は、ガラス製スライド上
で患者血清２５μＬと被覆ラテックスビーズ１５μＬと
を混合し、しかる後２５℃１００ｒｐｍで８分間スライ
ドを回転することによって実施した。抗原に対する抗体
について陽性の結果は被覆ラテックスビーズの凝集によ
って表わされるが、この凝集は肉眼で見ることができ
た。又は、低倍率の顕微鏡が用いられた。かかる５０例
の試験結果は第６表に示されている。ＥＬＩＳＡ試験で
陽性であった２４例の血清のうち２２例は、ラテックス
ビーズ凝集（ＬＢＡ）試験でも陽性であった。残り２例
のサンプルの再試験は、血清が未希釈の状態で用いられ
た場合に陽性であった。ＥＬＩＳＡ試験で陰性の２４例
すべての血清はＬＢＡ試験でも陰性であった。これらの
結果は、血清の１：１０希釈時にはＬＢＡ試験が９２％
の精度かつ１００％の特異性であり、一方血清の未希釈
時には精度及び特異性がいずれも１００％であってＥＬ
ＩＳＡ試験に匹敵することを示している。
【００９４】本開示は本発明に関するすべての必須情報
を含んでいるが、本明細書で引用された多数の文献は発
明の背景及び技術状況を理解する上で助けになるであろ
う。したがって、引用されたすべての文献は参考のため
発明の開示中に組込まれる。しかも前述の発明は、明確
化及び理解の目的で図解及び例により更に詳細に記載さ
れている。ある種の変更及び修正が添付された請求の範
囲のみによって制限されるけれども発明の範囲内で行な
いうることは、明らかであろう。
【００９５】 第６表 ヒト血清中のＨＴＬＶ‐III ／ＬＡＶ抗体に関するラテックスビーズ凝集試験＊ 患者血清 コントロール血清 サンプル 結果* サンプル 結果* Ａ２０８００４ ２＋ ２６ ＮＲ Ａ２０８０６ ４＋ ２７ ＮＲ Ａ２０２４１１ ４＋ ２８ ＮＲ Ａ２０６２１０ ３＋ ２９ ＮＲ Ａ２０６１１０ ３＋ ３０ ＮＲ Ａ１０２００８ ３＋ ３１ ＮＲ Ａ１６１０３ ３＋ ３２ ＮＲ ００３ ４＋ ３３ ＮＲ ０１４ ２＋ ３４ ＮＲ ０１７ １＋ ３５ ＮＲ 陽性コントロール ３＋ ３６ ＮＲ ＲＣ ４＋ ３７ ＮＲ Ｐ５ ２＋ ３８ ＮＲ Ｐ７ ３＋ ３９ ＮＲ Ｐ８ ３＋ ４０ ＮＲ Ｐ９ ４＋ ４１ ＮＲ Ｐ１０ ４＋ ４２ ＮＲ ６２７３ ２＋ ４３ ＮＲ ６３１６ ３＋ ４４ ＮＲ ６２７２ ３＋ ４５ ＮＲ ６３１０ ３＋ ４６ ＮＲ ＳＫ２−１４ ３＋ ４８ ＮＲ ＳＫ２−１７ ＷＲ ４８ ＮＲ ＳＫ２−２１ ＷＲ ４９ ＮＲ ５０ ＮＲ ＊１：１０希釈血清 ＮＲ：反応せず ＋肉眼による主観点評価 ＷＲ：未希釈時に弱い反応
【００９６】（抄 訳） 原明細書第９頁、第１６−１８行、 アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション １２３０１、パークローン、ドライブ、ロックヴィル、
メラリーンド、２０８５２、アメリカ合衆国、 寄託日：１９８６年１月３０日 受託番号：５３４５５ 微生物の表示：大腸菌 ｐΔＧ７１ＡＣ
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＪＬＡ１６からプラスミドｐＪＬＢ０、ｐＪ
ＬＢ１及びｐＪＬＢ２の製造法を示す。
【図２】図１のプラスミドへの翻訳ポリターミネーター
の付加方法、並びに得られたプラスミドｐＪＬＢ０Ｔ、
ｐＪＬＢ１Ｔ及びｐＪＬＢ２Ｔを示す。
【図３】図２のプラスミドからのＤＮＡ合成のプライミ
ング（priming ）に必要な転写リプレッサーの削除法、
並びに得られたプラスミドｐＪＬＢ０ＴＲ、ｐＪＬＢ１
ＴＲ及びｐＪＬＢ２ＴＲを示す。
【図４】ｐＢＲ３２２から中間プラスミドΔｐＢＲ２及
びΔｐＢＲ４の製造法を示す。
【図５】プラスミドΔｐＢＲ４に組込んだλｐＬ断片の
サブクローニング方法を示す。
【図６】ΔｐＢＲ４‐ｐＬ‐ｃIIと呼ばれるプラスミド
が得られる、λｐＬプロモーターの後に位置するλｃII
シャイン‐ダルガルノ（Shine-Dalgarno）配列のサブク
ローニング方法を示す。
【図７】プラスミドΔｐＢＲ４‐ｐＬ‐ｃIIに組込んだ
Ｔａｑ１断片の２工程サブクローニング方法、並びに得
られたプラスミドΔｐＢＲ４‐ｐＬ‐ｃII‐ＴａｑＩと
呼ばれるプラスミドを示す。
【図８】プラスミドΔｐＢＲ４‐ｐＬ‐ｃII‐ＴａｑＩ
への翻訳ポリターミネーターの付加方法、並びに得られ
たプラスミドΔｐＢＲ４ＰＴ‐ｐＬ‐ｃII‐ＯＳＤを示
す。
【図９】図８のプラスミドからのプラスミドΔｐＢＲ４
ＰＴ‐ｐＬ‐ｃII‐ＮＳＤの製造法を示す。
【図１０】図１０は、プラスミドΔｐＢＲ４ＰＴ‐ｐＬ
‐ｃII‐ＮＳＤからのプラスミドｐＬＣＢＣ０、ｐＬＣ
ＢＣ１及びｐＬＣＢＣ２の製造法、並びにプラスミドΔ
ｐＢＲ４ＰＴ‐ｐＬ‐ｃII‐ＯＳＤからのプラスミドｐ
ＬＣＢＣ００、ｐＬＣＢＣ１０及びｐＬＣＢＣ２０の製
造法を示す。
【図１１】クローン発現のためのランダムクローニング
法を示す。
【図１２】クローン発現のための直接クローニング法を
示す。
【図１３】直接クローニング法により得られる制限断片
を示す。制限部位は開裂部位の３′側に第一ヌクレオチ
ドを用いて番号付けしている。
【図１４】発現増加のためのクローンＧへの変換につい
て示す。
【図１５】ＨＴＬＶ‐IIIの特別な免疫診断用領域であ
る６５３−１２１８のヌクレオチド配列を示す。注意：
ＢＨ５はクローン名を表わす；配列の左側に付された数
値はヌクレオチド残基を表わす。
