JPH0644871B2 - 発酵法によるｌ−ロイシンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−ロイシンの製造法Info
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- JPH0644871B2 JPH0644871B2 JP8399987A JP8399987A JPH0644871B2 JP H0644871 B2 JPH0644871 B2 JP H0644871B2 JP 8399987 A JP8399987 A JP 8399987A JP 8399987 A JP8399987 A JP 8399987A JP H0644871 B2 JPH0644871 B2 JP H0644871B2
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- leucine
- producing
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- valine
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は発酵法によるＬ−ロイシンの製造法に関する。
Ｌ−ロイシンは医薬品，食品その他広い分野で種々の用
途を有する。
途を有する。
従来の技術 従来、Ｌ−ロイシンは発酵法または蛋白質からの分解抽
出法により製造されている。発酵法で生産する方法とし
ては、バリン要求性変異株を用いる方法（特公昭３８−
４３９５），コリネバクテリウム属に属しＳ−（２−ア
ミノエチル）−Ｌ−システイン抵抗性を有する変異株を
用いる方法（特公昭５１−３７３４７），コリネバクテ
リウム・グルタミクムのフェニルアラニン，イソロイシ
ン，バリンまたはメチオニン要求性変異株を用いる方法
（特公昭５４−３６２３３），ブレビバクテリウム属ま
たはコリネバクテリウム属に属し２−チアゾールアラニ
ン耐性変異株を用いる方法（特公昭４８−２４２７
３），Ｌ−ロイシン生産能を有する微生物を培養する際
に培地にＬ−バリンを存在させる方法（特開昭５６−１
２７０９５）などが知られている。
出法により製造されている。発酵法で生産する方法とし
ては、バリン要求性変異株を用いる方法（特公昭３８−
４３９５），コリネバクテリウム属に属しＳ−（２−ア
ミノエチル）−Ｌ−システイン抵抗性を有する変異株を
用いる方法（特公昭５１−３７３４７），コリネバクテ
リウム・グルタミクムのフェニルアラニン，イソロイシ
ン，バリンまたはメチオニン要求性変異株を用いる方法
（特公昭５４−３６２３３），ブレビバクテリウム属ま
たはコリネバクテリウム属に属し２−チアゾールアラニ
ン耐性変異株を用いる方法（特公昭４８−２４２７
３），Ｌ−ロイシン生産能を有する微生物を培養する際
に培地にＬ−バリンを存在させる方法（特開昭５６−１
２７０９５）などが知られている。
発明が解決しようとする問題点 医薬品，食品またはその原料など広い分野で種々の用途
を有するＬ−ロイシンを工業的に安価に製造する方法の
開発が望まれている。
を有するＬ−ロイシンを工業的に安価に製造する方法の
開発が望まれている。
問題点を解決するための手段 本発明者は、Ｌ−ロイシンを効率よく安価に得るため
に、発酵法によるＬ−ロイシン生産菌について鋭意検討
を行った。その結果、Ｌ−ロイシン生産菌の生産能がバ
リンアナログ耐性を付与することにより安定化しかつ向
上することを見出し本発明を完成した。
に、発酵法によるＬ−ロイシン生産菌について鋭意検討
を行った。その結果、Ｌ−ロイシン生産菌の生産能がバ
リンアナログ耐性を付与することにより安定化しかつ向
上することを見出し本発明を完成した。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、コリネ型グルタミン酸生産菌に属し、バリン
アナログに耐性を有しかつＬ−ロイシン生産能を有する
微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−ロイシンを生産
蓄積させ、該培養物よりＬ−ロイシンを採取することを
特徴とする発酵法によるＬ−ロイシンの製造方法を提供
する。
アナログに耐性を有しかつＬ−ロイシン生産能を有する
微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−ロイシンを生産
蓄積させ、該培養物よりＬ−ロイシンを採取することを
特徴とする発酵法によるＬ−ロイシンの製造方法を提供
する。
本発明でいうバリンアナログとは、コリネ型グルタミン
酸生産菌の成育を阻害するが、この阻害がバリンが存在
することにより解除されるようなものをいう。例えば、
α−アミノ酪酸，β−ハイドロキシバリン，バリンハイ
ドロキサメート，ノルバリンなどである。
酸生産菌の成育を阻害するが、この阻害がバリンが存在
することにより解除されるようなものをいう。例えば、
α−アミノ酪酸，β−ハイドロキシバリン，バリンハイ
ドロキサメート，ノルバリンなどである。
本発明の変異株を得るための親株としては、コリネバク
テリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２，コリネバ
クテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ１３８３
７，コリネバクテリウム・リリウムＡＴＣＣ１５９９
０，ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６
