JPH0412959B2 - - Google Patents
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- JPH0412959B2 JPH0412959B2 JP32995988A JP32995988A JPH0412959B2 JP H0412959 B2 JPH0412959 B2 JP H0412959B2 JP 32995988 A JP32995988 A JP 32995988A JP 32995988 A JP32995988 A JP 32995988A JP H0412959 B2 JPH0412959 B2 JP H0412959B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は遺伝子の新規形質発現方法に関する。
さらに詳細には本発明は少なくとも一種の遺伝子
を含むDNA断片とベクターDNAとの組換え体
で、かつ両DNAの少なくとも一方が宿主菌株に
対して外来性である組換え体DNAを用いコリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換して
得られる形質転換株を培地に培養し、該遺伝子の
形質を発現させることを特徴とする遺伝子の形質
発現方法に関する。 組換え遺伝子技法は大腸菌を宿主として確立さ
れ、現在までにソマトスタチン、インシユリン、
ヒト成長ホルモン、ヒトインターフエロン−α、
ヒトインターフエロン−β、口蹄病ワクチンなど
のペプタイドやワクチンなどの製造が可能である
ことが示された。生理活性の高いこれらペプタイ
ドやワクチンの発現の宿主として大腸菌は多くの
場合十分であると考えられるが、さらに高い生産
性、菌体外への分泌、グリコシル化を求めあるい
は菌体内毒素の混入を避けるため、酵母や枯草菌
なども宿主として開発されてきている。 ペプタイド、蛋白質などの生理活性物質を生産
する場合は、上記のような既に組換えDNA技法
が確立されているか、その基礎が整つている菌株
を利用すればよいが、アミノ酸、核酸、ビタミ
ン、抗生物質などの物質の工業的生産性の向上を
組換えDNA技法により行う場合には、同技法を
従来使用されているそれぞれの生産菌に適用する
工夫が必要である。 コリネバクテリウム・グルタミクムは微生物に
よるアミノ酸の工業的製造に最初に用いられた微
生物で、以後コリネバクテリウム属を含むコリネ
フオルムバクテリアによるグルタミン酸、リジ
ン、アラニル、ヒスチジン、トリプトフアン、チ
ロシン、フエニルアラニン、スレオニン、イソロ
イシン、バリン、ロイシン、グルタミン、プロリ
ン、アルギニンなどのアミノ酸の工業的生産が開
発され、今日ではほとんどのアミノ酸は微生物に
より生産されるに至つている。 従つてこれら微生物における組換えDNA技法
の確立は、今後アミノ酸生産の向上のために極め
て重要であると考えられる。 組換えDNA技法は、例えば (1) 制限酵素による目的遺伝子を含むDNAの断
片化 (2) 同一制限酵素によるベクターDNAの単一切
断による直鎖状化 (3) 上記(1)、(2)の生成物の混合によるアニーリン
グとDNAリガーゼを用いる連結による組換え
体DNAの作成 (4) 上記組換え体DNAの宿主菌株への導入（形
質転換） (5) 目的遺伝子を含む組換え体の選択されたクロ
ーンの純化 の各段階によりなる。このようにして得られる組
換え体保有株の造成の効率は、上記各段階の積と
もいうべきもので各段階を検証する手段を準備
し、各段階の効率を知りこれを向上することなし
には目的遺伝子の発現可能な形質転換株を得るこ
とができない。またこのようにして目的遺伝子を
含む組換え体DNAを有する形質転換株が得られ
たとしても、該遺伝子が宿主菌株に対して外来性
である場合には該遺伝子の発現に際し種々の障壁
があることが知られており〔“化学と生物”18，
110〜118（1978）〕その発現を行わせることは非常
に困難である。 コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属する微生物を宿主として用い、これに該
宿主に対して外来性である目的遺伝子またはベク
ターを含む組換え体DNAを導入して該目的遺伝
子の形質を発現させた例は今まで全く知られてい
ない。 コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属する微生物を宿主とする組換えDNA技
法においても、これら微生物中で自律複製し、選
択可能な表現型を有し、多くの遺伝子のクローニ
ングに用いうるベクター系の造成と、効率のよい
形質転換系の確立が必要である。さらに上記した
ような障壁の解消方法の確立が必要である。 本発明者らは先にコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物中で自律複
製し、選択可能な表現型と適当なクローニング部
位を有するプラスミドベクターを造成する一方効
率の高い形質転換系を開発した〔特願昭56−
58186（特開昭57−183799）、同56−58187（特開昭
57−186492）、同56−65777（特開昭57−186489）〕。
そこで本発明者らは該プラスミドベクターに既に
知られているインビトロにおけるDNA組換え技
法（U.S.Patent4237224）を用い、アミノ酸の生
合成に関与する外来性遺伝子を含むDNA断片を
連結し、開発した形質転換系を用いてコリネバク
テリウム・グルタミクムＬ−22株またはその誘導
株を形質転換したところ、該外来性遺伝子が該宿
主中で形質を発現され、アミノ酸などの有用物質
の生産の増大に利用することができることを見出
し本発明を完成するに至つた。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明は少なくとも一種の遺伝子を含むDNA
断片とベクターDNAとの組換え体で、かつ両
DNAの少なくも一方が宿主菌株に対して外来性
である組換え体DNAを用いコリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属に属する微生物か
ら選ばれる宿主菌株を形質転換して得られる形質
転換株を培地に培養し、該遺伝子の形質を発現さ
せる方法を提供する。 本発明に用いる遺伝子を含むDNA断片として
は、真核生物、原核生物、ウイルス、バクテリオ
フアージまたはプラスミドに由来し少なくとも一
種の完全な遺伝子を含むDNA断片があげられる。
真核生物に由来する遺伝子としては哺乳類とくに
ヒトのインターフエロン、インシユリン、生長ホ
ルモンなどのペプタイドをコードする遺伝子など
があげられる。原核生物に由来する遺伝子として
は細菌とくにエツシエリヒア属、コリネバクテリ
ウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属また
はスタフイロコツカス属に属する細菌の菌株に由
来する遺伝子で、細胞の代謝、とくに合成活性に
関与する遺伝子などがあげられる。細胞の代謝ま
たは合成活性とは、アミノ酸、ビタミン、核酸ま
たは抗生物質などの合成ならびにその合成に関与
する代謝系を意味し、本発明においてはアミノ酸
とくにグルタミン酸、リジン、スレオニン、ヒス
チジンまたはトリプトフアンの生合成活性が好適
にあげられる。 また目的とするペプタイド、蛋白質などのアミ
ノ酸組成が知られているときは、相当するDNA
を合成して用いることもできる。DNA合成方法
はたとえば、K.Itakura et al，Science 198，
1056（1977）に記載の方法に従つて行なうことが
できる。 本発明に用いるベクターとしては、宿主菌と和
合性（compatible）で自律増殖できるものでな
くてはならない。具体例としては本発明者らがコ
リネバクテリウム属に属する微生物から採取し
た、または採取したものを誘導して造成した
pCG1〔特願昭56−18101（特開昭57−134500）〕、
pCG2〔特願昭56−133557（特開昭58−35197）〕、
pCG4〔特願昭56−58186（特開昭57−183799）〕、
pCE53、pCE54、pCG11、pCB101、pEthrlなど
があげられる。 これらプラスミドを保有する菌株はそれぞれ下
記の寄託番号で工業技術院微生物工業技術研究所
ならびに米国アメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨンに寄託されている。 【表】 好適にはpCG11、pCE54が用いられる。pCG11
は本発明者らが先に開示〔特願昭56−18101（特開
昭57−134500）〕したプラスミドで、コリネバク
テリウム・グルタミクム225−57（ATCC31808、
FERM−P5865）から分離されたプラスミド
pCG1における制限酵素Bgのただ一つの切断
部位に、コリネバクテリウム・グルタミクム225
−250（ATCC31830、FERM−P5939）から分離
されたプラスミドpCG4のストレプトマイシンお
よび／またスペクチノマイシン耐性（SmR／
SpecR）遺伝子を含むBamHI断片を両者の同一
接着末端を利用して結合させたプラスミドであ
る。 pCG11は、分子量約6.8Kbのプラスミドで単一
な制限部位としてBg、Pstを有しSmR／
SpecRの表現型を与える。 pEC54は次のようにして作成することができ
る。まず、pCG2をその保有菌コリネバクテリウ
ム・グルタミクム225−218株（FERM−P5954、
ATCC31832）の培養菌体から特願昭56−133557
（特開昭58−35197）開示した方法で、pGA22を
その保有大腸菌の培養菌体から通常用いられる方
法で濃縮単離する。両プラスミドDNAを各分子
中１箇所の切断点をもつ制限酵素たとえばPst
で完全消化して直鎖状化した後、プラスミド分子
の両端に単鎖として突き出た同一接着末端で両
DNA分子の連結した和合分子を生成させるため
にT4フアージDNAリガーゼを作用させる。この