【図１６】ＨＴＬＶ‐IIIの特別な免疫診断用領域であ
る２６００−３９１１のヌクレオチド配列を示す。注
意：ＢＨ５はクローン名を表わす；配列の左側に付され
た数値はヌクレオチド残基を表わす。
【図１７】ＨＴＬＶ‐IIIの特別な免疫診断用領域であ
る２７４３−４２１１のヌクレオチド配列を示す。注
意：ＢＨ５はクローン名を表わす；配列の左側に付され
た数値はヌクレオチド残基を表わす。
【図１８】ＨＴＬＶ‐IIIの特別な免疫診断用領域であ
る６６１９−７１９８のヌクレオチド配列を示す。注
意：ＢＨ８はクローン名を表わす；配列の左側に付され
た数値はヌクレオチド残基を表わす。
【図１９】ＨＴＬＶ‐IIIの特別な免疫診断用領域であ
る７１９９−８０５２のヌクレオチド配列を示す。注
意：ＢＨ８はクローン名を表わす；配列の左側に付され
た数値はヌクレオチド残基を表わす。図１８及び図１９
における＊印はＨＴＬＶ‐III 配列によって完全にコー
ドされている最初のコドンのうち第一塩基を示す。ＨＴ
ＬＶ‐III 配列と発現ベクターの配列との結合によって
作られた追加コドンは、ＨＴＬＶ‐III 自体でみられる
コドンと同一であってもよいし又はそうでなくともよ
い。クローンＦの配列６９８７‐７００１は“ｎ”とし
て示されている。これらのヌクレオチドは、ＢＨ１０に
関してはＢＨ８で削除されている。この領域におけるＢ
Ｈ８の現実の配列はＴＴＧＧＡＧＴＡであり、即ちヌク
レオチド６９８６の次にヌクレオチド７００２が続いて
いる。ｎは、ラトナーらにより公表された配列と一致す
る番号付けを保持するために記入されている。
【図２０】コントロール及びヒト患者双方の血清におけ
る、ペプチド断片ΔＧ‐７１Ａを用いたＥＬＩＳＡアッ
セイについて示す。
【図２１】ＨＴＬＶ‐III免疫反応性タンパク質につい
てコードするクローンΔＧ‐７１Ａの一部のＤＮＡ配列
及び対応するアミノ酸配列を示す。
【図２２】ＨＴＬＶ‐III免疫反応性タンパク質につい
てコードするクローンΔＧ‐７１Ａの一部のＤＮＡ配列
及び対応するアミノ酸配列を示す。
【図２３】図１８及び図１９で示したヌクレオチド配列
であるが、ヌクレオチド６９８６と７００２との間の
“ｎ”が削除されている配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/536 Ｇ０１Ｎ 33/536 Ｃ Ｄ Ｅ 33/569 Ｈ 33/569 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ０７Ｋ 14/155 // Ｃ０７Ｋ 14/155 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ソーン、リチャード、エム アメリカ合衆国マサチューセッツ州、ミル フォード、タングルウッド、ドライブ、４ (72)発明者 マルチアーニ、ダンテ、ジュアン アメリカ合衆国マサチューセッツ州、ホプ キントン、スクール、ストリート、48 (72)発明者 フン、チュン‐ホ アメリカ合衆国マサチューセッツ州、ミル フォード、ウィンザー、ロード、12 (72)発明者 ハゼルタイン、ウィリアム、エー アメリカ合衆国マサチューセッツ州、ケン ブリッジ、マウント、バーノン、ストリー ト、24

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ＨＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗体に免
    疫反応性であって、下記のＨＴＬＶ‐III プロウイルス
    のヌクレオチド配列のヌクレオチド７１８４‐７３３
    ５、ヌクレオチド７４０４‐７８３５及びヌクレオチド
    ７９０２‐８０３７によりコードされるペプチド断片；
    ＨＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗体に免疫反応性であ
    って、下記のヌクレオチド配列のヌクレオチド６８２７
    ‐７３３４、ヌクレオチド７４０４‐７８３５及びヌク
    レオチド７９０２‐８０３７によりコードされるペプチ
    ド断片；並びにＨＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗体に
    免疫反応性であって、ＨＴＬＶ‐III プロウイルスの下
    記のヌクレオチド配列のヌクレオチド６８２７‐７３３
    ４（但しヌクレオチド６９３８はＡの代わりにＣであ
    る）及びヌクレオチド７４０４‐７７８７によりコード
    されるペプチド断片からなる群より選択されるペプチド
    断片に対する抗体： 【化１】
  2. 【請求項２】ＨＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗体に免
    疫反応性であって、下記のＨＴＬＶ‐III プロウイルス
    のヌクレオチド配列のヌクレオチド７１８４‐７３３
    ５、ヌクレオチド７４０４‐７８３５及びヌクレオチド
    ７９０２‐８０３７によりコードされるペプチド断片；
    ＨＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗体に免疫反応性であ
    って、下記のヌクレオチド配列のヌクレオチド６８２７