７，ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣ
Ｃ１３８６９，ブレビバクテリウム・ディバリカツムＡ
ＴＣＣ１４０２０などが挙げられる。
テリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２，コリネバ
クテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ１３８３
７，コリネバクテリウム・リリウムＡＴＣＣ１５９９
０，ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６
７，ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣ
Ｃ１３８６９，ブレビバクテリウム・ディバリカツムＡ
ＴＣＣ１４０２０などが挙げられる。
コリネ型グルタミン酸生産菌またはその他の微生物がＬ
−ロイシン生産能を有するためには５′，５′，５′−
トリフルオロロイシン，アザロイシンなどのロイシンア
ナログや、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイ
ン，２−チアゾールアラニンなどの薬剤に対する耐性を
付与すればよいことが知られている。しかしながら、こ
れらの薬剤耐性株の中にはＬ−ロイシン生産能の不安定
なものが多い。本発明者は、これらにバリンアナログ耐
性を付与することによりＬ−ロイシン生産能が安定化し
かつ向上することを見出した。
−ロイシン生産能を有するためには５′，５′，５′−
トリフルオロロイシン，アザロイシンなどのロイシンア
ナログや、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイ
ン，２−チアゾールアラニンなどの薬剤に対する耐性を
付与すればよいことが知られている。しかしながら、こ
れらの薬剤耐性株の中にはＬ−ロイシン生産能の不安定
なものが多い。本発明者は、これらにバリンアナログ耐
性を付与することによりＬ−ロイシン生産能が安定化し
かつ向上することを見出した。
本発明における変異株の誘導は、通常の変異誘導法、例
えば紫外線照射や薬剤による化学処理などにより行う。
具体的には上記親株をＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン２５０μｇ／mlで３０℃，３０分処
理し、親株が生育阻害を示す濃度のバリンアナログ、例
えばα−アミノ酪酸２０mg／mlを含む最少培地寒天平板
上に生育する変異株を取得すればよい。このようにして
取得した耐性変異株を培養し、Ｌ−ロイシン生産能を調
べることにより、Ｌ−ロイシン生産能が安定化しかつ向
上した変異株を分離することができる。
えば紫外線照射や薬剤による化学処理などにより行う。
具体的には上記親株をＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン２５０μｇ／mlで３０℃，３０分処
理し、親株が生育阻害を示す濃度のバリンアナログ、例
えばα−アミノ酪酸２０mg／mlを含む最少培地寒天平板
上に生育する変異株を取得すればよい。このようにして
取得した耐性変異株を培養し、Ｌ−ロイシン生産能を調
べることにより、Ｌ−ロイシン生産能が安定化しかつ向
上した変異株を分離することができる。
以下に、親株および親株より誘導したバリンアナログ耐
性株の例を示す。
性株の例を示す。
親株 コリネバクテリウム・グルタミクム ＣＵ−２５（FERM P-1834）：ＡＥＣＲ 耐性株 Ｈ−４６６９（FERM BP-1311):ＡＥＣＲ，ＡＢ
ＡＲ 親株 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＨ−
４６６７（FERM BP-1309）：ＴＦＬＲ（コリネバクテリ
ウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ１３８３７より誘
導） 耐性株 Ｈ−４６６８（FERM BP-1310）：ＴＦＬＲ，Ａ
ＢＡＲ ＡＥＣＲはＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン
耐性、ＡＢＡＲはαアミノ酪酸耐性、ＴＦＬＲは５′，
５′，５′−トリフルオロロイシン耐性を示す。
ＡＲ 親株 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＨ−
４６６７（FERM BP-1309）：ＴＦＬＲ（コリネバクテリ
ウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ１３８３７より誘
導） 耐性株 Ｈ−４６６８（FERM BP-1310）：ＴＦＬＲ，Ａ
ＢＡＲ ＡＥＣＲはＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン
耐性、ＡＢＡＲはαアミノ酪酸耐性、ＴＦＬＲは５′，
５′，５′−トリフルオロロイシン耐性を示す。
上記各菌株をバリンアナログ（α−アミノ酪酸）２０mg
／mlを含む最少培地寒天平板（グルコース１０ｇ／，
塩化アンモニウム１ｇ／，尿素２ｇ／ＫＨ2ＰＯ４
１ｇ／，Ｋ2ＨＰＯ４３ｇ／，ＭｇＣｌ２・２Ｈ2Ｏ
０．４ｇ／，ＦｅＳＯ４・７Ｈ2Ｏ １０mg／，
ＭｎＳＯ４・４Ｈ2Ｏ １０mg／，ＺｎＳＯ４・７Ｈ2
Ｏ １mg／，ＣｕＳＯ４・５Ｈ2Ｏ １mg／，(ＮＨ
