JPH0412713B2 - - Google Patents
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- JPH0412713B2 JPH0412713B2 JP62224083A JP22408387A JPH0412713B2 JP H0412713 B2 JPH0412713 B2 JP H0412713B2 JP 62224083 A JP62224083 A JP 62224083A JP 22408387 A JP22408387 A JP 22408387A JP H0412713 B2 JPH0412713 B2 JP H0412713B2
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- bacterial cells
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチレー
ト（以下 Ｂ成分 と記す）およびＤ−（−）−３
−ヒドロキシバリレート（以下 Ｖ成分 と記
す）を含有する共重合体の製造法に関し、さらに
詳細には、Ｂ成分とＶ成分との割合を広い範囲で
任意に制御でき、かつ、高収率でこの共重合体を
得る製造法に係わる。 〔従来の技術、発明が解決しようとする問題点〕 ポリ−３−ヒドロキシブチレート（以下
PHB と記すこともある）は、エネルギー貯蔵
物質として数多くの微生物の菌体内に生成、蓄積
され、優れた生物分解性と生体適合性とを示す熱
可塑性高分子であることから、環境を保全する
“クリーン”プラスチツクとして注目され、手術
糸や骨折固定用材などの医用材料および医薬や農
薬を徐々に放出する除放性システムなどの多方面
への応用が長年にわたり期待されてきた。特に近
年、合成プラスチツクが環境汚染や資源環境の観
点から深刻な社会問題となるに至り、PHBは石
油に依存しないバイオポリマーとして注目されて
いる。 しかしながら、PHBは耐衝撃性に劣るという
物性上の問題とともに、生産コストが高いことな
どから、工業的生産が見送られてきた。 近時、Ｂ成分およびＶ成分を含有する共重合体
およびその製造法について、研究、開発がなさ
れ、たとえば、特開昭57−150393号公報および特
開昭59−220192号公報にそれぞれ記載されてい
る。 これらの公報における共重合体の製造法は、従
来のPHBの製造法におけると同様に、前段では
菌体を増殖させ、後段では窒素またはりんを制限
して微生物を培養して、共重合体を製造するもの
である。 しかしながら、前者では、後段の培養において
基質として、たとえば、プロピオン酸およびイソ
ー酢酸を使用することにより、Ｂ成分99.9〜50モ
ル％と、たとえば、Ｖ成分のような他のエステル
成分0.1〜50モル％とを含む共重合体を製造する
との記載がある。しかしながら、この公報におい
ては、たとえば、実施例では、他のエステル成分
として最高33モル％のＶ成分を含む共重合体しか
示されておらず、Ｖ成分がこれよりも多い共重合
体は具体的には示されてはいない。 一方、後者では、後段の培養において、PHB
抽出後の廃菌体の細胞物質からの炭素を利用し
て、少なくとも40モル％のＢ成分と他のエステル
成分とを含む共重合体を製造するとの定性的な記
載がある。しかしながら、この公報には、Ｂ成分
とＶ成分との割合を具体的に示した共重合体は全
く配載されていない。また、この方法は煩雑であ
り、かつ、細胞物質の成分は、培養条件などによ
り物質の種類および量などに大幅な変動があり不
安定であつて、実際的ではない。 一方、本発明者は、さきに、Ｂ成分とＶ成分と
を含む共重合体において、Ｖ成分が50モル％以上
の共重合体とその製造法を発明して、日本特許出
願（特開昭63−269989）した。 しかしながら、この発明では、Ｖ成分を50〜95
モル％の範囲で任意に制御できるものの、菌体内
に生成、蓄積される共重合体の収量が充分ではな
く実用には適さなかつた。 〔問題点を解決するための手段、作用〕 本発明者は、吉草酸の使用量を節約し、Ｂ成分
とＶ成分との割合を広い範囲で任意に制御でき、
さらに、共重合体の収量を向上させるべく、鋭意
研鑽を重ねた結果、後段の窒素もしくはりんを制
御して、主として菌体内に、Ｂ成分とＶ成分とを
含有する共重合体を生成、蓄積させる培養におい
て、吉草酸の一部をｎ−酢酸で置き換えることに
より、この菌体内に、Ｂ成分とＶ成分とのモル比
を広い幅で任意に制御された共重合体が高収率で
生成、蓄積されるとの新知見を得て、この新知見
に基づいて本発明に到達した。 すなわち、本発明は、アルカリゲネス属に属し
ポリ−３−ヒドロキシブチレート生産能を有する
細菌を、前段で該菌体を主として増殖させ、後段
で窒素もしくはりんの制限下で該菌体を培養して
該菌体内にＤ−（−）−３−ヒドロキシブチレート
と他のエステル成分とを含有する共重合体を生
成、蓄積させるに際して、後段で(イ)吉草酸もしく
はその誘導体またはこれらの塩と、(ロ)ｎ−酢酸も