    ‐７３３４、ヌクレオチド７４０４‐７８３５及びヌク
    レオチド７９０２‐８０３７によりコードされるペプチ
    ド断片；並びにＨＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗体に
    免疫反応性であって、ＨＴＬＶ‐III プロウイルスの下
    記のヌクレオチド配列のヌクレオチド６８２７‐７３３
    ４（但しヌクレオチド６８３８はＡの代わりにＣであ
    る）及びヌクレオチド７４０４‐７７８７によりコード
    されるペプチド断片からなる群より選択されるペプチド
    断片に対する抗体であって、該抗体がモノクローナル抗
    体である抗体： 【化２】
  3. 【請求項３】（ａ）ＨＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗
    体に免疫反応性であって、下記のＨＴＬＶ‐III プロウ
    イルスのヌクレオチド配列のヌクレオチド７１８４‐７
    ３３５、ヌクレオチド７４０４‐７８３５及びヌクレオ
    チド７９０２‐８０３７によりコードされるペプチド断
    片；ＨＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗体に免疫反応性
    であって、下記のヌクレオチド配列のヌクレオチド６８
    ２７‐７３３４、ヌクレオチド７４０４‐７８３５及び
    ヌクレオチド７９０２‐８０３７によりコードされるペ
    プチド断片；並びにＨＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗
    体に免疫反応性であって、下記のＨＴＬＶ‐III プロウ
    イルスのヌクレオチド配列のヌクレオチド６８２７‐７
    ３３４（但しヌクレオチド６８３８はＡの代わりにＣで
    ある）及びヌクレオチド７４０４‐７７８７によりコー
    ドされるペプチド断片からなる群より選択されるペプチ
    ド断片に対する抗体と、ＨＴＬＶ‐III ウイルス又はそ
    の一部を含有している可能性があるサンプルを接触さ
    せ、及び（ｂ）上記ウイルスの存在を検出することから
    なる、ＨＴＬＶ‐III ウイルス又はその一部の検出方
    法： 【化３】
  4. 【請求項４】（ａ）ＨＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗
    体に免疫反応性であって、下記のＨＴＬＶ‐III プロウ
    イルスのヌクレオチド配列のヌクレオチド７１８４‐７
    ３３４、ヌクレオチド７４０４‐７８３５及びヌクレオ
    チド７９０２‐８０３７によりコードされるペプチド断
    片；ＨＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗体に免疫反応性
    であって、下記のヌクレオチド配列のヌクレオチド６８
    ２７‐７３３４、ヌクレオチド７４０４‐７８３５及び
    ヌクレオチド７９０２‐８０３７によりコードされるペ
    プチド断片；並びにＨＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗
    体に免疫反応性であって、ＨＴＬＶ‐III プロウイルス
    の下記のヌクレオチド配列のヌクレオチド６８２７‐７
    ３３４（但しヌクレオチド６８３８はＡの代わりにＣで
    ある）及びヌクレオチド７４０４‐７７８７によりコー
    ドされるペプチド断片からなる群より選択されるペプチ
    ド断片に対する抗体と、ＨＴＬＶ‐III ウイルス又はそ
    の一部を含有している可能性があるサンプルを接触さ
    せ、及び（ｂ）上記ウイルスの存在を検出することから
    なる、ＨＴＬＶ‐III ウイルス又はその一部の検出方法
    であって、 固相免疫吸着剤上に固定された上記ＨＴＬＶ‐III ウイ
    ルス又はその一部に対して特異的な第一抗体と、上記Ｈ
    ＴＬＶ‐III ウイルス又はその一部に対して特異的な検
    出可能に標識された第二抗体あるいは上記第一抗体に対
    する検出可能に標識された抗‐抗体を更に使うことから
    なる方法： 【化４】
  5. 【請求項５】（ａ）ＨＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗
    体に免疫反応性であって、下記のＨＴＬＶ‐III プロウ
    イルスのヌクレオチド配列のヌクレオチド７１８４‐７
    ３３４、ヌクレオチド７４０４‐７８３５及びヌクレオ
    チド７９０２‐８０３７によりコードされるペプチド断
    片；ＨＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗体に免疫反応性
    であって、下記のヌクレオチド配列のヌクレオチド６８
    ２７‐７３３４、ヌクレオチド７４０４‐７８３５及び
    ヌクレオチド７９０２‐８０３７によりコードされるペ
    プチド断片；並びにＨＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗
    体に免疫反応性であって、ＨＴＬＶ‐III プロウイルス
    の下記のヌクレオチド配列のヌクレオチド６８２７‐７
