JPH0412957B2 - - Google Patents
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- JPH0412957B2 JPH0412957B2 JP57000906A JP90682A JPH0412957B2 JP H0412957 B2 JPH0412957 B2 JP H0412957B2 JP 57000906 A JP57000906 A JP 57000906A JP 90682 A JP90682 A JP 90682A JP H0412957 B2 JPH0412957 B2 JP H0412957B2
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- Japan
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- culture
- concentration
- ammonium
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- acid
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明はトルロプシス属の酵母を用いてｎ−パ
ラフインからジカルボン酸を発酵生産する際の改
良に関する。 ｎ−パラフインを含む培地中でトルロプシス属
の酵母を好気的に培養して、その培養物から原料
ｎ−パラフインと同一炭素数のジカルボン酸を採
取するジカルボン酸の製造方法については、すで
に本出願人が特公昭55−43759号及び特公昭56−
8595号において提案している。かかる発酵法によ
るジカルボン酸の製造を回分法で行うに当つて
は、ジカルボン酸の生成速度を速めるとともに、
培養液中に蓄積されるジカルボン酸の濃度をでき
るだけ高めることが工業化に際しての大きな課題
となる。本発明者らはそのような観点から一層の
改善を行うべく鋭意検討した結果、以下の方法を
見出すに至つた。すなわち、本発明は、トルロプ
シス属の酵母を用いて好気的な発酵法によりｎ−
パラフインからジカルボン酸を製造する方法にお
いて、窒素源の一部としてアンモニウム塩を使用
し、培養液中におけるアンモニウムイオン濃度を
100ないし700ppmとするとともに、リン酸塩の濃
度をリン酸基として0.1ないし0.4重量％の範囲に
維持し、かつ培養後期における培養液中のアンモ
ニウムイオン濃度を、培養初期のそれより高濃度
となるように培養槽内の培地に窒素源及びリン酸
塩を連続的又は間欠的に加えて培養を行うことを
特徴とするジカルボン酸の製造方法に関する。 一般的な培養方法においては、適当な組成の培
地に最初に微生物を接種しておき、そのまま培養
を続行させる回分培養法が採用されることが多
い。これに対し近年、炭素源、とくにメタノール
などを最初から多量に加えると、微生物の生育に
阻害的に作用する基質を培養経過に応じて連続的
に少量ずつ加えるいわゆる流加培養法が発展して
きた。この流加培養法はまた、パン酵母を製造す
る際などにも採用されており、例えばグルコース
が培地中に多いとアルコールの副生が無視出来な
くなるため、グルコースを少量ずつ添加する方法
が実施されている。 本発明は、トルロプシス属酵母によるジカルボ
ン酸製造において、上記のような炭素源ではなく
広く他の成分について流加培養法の採用による改
善を達成すべく検討した結果、前述の如き特定成
分を流加する方法を見出してなされたものであ
る。 本発明で使用されるトルロプシス属の酵母は、
ｎ−パラフインからジカルボン酸を生産しうる能
力を有しており、例えば前記各公告公報に記載さ
れた菌株から選ぶことができる。 本発明を実施するに当たつて培養物中にジカル
ボン酸を蓄積させるために、ｎ−パラフイン、窒
素源、リン酸源、その他必要な栄養源を含む培地
に、トルロプシス属に属するジカルボン酸生産能
のある酵母を接種し、好気的に培養を行う。 原料ｎ−パラフインとしては、目的とするジカ
ルボン酸と同一炭素数を有するものが好適であ
り、通常炭素数９ないし19程度、とくに10ないし
16程度のものが好ましい。 窒素源としては例えば硝酸アンモニウム、リン
酸アンモニウム、硫酸アンモニウムもしくは塩化
アンモニウムなどの無機窒素源または例えばペプ
トン、カザミノ酸、グルタミン酸、アスパラギン
酸、セリンのようなアミノ酸類、尿素、尿酸もし
くはコンステイープリカーなどの有機窒素源が挙
げられ、これらの一種あるいは二種以上を選択し
て用いる。無機塩類としては例えばリン酸カリウ
ム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