しくはその誘導体またはこれらの塩との共存下で
該細菌を培養し、該菌体内にＤ−（−）−３−ヒド
ロキシブチレートおよびＤ−（−）−３−ヒドロキ
シバリレートを含有する共重合体を生成、蓄積さ
せることを特徴とする共重合体の製造法である。 本発明において、共重合体に含有されるＢ成分
およびＶ成分は、それぞれの次の式で示される。 すなわち、 Ｂ成分：−OCH（CH3）CH2CO− Ｖ成分：−OCH（C2H5）CH2CO− 本発明で使用される細菌は、アルカリゲネス属
に属しPHB生産能を有する細菌であればよく、
特に制限はないが、実用上は、たとえば、アルカ
リゲネス フエカリス（Alcaligenes facalis），
アルカリゲネス デニトリフイカンス
（Alcaligenes denitrificans），アルカリゲネス
ラタス（Alcaligenes latus），アルカリゲネス
アクアマリヌス（Alcaligenes aquamarinus）お
よびアルカリゲネス ユウトロフス
（Alcaligenes eutrophus）などが使用される。 これらの菌種に属する菌株の代表例として、ア
ルカリゲネス フエカリス ATCC 8750，アル
カリゲネス デニトリフイカンス サブスペシー
ス キシローススオキシダンス ATCC 15749，
アルカリゲネス ラタス ATCC 29712，アルカ
リゲネス アクアマリヌス ATCC 14400 なら
びにアルカリゲネス ユウトロフス Ｈ−16
ATCC 17699 およびこの Ｈ−16 株の突然変
異株であるアルカリゲネス ユウトロフス
NCIB 11597，同 NCIB 11598，同 NCIB
11599，同 NCIB 11600 などを挙げることが
できる。これらのうち、アルカリゲネス ユウト
ロフス Ｈ−16 ATCC 17699 およびアルカリ
ゲネス ユウトロフス NCIB 11599 が、実用
上、特に好ましい。 アルカリゲネス属に属するこれらの細菌の菌学
的性質は、たとえば、“BERGEY'S MANUAL
OF DETERMINATIVE BACTERIOLOGY：
Eighth Edition，The Williams＆Wilkins
Company／Baltimore”に、また、アルカリゲ
ネス ユウトロフス Ｈ−16 の菌学的性質は、
たとえば、“J.Gen.Microbiol.，115，185〜192
（1979）”にそれぞれ記載されている。 これらの細菌は、従来の製造方法におけると同
様に、主として菌体を増殖させる前段の培養と、
窒素もしくはりんを制限して、主として菌体内に
共重合体を生成、蓄積させる後段の培養の２段で
培養される。 前段の培養は、細菌を増殖させる為の通常の培
養法を適用することができる。すなわち、使用す
る細菌が増殖し得る培地および培養条件を選択、
採用すればよい。 培地成分は、使用する細菌が資化し得る物質で
あればよく、特に制限はないが、実用上は、炭素
源としては、たとえば、メタノール、エタノール
および酢酸などの合成炭素源、二酸化炭素などの
無機炭素源、酵母エキス、糖密、ペポトンおよび
肉エキスなどの天然物、アラビノース、グルコー
ス、マンノース、フラクトースおよびガラクトー
スなどの糖類ならびにソルビトール、マンニトー
ルおよびイノシトールなどの糖アルコールなど、
窒素源としては、たとえば、アンモニア、アンモ
ニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および／
または、たとえば、尿素、コーン・ステイプー・
リカー、ガゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エ
キスなどの有機窒素含有物、また、無機成分とし
ては、たとえば、カルシウム塩、マグネシウム
塩、カリウム塩、ナトリウム塩、りん酸塩、マン
ガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コ
バルト塩、ニツケル塩、クロム塩、ほう素化合物
およびよう素化合物などからそれぞれ選択され
る。 また、必要に応じて、ビタミン類なども使用す
ることができる。 培養条件としては、温度は、たとえば、20〜40
℃程度、好ましく25〜35℃程度とされ、また、PH
は、たとえば、６〜10程度、好ましくは6.5〜9.5
程度とされる。このような条件で好気的に培養さ
れる。 これらの条件をはずして培養した場合には、細
菌の増殖は相対的に悪くはなるが、これらの条件
をはずして培養することを防げない。 培養方式は、回分培養、連続培養または半連続
培養のいずれでもよい。 前段の培養によつて得られた菌体を、さらに、
窒素および／またはりんを制限した条件下で培養
する。 すなわち、前段の培養で得られた培養液から、
無菌菌体を、濾過および遠心分離のような通常の
固液分離手段により分離回収し、この菌体を後段
の培養に付するか、または、前段の培養におい
て、窒素および／またはりんを実質的に枯渇させ
て、乃至は、窒素および／またはりんを少量残存