    ３３４（但しヌクレオチド６８３８はＡの代わりにＣで
    ある）及びヌクレオチド７４０４‐７７８７によりコー
    ドされるペプチド断片からなる群より選択されるペプチ
    ド断片に対する抗体と、ＨＴＬＶ‐III ウイルス又はそ
    の一部を含有している可能性があるサンプルを接触さ
    せ、及び （ｂ）上記ウイルスの存在を検出することからなる、Ｈ
    ＴＬＶ‐III ウイルス又はその一部の検出方法であっ
    て、 固相免疫吸着剤上に固定された上記ＨＴＬＶ‐III ウイ
    ルス又はその一部に対して特異的な第一抗体と、上記Ｈ
    ＴＬＶ‐III ウイルス又はその一部に対して特異的な検
    出可能に標識された第二抗体あるいは上記第一抗体に対
    する検出可能に標識された抗‐抗体を更に使い、 上記検出可能に標識された抗体又は上記検出可能に標識
    された抗‐抗体が酵素標識されていて、更に （ｃ）上記固相に固定された上記第一抗体を上記サンプ
    ル及び上記酵素標識抗体又は上記酵素標識抗‐抗体と共
    にインキュベートして各成分を反応させ、 （ｄ）洗浄して、上記固相から未反応物質を除去し、及
    び （ｅ）上記酵素標識と反応しうる指示薬を上記固相に適
    用して、検出可能な酵素‐基質反応を生じさせることか
    らなる方法： 【化５】
  6. 【請求項６】（ａ）ＨＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗
    体に免疫反応性であって、下記のＨＴＬＶ‐III プロウ
    イルスのヌクレオチド配列のヌクレオチド７１８４‐７
    ３３４、ヌクレオチド７４０４‐７８３５及びヌクレオ
    チド７９０２‐８０３７によりコードされるペプチド断
    片；ＨＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗体に免疫反応性
    であって、下記のヌクレオチド配列のヌクレオチド６８
    ２７‐７３３４、ヌクレオチド７４０４‐７８３５及び
    ヌクレオチド７９０２‐８０３７によりコードされるペ
    プチド断片；並びにＨＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗
    体に免疫反応性であって、ＨＴＬＶ‐III プロウイルス
    の下記のヌクレオチド配列のヌクレオチド６８２７‐７
    ３３４（但しヌクレオチド６８３８はＡの代わりにＣで
    ある）及びヌクレオチド７４０４‐７７８７によりコー
    ドされるペプチド断片からなる群より選択されるペプチ
    ド断片に対する抗体と、ＨＴＬＶ‐III ウイルス又はそ
    の一部を含有している可能性があるサンプルを接触さ
    せ、及び（ｂ）上記ウイルスの存在を検出することから
    なる、ＨＴＬＶ‐III ウイルス又はその一部の検出方法
    であって、 固相免疫吸着剤上に固定された上記ＨＴＬＶ‐III ウイ
    ルス又はその一部に対して特異的な第一抗体と、上記Ｈ
    ＴＬＶ‐III ウイルス又はその一部に対して特異的な検
    出可能に標識された第二抗体あるいは上記第一抗体に対
    する検出可能に標識された抗‐抗体を更に使い、 上記検出可能な標識が放射性同位元素標識、蛍光標識、
    化学発光標識及び生物発光標識からなる群より選択され
    る方法： 【化６】
  7. 【請求項７】１以上の容器手段を密な状態で収納するよ
    うに仕切られた運搬手段からなり、第一容器手段が、Ｈ
    ＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗体に免疫反応性であっ
    て、下記のＨＴＬＶ‐III プロウイルスのヌクレオチド
    配列のヌクレオチド７１８４‐７３３４、ヌクレオチド
    ７４０４‐７８３５及びヌクレオチド７９０２‐８０３
    ７によりコードされるペプチド断片；ＨＴＬＶ‐III ウ
    イルスに対する抗体に免疫反応性であって、下記のヌク
    レオチド配列のヌクレオチド６８２７‐７３３４、ヌク
    レオチド７４０４‐７８３５及びヌクレオチド７９０２
    ‐８０３７によりコードされるペプチド断片；並びにＨ
    ＴＬＶ‐III ウイルスに対する抗体に免疫反応性であっ
    て、ＨＴＬＶ‐III プロウイルスの下記のヌクレオチド
    配列のヌクレオチド６８２７‐７３３４（但しヌクレオ
    チド６８３８はＡの代わりにＣである）及びヌクレオチ
    ド７４０４‐７７８７によりコードされるペプチド断片
    からなる群より選択されるペプチド断片に対する第一抗
    体を含有している、サンプル中のＨＴＬＶ‐III ウイル
    ス又はその一部を検出するためのキットであって、 上記抗体が固相免疫吸着剤上に固定されていて、第二容
    器手段が上記第一抗体とは別にＨＴＬＶ‐III ウイルス
    の異なるドメインと交差反応する検出可能に標識された
    第二抗体を含有しているか又は上記第一抗体に対する検
    出可能に標識された抗‐抗体を有しているキット： 【化７】