マンガン、硫酸鉄、硫酸亜鉛および塩化カルシウ
ムなどが挙げられる。その他に必要な場合に添加
される栄養源としては、イーストエキス、コーン
ステイープリカー、肉エキス、ビタミンなどが挙
げられ、これらの内から適当なものを選択して用
いる。 培地の好適な１例は10〜400gのｎ−パラフイ
ン、１〜20gの窒素化合物（例えば硫酸アンモニ
ウム）、0.2〜3gのリン酸水素一カリウム、0.2〜
3gのリン酸水素二ナトリウム、0.1〜1gの硫酸マ
グネシウム・七水塩、各々0.1〜20mgの硫酸鉄・
七水塩、硫酸亜鉛・七水塩、硫酸マンガン四水塩
塩、塩化カルシウム、塩化ナトリウムおよび硫酸
銅から選ばれたものおよび100〜1500mgのイース
トエキス、又はコーンステイープリカーを１の
蒸留水、水道水、井戸水等に溶解したものであ
る。 とくに主な窒素源として硫酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩を用い、
アンモニウムイオンの濃度を100ないし700ppm、
好ましくは100ないし400ppmとし、中でも培養初
期においてその濃度を100ないし300ppm、とくに
100ないし200ppm程度とするのが好ましい。また
リン酸基全体として、0.1ないし0.4重量％程度の
濃度に維持するのが好ましい。 本発明においては、培養の途中で窒素源及びリ
ン酸塩を連続的又は間欠的に培地に添加して行く
ことが肝要である。これによりジカルボン酸の蓄
積速度を速めることができるとともに、最高蓄積
濃度をも高めることができる。添加に使用する窒
素源として前記したものから適宜選択することが
できるが、中でも硫酸アンモニウム、リン酸アン
モニウムなどのアンモニウム塩を使用するのが好
ましい。アンモニウム塩を添加する場合には、培
地中の濃度が前記したような範囲とするとともに
培地中におけるジカルボン酸の濃度が25ないし35
ｇ／以上となつた時点ではアンモニウムイオン
としてとくに200ないし400ppm程度の濃度になる
ように添加するのが好ましい。 添加に使用するリン酸塩としては、例えば先に
例示したものから選択するのが好ましく、その添
加速度は、培地中におけるリン酸基としての濃度
が好ましくは0.1ないし0.4重量％程度となるよう
な範囲で選択すればよい。 培養は、前記したような培地を予め高温度で滅
菌した後（例えば120ないし125℃、10ないし20
分）、トルロプシス属に属するジカルボン酸生産
酵母を接種して行うのがよい。培養時のpHは6.5
ないし8.0程度、培養時の温度は25ないし35℃の
範囲がそれぞれ適当であり、振とう培養、通気培
養などの好気的条件で培養を行えばよい。途中で
添加する窒素源及びリン酸塩は、粉末状で加えて
もよいし水溶液の形で添加してもよい。 培養物中に蓄積したジカルボン酸を採取するに
は、例えば遠心分離によつて菌体を除いた後、強
酸で酸性にすることによつてジカルボン酸を遊離
な状態とし、次いでこれをエ−テル等の溶媒で抽
出してから溶媒を留去すればジカルボン酸の粗結
晶を得ることができる。次いで水、エタノール，
トルエンなどの適当な溶媒を用いて再結晶を行う
ことにより、高純度のジカルボン酸を得ることが
できる。 次に実施例を示す。 実施例 １ 硫安4.0g、K2HPO42.0g、KH2PO41.0g、
MgSO4・7H2O0.45g、FeSO4・7H2O0.9mg、
MnSO4・4H2O0.9mg、ZnSO4・7H2O0.9mg、イー
ストエキス0.9g、ビオチン9μgを720mlの水にとか
し、ｎ−トリデカン130mlを２容のミニジヤー
フアーメンターに加えオートクレーブ殺菌後、同
じ組成の培地で前培養したトルロプシスキヤンデ
イダMT1028（FERMPNo.3123号）の懸濁液90ml
を接種し、30℃、通気量0.16VVM、攪拌翼の回
転数500rpmで培養を開始した。 ただし培地のPHは7.4に維持するように水酸化
ナトリウム水溶液を自動的に注入した。 培養開始後21時間目からリン酸カリと硫安を流
加し、培地中の濃度をリン酸として0.1〜0.3％に
保ちつつ、培地中のアンモニアは東興化学（株）
製のアンモニアイオン電極を用いて経時的に測定
し、それに応じて流加用高濃度硫安溶液
（180g／）の供給速度を調節し、硫安濃度を
400〜700ppm（アンモニウムイオンとして109〜
190ppm）に保つて培養を継続した。培養全期間
における硫安溶液の総添加量は30ccであつた。培
養94時間でブラシル酸濃度が42g／と最大にな
つた。ブラシル酸の生産性は0.45g／・hrをえ
た。 比較例 １ 実施例１と同様に培養を開始し、リン酸と硫安