DNA混成物中から両プラスミド分子の和合連結
した組換え体プラスミドの取得は、一旦、
pGA22に由来する薬剤耐性で選択されるコリネ
バクテリウム属あるいはブレビバクテリウム属菌
種の形質転換株を分離し、これら形質転換株の保
有するプラスミドを解析することによつて達成さ
れる。 DNA混成物による形質転換は、本発明者らが
先に開示したコリネバクテリウム属およびブレビ
バクテリウム属菌種のプロトプラストを使用する
形質転換法〔特願昭56−58187（特開昭57−
186492）および特願昭56−65777（特開昭57−
186489）〕により実施することができる。選択に
用いる薬剤はpGA22に由来する薬剤耐性遺伝子
のうち、pGA22との連結部位となるため挿入不
活化されるアンピシリン耐性遺伝子を除いた他の
耐性遺伝子に対応するテトラサイクリン（Tc）、
クロラムフエニコール（Cm）あるいはカナマイ
シン（Km）を使用すればよい。形質転換株は
DNA無添加系で受容菌プロトプラストが正常細
胞へ復帰増殖できない濃度の薬剤（通常、テトラ
サイクリン0.4−1.6μg／ml、クロラムフエニコー
ル2.5−5μg／mlおよびカナマイシン100−800μg／
ml）を含む高張寒天培地上で復帰するコロニーを
分離するか、あるいは、一旦非選択的に再生培地
上で正常細胞に復帰増殖させた後にかき集め、こ
の再懸濁液を受容菌正常細胞が生育できない濃度
の薬剤（通常、テトラサイクリン0.5−4μg／ml、
クロラムフエニコール２−15μg／mlおよびカナ
マイシン２−25μg／ml）を含む寒天培地上で生
育するコロニーを分離することによつて得られ
る。テトラサイクリン、クロラムフエニコールあ
るいはカナマイシン耐性（TcR，CmR，KmRとそ
れぞれいう）により選択された形質転換株の中に
は、pGA22由来の他の薬剤耐性形質をも同時に
獲得しているものがある。 こうして得られる形質転換株の保有するプラス
ミドDNAは、本発明他らが特願昭56−18101（特
開昭57−134500）および特願昭56−65777（特開昭
57−186489）に開示した方法で培養菌体から単離
精製でき、さらに各種制限酵素で消化して生成す
るDNA断片をアガロースゲル電気泳動で解析す
る常法により構造を知ることができる。形質転換
株の一株から分離されたプラスミドでpCE54であ
る。 pCE54は大きさ約14.5kbのプラスミドで、単一
制限部位としてEcoR，Sal、Sma、Xho
などを有し、TcR，CmR，KmRの表現型を与え
る。XhoはKmR遺伝子中にあり、いわゆる挿
入不活化（DNA断片の挿入により当該表現型の
発現が妨げられる現象）による選択も可能であ
る。 プラスミド保有菌株からのプラスミドの採取
は、たとえば特願昭56−18101（特開昭57−
134500）、同56−58186（特開昭57−183799）およ
び同56−133557（特開昭58−35197）に記載の方法
に従つて行えばよい。 遺伝子を含むDNA断片とベクターDNAとの組
換え体の作製は、公知の試験管内組換えDNA技
法を駆使することにより実施できる。 試験管内のDNA組換えは、通常、目的の遺伝
子を含む供与体DNAとベクターDNAの切断と再
結合により行われる。DNAの切断は、制限酵素
を用いれば容易にできる。試験管内組換えに使わ
れる制限酵素は生物種を問わずすべての２本鎖
DNA上で特定の塩基配列部分を認識し切断する。
その塩基配列は、制限酵素の種類により異なつて
いる。従つて適当な制限酵素を使用することによ
り目的の遺伝子は発現機能を損うことなく一つの
DNA切断片として切り出される。同一制限酵素
により切断された供与体DNAとベクターDNAの
切断片の末端構造は同一構造を持ち、ある種の制
限酵素の場合には１本鎖が突き出た接着末端を与
え、別の制限酵素では、平滑末端を与える。いず
れの末端であれ同一制限酵素で切断する限り供与
体DNAの切断片とベクターDNAの切断片は、
T4フアージDNAリガーゼにより連結することが
できる。 両DNAを異なる制限酵素で切断した場合も、
例えば、接着末端をDNAポリメラーゼで修復し
て２本鎖として、平滑末端になおしてから結合し
たり、ターミナルトランスフエラーゼで相補的な
ホモポリマーを付与して接着末端としてから結合
したり、あるいは、ある種の制限酵素切断部位を
含んだ合成オリゴヌクレオチドリンカーを連結さ
せてから、その内部を切断して接着末端を作つて
から結合させることができる。これらの連結法に
より目的の遺伝子を含むDNA断片とベクター
DNA切断片の組換え体が生成する。 リガーゼ反応により目的の組換え体以外に他の
組換え体も生成するが、目的の組換え体を取得す
るにはこのDNA混成液を用いてコリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属菌種を直接形
質転換し、目的の遺伝子の遺伝情報に由来する遺
伝形質を付与された形質転換株を選択分離し、そ
の培養菌体から抽出単離することによつて達成で
きる。コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属菌種を直接形質転換しないで例えば大腸
菌のような他の微生物の宿主ベクター系にて目的
の遺伝子を一旦クローン化し、しかる後にコリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種
のベクターとの組換え体を試験管内で作製してか
らコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属菌種を形質転換し前記と同様に形質転換株を
選択分離しても組換え体を取得できる。 組換え体製造のためには下記文献の記載が広く
応用できる。 S.N.Cohen，et alU.S Patent 4237224、遺伝
子操作実験法〔高木康敬編著、講談社サンエンテ
イフィツク（1980）〕、Method in Enzymology
68，Recombinant DNA edited by Rey Wu，
Academic Press 1979 本発明の宿主微生物としては、コリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属に属しDNA
取り込み能を有する菌株ならばいかなる菌株を用
いてもよい。好適には本発明者らが先に特願昭56
−151464（特開昭58−56678）において開示したリ
ゾチーム感受性微生物を用いる。具体的な菌株の
一例としては次の菌株があげられる。 【表】 宿主微生物の組換え体DNAによる形質転換は
１）培養細胞からのプロトプラストの調製、２）
プロトプラストの組換え体DNAによる形質転換
処理、３）プロトプラストの正常細胞への復帰再
生と形質転換株の選択、からなる工程にて行われ
る。具体的方法の例を以下に示す。 １ 培養細胞からのプロトプラストの調製 プロトプラスト形成は、微生物を細胞壁溶解酵
素リゾチームに感受性にする条件下で増殖させ、
この培養細胞を高張液中でリゾチーム作用させ細
胞壁を溶解除去ることによつて行われる。微生物
をリゾチーム感受性型細胞にするには各種細胞壁
合成阻害剤が用いられる。例えば、微生物培養の
対数増殖期の中途で生育を抑制しないかあるいは
半制御する濃度のペニシリンを添加し、さらに数
世代増殖させることによつて微生物細胞をリゾチ
ーム感受性にすることができる。 このとき使用する培地は微生物が増殖できる培
地であればよく、例えば栄養培地NB（粉末ブイ
ヨン20g、酵母エキス5gを純水１に含み、PH7.2
に調整した培地）あるいは半合成培地SSM〔グル
コース10g、NH4Ｃ 4g、尿素2g、酵母エキス
1g、KH2PO4 1g、K2HPO4 3g、MgC2・
6H2Ｏ 0.4g、FeSO4・7H2Ｏ 10mg，MnSO4・
４〜6H2Ｏ 0.2mg、ZnSO4・7H2Ｏ 0.9mg、
CuSO4・5H2Ｏ 0.4mg、Na2B4O7・10H2Ｏ
0.09mg、（NH4）6Mo7O24・4H2Ｏ 0.04mg、ビオ
チン30μg、サイアミン塩酸塩１mgを水１に含
み、PH7.2に調整した培地〕などが用いられる。 この培地に微生物を接種し、振盪培養する。 比色計によつて660nmにおける吸光度（OD）
を測定し対数増殖期の初期（OD＝0.1〜0.4）に
培養液中0.1〜2.0単位／mlの濃度になるようにペ
ニシリンＧなどのペニシリン類を添加する。培養
をさらに続けて、ODが0.3〜0.5に増加したとこ
ろで細胞を集菌しSSM培地で洗浄する。次いで
細胞を適当な高張培地、例えばPFM培地
（SSM2倍希釈液中にシヨ糖0.4M、MgC2・6H2
O0.01Mを含み、PH7.0〜8.5に調整した培地）あ
るいはRCG培地〔グルコース5g、カゼイン加水
分解物5g、酵母エキス25g、K2HPO4 3.5g、
KH2PO4 1.5g、MgC2・6H2Ｏ 0.41g
FeSO4・7H2Ｏ 10mg、MnSO4・４〜6H2Ｏ ２
mg、ZnSO4・7H2Ｏ 0.9mg、CuSO4・5H2Ｏ 0.4
mg、Na2B4O7・10H2Ｏ 0.09mg、（NH4）6MO7
O24・4H2Ｏ 0.04mg、ビオチン30μg、サイアミ
ン塩酸塩２mg、コハク酸二ナトリウム1.35gを水
１に含み、PH7.0〜8.5に調整した培地〕に再懸
濁する。この細胞懸濁液に最終濃度0.2〜10mg／
mlとなるようにリゾチームを加え30〜37℃で反応
する。プロトプラスト化は反応時間が進むつれて
進行し、その経過は光学顕微鏡で観察できる。顕
微鏡下でほとんどの細胞がプロトプラスト化され
るに要する時間は、細胞培養時の添加ペニシリン
濃度および用いるリゾチームの濃度によつて変わ
るが、前記条件にて３〜24時間である。 生成したプロトプラストは低張条件で破裂死す
るので、プロトプラストの形成度は低張条件で生
残する正常細胞の残存度で間接的に知ることがで
きる。通常、正常細胞はリゾチーム処理供試正常
細胞の約10-4の残存度に抑えることができる。 このようにして調製したプロトプラストは適当
な高張寒天培地上でコロニー形成能（再生能）を