させて、菌体を分離回収することなく、この培養
液を使用して、後段の培養に移行させることによ
つてもできる。 この後段の培養においては、培地または培養液
に、窒素および／またはりんを実質的に含有させ
ず、乃至は少量含有させて、かつ、(イ)吉草酸、そ
の誘導体もしくはこれらの塩（これらを総称して
吉草酸類と記すこともある）および(ロ)ｎ−酢酸、
その誘導体もしくはこれらの塩（これらを総称し
て ｎ−酪酸類 と記すこともある）を含有させ
る以外は、前段の培養におけると異なる処はな
い。 吉草酸およびその誘導体は、一般式 CH2XCHYCH2CH2COOH （ただし、式中、Ｘは、水素原子、ハロゲン原子
もしくは、ヒドロキシ基、Ｙは、水素原子、ハロ
ゲン原子、ヒドロキシ基もしくはアルキル基を示
す）で表わされ、この誘導体の代表例として、４
−クロロ吉草酸、４−ヒドロキシ吉草酸、４−メ
チル吉草酸、４−エチル吉草酸、５ヒドロキシ吉
草酸および５−クロロ吉草酸などが挙げられる。 吉草酸およびその誘導体のそれぞれの塩の代表
例としてナトリウム塩およびカリウム塩などがあ
る。 ｎ−酪酸およびその誘導体は、一般式 CH2XCH2CH2COOH （ただし、式中、Ｘは、水素原子、ハロゲン原子
もしくはヒドロキシ基）で表され、この誘導体の
代表例として４−クロロｎ−酪酸および４−ヒド
ロキシｎ−酪酸などが挙げられる。ｎ−酢酸およ
びその誘導体のそれぞれの塩の代表例としてナト
リウム塩およびカリウム塩などがある。 吉草酸類およびｎ−酪酸類は、後段の培養にお
ける培地もしくは培養液に含有せしめられる。後
者の場合には、培養の初期乃至終期のどの時点で
もよいが、培養の初期が好ましい。 吉草酸類およびｎ−酪酸類のそれぞれの使用量
は、共重合体を生成させることができ、かつ、細
菌の成育、増殖を阻害しないような量であればよ
く、使用した細菌の菌株および共重合体のＢ成分
に対するＶ成分の所望のモル比などによつて異な
るが、培地中および培養液中の吉草酸類とｎ−酪
酸類との合計の濃度は、通常は、遊離の酸として
培地または培養液１あたり５〜40ｇ程度、好ま
しくは、10〜30ｇ程度とされる。 なお、培地または培養液において、吉草酸類の
割合を大きくする程、また、ｎ−酪酸の割合を小
さくする程、共重合体中のＶ成分のモル比を大き
くすることができる。 この後段の培養においては、炭素源を吉草酸類
とｎ−酪酸との両者のみとしてもよいが、使用し
た微生物が資化し得る他の炭素源−たとえば、グ
ルコース、フラクトース、メタノール、エタノー
ル、酢酸、プロピオン酸および乳酸など−を少量
共存させることもできる。たとえば、グルコール
を共存させる場合には、グルコースの濃度は、高
くても1.5ｇ／程度とされる。 このようにして培養して得られた培養液から、
濾過および遠心分離などの通常の固液分離手段に
よつて菌体を分離回収し、この菌体を洗浄、乾燥
して乾燥菌体を得、または、湿潤菌体から、常法
により、生成された共重合体を、たとえば、クロ
ロホルムのような有機溶剤で抽出し、この抽出液
に、たとえば、ヘキサンのような貧溶媒を加え
て、共重合体を沈澱させる。 〔実施例〕 本発明を、実施例によりさらに具体的に説明す
る。なお、本発明は、これらの実施例に限定され
るものではない。 実施例 １ アルカリゲネス ユウトロフス NCIB 11599
を使用して共重合体を製造した。 すなわち、 前段培養： つぎに組成を有する培地で、前記の微生物を30
℃で24時間培養し、対数増殖期冬期の培養液から
遠心分離により菌体を分離回収した。 前段培養用培地の組成 酵母エキス 10ｇ ポリペプトン 10ｇ 肉エキス ５ｇ （NH4）2SO4 ５ｇ これらを脱イオン水１に溶解し、PH7.0に調
製した。 後段培養： 前段培養で得られた菌体を、つぎの組名を有す
る培地に、１あたり3.5ｇの割合で懸濁させ30
℃で48時間培養し、得られた培養液から遠心分離
により菌体を分離回収した。 後段培養用培地の組成 0.5M りん酸水素カリウム水溶液 39.0ml 0.5M りん酸水素二カリウム水溶液 53.6ml 20wt／Ｖ％硫酸マグネシウム水溶液 1.0ml 炭素源* ミネラル溶液** 1.0ml* 炭酸源としてつぎの量の吉草酸およびｎ−酪酸
をそれぞれ使用した。 吉草酸（ｇ／） ｎ−酪酸（ｇ／） 18 ２ 16 ４ 14 ６ 12 ８ 10 10 ５ 15 ** ミネラル溶液 CoCl2 119.0mg FeCl3 9.7ｇ CaCl2 7.8ｇ NiCl2 118.0mg CrCl2 62.2mg CaSO4 156.4mg を0.1N−HCl １に溶解 これらを脱イオン水１に溶解し、PH7.0に調
製した。 菌体の処理： 後段培養で得られた菌体を蒸溜水で洗浄し、引
続きアセトンで洗浄し、これを減圧乾燥（20℃、
0.1mmHg）して乾燥菌体を得た。 炭素源として前記の〜を使用した場合のそ
れぞれの培養液中の乾燥菌体体重を第１表に示
す。 共重合体の分離回収： このようにして得られた乾燥菌体から、熱クロ