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Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4956273A (en) * 1985-10-24 1990-09-11 Southwest Foundation For Biomedical Research Synthetic peptides and method of use for diagnosis and vaccination for AIDS and ARC
US5075211A (en) * 1986-03-26 1991-12-24 Genetic Systems Corporation Synthetic antigen for the detection of AIDS-related disease
US4925784A (en) * 1986-04-04 1990-05-15 Hoffmann-La Roche Inc. Expression and purification of an HTLV-III gag/env gene protein
EP0525828A3 (en) * 1986-08-01 1993-02-24 Repligen Corporation Recombinant polypeptides and their uses, including assay for aids virus
US5166050A (en) * 1986-08-20 1992-11-24 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies and peptides useful in treating and diagnosing HIV infections
NZ221440A (en) * 1986-08-20 1991-11-26 Genetic Systems Corp Composition containing monoclonal antibodies/peptides useful in treating and diagnosing hiv infections
US5179199A (en) * 1986-10-20 1993-01-12 Genzyme Corporation Protein purification
DE3637253A1 (de) * 1986-11-03 1988-05-05 Behringwerke Ag Latex-agglutinations-verfahren zum nachweis von anti-streptokokken-desoxyribonuclease b
US4940456A (en) * 1987-02-10 1990-07-10 Dan Sibalis Electrolytic transdermal delivery of proteins
AU621051B2 (en) * 1987-04-28 1992-03-05 Amgen, Inc. Method for purifying granulocyte-macrophage colony stimulating factor
US4921787A (en) * 1987-05-01 1990-05-01 Cambridge Bioscience Corporation Detection of antibodies to human immunodeficiency virus by agglutination of antigen coated latex
EP0321606B1 (de) * 1987-12-23 1993-09-29 IMMUNO Aktiengesellschaft Zelluläre amphipatische Proteine in aggregierten Formen und Verfahren zur Herstellung und Reinigung diese Proteine
US6210874B1 (en) 1988-01-27 2001-04-03 Biochem Immunosystems, Inc. Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies
US6214537B1 (en) 1988-01-27 2001-04-10 Biochem Immunosystems, Inc. Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies
US6218102B1 (en) 1988-01-27 2001-04-17 Biochem Immunosystems, Inc. Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies
US5241047A (en) * 1988-12-08 1993-08-31 Biochem Pharma Inc. Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies
DE68921186T2 (de) * 1988-05-31 1995-06-14 Cetus Oncology Corp Verfahren zur gewinnung von heterologe proteine enthaltenden refraktilkörpern aus mikrobiellen wirten.