有する。この寒天培地として栄養培地、半合成培
地あるいは数種類のアミノ酸を補充した合成培地
に0.3〜0.8Mコハク酸二ナトリウムおよび0.5〜６
％ポリビニルピロリドン（分子量10000あるいは
40000）を含有させたものが好適に用いられる。 通常、半合成培地RCGP培地〔RCG培地に３
％のポリビニルピロリドン（分子量10000）と1.4
％の寒天を添加した培地、PH7.2〕を用いること
ができる。培養は25〜35℃で行うのが好ましい。
再生コロニーの出現が認められるのに要する培養
日数は菌株により差があるが、釣菌できるまでの
大きさになるのは10〜14日である。 RCGP培地でのプロトプラストの再生は菌種、
培養中途ペニシリン添加濃度およびリゾチーム処
理濃度によつて異なるが、リゾチーム処理供試正
常細胞あたり10-2〜10-4の効率である。 ２ プロトプラストへの組換え体DNAによる形
質転換 プロトプラストへの組換え体DNAの取り込み
は細胞がプロトプラスト状態を保持できる高張液
中でプロトプラストと組換え体DNAとを混合し、
これにDNA取り込み媒介作用のあるポリエチレ
ングリコール（PEG、平均分子量1540〜6000）
あるいはポリビニルアルコール（PVA、重合度
500〜1500）と二価金属陽イオンを加えて処理す
ることによつて行われる。高張条件を与える安定
化剤としては、微生物のプロトプラストの保持に
一般に使われるものでよく、例えがシヨ糖やコハ
ク酸二ナトリウムを用いることができる。PEG
およびPVAの使用可能な濃度範囲は最終濃度で
各々５〜60％、１〜20％である。二価金属陽イオ
ンは最終濃度１〜100mMのCa++、Mg++，
Mn++、Ba++、Sr++などが効果的で単独あるいは
併用することができる。処理の温度は０〜25℃が
好適である。 ３ プロトプラストの正常細胞への復帰再生と形
質転換株の選択 組換え体DNAで形質転換処理したプロトプラ
ストの再生は、前記のプロトプラストの再生と同
様に、コハク酸二ナトリウムとポリピロリドンを
含有する高張寒天培地（例えばRCGP培地）上に
プロトプラストを塗布し、正常細胞が生育できる
温度、一般に25〜35℃で培養することによつて行
われる。形質転換株は供与体DNAに由来する遺
伝子が菌に付与する形質について選択することに
よつて取得できる。この特徴的形質獲得に基づく
選択は、高張寒天培地上で再生と同時に行つても
よく、あるいは一旦非選択的に再生させてから再
生正常細胞を集め普通の低張寒天培地上で行つて
もよい。 本発明における具体的に好適な宿主菌株として
示したリゾチーム感受性菌株を用いる場合には形
質転換は上記行程１）におけるペニシリン処理を
行なわずに単に培養増殖させた細胞を直接リゾチ
ーム処理する以外は上記工程１）〜３）と同様に
行えばよい。リゾチーム感受性微生物を用いる場
合の形質転換株は再生菌あたり10-4〜10-6の高頻
度で得られる。 形質転換株は通常の栄養培地に培養することに
より導入した組換え体DNAの形質を発現させる
ことができる。組換え体DNAに遺伝子DNAまた
はベクターDNA由来の性質が付与されている場
合は、その性質にあわせて培地に薬剤を補給する
ときもある。 本発明の形質発現方法により生産されるアミノ
酸などの有用物質の採取は、発酵液からのこれら
の物質を採取する常法により行なわれる。 本発明によりコリネバクテリウム属、ブレビバ
クテリウム属微生物におけるアミノ酸、核酸、ビ
タミン、抗生物質 酵素、ペプタイド、蛋白質の
生産性の増大または新たな生産性の付与が可能と
なつた。また微生物の代謝活性を強化し、基質の
利用能を増大させ、新たな代謝活性を与え、新し
い基質の利用性を与えるなどの製造法の改良も可
能になつた。 さらに本発明における特徴は、異種遺伝子ある
いは外来性の組換えDNAをコリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属微生物において発
現させるのに成功した点にある。すなわち、実施
例に示すような大腸菌のスレオニンオペロン、フ
オスホエノールピンビン酸カルボキシラーゼ
（PPC）遺伝子、枯草菌およびブドウ状球菌で発
現する遺伝子pUB110〔Keggins K.M.，et al，．
Proc.Natl Acad.Sci.，U.S.A.75， 1423
（1978）〕のカナマイシン耐性遺伝子、コリネバク
テリウム・グルタミクムのリジン生合成に関与す
る遺伝子、ブレビバクテリウム・フラブムのアン
スラニレート合成酵素遺伝子がコリネバクテリウ
ム属菌において発現した。 例示したいずれの遺伝子も単にコリネバクテリ
ウム・グルタミクムのプラスミドに連結した形で
導入されており、コリネバクテリウム・グルタミ
クムで発現させるための特殊な操作は施していな
い。また、遺伝子を含むDNA断片を、コリネバ
クテリウム・グルタミクムのプラスミドに対し
て、いずれの向きに連結しても、コリネバクテリ
ウム・グルタミクム内で発現することから、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムは、導入された遺
伝子の転写・翻訳の開始点を正確に認識し、転
写・翻訳を遂行できる機能をもつことが明白であ
る。周知のように全ての遺伝子は、正確に転写・
翻訳が開始されるために必要な塩基配列のレベル
で類似性のある部位を有していることを考慮する
と、コリネバクテリウム・グルタミクムは、例示
した遺伝子以外の遺伝子の転写・翻訳開始点をも
認識して発現しうることが容易に推察される。 グルタミン酸高生産能を有するいわゆるグルタ
ミン酸生産菌は、主な菌学的性質を同じくしてい
るにもかかわらず、産業上の重要性から各研究者
により、種々の菌名が付されており属名までもコ
リネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウム
属などさまざまである。しかしながら、これらの
菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やDNAの塩基組
成が画一的であることから、同一の菌種であるこ
とが指摘されていた。さらに、最近、これらの菌
種間には、70〜80％以上のDNAの相同性がある
ことが明らかにされ、非常に近縁な微生物である
ことが明白である〔Komatsu，Y.：Report of
the Fermentative Research Institute，No.55，
１（1980）、およびSuzuki，K.，Keneko，T.，
and Komagata，K.：Int.J.Syst.Bacteriol.，31，
131（1981）参照〕。本明細書では組換えDNA実験
に使用できる宿主が規制されているため、本発明
の有用性はコリネバクテリウム・グルタミクムＬ
−22の誘導株を宿主として示したが上記の事実を
踏まえれば、グルタミン酸生産菌全般にそのまま
適用できることが容易に類推される。組換え体
DNAがこれら菌種において安定に保持される、
発現されためにはDNAの相同性など宿主菌の性
質における若干の相違は問題でなく、これら菌種
が当該プラスミドの自律複製と導入遺伝子の発現
を可能にする機能を有していればよい。しかる
に、これらの菌種がこの両機能を共有しているこ
とは、本発明者らが、先に開示〔特願昭56−
58186（特開昭57−183799）〕したコリネバクテリ
ウム・グルタミクム225−250から分離され、スト
レプトマイシンおよび／またはスペクチノマイシ
ン耐性遺伝子を有するプラスミドpCG4がコリネ
バクテリウム属およびブレビバクテリウム属菌種
など、グルタミン酸生産菌内で同じく複製でき、
また、その耐性遺伝子が発現される〔特願昭56−
58187（特開昭57−186492〕ことから明らかであ
る。従つて、本発明を適用し得る宿主菌として
は、コリネバクテリウム・グルタミクムに限ら
ず、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリ
ウム属菌種を含むグルタミン酸生産菌全てが包括
される。 以下に本発明の実施例および参考例を示す。 参考例 １ リジン生産菌コリネバクテリウム・グルタミク
ムATCC21543のリジン生合成に関与する遺伝子
のコリネバクテリウム・グルタミクムでのクロー
ン化と、その遺伝子の発現を利用したコリネバク
テリウム・グルタミクムによるリジンの生産： (1) コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC21543の染色体DNAとベクターpCG11の
調製： コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032から誘導され、リジンアナログであ
るＳ−（２−アミノエチル）−システイン（以下
AECと略す）に耐性を有するリジン生産性変異
株コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC21543の染色体DNAを次のようにして抽出
単離する。 400ml半合成培地SSM〔グルコース20g、（NH4）
2SO4 10g、尿素3g、酵母エキス1g、KH2PO4
1g、MgC2・6H2Ｏ 0.4g、FeSO4・7H2Ｏ 10
mg、MnSO4・４〜6H2Ｏ 0.2mg、ZnSO4・7H2
Ｏ 0.9mg、CuSO4・5H2Ｏ 0.4mg、Na2B4O7・
10H2Ｏ 0.09mg、（NH4）6Mo7O24・4H2Ｏ 0.04
mg、ビオチン30μg、サイアミン塩酸塩１mgを水
１に含みPH7.2に調整した培地〕にスレオニン
を100μg／mlとなるように補つた培地に種培養を
接種して30℃で振盪培養する。東京光電比色計で
660nmにおける吸光度（OD）を測定し、OD0.2
になつた時点で培養液中0.5単位／mlの濃度とな
るようにペニシリンＧを添加する。さらに培養を
継続しOD約0.6になるまで生育させる。 培養液から菌体を集菌し、TES緩衝液〔0.03M