ロホルムで共重合体を抽出し、この抽出液にヘキ
サンを加えて共重合体を沈澱させ、この沈澱を濾
取、乾燥して共重合体を得た。 共重合体の特性： このようにして得られた共重合体の組成、固有
粘度、融解温度および融解熱は、それぞれ、つぎ
のようにして測定した。 すなわち、 組成 ：1H NMRスペクトルによる。 固有粘度〔η〕：30℃、クロロホルム中。 融解温度 Tm：DSC測定による。（昇温速度
10℃／分） 融解熱 ：DSC測定による。 測定結果などを第１表に示す。 なお、本実施例において、炭素源として〜
をそれぞれ使用して得られた共重合体について、
125NH2 13C NMRスペクトルを用いて共重合体
の連鎖分布を求めた。 すなわち、本発明者およびその他らの方法
〔Y.Doi et al.Maclomolecules，19， 2860〜
2864，（1986）〕に従い、カルボニル炭素の多重線
共鳴構造からＢ成分およびＶ成分のダイアド連鎖
分布を決定した。たとえば、の場合には、つぎ
の連鎖分布を持つことが判つた。 すなわち、 BB（ブチレート−ブチレート）連鎖 32％ BV（ブチレート−バリレート）および VB（バリレート−ブチレート）連鎖 48％ VV（バリレート−バリレート）連鎖 20％ この連鎖分布は、共重合体がランダム共重合連
鎖分布を持つことを示している。 比較例 炭素源として、吉草酸を単独で使用し、また
は、吉草酸とグルコースとを併用した他は実施例
１と同様にして行なつた。 すなわち、 吉草酸（ｇ／） グルコース（ｇ／） 20.0 ０ 19.5 0.5 19.0 1.0 18.0 2.0 結果を第１表に示す。
ト（以下 Ｂ成分 と記す）およびＤ−（−）−３
−ヒドロキシバリレート（以下 Ｖ成分 と記
す）を含有する共重合体の製造法に関し、さらに
詳細には、Ｂ成分とＶ成分との割合を広い範囲で
任意に制御でき、かつ、高収率でこの共重合体を
得る製造法に係わる。 〔従来の技術、発明が解決しようとする問題点〕 ポリ−３−ヒドロキシブチレート（以下
PHB と記すこともある）は、エネルギー貯蔵
物質として数多くの微生物の菌体内に生成、蓄積
され、優れた生物分解性と生体適合性とを示す熱
可塑性高分子であることから、環境を保全する
“クリーン”プラスチツクとして注目され、手術
糸や骨折固定用材などの医用材料および医薬や農
薬を徐々に放出する除放性システムなどの多方面
への応用が長年にわたり期待されてきた。特に近
年、合成プラスチツクが環境汚染や資源環境の観
点から深刻な社会問題となるに至り、PHBは石
油に依存しないバイオポリマーとして注目されて
いる。 しかしながら、PHBは耐衝撃性に劣るという
物性上の問題とともに、生産コストが高いことな
どから、工業的生産が見送られてきた。 近時、Ｂ成分およびＶ成分を含有する共重合体
およびその製造法について、研究、開発がなさ
れ、たとえば、特開昭57−150393号公報および特
開昭59−220192号公報にそれぞれ記載されてい
る。 これらの公報における共重合体の製造法は、従
来のPHBの製造法におけると同様に、前段では
菌体を増殖させ、後段では窒素またはりんを制限
して微生物を培養して、共重合体を製造するもの
である。 しかしながら、前者では、後段の培養において
基質として、たとえば、プロピオン酸およびイソ
ー酢酸を使用することにより、Ｂ成分99.9〜50モ
ル％と、たとえば、Ｖ成分のような他のエステル
成分0.1〜50モル％とを含む共重合体を製造する
との記載がある。しかしながら、この公報におい
ては、たとえば、実施例では、他のエステル成分
として最高33モル％のＶ成分を含む共重合体しか
示されておらず、Ｖ成分がこれよりも多い共重合
体は具体的には示されてはいない。 一方、後者では、後段の培養において、PHB
抽出後の廃菌体の細胞物質からの炭素を利用し
て、少なくとも40モル％のＢ成分と他のエステル
成分とを含む共重合体を製造するとの定性的な記
載がある。しかしながら、この公報には、Ｂ成分
とＶ成分との割合を具体的に示した共重合体は全
く配載されていない。また、この方法は煩雑であ
り、かつ、細胞物質の成分は、培養条件などによ
り物質の種類および量などに大幅な変動があり不
安定であつて、実際的ではない。 一方、本発明者は、さきに、Ｂ成分とＶ成分と
を含む共重合体において、Ｖ成分が50モル％以上
の共重合体とその製造法を発明して、日本特許出
願（特開昭63−269989）した。 しかしながら、この発明では、Ｖ成分を50〜95
モル％の範囲で任意に制御できるものの、菌体内
に生成、蓄積される共重合体の収量が充分ではな
く実用には適さなかつた。 〔問題点を解決するための手段、作用〕 本発明者は、吉草酸の使用量を節約し、Ｂ成分
とＶ成分との割合を広い範囲で任意に制御でき、
さらに、共重合体の収量を向上させるべく、鋭意
研鑽を重ねた結果、後段の窒素もしくはりんを制
御して、主として菌体内に、Ｂ成分とＶ成分とを
含有する共重合体を生成、蓄積させる培養におい
て、吉草酸の一部をｎ−酢酸で置き換えることに