WO1994029459A1 (en) * 1993-06-04 1994-12-22 Whitehead Institute For Biomedical Research Stress proteins and uses therefor
US4981952A (en) * 1988-10-04 1991-01-01 Eli Lilly And Company Method for the purification of vitamin K-dependent proteins
DE3839020A1 (de) * 1988-11-18 1990-05-23 Roehm Gmbh Fixierung von proteinen an festen traegern
GB8828098D0 (en) * 1988-12-01 1989-01-05 Wellcome Found Peptides
GB8828097D0 (en) * 1988-12-01 1989-01-05 Wellcome Found Peptides
ATE128730T1 (de) * 1988-12-13 1995-10-15 Univ Harvard Prototypische felv-isolate für die verwendung als krankheitsmuster oder impfstoffe.
US5679320A (en) * 1988-12-29 1997-10-21 Bio-Technology General Corp. Fibrin binding domain polypeptides and uses and methods of producing same
US5270030A (en) * 1988-12-29 1993-12-14 Bio-Technology General Corp. Fibrin binding domain polypeptide and method of producing
AU5184190A (en) * 1989-02-23 1990-09-26 University Of Ottawa Polypeptide having immunological activity for use as diagnostic reagent and/or vaccine
US5552302A (en) * 1989-04-24 1996-09-03 Promega Corporation Methods and compositions for production of human recombinant placental ribonuclease inhibitor
US5180820A (en) * 1989-08-30 1993-01-19 Barde Yves Alain Brain-derived neurotrophic factor
US5243027A (en) * 1990-02-26 1993-09-07 Unitika, Ltd. Method of preparing angiotensin converting enzyme inhibitors
US5530100A (en) * 1990-05-07 1996-06-25 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Methods for purification of recombinantly produced proteins
US5258496A (en) * 1990-07-10 1993-11-02 Scios Nova Inc. Isolation and purification of lung surfactant protein
US5235041A (en) * 1990-12-28 1993-08-10 Protein Polymer Technologies, Inc. Purification of structurally ordered recombinant protein polymers
US5389529A (en) * 1991-06-12 1995-02-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified lamβ signal sequence and processes for producing recombinant neurotrophins
US5212091A (en) * 1992-03-02 1993-05-18 Monsanto Company Method of producing tissue factor pathway inhibitor
EP0578472A3 (en) * 1992-07-07 1994-12-21 Sankyo Co Process for the recovery of peptides expressed as fused proteins.