の流加を行わず、通常の回分培養を行つた。培養
105時間でブラシル酸濃度が39g／となつた。
ブラシル酸の生産性は0.35g／・hrであつた。 実施例 ２ 硫安を0.5gとした以外の成分は、実施例１と同
じものを用い、同じように殺菌後、ブラシル酸生
産株を接種し、硫安濃度を500ppm程度（アンモ
ニウムイオンとして136ppm程度）に維持しつつ
実施例１と同様な温度、通気攪拌条件で培養をし
た。培養開始後約60時間目（ブラシル酸が25g／
〜30g／生産された頃）以後硫安濃度を
1000ppm程度（アンモニウムイオンとして
273ppm程度）に制御した。この間培養液中のリ
ン酸は1000ppm付近に維持した。このように硫酸
濃度を段階的に変化させることによつて、98時間
の培養で46.8g／のブラシル酸をえた。この時
の生産性は0.48g／・hrであつた。 なお、硫安を培養初期から終了まで500ppm（ア
ンモニウムイオンとして136ppm）程度に維持し
た時のブラシル酸生産性は0.44g／・hrであつ
た。 実施例 ３ 表１に示した組成の培地を使用しセバシン酸生
産株を接種した以外は実施例１と同様に培養し、
リン酸を0.1〜0.2％に保ちつつ、培養15時間目か
ら硫安を500ppm程度（アンモニウムイオンとし
て136ppm）に維持して、通気攪拌培養を行つた。
培養時間83時間で36.5g／、0.44g／・hrの生
産性でセバシン酸をえた。
ラフインからジカルボン酸を発酵生産する際の改
良に関する。 ｎ−パラフインを含む培地中でトルロプシス属
の酵母を好気的に培養して、その培養物から原料
ｎ−パラフインと同一炭素数のジカルボン酸を採
取するジカルボン酸の製造方法については、すで
に本出願人が特公昭55−43759号及び特公昭56−
8595号において提案している。かかる発酵法によ
るジカルボン酸の製造を回分法で行うに当つて
は、ジカルボン酸の生成速度を速めるとともに、
培養液中に蓄積されるジカルボン酸の濃度をでき
るだけ高めることが工業化に際しての大きな課題
となる。本発明者らはそのような観点から一層の
改善を行うべく鋭意検討した結果、以下の方法を
見出すに至つた。すなわち、本発明は、トルロプ
シス属の酵母を用いて好気的な発酵法によりｎ−
パラフインからジカルボン酸を製造する方法にお
いて、窒素源の一部としてアンモニウム塩を使用
し、培養液中におけるアンモニウムイオン濃度を
100ないし700ppmとするとともに、リン酸塩の濃
度をリン酸基として0.1ないし0.4重量％の範囲に
維持し、かつ培養後期における培養液中のアンモ
ニウムイオン濃度を、培養初期のそれより高濃度
となるように培養槽内の培地に窒素源及びリン酸
塩を連続的又は間欠的に加えて培養を行うことを
特徴とするジカルボン酸の製造方法に関する。 一般的な培養方法においては、適当な組成の培
地に最初に微生物を接種しておき、そのまま培養
を続行させる回分培養法が採用されることが多
い。これに対し近年、炭素源、とくにメタノール
などを最初から多量に加えると、微生物の生育に
阻害的に作用する基質を培養経過に応じて連続的
に少量ずつ加えるいわゆる流加培養法が発展して
きた。この流加培養法はまた、パン酵母を製造す
る際などにも採用されており、例えばグルコース
が培地中に多いとアルコールの副生が無視出来な
くなるため、グルコースを少量ずつ添加する方法
が実施されている。 本発明は、トルロプシス属酵母によるジカルボ
ン酸製造において、上記のような炭素源ではなく
広く他の成分について流加培養法の採用による改
善を達成すべく検討した結果、前述の如き特定成
分を流加する方法を見出してなされたものであ
る。 本発明で使用されるトルロプシス属の酵母は、
ｎ−パラフインからジカルボン酸を生産しうる能
力を有しており、例えば前記各公告公報に記載さ
れた菌株から選ぶことができる。 本発明を実施するに当たつて培養物中にジカル
ボン酸を蓄積させるために、ｎ−パラフイン、窒
素源、リン酸源、その他必要な栄養源を含む培地
に、トルロプシス属に属するジカルボン酸生産能
のある酵母を接種し、好気的に培養を行う。 原料ｎ−パラフインとしては、目的とするジカ
ルボン酸と同一炭素数を有するものが好適であ
り、通常炭素数９ないし19程度、とくに10ないし
16程度のものが好ましい。 窒素源としては例えば硝酸アンモニウム、リン
酸アンモニウム、硫酸アンモニウムもしくは塩化
アンモニウムなどの無機窒素源または例えばペプ
トン、カザミノ酸、グルタミン酸、アスパラギン
酸、セリンのようなアミノ酸類、尿素、尿酸もし
くはコンステイープリカーなどの有機窒素源が挙
げられ、これらの一種あるいは二種以上を選択し
て用いる。無機塩類としては例えばリン酸カリウ