より、この菌体内に、Ｂ成分とＶ成分とのモル比
を広い幅で任意に制御された共重合体が高収率で
生成、蓄積されるとの新知見を得て、この新知見
に基づいて本発明に到達した。 すなわち、本発明は、アルカリゲネス属に属し
ポリ−３−ヒドロキシブチレート生産能を有する
細菌を、前段で該菌体を主として増殖させ、後段
で窒素もしくはりんの制限下で該菌体を培養して
該菌体内にＤ−（−）−３−ヒドロキシブチレート
と他のエステル成分とを含有する共重合体を生
成、蓄積させるに際して、後段で(イ)吉草酸もしく
はその誘導体またはこれらの塩と、(ロ)ｎ−酢酸も
しくはその誘導体またはこれらの塩との共存下で
該細菌を培養し、該菌体内にＤ−（−）−３−ヒド
ロキシブチレートおよびＤ−（−）−３−ヒドロキ
シバリレートを含有する共重合体を生成、蓄積さ
せることを特徴とする共重合体の製造法である。 本発明において、共重合体に含有されるＢ成分
およびＶ成分は、それぞれの次の式で示される。 すなわち、 Ｂ成分：−OCH（CH3）CH2CO− Ｖ成分：−OCH（C2H5）CH2CO− 本発明で使用される細菌は、アルカリゲネス属
に属しPHB生産能を有する細菌であればよく、
特に制限はないが、実用上は、たとえば、アルカ
リゲネス フエカリス（Alcaligenes facalis），
アルカリゲネス デニトリフイカンス
（Alcaligenes denitrificans），アルカリゲネス
ラタス（Alcaligenes latus），アルカリゲネス
アクアマリヌス（Alcaligenes aquamarinus）お
よびアルカリゲネス ユウトロフス
（Alcaligenes eutrophus）などが使用される。 これらの菌種に属する菌株の代表例として、ア
ルカリゲネス フエカリス ATCC 8750，アル
カリゲネス デニトリフイカンス サブスペシー
ス キシローススオキシダンス ATCC 15749，
アルカリゲネス ラタス ATCC 29712，アルカ
リゲネス アクアマリヌス ATCC 14400 なら
びにアルカリゲネス ユウトロフス Ｈ−16
ATCC 17699 およびこの Ｈ−16 株の突然変
異株であるアルカリゲネス ユウトロフス
NCIB 11597，同 NCIB 11598，同 NCIB
11599，同 NCIB 11600 などを挙げることが
できる。これらのうち、アルカリゲネス ユウト
ロフス Ｈ−16 ATCC 17699 およびアルカリ
ゲネス ユウトロフス NCIB 11599 が、実用
上、特に好ましい。 アルカリゲネス属に属するこれらの細菌の菌学
的性質は、たとえば、“BERGEY'S MANUAL
OF DETERMINATIVE BACTERIOLOGY：
Eighth Edition，The Williams＆Wilkins
Company／Baltimore”に、また、アルカリゲ
ネス ユウトロフス Ｈ−16 の菌学的性質は、
たとえば、“J.Gen.Microbiol.，115，185〜192
（1979）”にそれぞれ記載されている。 これらの細菌は、従来の製造方法におけると同
様に、主として菌体を増殖させる前段の培養と、
窒素もしくはりんを制限して、主として菌体内に
共重合体を生成、蓄積させる後段の培養の２段で
培養される。 前段の培養は、細菌を増殖させる為の通常の培
養法を適用することができる。すなわち、使用す
る細菌が増殖し得る培地および培養条件を選択、
採用すればよい。 培地成分は、使用する細菌が資化し得る物質で
あればよく、特に制限はないが、実用上は、炭素
源としては、たとえば、メタノール、エタノール
および酢酸などの合成炭素源、二酸化炭素などの
無機炭素源、酵母エキス、糖密、ペポトンおよび
肉エキスなどの天然物、アラビノース、グルコー
ス、マンノース、フラクトースおよびガラクトー
スなどの糖類ならびにソルビトール、マンニトー
ルおよびイノシトールなどの糖アルコールなど、
窒素源としては、たとえば、アンモニア、アンモ
ニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および／
または、たとえば、尿素、コーン・ステイプー・
リカー、ガゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エ
キスなどの有機窒素含有物、また、無機成分とし
ては、たとえば、カルシウム塩、マグネシウム
塩、カリウム塩、ナトリウム塩、りん酸塩、マン
ガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コ
バルト塩、ニツケル塩、クロム塩、ほう素化合物
およびよう素化合物などからそれぞれ選択され
る。 また、必要に応じて、ビタミン類なども使用す
ることができる。 培養条件としては、温度は、たとえば、20〜40
℃程度、好ましく25〜35℃程度とされ、また、PH
は、たとえば、６〜10程度、好ましくは6.5〜9.5
程度とされる。このような条件で好気的に培養さ