CA2178635C (en) * 1993-12-10 2004-05-25 Yu-Wen Hu Immunofluorescence assay for the detection of antibodies using recombinant antigens in insoluble form
DE4405810A1 (de) 1994-02-23 1995-08-24 Behringwerke Ag Von einem Retrovirus aus der HIV-Gruppe abgeleitete Peptide und deren Verwendung
GB9407182D0 (en) * 1994-04-12 1994-06-08 Raychem Sa Nv Curable adhesive system
FR2726576B1 (fr) * 1994-11-07 1997-01-31 Pf Medicament Production de peptides analogues de peptides hydrophobes, peptide recombinant, sequence d'adn correspondante
JPH1123530A (ja) * 1996-03-28 1999-01-29 Fmc Corp 電気泳動技術に用いる安定な変性剤及びその使用方法
US7157089B1 (en) * 1996-11-26 2007-01-02 Stressgen Biotechnologies Corporation Immune responses using compositions containing stress proteins
US5993627A (en) * 1997-06-24 1999-11-30 Large Scale Biology Corporation Automated system for two-dimensional electrophoresis
US6068993A (en) * 1997-07-02 2000-05-30 Biobras Sa Vector for expression of heterologous protein and methods for extracting recombinant protein and for purifying isolated recombinant insulin
CA2329897A1 (en) 1998-04-28 1999-11-04 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Polysaccharide-antigen conjugates
CA2378097A1 (en) * 1999-07-08 2001-01-18 Stressgen Biotechnologies Corporation Induction of a th1-like response in vitro
NZ518095A (en) * 1999-10-27 2003-09-26 Innogenetics N Redox reversible HCV proteins with native-like conformation
SE9904272D0 (sv) * 1999-11-25 1999-11-25 Amersham Pharm Biotech Ab A method for selective removal of a substance from samples containing compounds having nucleic acid structure
US6964851B2 (en) * 1999-12-07 2005-11-15 Stressgen Biotechnologies Corp. Compositions and methods for detecting stress-inducible proteins
JP2003519668A (ja) * 2000-01-14 2003-06-24 ホワイトヘッド インスチチュート フォアー バイオメディカル リサーチ 熱ショックタンパク質融合タンパク質による、ｃｄ４＋ｔ細胞非依存性のインビボｃｔｌ惹起による個別ａｔｐ結合ドメインのマッピング
DK1296711T3 (da) * 2000-06-26 2006-08-28 Stressgen Biotechnologies Corp HPV-E7 til behandling af humant papillomavirus
AU2001273348A1 (en) * 2000-07-10 2002-01-21 Diosynth Rtp, Inc. Purification of human troponin i
DE10044360A1 (de) * 2000-09-08 2002-03-21 Merck Patent Gmbh Verfahren zur Aufreinigung von rekombinanten als unlösliche Aggregate exprimierte Proteinen
US6921534B2 (en) * 2001-02-05 2005-07-26 Stressgen Biotechnologies Corporation Hepatitis B virus treatment
US20030105017A1 (en) * 2001-07-10 2003-06-05 Gregory Conn Purification of human Troponin I
US6713272B2 (en) * 2001-09-19 2004-03-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Attachment of biomolecules to hydrophobic surfaces
NZ535754A (en) * 2002-03-15 2007-01-26 Wyeth Corp Mutants of the P4 protein of nontypable haemophilus influenzae with reduced enzymatic activity
WO2004048530A2 (en) * 2002-11-22 2004-06-10 Carnegie Mellon University Compositions and methods for the reversible capture of biomolecules
WO2004056872A1 (ja) * 2002-12-20 2004-07-08 Mitsubishi Pharma Corporation タンパク質のチオール基を保護する方法
NL1025149C2 (nl) * 2003-12-30 2005-07-04 Univ Delft Tech Werkwijze voor het produceren van een fermentatieproduct uit een organisme.
US20070287828A1 (en) * 2005-02-18 2007-12-13 Minden Jonathan S Compositions and Methods for the Reversible Capture of Biomolecules
IES20050816A2 (en) * 2005-12-06 2007-05-16 Trinity Res Ltd A method for preparing microbeads for use in an assay for determining the presence of antibodies to human immunodeficiency virus in a sample
US20080125580A1 (en) * 2006-07-14 2008-05-29 Genentech, Inc. Refolding of Recombinant Proteins
WO2009114520A2 (en) * 2008-03-10 2009-09-17 Pharmain Corporation Compositions for treatment with metallopeptidases, methods of making and using the same
WO2011109556A2 (en) * 2010-03-04 2011-09-09 Pfenex Inc. Method for producing soluble recombinant interferon protein without denaturing
PL394619A1 (pl) * 2011-04-19 2012-10-22 Miedzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej I Komórkowej Sposób proteolizy, peptydaza, kompozycja do stosowania jako srodek bakteriostatyczny lub bakteriobójczy, zestaw oraz zastosowania aktywnej formy LytM z S. aureus lub jej pochodnej
MX2021009264A (es) * 2019-01-30 2021-08-24 Regeneron Pharma Metodo de caracterizacion de particulas visibles y/o subvisibles en agentes biologicos.