ム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
マンガン、硫酸鉄、硫酸亜鉛および塩化カルシウ
ムなどが挙げられる。その他に必要な場合に添加
される栄養源としては、イーストエキス、コーン
ステイープリカー、肉エキス、ビタミンなどが挙
げられ、これらの内から適当なものを選択して用
いる。 培地の好適な１例は10〜400gのｎ−パラフイ
ン、１〜20gの窒素化合物（例えば硫酸アンモニ
ウム）、0.2〜3gのリン酸水素一カリウム、0.2〜
3gのリン酸水素二ナトリウム、0.1〜1gの硫酸マ
グネシウム・七水塩、各々0.1〜20mgの硫酸鉄・
七水塩、硫酸亜鉛・七水塩、硫酸マンガン四水塩
塩、塩化カルシウム、塩化ナトリウムおよび硫酸
銅から選ばれたものおよび100〜1500mgのイース
トエキス、又はコーンステイープリカーを１の
蒸留水、水道水、井戸水等に溶解したものであ
る。 とくに主な窒素源として硫酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩を用い、
アンモニウムイオンの濃度を100ないし700ppm、
好ましくは100ないし400ppmとし、中でも培養初
期においてその濃度を100ないし300ppm、とくに
100ないし200ppm程度とするのが好ましい。また
リン酸基全体として、0.1ないし0.4重量％程度の
濃度に維持するのが好ましい。 本発明においては、培養の途中で窒素源及びリ
ン酸塩を連続的又は間欠的に培地に添加して行く
ことが肝要である。これによりジカルボン酸の蓄
積速度を速めることができるとともに、最高蓄積
濃度をも高めることができる。添加に使用する窒
素源として前記したものから適宜選択することが
できるが、中でも硫酸アンモニウム、リン酸アン
モニウムなどのアンモニウム塩を使用するのが好
ましい。アンモニウム塩を添加する場合には、培
地中の濃度が前記したような範囲とするとともに
培地中におけるジカルボン酸の濃度が25ないし35
ｇ／以上となつた時点ではアンモニウムイオン
としてとくに200ないし400ppm程度の濃度になる
ように添加するのが好ましい。 添加に使用するリン酸塩としては、例えば先に
例示したものから選択するのが好ましく、その添
加速度は、培地中におけるリン酸基としての濃度
が好ましくは0.1ないし0.4重量％程度となるよう
な範囲で選択すればよい。 培養は、前記したような培地を予め高温度で滅
菌した後（例えば120ないし125℃、10ないし20
分）、トルロプシス属に属するジカルボン酸生産
酵母を接種して行うのがよい。培養時のpHは6.5
ないし8.0程度、培養時の温度は25ないし35℃の
範囲がそれぞれ適当であり、振とう培養、通気培
養などの好気的条件で培養を行えばよい。途中で
添加する窒素源及びリン酸塩は、粉末状で加えて
もよいし水溶液の形で添加してもよい。 培養物中に蓄積したジカルボン酸を採取するに
は、例えば遠心分離によつて菌体を除いた後、強
酸で酸性にすることによつてジカルボン酸を遊離
な状態とし、次いでこれをエ−テル等の溶媒で抽
出してから溶媒を留去すればジカルボン酸の粗結
晶を得ることができる。次いで水、エタノール，
トルエンなどの適当な溶媒を用いて再結晶を行う
ことにより、高純度のジカルボン酸を得ることが
できる。 次に実施例を示す。 実施例 １ 硫安4.0g、K2HPO42.0g、KH2PO41.0g、
MgSO4・7H2O0.45g、FeSO4・7H2O0.9mg、
MnSO4・4H2O0.9mg、ZnSO4・7H2O0.9mg、イー
ストエキス0.9g、ビオチン9μgを720mlの水にとか
し、ｎ−トリデカン130mlを２容のミニジヤー
フアーメンターに加えオートクレーブ殺菌後、同
じ組成の培地で前培養したトルロプシスキヤンデ
イダMT1028（FERMPNo.3123号）の懸濁液90ml
を接種し、30℃、通気量0.16VVM、攪拌翼の回
転数500rpmで培養を開始した。 ただし培地のPHは7.4に維持するように水酸化
ナトリウム水溶液を自動的に注入した。 培養開始後21時間目からリン酸カリと硫安を流
加し、培地中の濃度をリン酸として0.1〜0.3％に
保ちつつ、培地中のアンモニアは東興化学（株）
製のアンモニアイオン電極を用いて経時的に測定
し、それに応じて流加用高濃度硫安溶液
（180g／）の供給速度を調節し、硫安濃度を
400〜700ppm（アンモニウムイオンとして109〜
190ppm）に保つて培養を継続した。培養全期間
における硫安溶液の総添加量は30ccであつた。培
養94時間でブラシル酸濃度が42g／と最大にな
つた。ブラシル酸の生産性は0.45g／・hrをえ