れる。 これらの条件をはずして培養した場合には、細
菌の増殖は相対的に悪くはなるが、これらの条件
をはずして培養することを防げない。 培養方式は、回分培養、連続培養または半連続
培養のいずれでもよい。 前段の培養によつて得られた菌体を、さらに、
窒素および／またはりんを制限した条件下で培養
する。 すなわち、前段の培養で得られた培養液から、
無菌菌体を、濾過および遠心分離のような通常の
固液分離手段により分離回収し、この菌体を後段
の培養に付するか、または、前段の培養におい
て、窒素および／またはりんを実質的に枯渇させ
て、乃至は、窒素および／またはりんを少量残存
させて、菌体を分離回収することなく、この培養
液を使用して、後段の培養に移行させることによ
つてもできる。 この後段の培養においては、培地または培養液
に、窒素および／またはりんを実質的に含有させ
ず、乃至は少量含有させて、かつ、(イ)吉草酸、そ
の誘導体もしくはこれらの塩（これらを総称して
吉草酸類と記すこともある）および(ロ)ｎ−酢酸、
その誘導体もしくはこれらの塩（これらを総称し
て ｎ−酪酸類 と記すこともある）を含有させ
る以外は、前段の培養におけると異なる処はな
い。 吉草酸およびその誘導体は、一般式 CH2XCHYCH2CH2COOH （ただし、式中、Ｘは、水素原子、ハロゲン原子
もしくは、ヒドロキシ基、Ｙは、水素原子、ハロ
ゲン原子、ヒドロキシ基もしくはアルキル基を示
す）で表わされ、この誘導体の代表例として、４
−クロロ吉草酸、４−ヒドロキシ吉草酸、４−メ
チル吉草酸、４−エチル吉草酸、５ヒドロキシ吉
草酸および５−クロロ吉草酸などが挙げられる。 吉草酸およびその誘導体のそれぞれの塩の代表
例としてナトリウム塩およびカリウム塩などがあ
る。 ｎ−酪酸およびその誘導体は、一般式 CH2XCH2CH2COOH （ただし、式中、Ｘは、水素原子、ハロゲン原子
もしくはヒドロキシ基）で表され、この誘導体の
代表例として４−クロロｎ−酪酸および４−ヒド
ロキシｎ−酪酸などが挙げられる。ｎ−酢酸およ
びその誘導体のそれぞれの塩の代表例としてナト
リウム塩およびカリウム塩などがある。 吉草酸類およびｎ−酪酸類は、後段の培養にお
ける培地もしくは培養液に含有せしめられる。後
者の場合には、培養の初期乃至終期のどの時点で
もよいが、培養の初期が好ましい。 吉草酸類およびｎ−酪酸類のそれぞれの使用量
は、共重合体を生成させることができ、かつ、細
菌の成育、増殖を阻害しないような量であればよ
く、使用した細菌の菌株および共重合体のＢ成分
に対するＶ成分の所望のモル比などによつて異な
るが、培地中および培養液中の吉草酸類とｎ−酪
酸類との合計の濃度は、通常は、遊離の酸として
培地または培養液１あたり５〜40ｇ程度、好ま
しくは、10〜30ｇ程度とされる。 なお、培地または培養液において、吉草酸類の
割合を大きくする程、また、ｎ−酪酸の割合を小
さくする程、共重合体中のＶ成分のモル比を大き
くすることができる。 この後段の培養においては、炭素源を吉草酸類
とｎ−酪酸との両者のみとしてもよいが、使用し
た微生物が資化し得る他の炭素源−たとえば、グ
ルコース、フラクトース、メタノール、エタノー
ル、酢酸、プロピオン酸および乳酸など−を少量
共存させることもできる。たとえば、グルコール
を共存させる場合には、グルコースの濃度は、高
くても1.5ｇ／程度とされる。 このようにして培養して得られた培養液から、
濾過および遠心分離などの通常の固液分離手段に
よつて菌体を分離回収し、この菌体を洗浄、乾燥
して乾燥菌体を得、または、湿潤菌体から、常法
により、生成された共重合体を、たとえば、クロ
ロホルムのような有機溶剤で抽出し、この抽出液
に、たとえば、ヘキサンのような貧溶媒を加え
て、共重合体を沈澱させる。 〔実施例〕 本発明を、実施例によりさらに具体的に説明す
る。なお、本発明は、これらの実施例に限定され
るものではない。 実施例 １ アルカリゲネス ユウトロフス NCIB 11599
を使用して共重合体を製造した。 すなわち、 前段培養： つぎに組成を有する培地で、前記の微生物を30
℃で24時間培養し、対数増殖期冬期の培養液から
遠心分離により菌体を分離回収した。 前段培養用培地の組成 酵母エキス 10ｇ ポリペプトン 10ｇ 肉エキス ５ｇ （NH4）2SO4 ５ｇ これらを脱イオン水１に溶解し、PH7.0に調
製した。 後段培養： 前段培養で得られた菌体を、つぎの組名を有す
る培地に、１あたり3.5ｇの割合で懸濁させ30
℃で48時間培養し、得られた培養液から遠心分離
により菌体を分離回収した。 後段培養用培地の組成 0.5M りん酸水素カリウム水溶液 39.0ml 0.5M りん酸水素二カリウム水溶液 53.6ml 20wt／Ｖ％硫酸マグネシウム水溶液 1.0ml 炭素源* ミネラル溶液** 1.0ml* 炭酸源としてつぎの量の吉草酸およびｎ−酪酸