4)6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ １mg／，ビオチン５０μｇ
／，寒天２０ｇ／，ｐＨ７．２）上で２４時間培養
したときの生育度を第１表に示す。
／mlを含む最少培地寒天平板（グルコース１０ｇ／，
塩化アンモニウム１ｇ／，尿素２ｇ／ＫＨ2ＰＯ４
１ｇ／，Ｋ2ＨＰＯ４３ｇ／，ＭｇＣｌ２・２Ｈ2Ｏ
０．４ｇ／，ＦｅＳＯ４・７Ｈ2Ｏ １０mg／，
ＭｎＳＯ４・４Ｈ2Ｏ １０mg／，ＺｎＳＯ４・７Ｈ2
Ｏ １mg／，ＣｕＳＯ４・５Ｈ2Ｏ １mg／，(ＮＨ
4)6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ １mg／，ビオチン５０μｇ
／，寒天２０ｇ／，ｐＨ７．２）上で２４時間培養
したときの生育度を第１表に示す。
上記した親株およびそれらから誘導したバリンアナログ
耐性変異株は、昭和６２年３月１０日付で工業技術院微
生物工業研究所（微工研）にそれぞれ寄託されている。
耐性変異株は、昭和６２年３月１０日付で工業技術院微
生物工業研究所（微工研）にそれぞれ寄託されている。
本発明方法において用いられる菌の培養に際しては、一
般にアミノ酸の発酵生産に用いられる培地が使用され
る。すなわち菌が資化しうる炭素源，窒素源，無機物，
生育因子などを含有する合成培地または天然培地が適宜
用いられる。
般にアミノ酸の発酵生産に用いられる培地が使用され
る。すなわち菌が資化しうる炭素源，窒素源，無機物，
生育因子などを含有する合成培地または天然培地が適宜
用いられる。
炭素源としては、グルコース，フラクトース，シュクロ
ース，糖密，澱粉加水分解物などの糖類、酢酸，フマー
ル酸，クエン酸などの各種有機酸、エタノール，グリセ
ロール，アンノースなどのアルコール類などが使用でき
る。
ース，糖密，澱粉加水分解物などの糖類、酢酸，フマー
ル酸，クエン酸などの各種有機酸、エタノール，グリセ
ロール，アンノースなどのアルコール類などが使用でき
る。
窒素源としては、アンモニア，塩化アンモニウム，硫酸
アンモニウム，酢酸アンモニウム，燐酸アンモニウムな
どの各種無機塩類や有機酸のアンモニウム塩、アミン
類，その他含窒素化合物、ならびにペプトン，肉エキ
ス，コーン・スティープ・リカー，カゼイン加水分解，
大豆粕加水分解物，各種発酵菌体およびその消化物など
が用いられる。
アンモニウム，酢酸アンモニウム，燐酸アンモニウムな
どの各種無機塩類や有機酸のアンモニウム塩、アミン
類，その他含窒素化合物、ならびにペプトン，肉エキ
ス，コーン・スティープ・リカー，カゼイン加水分解，
大豆粕加水分解物，各種発酵菌体およびその消化物など
が用いられる。
無機物としては、燐酸第一カリウム，燐酸第二カリウ
ム，燐酸マグネシウム，硫酸マグネシウム，塩化ナトリ
ウム，硫酸第一鉄，硫酸マンガン，硫酸銅，炭酸カルシ
ウムなどが用いられる。
ム，燐酸マグネシウム，硫酸マグネシウム，塩化ナトリ
ウム，硫酸第一鉄，硫酸マンガン，硫酸銅，炭酸カルシ
ウムなどが用いられる。
培養は振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条
件下で行う。培養温度は２０〜４０℃，好ましくは２５
〜３８℃の範囲である。培地のｐＨは５〜９の範囲で、
好ましくは中性付近に保持する。培地のｐＨ調整は炭酸
カルシウム，無機または有機の酸，アルカリ溶液，アン
モニア，ｐＨ緩衝液などによって行う。
件下で行う。培養温度は２０〜４０℃，好ましくは２５
〜３８℃の範囲である。培地のｐＨは５〜９の範囲で、
好ましくは中性付近に保持する。培地のｐＨ調整は炭酸
カルシウム，無機または有機の酸，アルカリ溶液，アン
モニア，ｐＨ緩衝液などによって行う。
培養期間は通常１〜７日間で、培養物中にＬ−ロイシン
が生成蓄積する。培養終了後、培養液から菌体などの沈
殿物を除去し、イオン交換処理法，濃縮法，塩折法，等
電点沈澱法などを併用することにより培養液からＬ−ロ
イシンを回収することができる。
が生成蓄積する。培養終了後、培養液から菌体などの沈
殿物を除去し、イオン交換処理法，濃縮法，塩折法，等
電点沈澱法などを併用することにより培養液からＬ−ロ
イシンを回収することができる。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例1. コリネバクテリウム・グルタミクムＣＵ−２５（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１８３４）およびＨ−４６６９（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１３１１）を下記の組成の保存寒天培地上で生育さ
せたのち、その１白金耳を下記の組成の生産培地２０ml
（３００ml容三角フラスコ）に植菌し、３０℃にて７２
時間振盪培養した。培養終了液中には各々１０．２mg／
ml，１３．５mg／mlのＬ−ロイシンが生成蓄積した。
Ｍ Ｐ−１８３４）およびＨ−４６６９（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１３１１）を下記の組成の保存寒天培地上で生育さ
せたのち、その１白金耳を下記の組成の生産培地２０ml
（３００ml容三角フラスコ）に植菌し、３０℃にて７２
時間振盪培養した。培養終了液中には各々１０．２mg／
ml，１３．５mg／mlのＬ−ロイシンが生成蓄積した。
Ｈ−４４６９の培養終了液を遠心分離し、得られた上清
液１を、強酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ＋