た。 比較例 １ 実施例１と同様に培養を開始し、リン酸と硫安
の流加を行わず、通常の回分培養を行つた。培養
105時間でブラシル酸濃度が39g／となつた。
ブラシル酸の生産性は0.35g／・hrであつた。 実施例 ２ 硫安を0.5gとした以外の成分は、実施例１と同
じものを用い、同じように殺菌後、ブラシル酸生
産株を接種し、硫安濃度を500ppm程度（アンモ
ニウムイオンとして136ppm程度）に維持しつつ
実施例１と同様な温度、通気攪拌条件で培養をし
た。培養開始後約60時間目（ブラシル酸が25g／
〜30g／生産された頃）以後硫安濃度を
1000ppm程度（アンモニウムイオンとして
273ppm程度）に制御した。この間培養液中のリ
ン酸は1000ppm付近に維持した。このように硫酸
濃度を段階的に変化させることによつて、98時間
の培養で46.8g／のブラシル酸をえた。この時
の生産性は0.48g／・hrであつた。 なお、硫安を培養初期から終了まで500ppm（ア
ンモニウムイオンとして136ppm）程度に維持し
た時のブラシル酸生産性は0.44g／・hrであつ
た。 実施例 ３ 表１に示した組成の培地を使用しセバシン酸生
産株を接種した以外は実施例１と同様に培養し、
リン酸を0.1〜0.2％に保ちつつ、培養15時間目か
ら硫安を500ppm程度（アンモニウムイオンとし
て136ppm）に維持して、通気攪拌培養を行つた。
培養時間83時間で36.5g／、0.44g／・hrの生
産性でセバシン酸をえた。
【表】
比較例 ２
実施例３と同様の培地を使用し、硫安の流加を
行わなかつたところ、培養83時間で27.3g／、
生産性0.33g／・hrでセバシン酸をえた。
行わなかつたところ、培養83時間で27.3g／、
生産性0.33g／・hrでセバシン酸をえた。
Claims (1)
- １ トルロプシス属の酵母を用いて好気的な発酵
法によりｎ−パラフインからジカルボン酸を製造
する方法において、窒素源の一部としてアンモニ
ウム塩を使用し、培養液中におけるアンモニウム
イオン濃度を100ないし700ppmとするとともに、
リン酸塩の濃度をリン酸基として0.1ないし0.4重
量％の範囲に維持し、かつ培養後期における培養
液中のアンモニウムイオン濃度を、培養初期のそ
れより高濃度となるように培養槽内の培地に窒素
源及びリン酸塩を連続的又は間欠的に加えて培養
を行うことを特徴とするジカルボン酸の製造方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP90682A JPS58121797A (ja) | 1982-01-08 | 1982-01-08 | ジカルボン酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP90682A JPS58121797A (ja) | 1982-01-08 | 1982-01-08 | ジカルボン酸の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58121797A JPS58121797A (ja) | 1983-07-20 |
| JPH0412957B2 true JPH0412957B2 (ja) | 1992-03-06 |
Family
ID=11486717
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP90682A Granted JPS58121797A (ja) | 1982-01-08 | 1982-01-08 | ジカルボン酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58121797A (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5543759A (en) * | 1978-09-21 | 1980-03-27 | Nec Corp | Gas discharge display device |
| JPS568595A (en) * | 1979-07-03 | 1981-01-28 | Tokyo Shibaura Electric Co | Control rod assembly |
-
1982
- 1982-01-08 JP JP90682A patent/JPS58121797A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58121797A (ja) | 1983-07-20 |
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