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下
トリスと略す）、0.005M EDTA 、0.05M NaC
：PH8.0〕で洗浄後、リゾチーム液（25％シヨ
糖、0.1M NaC、0.05Mトリス、0.8mg／mlリゾ
チーム：PH8.0以下同じ）10mlに懸濁し37℃で４
時間反応させる。集菌した菌体から斉藤らの方法
〔Saito，H.et al：Biochim.Beiophys.Acta，72，
619（1963）〕に従つて高分子染色体DNAを単離す
る。 一方、ベクタープラスミドとして用いるpCG11
は、コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−22株
の誘導株LA103のpCG11保有株LA103／pCG11
（ATCC39022）から次のようにして単離する。 400mlNB培地（粉末ブイヨン20g、酵母エキス
5gを水１に含みPH7.2に調整した培地）で30℃
で振盪培養しOD約0.7になるまで生育させる。菌
体を集菌し、TES緩衝液で洗浄後、リゾチーム
液10mlに懸濁し、37℃で２時間反応させる。反応
液5M NaC2.4ml、0.5M EDTA（PH8.5）0.6ml、
４％ラウリ硫酸ナトリウムと0.7M NaCからな
る溶液4.4mlを順次添加し、緩やかに混和してか
ら氷水中に15時間置く。 溶菌物全体を遠心管に移し４℃で60分間、
69400×ｇの遠心分離にかけ上澄液を回収する。
これに重量百分率10％相当のポリエチレングリコ
ール（PEG）6000（半井化学薬品社製）を加え、
静かに混和して溶解後、氷水中に置く。10時間後
1500×ｇで10分間遠心分離してペレツトを回収す
る。TES緩衝液５mlを加えてペレツトを静かに
再溶解してから1.5mg／mlエチジウムブロマイド
2.0mlを添加し、これに塩化セシウムを加えて静
かに溶解し密度を1.580に合わせる。この溶液を
105000×ｇ、18℃で48時間超遠心分離にかける。
この密度勾配遠心により共有結合で閉じられた環
状のDNAは、紫外線照射することによつて遠心
チユーブ中下方の密度の高いバンドとして見出さ
れる。このバンドを注射器で遠心チユーブの側面
から抜きとることによつてpCG11DNAが分離さ
れる。次いで分画液を等容量のイソプロピルアル
コール液〔容量百分率90％イソプロピルアルコー
ル、10％TES緩衝液（この混液中に飽和溶解量
の塩化セシウムを含む）〕で５回処理してエチジ
ウムブロマイドを抽出除去し、しかる後にTES
緩衝液に対して透析する。 (2) コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC21543のリジン生合成に関与する遺伝子
のクローン化 上記で調整したpCG11プラスミドDNA3μgを
含む制限酵素Bg用反応液（10mMトリス塩
酸、7mM MgC2、60mM NaC、7mM ２−
メルカプトエタノールPH7.5）60μに６単位の
Bg（宝酒造社製）を添加し、37℃で60分間
反応後65℃で10分間加温して反応を停止する。一
方コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC21543の染色体DNA8μgを含む制限酵素
BamH反応液（10mMトリス塩素、7mM
MaC2、100mM NaC、2mM2−メルカプト
エタノール、0.01％ウシ血清アルブミン、PH8.0）
140μに４単位のBamHを添加し、37℃で60
分間反応後、65℃で10分間加温して反応を停止さ
せる。 両消化物を混合し、T4リガーゼ用緩衝液（ト
リス塩酸660mM，MaC2 66mM、ジチオスレ
イトール100mM、PH7.6）40μ、ATP（5mM）
40μ，T4リガーゼ（宝酒造社製、１単位／μ
）0.3μおよびH2Ｏ 120μを加え、12℃で
16時間反応させる。この混合物をTES緩衝液で
飽和したフエノール400μで２回抽出し、TES
緩衝液に対して透析してフエノールを除外する。 このリガーゼ反応混合物を、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムＬ−22株から誘導させたAEC
感受性のLP4株の形質転換に供する。形質転換は
LP4株のプロトプラストを用いて行なう。LP4株
の種培養をNB培地に植菌し30℃で振盪培養す
る。OD0.6になつた時点で集菌し、該細胞を
RCGP培地〔グルコース5g、カザミノ酸5g、酵母
エキス2.5g、K2HPO43.5g、KH2PO4 1.5g、
MgC2・6H2Ｏ 0.41g、FeSO4・7H2Ｏ 10mg，
MnSO4・４〜6H2Ｏ ２mg、ZnSO4・7H2Ｏ
0.9mg、（NH4）6MO7O24・4H2Ｏ 0.04mg、ビオチ
ン30μg、サイアミン塩酸塩２mg、コハク酸二ナ
トリウム135g、ポリビニルピロリドン（分子量
10000）30gを水１に含む培地〕に１mg／mlの
リゾチームを含む液（PH7.6）に約109細胞／mlと
なるように懸濁し、Ｌ型試験管に移し30℃で５時
間緩やかに振盪反応してプロトプラスト化する。 このプロトプラスト菌液0.5mlを小試験管にと
り2500×ｇで５分間遠心分離しTSMC緩衝液
（10mM塩化マグネシウム、30mM塩化カルシウ
ム、50mMトリス、40mMシヨ糖、PH7.5）１ml
に再懸濁して遠心洗浄後、TSMC緩衝液0.1mlに
再懸濁する。この菌液に２倍高濃度のTSMC緩
衝液と上記リガーゼ反応DNA混合物の１対１混
合液100μを加えて混和し、次いでTSMC緩衝
液中に20％PEG6000を含む液0.8mlを添加して混
合する。３分後、RCGP培地（PH7.2）2mlを添加
し、2500×ｇで５分間遠心分離にかけて上澄み液
を除去し、沈降したプロトプラストを１mlの
RCGP培地に懸濁してから0.2mlをスペクチノマ
イシン400μg／mlを含むRCGP寒天培地（RCGP
培地に1.4％寒天を含む培地、PH7.2）に塗抹し、
30℃で７日間培養する。 寒天培地上に生育した菌全量をかき集め生理食
塩水で洗浄後、１mlの生理食塩水に懸濁する。こ
の菌液をスレオニン２mg／ml、AEC2mg／mlおよ
びストレプトマイシン12.5μg／ml相当を含有する
最少寒天培地M1〔グルコース10g、NH4H2PO4
1g、KC 0.2g、MgSO4・7H2Ｏ 0.2g、
FeSO4・7H2Ｏ 10mg、MnSO4・４〜6H2Ｏ
0.2mg、ZnSO4・7H2Ｏ 0.9mg、CuSO4・5H2Ｏ・
0.4mg、Na2B4O7・10H2Ｏ 0.09mg、（NH4）6Mo7
O24・4H2Ｏ 0.04mg、ビオチン50μg、ｐ−アミ
ノ安息香酸2.5mg、サイアミン塩酸塩1mg、寒天
16gを水１中に含みPH7.2に調整した培地〕上に
再塗布して30℃で３日培養する。出現したコロニ
ーの中からAEC、スペクチノマイシンおよびス
トレプトマイシンに耐性の株が得られる。 これらの形質転換株の保有するプラスミドは、
前記のpCG11を単離したのと同様の方法で単離さ
れる。これらのプラスミドDNA1μgを用い、
pCG11上に切断部位のある制限酵素EcoRで完
全消化後、アガロースゲル電気泳動で解析し、生
成断片の和から分子量を同定した。分子量は同一
アガロースゲル上で同時に泳動したラムダフアー
ジDNAの制限酵素Hind消化で生成する分子量
既知の各断片の泳動距離で描かれる標準曲線に基
づいて算定する。形質転換株の一株から得られた
プラスミドpAec5は分子量10.7KbでpCG11のBg
切断部位に3.9KbのDNA断片が挿入された
組換え体屈曲プラスミドである。 pAec5DNAを用い上記と同様な方法でLP4株
のプロトプラストを形質転換してスペクチノマイ
シン耐性で選択される形質転換株は同時にAEC
耐性形質を付与されたEcoRの切断様式で判定
されるpAec5と同一のプラスミドを保有してい
る。即ちpAec5にコリネバクテリウム・グルタミ
クムATCC21543のAEC耐性形質を支配する遺伝
子がクローン化されていることが明らかである。
pAec5保有菌株は米国アメリカン・タイプ・カル
チヤー・コレクシヨンにCorynebacterium
glutamicum K17ATCC39032として寄託されて
いる。 (3) pAec5保有株によるリジンの生産 コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−22株か
ら誘導されたLP4株のpAec5保有株
（ATCC39032）と非保有株のリジン生産試験を行
なう。NB寒天培地上で生育させた菌を１白金耳
ずつ5mlの生産培地P1〔グルコース100g、（NH4）
2SO4 24.5g、 KH2PO4 1g、MgSO4・7H2Ｏ
0.4g、FeSO4・7H2Ｏ 10mg、MnSO4・４〜
6H2Ｏ 10mg、ビオチン50μg、サイアミン塩酸塩
200μg、パントテン酸カルシウム500μg、ニコチ
ン酸500μg、大豆加水分解物10g、炭酸カルシウ
ム30gを水１に含みPH7.2に調整した培地〕の入
つた試験管に植菌し30℃で75時間振盪培養する。
培養後、培地中のＬ−リジン生成量を酸性−銅ニ
ンヒドリン反応を用いる比色法によつて測定した
結果を第１表に示す。 【表】 参考例 ２ 大腸菌のスレオニン生合成に関与する遺伝子の
クローン化とその遺伝子の発現を利用したコリネ
バクテリウム・グルタミクムによるスレオニンの
生産： (1) 大腸菌スレオニンオペロンを含有するDNA
断片のクローン化とコリネバクテリウム・グル
タミクムへの導入： クローン化は大腸菌の宿主ベクター系にて実施
する。ベクターとして用いたpGA22は本プラス
ミドを作製したアンらが用いている方法〔An.G.
et al：J.Bacteriol.，140，400（1979）〕に従い、
本プラスミドを保有する大腸菌Ｋ−12株亜株の培
養菌体から単離する。供与DNAとなる高分子染
色体DNAは大腸菌Ｋ−12株（ATCC23740）の培
養菌体からスミスのフエノール抽出法〔Smith.