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4021303A (en) * 1972-11-10 1977-05-03 Dai-Nippon Sugar Manufacturing Co., Ltd. Method for treatment of microorganisms
BE821053A (fr) * 1974-08-01 1975-04-14 Produit pour diagnostic par determination immunochimique
GB1549069A (en) * 1976-12-10 1979-08-01 Erba Farmitalia Enzyme linked immunoassay
US4168262A (en) * 1978-03-13 1979-09-18 Cornell Research Foundation, Inc. Anhydride modified microbial protein having reduced nucleic acid levels
US4551502A (en) * 1979-09-14 1985-11-05 Howell Bobby A Macromolecular complexes of amidocarbonylic water-soluble polymers and square platinous and equivalent organometallics
US4350764A (en) * 1980-03-10 1982-09-21 The Regents Of The University Of California Microbiological synthesis of beta endorphin
US4348479A (en) * 1980-08-18 1982-09-07 Cornell Research Foundation, Inc. Recovery of proteinaceous material having reduced nucleic acid levels
US4427580A (en) * 1982-09-01 1984-01-24 Cornell Research Foundation, Inc. Method for separation and recovery of proteins and nucleic acids from nucleoproteins using water destructuring salts
US4518526A (en) * 1982-12-22 1985-05-21 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4512922A (en) * 1982-12-22 1985-04-23 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4599197A (en) * 1982-12-22 1986-07-08 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4511502A (en) * 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
GR79124B (ja) * 1982-12-22 1984-10-02 Genentech Inc
US4511503A (en) * 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
JPS59224565A (ja) * 1983-04-28 1984-12-17 Morinaga Milk Ind Co Ltd 抗原検出用試薬
GB8324800D0 (en) * 1983-09-15 1983-10-19 Pasteur Institut Antigens
JPS6061534A (ja) * 1983-09-16 1985-04-09 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 成人ｔ細胞白血病ウイルス抗原ペプチド
US4701416A (en) * 1983-12-09 1987-10-20 Cetus Corporation Feline leukemia virus vaccine plasmids for fusion protein of the gp70 envelope protein of FELV
US4520113A (en) * 1984-04-23 1985-05-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Serological detection of antibodies to HTLV-III in sera of patients with AIDS and pre-AIDS conditions
NZ228756A (en) * 1984-04-23 1990-10-26 Us Health Detection of hiv antigen using competition immune assay or western blot assay
DE3432196A1 (de) * 1984-09-01 1986-03-06 Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim Neues mechanisches aufschlussverfahren von bakterienzellen zur isolierung von rekombinant hergestellten peptiden
KR930000189B1 (ko) * 1984-10-18 1993-01-11 앵스뛰띠 빠스뙤르 임파선증과 후천성 면역 결핍증 바이러스의 항원을 제조하는 방법 및 이 항원에 대한 항체의 생산 방법
CA1341482C (en) * 1984-10-31 2005-05-10 Paul A. Luciw Process for preparing fragments of aids-associated retroviruses
US4725669A (en) * 1984-11-09 1988-02-16 President And Fellows Of Harvard College Assay for detecting infection by human T-cell lymphotropic virus-III
ATE138100T1 (de) * 1984-12-24 1996-06-15 Genentech Inc Fusionen von aids-verwandten polypeptiden
US4774175A (en) * 1985-03-01 1988-09-27 Centocor, Inc. Immunochemical methods for the detection of antibody against HTLV-III
IE64785B1 (en) * 1985-04-08 1995-09-06 Genetic Systems Corp Expression of immunologically reactive viral proteins
FR2580177B2 (fr) * 1985-04-15 1989-06-02 Pasteur Institut Antigenes apparentes a la glycoproteine d'enveloppe du virus du sida, notamment precurseurs de cette glycoproteine, procedes d'obtention de ces antigenes et moyens mis en oeuvre dans ces procedes, applications de ces antigenes a la preparation de compositions immunogenes ou pour le diagnostic du sida ou des affections qui lui sont apparentees
DK171119B1 (da) * 1985-04-19 1996-06-17 Hoffmann La Roche AIDS-viruskappeprotein, ekspressionsvektor bærende viruskappeproteinet, transformanter transformeret med ekspressionsvektoren, fremgangsmåde til fremstilling af viruskappeproteinet, fremgangsmåde til detektion af AIDS-antistoffer, fremgangsmåde til bestemmelse af AIDS-virus, vaccine mod AIDS, antistoffer mod viruskappeproteinet samt anvendelse af dette til fremstilling af en vaccine og til testnin
WO1986006414A1 (en) * 1985-04-29 1986-11-06 Genetic Systems Corporation Synthetic antigens for the detection of aids-related disease
US4629783A (en) * 1985-04-29 1986-12-16 Genetic Systems Corporation Synthetic antigen for the detection of AIDS-related disease
US4661445A (en) * 1985-05-24 1987-04-28 Saxinger W Carl Competitive ELISA for the detection of HTLV-III antibodies
NZ217645A (en) * 1985-09-25 1991-11-26 Oncogen Recombinant viruses expressing lav/htlv-iii related epitopes and vaccine formulations

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