をそれぞれ使用した。 吉草酸（ｇ／） ｎ−酪酸（ｇ／） 18 ２ 16 ４ 14 ６ 12 ８ 10 10 ５ 15 ** ミネラル溶液 CoCl2 119.0mg FeCl3 9.7ｇ CaCl2 7.8ｇ NiCl2 118.0mg CrCl2 62.2mg CaSO4 156.4mg を0.1N−HCl １に溶解 これらを脱イオン水１に溶解し、PH7.0に調
製した。 菌体の処理： 後段培養で得られた菌体を蒸溜水で洗浄し、引
続きアセトンで洗浄し、これを減圧乾燥（20℃、
0.1mmHg）して乾燥菌体を得た。 炭素源として前記の〜を使用した場合のそ
れぞれの培養液中の乾燥菌体体重を第１表に示
す。 共重合体の分離回収： このようにして得られた乾燥菌体から、熱クロ
ロホルムで共重合体を抽出し、この抽出液にヘキ
サンを加えて共重合体を沈澱させ、この沈澱を濾
取、乾燥して共重合体を得た。 共重合体の特性： このようにして得られた共重合体の組成、固有
粘度、融解温度および融解熱は、それぞれ、つぎ
のようにして測定した。 すなわち、 組成 ：1H NMRスペクトルによる。 固有粘度〔η〕：30℃、クロロホルム中。 融解温度 Tm：DSC測定による。（昇温速度
10℃／分） 融解熱 ：DSC測定による。 測定結果などを第１表に示す。 なお、本実施例において、炭素源として〜
をそれぞれ使用して得られた共重合体について、
125NH2 13C NMRスペクトルを用いて共重合体
の連鎖分布を求めた。 すなわち、本発明者およびその他らの方法
〔Y.Doi et al.Maclomolecules，19， 2860〜
2864，（1986）〕に従い、カルボニル炭素の多重線
共鳴構造からＢ成分およびＶ成分のダイアド連鎖
分布を決定した。たとえば、の場合には、つぎ
の連鎖分布を持つことが判つた。 すなわち、 BB（ブチレート−ブチレート）連鎖 32％ BV（ブチレート−バリレート）および VB（バリレート−ブチレート）連鎖 48％ VV（バリレート−バリレート）連鎖 20％ この連鎖分布は、共重合体がランダム共重合連
鎖分布を持つことを示している。 比較例 炭素源として、吉草酸を単独で使用し、また
は、吉草酸とグルコースとを併用した他は実施例
１と同様にして行なつた。 すなわち、 吉草酸（ｇ／） グルコース（ｇ／） 20.0 ０ 19.5 0.5 19.0 1.0 18.0 2.0 結果を第１表に示す。
本発明の製造によつて、共重合体のＢ成分に対
するＶ成分のモル比を広い幅で任意に調節するこ
とができ、したがつて、Ｂ成分にたいするＶ成分
のモル比が大きい共重合体も得られ、さらに、共
重合体を高収率で得ることができる。 本発明で得られる共重合体は、Ｄ−（−）−３−
ヒドロキシブチレートのみから成るポリ−３−ヒ
ドロキシブチレートに比べ、融解温度は低下し、
融解温度の安定性が大きくなり、かつ、結晶化度
が小さくなるため、強度的に優れ、紡糸および圧
延などの成形が容易で、しかも、安定し、また、
得られた繊維およびフイルムなどの完成品はしな
やかで、しかも、強靭となる。 また、本発明で得られる共重合体は、前記のよ
うに、優れた諸特性を有しているので、手術糸お
よび骨折用固定材などの医用材料の原料として極
めて好適であり、また、徐放性システムへの利用
などの多方面へ応用される可能性がある。
するＶ成分のモル比を広い幅で任意に調節するこ
とができ、したがつて、Ｂ成分にたいするＶ成分
のモル比が大きい共重合体も得られ、さらに、共
重合体を高収率で得ることができる。 本発明で得られる共重合体は、Ｄ−（−）−３−
ヒドロキシブチレートのみから成るポリ−３−ヒ
ドロキシブチレートに比べ、融解温度は低下し、
融解温度の安定性が大きくなり、かつ、結晶化度
が小さくなるため、強度的に優れ、紡糸および圧
延などの成形が容易で、しかも、安定し、また、
得られた繊維およびフイルムなどの完成品はしな
やかで、しかも、強靭となる。 また、本発明で得られる共重合体は、前記のよ
うに、優れた諸特性を有しているので、手術糸お
よび骨折用固定材などの医用材料の原料として極
めて好適であり、また、徐放性システムへの利用
などの多方面へ応用される可能性がある。
Claims (1)
- １ アルカリゲネス属に属し、ポリ−３−ヒドロ
キシブチレート生産能を有する細菌を、前段で該
細菌を主として増殖させ、後段で窒素もしくはり
んの制限下で該細菌を培養して、該菌体内にＤ−
（−）−３−ヒドロキシブチレートと他のエステル
成分とを含有する共重合体を生成、蓄積させるに
際して、後段で(イ)吉草酸もしくはその誘導体また
はこれらの塩と、(ロ)ｎ−酢酸もしくはその誘導体
またはこれらの塩との共存下で該細菌を培養し、
該菌体内にＤ−（−）−３−ヒドロキシブチレート
およびＤ−（−）−３−ヒドロキシバリレートを含
有する共重合体を生成、蓄積させることを特徴と
する共重合体の製造法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62224083A JPS6469622A (en) | 1987-09-09 | 1987-09-09 | Preparation of copolymer |