M.G：Method in Enzy−mology，12，part
Ａ，545（1967）〕に従つて単離する。 pGA22プラスミドDNA4μgを含む制限酵素
Hind反応液（10mMトリス塩酸、7mM MgC
2，60mM NaC、PH7.5）60μに0.4単位の
Hind（宝酒造社製、６単位／μ）を添加し
37℃で30分間反応後65℃で10分間加温して反応を
停止する。pGA22には２ケ所のHind切断部位
が存在するが、同一条件でHind消化した試料
をアガロースゲル電気泳動で調べた結果、一断片
に切断されていることが確認される。別に、染色
体DNA 8μgを含む制限酵素Hind反応液140μ
に４単位のHindを添加し37℃で60分間反応後
65℃で10分間加温して反応を停止させる。 両消化物を混合し、T4リガーゼ用緩衝液40μ
、ATP（5mM）40μ、T4リガーゼ0.3μおよ
びH2Ｏ 120μを加え、12℃で16時間反応させ
る。この混合物をTES緩衝液で飽和したフエノ
ール400μで２回抽出し、TES緩衝液に対して
透析してフエノールを除去する。 このリガーゼ反応混合物を大腸菌Ｋ−12株亜株
GT−３〔J.Bacteriol・117，133−143（1974）〕
（ホモセリンおよびジアモミピメリン酸要求性）
の形質転換に供与する。 GT−３株のコンピテント・セル（DNA取り
込み能を有する菌体）はダジエルトらの方法
〔Dagert.M.，et al：Gene.６，23（1979）〕で調
製する。即ち100μg／mlとなるようにジアミノピ
メリン酸を補つたＬ培地（バクトトリプトン
10g、酵母エキス5gを水１に含みPH7.2に調整し
た培地）50mlに植菌し、OD0.6になるまで37℃で
培養する。培養液を氷水で10分間冷却してから遠
心集菌する。冷却した0.1M塩化カルシウム20ml
に再懸濁し、０℃に20分間置く。細胞を再遠心
し、0.1M塩化カルシウム0.5mlに懸濁し０℃で18
時間置く。 塩化カルシウム処理した菌液400μに前記リ
ガーゼ反応混合物200μを添加混合し、０℃に
10分間置いてから37℃で５分間加温する。次いで
Ｌ培地９mlを添加し、37℃で２時間振盪培養す
る。生理食塩水で２回遠心洗浄後、12.5μg／ml相
当のカナマイシンを添加したM9最少寒天培地
（ブドウ糖2g、NH4Ｃ 1g，Na2HPO4 6g、
KH2PO4 3g、MgSO4・7H2Ｏ 0.1g、CaC
２・2H2O15mg、サイアミン塩酸塩４mgおよび寒天
15gを水１に含み、PH7.2に調整した培地）に塗
布し37℃で３日培養する。出現したただ一つのコ
ロニーは、アンピシリン25μg／ml、クロラムフ
エニコール25μg／mlあるいはカナマイシン
25μg／mlを含むＬ寒天培地上でも生育すること
が確認される。 この形質転換株の培養菌体から上記でpGA22
を単離したのと同一の方法によりプラスミド
DNAを単離する。このプラスミドDNAを用い制
限酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析した
結果、第１図にpGH2として示した構造を有して
いる。pGA22に挿入されたDNA断片は既にクス
ーン化された大腸菌オペスン含有DNA断片
〔Cossart，P.，et al：Molec.Gen.，Genet.，
175，39（1979）参照〕と同一の制限酵素切断部位
を有していることからpGH2がスレオニンオペロ
ンを含有することが確認される。 次にpCG11とpGH2の組換え体を作製する。ま
ず、pCG11とpGH2を各々Bg、および
BamHで適正条件下完全消化する。各プラス
ミドDNA2μgを含む消化物を混合し、総容量
200μに対してT4リガーゼ用緩衝液40μ、
ATP（5mM）40μ，T4リガーゼ0.2μおよび
H2Ｏ 120μを加え12℃で16時間反応させる。
この混合物をTES緩衝液で飽和したフエノール
400μで２回抽出しTES緩衝液に対して透析し
てフエノールを除去する。続いて２倍高濃度の
TSMC緩衝液と前記リガーゼ反応混合物の１対
１混合液100μを供与DNAとして用い、参考例
１(1)と同様な方法でコリネバクテリウム・グルタ
ミクムLA201株（LA103の誘導株、ホモセリン、
ロイシン要求株）のプロトプラストを形質転換し
た後、RCGP寒天培地に塗抹し、30℃で６日間培
養して再生増殖させる。寒天培地上全面に生育し
た菌をかき集め、生理食塩水で遠心洗浄後、ロイ
シン50μg／mlを補充した最少寒天培地M1上に再
塗布して、30℃で３日間培養する。出現したコロ
ニーの中からカナマイシン12μg／mlあるいはス
ペクチノマイシン100μg／mlを含むNB寒天培地
上で生育できる株が得られる。 これらの形質転換株から参考例１(1)記載のエチ
ジウムブロマイド、セシウムクロライド密度勾配
遠心によりプラスミドを単離する。 これらのプラスミドDNA0.5μgを用い各種制限
酵素による単独消化および二種類の制限酵素によ
る二重消化で生成するDNA断片をアガロースゲ
ル電気泳動で解析し、分子量およびプラスミド分
子中の各制限酵素切断部位を同定する。一株から
得られたプラスミドをpEthr1と命名した。制限
酵素pst、EcoR，およびXhoの切断部位で
特徴づけられる構造を第３図に示す。pEthr1は
pCG11にpGH2のスレオニンオペロンを含む、
BamH切断片を結合した構造を有することが
判明した。 pEthr1DNAを用いて、コリネバクテリウム・
グルタミクムLA103株を前記と同様に再形質転換
した結果、ホモセリン非要求性とカナマイシンお
よびスペクチノマイシン耐性形質が連関して導入
され、それらの形質転換株は、各種制限酵素切断
様式で特徴づけられるpEthr1と同一のプラスミ
ドを保有している。ホモセリンデヒドロゲナーゼ
の欠失に起因するLA103株のホモセリン要求性が
pEthr1によるホモセリン非要求性に復帰するの
は、大腸菌スレオニンオペロン上にあるホモセリ
ンデヒドロゲナーゼが発現しているためにほかな
らない。 (2) pEthr1保有株の造成 コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−22株よ
り誘導したスレオニン生産菌、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムLA−106（メチオニン要求性、
AEC耐性、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸
耐性）のpEthr1保有株は、LA−106のプロトプ
ラストをpEthr1で形質転換することによつて得
られる。 プロトプラストはLA−106株を半合成培地
SSMに100μg／ml相当のメチオニンを補つた培地
で培養し、OD約0.6まで生育させた細胞を参考例
１(2)と同様な工程で処理することにより調製す
る。形質転換も参考例１(2)と同様に行ないスペク
チノマイシン400μg／mlを含むRCGP寒天培地上
で選択して形質転換株を取得する。pEthr1保有
菌株は米国アメリカン・タイプ・カルチヤー・コ
レクシヨンにCorynebacterium glutamicum
K19 ATCC39034として寄託されている。 (3) pEthr1保有株によるスレオニンの生産 上記のようにして得たLA−106株のpEthr1保
有株（ATCC39034）と非保有株のスレオニン生
産試験を行なう。NB寒天培地上で生産させた菌
を１白金耳ずつ5mlの生産培地P2〔グルコース
100g、（NH4）2SO420g、KH2PO40.5g、K2HPO4
0.5g、MgSO4・7H2O1g、FeSO4・7H2O10mg、
MnSO4・４〜6H2O10mg、ビオチン100μg、炭酸
カルシウム20g、メチオニン100mgを水１に含
みPH7.2に調整した培地〕の入つた試験管に植菌
し30°Cで75時間振盪培養する。培養後、培養液
をペーパークロマトグラフイーにかけニンヒドリ
ン発色後、比色定量してＬ−スレオニン生成量を
測定した。結果を第２表に示す。 【表】 参考例 ３ 大腸菌のフオスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼ（PPC）遺伝子を含む組換え体プラス
ミドを保有するコリネバクテリウム・グルタミク
ムによるグルタミン酸の生産： (1) 大腸菌のPPC遺伝子（本遺伝子は大腸菌で
Glu-をGlu+にすることが知られているグルタ
ミン酸生合成に関与する遺伝子である）を含有
するDNA断片のクローン化とコリネバクテリ
ウム・グルタミクムへの導入： クローン化は大腸菌の宿主・ベクター系にて実施
する。ベクターとして用いたpBR322は参考例２
(1)でpGA22を調製したのと同一の方法で大腸菌
Ｋ−12株亜株の培養菌体から単離する。供与
DNAとなる高分子染色体DNAは参考例２(1)で大
腸菌Ｋ−12株（ATCC23740）から調製したもの
を使用する。 pBR322プラスミドDNA3μgおよび染色体
DNA9μgを含む制限酵素Sal用反応液（10mM
トリス塩酸、7mM MgC2、100mM NaC、
7mM ２−メルカプトエタノール、0.01％ウシ血
清アルブミン、PH7.5）200μに10単位のSal
（宝酒造社製）を添加し、37℃で60分間反応後、
65℃で10分間加温して反応を停止させる。この混
合消化物にT4リガーゼ用緩衝液40μ、ATP
（5mM）40μ、T4リガーゼ0.4μおよび水120μ
を加え、12℃で16時間反応させる。この混合物
をTES緩衝液で飽和したフエノール400μで２
回抽出し、TES緩衝液に対して透析しフエノー
ルを除去する。 このリガーゼ反応混合物を大腸菌Ｋ−12株亜株
PPC2〔Glansdorff，N.，Genetics，51，167
（1965）〕（arg-，thr-，leu-，his-，Thi-，
PPC-，STR）の形質転換に供する。PPC2株のコ
ンピテント・セルは２mg／mlのグルタミン酸を補
つたＬ培地で培養し、参考例２(1)でGT−３株の
コンピテント・セルを得たのと同様に調製する。
形質転換は前記リガーゼ反応混合物200μを使
用し、参考例２(1)と同様に行う。Ｌ培地９mlを添
加し、37℃で２時間振盪培養して形質発現させ
る。次いで生理食塩水で２回遠心洗浄後、アルギ
ニン、スレオニン、ロイシン、ヒスチジン各
50μg／mlを補つたM9最少寒天培地に塗布し、37
℃で３日間培養する。出現したコロニーをアンピ
シリン25μg／mlあるいはテトラサイクリン
25μg／mlを含むＬ寒天培地上にレプリカし、37
℃で24時間培養してアンピシリン耐性でテトラサ
イクリン感受性のものを選び出す。 これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様
の方法でプラスミドDNAを単離する。形質転換
株の一株から得られたプラスミドpPC1を制限酵