１Ｂ（三菱化成工業社製）を充填したカラムに通塔した
後、０．２Ｎアンモニア水で溶出し、Ｌ−ロイシンを含
む画分を活性炭処理した。処理液をｐＨ６．０に調整し
た後濃縮し、Ｌ−ロイシンの粗結晶１２．２ｇを得た。
液１を、強酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ＋
１Ｂ（三菱化成工業社製）を充填したカラムに通塔した
後、０．２Ｎアンモニア水で溶出し、Ｌ−ロイシンを含
む画分を活性炭処理した。処理液をｐＨ６．０に調整し
た後濃縮し、Ｌ−ロイシンの粗結晶１２．２ｇを得た。
実施例2. コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＨ−４６６
７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３０９），Ｈ−４６６８（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１３１０）を実施例１と同様にして培養し
たところ、第２表に示したようにＬ−ロイシンが生成蓄
積した。
７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３０９），Ｈ−４６６８（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１３１０）を実施例１と同様にして培養し
たところ、第２表に示したようにＬ−ロイシンが生成蓄
積した。
発明の効果 本発明によりＬ−ロイシンを収率よく得ることができ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:15）
Claims (1)
- 【請求項１】コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属し、バリンアナログに耐性を有しかつＬ−
ロイシン生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物
中にＬ−ロイシンを生成蓄積させ、該培養物よりＬ−ロ
イシンを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−ロ
イシンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8399987A JPH0644871B2 (ja) | 1987-04-06 | 1987-04-06 | 発酵法によるｌ−ロイシンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8399987A JPH0644871B2 (ja) | 1987-04-06 | 1987-04-06 | 発酵法によるｌ−ロイシンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63248392A JPS63248392A (ja) | 1988-10-14 |
| JPH0644871B2 true JPH0644871B2 (ja) | 1994-06-15 |
Family
ID=13818226
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8399987A Expired - Lifetime JPH0644871B2 (ja) | 1987-04-06 | 1987-04-06 | 発酵法によるｌ−ロイシンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0644871B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU3956399A (en) | 1998-06-02 | 1999-12-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. | Iga nephropathy-associated dna |
| JP2010017082A (ja) | 2006-10-10 | 2010-01-28 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010041920A (ja) | 2006-12-19 | 2010-02-25 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2010110216A (ja) | 2007-02-20 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法 |
| JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| RU2628696C1 (ru) | 2013-10-02 | 2017-08-21 | Адзиномото Ко., Инк. | Способ получения основной аминокислоты (варианты) |
-
1987
- 1987-04-06 JP JP8399987A patent/JPH0644871B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63248392A (ja) | 1988-10-14 |
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