| EP88106399A EP0288908B1 (en) | 1987-04-28 | 1988-04-21 | Process for production of a random copolymer comprising d-(-)-3-hydroxybutyrate units and d-(-)-3-hydroxyvalerate |
| DE8888106399T DE3875367T2 (de) | 1987-04-28 | 1988-04-21 | Verfahren zur herstellung eines d-(-)-3-hydroxybutyrat- und d-(-)-3-hydroxyvalerat-einheiten enthaltenden zufallscopolymers. |
| CA000564973A CA1338142C (en) | 1987-04-28 | 1988-04-25 | Random copolymer comprising d-(-)-3-hydroxybutyrate units and d-(-)-3-hydroxyvalerate, and process for production thereof |
| KR1019880004857A KR880012666A (ko) | 1987-04-28 | 1988-04-28 | D-(-)-3-히드록시부티레이트 단위 및 d-(-)-3-히드록시발레레이트 단위를 함유하는 랜덤 공중합체 및 그의 제조방법 |
| US07/532,167 US4997909A (en) | 1987-04-28 | 1990-06-05 | Random copolymer comprising D-(-)-3-hydroxybutyrate units and D-(-)-3-hydroxyvalerate, and process for production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62224083A JPS6469622A (en) | 1987-09-09 | 1987-09-09 | Preparation of copolymer |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6469622A JPS6469622A (en) | 1989-03-15 |
| JPH0412713B2 true JPH0412713B2 (ja) | 1992-03-05 |
Family
ID=16808291
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62224083A Granted JPS6469622A (en) | 1987-04-28 | 1987-09-09 | Preparation of copolymer |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6469622A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0475785A3 (en) * | 1990-09-14 | 1993-04-14 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. | Process for preparation of copolymer |
| CN102056962B (zh) | 2008-06-05 | 2013-04-17 | 国立大学法人东京工业大学 | 聚羟基脂肪酸共聚物及其制备方法 |
| TW202212088A (zh) | 2020-06-02 | 2022-04-01 | 日商三菱瓦斯化學股份有限公司 | 伴隨由加熱所成之前處理高分子成形物之製造方法 |
| KR20230018413A (ko) | 2020-06-02 | 2023-02-07 | 미쯔비시 가스 케미칼 컴파니, 인코포레이티드 | 고분자 성형물의 제조방법 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1375143A3 (ru) * | 1981-07-07 | 1988-02-15 | Империал Кемикал Индастриз Плс (Фирма) | Способ получени полимера,содержащего звень - О.СН(СН @ )СН @ СО- |
-
1987
- 1987-09-09 JP JP62224083A patent/JPS6469622A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6469622A (en) | 1989-03-15 |
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