素消化とアガロースゲル電気泳動で解析した結
果、pBR322のSal1切断部位に4.4KbのDNA断片
が挿入されたゲノムサイズ8.8Kbの組換え体プラ
スミドであることが判明した。 このpPC1プラスミドを用いてPPC2株を前記と
同様な方法で形質転換し、アンピシリン耐性で選
択される形質転換株は全てグルタミン酸非要求性
で、制限酵素切断様式で特徴づけられるpPC1と
同一構造のプラスミドを保有している。このこと
はpPC1プラスミド上に大腸菌のPPC遺伝子がク
ローン化されていることを示す。 クローン化されたPPC遺伝子をコリネバクテ
リウム・グルタミクムに導入するために、pCG11
とpPC1の組換え体を宿主大腸菌で調製する。
pCG11およびpPC1プラスミドDNAを各々2μg含
む制限酵素Pst用反応緩衝液〔20mMトリス塩
酸、10mM MgC2、50mM（NH4）2SO4、0.01％
ウシ血清アルブミン、PH7.5〕200μに４単位の
Pst（宝酒造社製）を添加し、30℃で60分間反
応後、65℃で10分間加温して反応を停止させる。
この反応混合物にT4リガーゼ用緩衝液40μ、
ATP（5mM）40μ，T4リガーゼ0.2μおよび水
120μを加え、12℃で16時間反応させる。前記
と同様にフエノール抽出後、透析してフエノール
を除去する。このリガーゼ反応混合物100μを
使用し、前記と同様にPPC2株を形質転換した。 生じたコロニーから前記の方法でプラスミドを
分離し、その大きさをアガロースゲル電気泳動で
調べた。大きさが約15〜16Kbのプラスミドを選
択し、そのプラスミドで再度PPC2株を形質転換
しPPC遺伝子の存在を確認した。先の形質転換
株の一株から得られたプラスミドpEppc1を制限
酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析した結
果、pCG11とpPC1が両者のPst切断部位で和合
連結したゲノムサイズ15.6Kbの組換え体プラス
ミドであることが明示された。こうして大腸菌で
調製されたpEppc1プラスミドDNAを用い、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムＬ−22株から誘導
されたLP4株を形質転換する。形質転換は参考例
１(2)と同様に行い、形質転換株はスペクチノマイ
シン400μg／mlを含むPCGP寒天培地上で生育す
るコロニーの中から取得される。これらの形質転
換株から単離されるプラスミドを制限酵素Sal
あるいはPstの単独消化または両者の２重消化
し、アガロースゲル電気泳動で解析することによ
りpEppc1を保有していることが確認される。 pEppc1保有菌株は米国アメリカン・タイプ・
カルチヤー・コレクシヨンにCorynebacteruim
glutamicum Ｋ−18ATCC39033として寄託され
ている。 (2) pEppc1保有株によるグルタミン酸の生産： コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−22株から
誘導されたLP4株pEppc1保有株（ATCC39033）
と非保有株のグルタミン酸生産試験を行つた。
NB寒天培地上で生育させた菌をかき集め、生理
食塩水で洗浄後、5mlの生産培地P3〔グルコース
50g、（NH4）2SO4 3g，尿素3g、KH2PO4
0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4・7H2Ｏ 0.5g、
FeSO4・7H2Ｏ 10mg、MnSO4・４〜6H2Ｏ 10
mg、ビオチン3μg、サイアミン塩酸塩500μg、フ
エノールレツド10mgを純水１に含み、PH7.2に
調整した培地〕の入つた試験管に植菌し、30℃で
振盪培養する。培養中、20％尿素液を0.2mlずつ
３回添加し、40時間培養する。培養後、培養液
をペーパークロマトグラフイーにかけ、ニンヒド
リン発色後、比色定量してＬ−グルタミン酸の生
成量を測定した。 結果を第３表に示す。 【表】 参考例４ ブレビバクテリウム・フラブム ATCC14067のアンスラニル酸合成酵素遺伝子
のコリネバクテリウム・グルタミクムでのクロ
ーン化と発現： ブレビバクテリウム・フラブムATCC14067の染
色体DNAを参考例１(1)と同様の方法で調製する。
ベクターとして用いるpCE53は参考例１(1)で
pCG11を単離したのと同様の方法でその保有株コ
リネバクテリウム・グルタミクムＬ−22株の培養
菌体から単離する。pCE53は本発明者らが先に開
示したコリネバクテリウム・グルタミクムのプラ
スミドpCG1〔特願昭56−18101（特開昭57−
134500）〕と大腸菌のプラスミドpGA22〔An，G.
et al.：J.Bacteriol.，140，400（1979）参照〕を
和合連結させたプラスミドである。詳しくは
pCG1上に１ケ所しかないBg切断部位と
pGA22上に２ケ所あるBamH切断部位のうち
テトラサイクリン耐性遺伝子内でないBamH
切断部位とで、両制限酵素の同一接着末端を利用
して連結したものである。pCE53はpGA22由来
のカナマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーを
有し、制限酵素Salに対する切断部位は１ケ所
である。 上記で調製したpCE53プラスミドDNA3μgおよ
び染色体DNA9μgを含む制限酵素Sal反応液
200μに10単位のSalを添加し、37℃で60分間
反応後、65℃で10分間加温して反応を停止させ
る。この混合消化物にT4リガーゼ用緩衝液40μ
、ATP（5mM）40μ，T4リガーゼ0.4μおよ
びH2O120μを加え、12℃で16時間反応させる。
この混合物をTES緩衝液で飽和したフエノール
400μで抽出し、TES緩衝液に対して透析し、
フエノールを除去する。 このリガーゼ反応混合物を形質転換に供する。
形質転換する受容菌としてコリネバクテリウム・
グルタミクムＬ−22株から誘導されたアンスラニ
ル酸要求性変異株LA105（アンスラニル酸合成酵
素欠損変異株）を用いる。アンスラニル酸要求性
変異株は、常法の変異処理により、M1寒天培地
上で生育できず、アンスラニル酸（30μg／ml相
当）を補つたM1寒天培地上で生育できる菌を選
択することによつて取得される。LA105株のプロ
トプラストの調製および形質転換は、生育培地
NBに100μg／ml相当のアンスラニル酸を補つた
培地を使用する以外は参考例１(2)と同様に行う。
形質転換株は、カナマイシン200μg／ml相当を含
むRCGP寒天培地上で生育するコロニーとして選
択される。出現したコロニーの中からM1寒天培
地上で生育できる形質転換株が得られる。 これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様
にプラスミドDNAを単離する。形質転換株の一
株から得られたプラスミドpTrp2−３を各種制限
酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析した結
果、pCE53の唯一のSal切断部位に約7.1Kbの
SalDNA切断片が挿入されたプラスミドである
ことがわかつた。 pTrp2−３を用い、同様な方法でLA105株を再
形質転換したところ、トリプトフアン100μg／ml
およびカナマイシン400μg／mlを含むRCGP寒天
培地上で生育するコロニーは、同時にアンスラニ
ル酸非要求性となり、それらは、Salの切断様
式で判定されるpTrp2−３と同一のプラスミドを
保有している。 以上の結果は、クローン化された約7.1Kbの
SalDNA切断片にはブレビバクテリウム・フラ
ブムATCC14067のアンスラニル酸合成酵素をコ
ードする遺伝子が存在し、それがコリネバクテリ
ウム・グルタミクムLA105株中で発現しているこ
とを示す。 pTrp2−３保有菌株は米国アメリカン・タイ
プ・カルチヤー・コレクシヨンに
Corynebacterium glutamicum K20ATCC39035
として寄託されている。 プラスミドpCE52を用いて上記と同様の処理を
行い、ブレビバクテリウム・フラバム
ATCC14067のアンスラニル酸合成酵素をコード
する遺伝子を有するプラスミドpTrp4−３を得
る。 pEC52は本発明者らが先に開示したコリネバク
テリウム・グルタミクムのプラスミドpCG1〔特願
昭56−18101（特開昭57−134500）〕と大腸菌のプ
ラスミドpGA22〔An，G.et al．：J.Bacteriol.
140，400（1979）参照〕を和合連結させたプラス
ミドである。詳しくはpCG1上に１カ所しかない
Bg切断部位とpGA22上に２カ所あるBamH
切断部位のうちテトラサイクリン耐性遺伝子内
のBamH切断部位とで、両制限酵素の同一接
着末端を利用して連結したものである。pCE52は
pGA22由来のカナマイシン耐性遺伝子などの選
択マーカーを有し、制限酵素Salに対する切断
部位は１カ所である。 pCE52は参考例１(1)でpCG11を単離したのと同
様の方法でpCE52保有株コリネバクテリウム・グ
ルタミクムＬ−22株の培養菌体から単離する。 上記と同様にトリプトフアン生産性のコリネバ
クテリウム・グルタミクムK36株（FERM BP−
451）をpTrp4−３で形質転換する。得られた形
質転換株は米国アメリカン・タイプ・カルチヤ
ー・コレクシヨンにCorynebacterium
glutamicum K31，ATCC39280として寄託され
ている。 pTrp2−３保有株コリネバクテリウム・グルタ
ミクムK20，ATCC39035およびpTrp4−３保有
株同 K31，ATCC39280によるＬ−トリプトフ
アン生産試験を下記のとおり行う。 菌株をNB液体培地中で30℃、16時間振盪培養
した菌液0.5mlを５mlの生産培地P4〔廃糖蜜100g／
、（NH4）2SO4 20g／、KH2PO4 0.5g／
、K2HPO4 0.5g／、MgSO4・7H2Ｏ
0.25g／、CaCO3 20g／、PH7.2〕の入つた
試験管に植菌し、30℃で96時間振盪培養する。 培養後、培養液をペーパークロマトグラフイ
ーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量して、
Ｌ−トリプトフアンの生成量を測定する。 対照として、LA−105株およびLAR−１株を
同様に処理する。 結果を第４表に示す。 【表】 参考例５ pCB101の作製： (1) CG11とpUB110の分離 pCG11は、本プラスミドを保有するコリネバ
クテリウム・グルタミクムLA103／pCG11
（ATCC39022）を400mlNB培地でOD約0.8に
なるまで生育させ、その培養細胞から、参考例
１(1)でpCG2を単離したのと同一の方法で単離
する。 pUB110は、グリクザンらの方法〔Gryczan，T.
J.et al，：J.Bacteriol.，134，318（1978）参照〕
により、本プラスミドを保有するバチルス・サチ
ルスBR151／pUB110〔Proc.Natl.Acad.Sci，
USA，75，1423（1978）〕の培養菌体から単離す
る。 (2) CG11とpUB110の試験管内組換え 上記で調製したpCG11プラスミドDNA2μg
を含む制限酵素Bg反応緩衝液（10mMト
リス塩酸、7mM MgC2，60mM NaC，
7mM ２−メルカプトエタノール，PH7.5）
100μに２単位のBg（宝酒造社製、６単
位／μ）を添加し、37℃で60分間反応させ
る。また、pUB110プラスミドDNA2μgを含む
制限酵素BamH反応緩衝液（10mMトリス塩
酸、7mM MgC2、100mM NaC、2mMメ
ルカプトエタノール、0.01％ウシ血清アルブミ
ン、PH8.0）100μに２単位のBamH（宝酒
造社製、６単位／μ）を添加し、37℃で60分
間反応させる。 両制限酵素消化物を混合し、T4リガーゼ緩
衝液40μ、ATP（5mM）40μT4リガーゼ
0.2μおよびH2Ｏ 120μを加え、12℃で16
時間反応させる。この混合物を、TES緩衝液
で飽和したフエノール400μで２回抽出し、
TES緩衝液に対して透析したフエノールを除
外する。 (3) pCB101の取得 ２倍高濃度のTSMC緩衝液と上記リガーゼ
反応混合物の１対１混合液100μを供与DNA
として用い、参考例１(3)と同様な方法で、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムLA103を形質転
換し、カナマイシン耐性株を選択する。出現し
たコロニーをカナマイシン12.5μg／mlあるいは
スペクチノマイシン100μg／mlを含むNB寒天
培地上にレプリカし、30℃で２日培養して生育
した二重耐性形質転換株３株を任意に選び、同
一寒天培地上で純化する。この３株を400μ
NB培地で、OD約0.8になるまで生育させ、集
菌後、その培養細胞から参考例１(1)記載のエチ
ジウムブロマイド−セシウムクロライド密度勾
配遠心によりプラスミドを単離する。いずれの
形質転換株からも30〜35μgのプラスミドDNA
が得られる。 これらのプラスミドDNAを参考例１(3)と同
じように制限酵素消化とアガロースゲル電気泳
動で解析し、分子量と制限酵素Pst、EcoR
、HincおよびBgの切断点を同定す
る。３株のプラスミドは全てpCG11とpUB110
が和合連結した構造を有し、そのうち二種は第
２図にpCB101で示した構造であるが、他の一
種は結合向きが逆向きである。 いずれのプラスミドを有する形質転換株も
pCG11由来のスペクチノマイシン耐性形質と
pUB110由来のカナマイシン耐性形質を有して
いる。 これらのプラスミドDNAを用い、コリネバ
クテリウム・グルタミクムLA103株を再形質転
換した結果得られたカナマイシン耐性形質転換
株は、スペクチノマイシン耐性形質を同時に獲
得しており、各種制限酵素切断様式で特徴付け
られる供与プラスミド同一のプラスミドを保有
している。 実施例 １ コリネバクテリウム・グルタミクムC156株の
Ｌ−ヒスチジン生合成に関与する遺伝子のクロ
ーン化および該遺伝子の発現を利用したコリネ
バクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリ
ウム、ハーキユリス、ブレビバクテリウム・フ
ラブムおよびブレビバクテリウム・ラクトフア
ーメンタムによるＬ−ヒスチジンの生産： (1) コリネバクテリウム・グルタミクムC156株
の染色体DNAとプラスミドpCG11の調製： １，２，４−トリアゾール−３−アラニン耐性
でヒスチジン生産能をコリネバクテリウム・グル
タミクムC156株（FERM BP−453）の染色体
DNAを参考例１(1)と同様の方法で調製する。 一方、ベクタープラスミドとして用いるpCG11
は、コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−22株
の誘導株LA103のpCG11保有株LA103／pCG11
（ATCC39022）から参考例１(1)と同様にして単離
する。 (2) コリネバクテリウム・グルタミクムC156株
のヒスチジン生合成に関与する遺伝子のクロー
ン化： 上記で調製したpCG11プラスミドDNA3μgお
よび上記染色体DNA9μgを含む制限酵素Bg
用反応液〔10mMトリス（PH7.5）、7mM MgC
２、60mM NaC、7mM2−メルカプトエタノー
ル〕200μに10単位のBg（宝酒造社製）を
添加し、37℃で60分間反応後、65℃で10分間加温
して反応を停止させる。この混合消化物にT4リ
ガーゼ用緩衝液（トリス200mM、MgC2
66mM，ジチオスレイトール100mM、PH7.6）
40μ、5mMATP溶液40μ、T4リガーゼ（宝
酒造社製、１単位／μ）0.3μおよび水120μ
を加え、12℃で16時間反応させる。 T4リガーゼ反応混合物をコリネバクテリウ
ム・グルタミクムLH33株（ヒスチジン要求性、
リゾチーム感受性）の形質転換に供する。 形質転換はLH33株のプロトプラストを用いて
行う。プロトプラストの調製は参考例１(2)と同様
に行う。 プロトプラスト懸濁液0.5mlを小試験管にとり
2500×ｇで５分間遠心分離し、TSMC緩衝液
（10mM塩化マグネシウム、30mM塩化カルシウ
ム、50mMトリス、400mM シヨ糖、PH7.5）１
mlに再懸濁して遠心洗浄後、TSMC緩衝液0.1ml
に再懸濁する。この懸濁液に２倍濃度のTSMC
緩衝液と上記リガーゼ反応DNA混合物の１対１
混合液100μを加えて混和し、次いでTSMC緩
衝液中に20％PEG6000を含む液0.8mlを添加して
混合する。３分後、RCGP培地（PH7.2）2mlを添
加し、2500×ｇで５分間遠心分離にかけて上澄み
液を除去し、沈降したプロトプラストを１mlの
RCGP培地に懸濁してから0.2mlをスペクチノマ
イシン400μg／mlを含むRCGP寒天培地（RCGP
培地に1.4％寒天を含む培地、PH7.2）に塗抹し、
30℃で７日間培養する。 選択プレート上に生育したスペクチノマイシン
耐性コロニーをかき集め、生理食塩水を用いて２
回遠心洗浄後、スペクチノマイシン100μg／mlを
含む最少寒天培地M1に塗布して30℃で２日間培
養し、スペクチノマイシン耐性でかつヒスチジン
非要求性となつた形質転換株を選択する。 形質転換株の１株から参考例１(1)記載のエチジ
ウムブロマイド・セシウムクロライド密度勾配遠
心によりプラスミドを単離する。各種制限酵素に
よる単独消化および２種類の制限酵素による二重
消化で生成するDNA断片をアガロースゲル電気
泳動で解析し、このプラスミドDNAの制限酵素
切断様式を同定する。このプラスミドをpPH8と
命名した。pPH8はpCG11のBg切断部位に約
10.6KbのDNA断片が挿入された構造である。 さらにpPH8DNAを用いてH33株〔LH33株の
親株（ヒスチジン要求性、リゾチーム耐性）：
FERM BP−452〕を再形質転換したところスペ
クチノマイシン耐性株として選択される形質転換
株のすべてがヒスチジン非要求性となつていた。
これらのことより、ヒスチジン生産菌C156株の
ヒスチジン生合成に関与する遺伝子がクローン化
されていることが明白である。 ヒスチジン生成に関与する遺伝子のクローニン
グは最初からH33株を宿主菌株として用いて行う
こともできる。 (3) pPH8を保有するコリネバクテリウム・グル
タミクム菌体によるＬ−ヒスチジンの生産： コリネバクテリウム・グルタミクムLA−103株
（FERM Ｐ−5947、ATCC31866）をpPH8DNA
で形質転換し、スペクチノマイシン400μg／mlを
含むRCGP寒天培地上で同薬剤耐性の形質転換株
を選択する。得られた形質転換株を純化後、上記
と同様にプラスミド単離、構造解析を行つて、
pPH8と同じ構造のプラスミドであることを確認
した。 pPH8保有株コリネバクテリウム・グルタミク
ムLA103／pPH8は米国アメリカン・タイプ・カ
ルチヤー・コレクシヨンにCorynebacterium
glutamicumK32，ATCC39281として寄託されて
いる。 コリネバクテリウム・グルタミクムLA103／
pCG11（ATCC39022）および同LA103／pPH8
（ATCC39281）のＬ−ヒスチジン生産試験を以下
のとおり行う。 NB寒天培地上で30℃一晩培養した上記の菌を
それぞれ１白金耳ずつ200μg／mlのアルギニンお
よびメチオニンを補つた5mlの生産培地P5〔糖蜜
12％（糖として）、KH2PO4 0.2％、K2HPO4
0.1％、MgSO4・7H2O0.05％、NaC 0.25％、
（NH4）2SO4 2.3％、尿素0.2％、CaCO3 ２％、
PH7.4（アンモニアで調整）〕に植菌する。30℃で
75時間培養後、培地中のＬ−ヒスチジン生成量を
スルフアニル酸（ポーリー）試薬を用いる比色法
〔H.Pauly、Hoppe−Seylers；Z.Physiolo.
Chem.，42，508（1904），同94，284（1915）〕によ
つて定量した。結果を第５表に示す。 【表】 (4) pPH8を保有するコリネバクテリウム・ハー
キユリス、ブレビバクテリウム・フラブムおよ
びブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
によるＬ−ヒスチジンの生産： コリネバクテリウム・ハーキユリス
ATCC13868、ブレビバクテリウム・フラブム
ATCC14067およびブレビバクテリウム・ラクト
フアーメンタムATCC13869にプラスミドpPH8
を保有させるために各菌株を受容菌として形質転
換を行う。 各菌株をSSM培地で増殖させ、OD660nmが0.2
になつたときにペニシリンＧを0.3単位／mlとな
るように添加する。培養を続け、OD660nmが0.6
まで増加したところで集菌し、１mg／mlリゾチー
ムを含むRCGP培地中で上記の記載と同様にプロ
トプラストを形成させる。pPH8を用い、上記の
方法に従い形質転換を行い、形質転換株をスペク
チノマイシン400μg／mlを含むRCGP寒天培地上
で生育するコロニーとして選択する。 純化したスペクチノマイシン耐性形質転換株の
培養菌体よりプラスミドDNAを特開昭57−
183799、同57−134500の記載に従つて調製し、こ
れらがpPH8と同じ構造をすることが制限酵素切
断様式より確認される。以上のことから、プラス
ミドpCG1の誘導体であるプラスミドpPH8はコ
リネバクテリウム・ハーキユリス、ブレビバクテ
リウム・フラブムおよびブレビバクテリウム・ラ
クトフアーメンタム中でも複製可能であり、プラ
スミドpCG11が広くこれら菌種の細菌で使用可能
であるこがわかる。 pPH8保有株であるコリネバクテリウム・ハー
キユリスK33、ブレビバクテリウム・フラブム
K34、およびブレビバクテリウム・ラクトフアー
メンタムK35はそれぞれ米国アメリカン・タイ
プ・カルチヤー・コレクシヨンにATCC39282、
39283および39284として寄託されている。 これら菌株によるＬ−ヒスチジン生産試験を次
のように行う。 NB寒天培地上で30℃一晩培養させたpPH8保
有株およびそれらの親株をそれぞれ１白金耳ずつ
５mlの生産培地P5に植菌する。30℃で75時間振
盪培養後、培地中のＬ−ヒスチジン生産量をポー
リー法によつて比色定量する。結果を第６表に示
す。 【表】 以上より、コリネバクテリウム・グルタミクム
由来のヒスチジン生成に関与する遺伝子がコリネ
バクテリウム・グルタミクム以外にコリネバクテ
リウム・ハーキユリス、ブレビバクテリウム・フ
ラブム、ブレビバクテリウム・ラクトフアーメン
タムの諸菌種において発現し、ヒスチジンの生産
に寄与していることが明らかであつた。
さらに詳細には本発明は少なくとも一種の遺伝子
を含むDNA断片とベクターDNAとの組換え体
で、かつ両DNAの少なくとも一方が宿主菌株に
対して外来性である組換え体DNAを用いコリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換して
得られる形質転換株を培地に培養し、該遺伝子の
形質を発現させることを特徴とする遺伝子の形質
発現方法に関する。 組換え遺伝子技法は大腸菌を宿主として確立さ
れ、現在までにソマトスタチン、インシユリン、
ヒト成長ホルモン、ヒトインターフエロン−α、
ヒトインターフエロン−β、口蹄病ワクチンなど
のペプタイドやワクチンなどの製造が可能である
ことが示された。生理活性の高いこれらペプタイ
ドやワクチンの発現の宿主として大腸菌は多くの
場合十分であると考えられるが、さらに高い生産
性、菌体外への分泌、グリコシル化を求めあるい
は菌体内毒素の混入を避けるため、酵母や枯草菌
なども宿主として開発されてきている。 ペプタイド、蛋白質などの生理活性物質を生産
する場合は、上記のような既に組換えDNA技法
が確立されているか、その基礎が整つている菌株
を利用すればよいが、アミノ酸、核酸、ビタミ
ン、抗生物質などの物質の工業的生産性の向上を
組換えDNA技法により行う場合には、同技法を
従来使用されているそれぞれの生産菌に適用する
工夫が必要である。 コリネバクテリウム・グルタミクムは微生物に
よるアミノ酸の工業的製造に最初に用いられた微
生物で、以後コリネバクテリウム属を含むコリネ
フオルムバクテリアによるグルタミン酸、リジ
ン、アラニル、ヒスチジン、トリプトフアン、チ
ロシン、フエニルアラニン、スレオニン、イソロ
イシン、バリン、ロイシン、グルタミン、プロリ
ン、アルギニンなどのアミノ酸の工業的生産が開
発され、今日ではほとんどのアミノ酸は微生物に
より生産されるに至つている。 従つてこれら微生物における組換えDNA技法
の確立は、今後アミノ酸生産の向上のために極め
て重要であると考えられる。 組換えDNA技法は、例えば (1) 制限酵素による目的遺伝子を含むDNAの断
片化 (2) 同一制限酵素によるベクターDNAの単一切
断による直鎖状化 (3) 上記(1)、(2)の生成物の混合によるアニーリン
グとDNAリガーゼを用いる連結による組換え
体DNAの作成 (4) 上記組換え体DNAの宿主菌株への導入（形
質転換） (5) 目的遺伝子を含む組換え体の選択されたクロ
ーンの純化 の各段階によりなる。このようにして得られる組
換え体保有株の造成の効率は、上記各段階の積と
もいうべきもので各段階を検証する手段を準備
し、各段階の効率を知りこれを向上することなし
には目的遺伝子の発現可能な形質転換株を得るこ
とができない。またこのようにして目的遺伝子を
含む組換え体DNAを有する形質転換株が得られ
たとしても、該遺伝子が宿主菌株に対して外来性
である場合には該遺伝子の発現に際し種々の障壁
があることが知られており〔“化学と生物”18，
110〜118（1978）〕その発現を行わせることは非常
に困難である。 コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属する微生物を宿主として用い、これに該
宿主に対して外来性である目的遺伝子またはベク
ターを含む組換え体DNAを導入して該目的遺伝
子の形質を発現させた例は今まで全く知られてい
ない。 コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属する微生物を宿主とする組換えDNA技
法においても、これら微生物中で自律複製し、選
択可能な表現型を有し、多くの遺伝子のクローニ
ングに用いうるベクター系の造成と、効率のよい
形質転換系の確立が必要である。さらに上記した
ような障壁の解消方法の確立が必要である。 本発明者らは先にコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物中で自律複
製し、選択可能な表現型と適当なクローニング部
位を有するプラスミドベクターを造成する一方効
率の高い形質転換系を開発した〔特願昭56−
58186（特開昭57−183799）、同56−58187（特開昭
57−186492）、同56−65777（特開昭57−186489）〕。
そこで本発明者らは該プラスミドベクターに既に
知られているインビトロにおけるDNA組換え技
法（U.S.Patent4237224）を用い、アミノ酸の生
合成に関与する外来性遺伝子を含むDNA断片を
連結し、開発した形質転換系を用いてコリネバク
テリウム・グルタミクムＬ−22株またはその誘導
株を形質転換したところ、該外来性遺伝子が該宿
主中で形質を発現され、アミノ酸などの有用物質
の生産の増大に利用することができることを見出
し本発明を完成するに至つた。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明は少なくとも一種の遺伝子を含むDNA
断片とベクターDNAとの組換え体で、かつ両
DNAの少なくも一方が宿主菌株に対して外来性
である組換え体DNAを用いコリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属に属する微生物か
ら選ばれる宿主菌株を形質転換して得られる形質
転換株を培地に培養し、該遺伝子の形質を発現さ
せる方法を提供する。 本発明に用いる遺伝子を含むDNA断片として
は、真核生物、原核生物、ウイルス、バクテリオ
フアージまたはプラスミドに由来し少なくとも一
種の完全な遺伝子を含むDNA断片があげられる。
真核生物に由来する遺伝子としては哺乳類とくに
ヒトのインターフエロン、インシユリン、生長ホ
ルモンなどのペプタイドをコードする遺伝子など
があげられる。原核生物に由来する遺伝子として
は細菌とくにエツシエリヒア属、コリネバクテリ
ウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属また
はスタフイロコツカス属に属する細菌の菌株に由
来する遺伝子で、細胞の代謝、とくに合成活性に
関与する遺伝子などがあげられる。細胞の代謝ま
たは合成活性とは、アミノ酸、ビタミン、核酸ま
たは抗生物質などの合成ならびにその合成に関与
する代謝系を意味し、本発明においてはアミノ酸
とくにグルタミン酸、リジン、スレオニン、ヒス
チジンまたはトリプトフアンの生合成活性が好適
にあげられる。 また目的とするペプタイド、蛋白質などのアミ
ノ酸組成が知られているときは、相当するDNA
を合成して用いることもできる。DNA合成方法
はたとえば、K.Itakura et al，Science 198，
1056（1977）に記載の方法に従つて行なうことが
できる。 本発明に用いるベクターとしては、宿主菌と和
合性（compatible）で自律増殖できるものでな
くてはならない。具体例としては本発明者らがコ
リネバクテリウム属に属する微生物から採取し
た、または採取したものを誘導して造成した
pCG1〔特願昭56−18101（特開昭57−134500）〕、
pCG2〔特願昭56−133557（特開昭58−35197）〕、
pCG4〔特願昭56−58186（特開昭57−183799）〕、
pCE53、pCE54、pCG11、pCB101、pEthrlなど
があげられる。 これらプラスミドを保有する菌株はそれぞれ下
記の寄託番号で工業技術院微生物工業技術研究所
ならびに米国アメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨンに寄託されている。 【表】 好適にはpCG11、pCE54が用いられる。pCG11
は本発明者らが先に開示〔特願昭56−18101（特開
昭57−134500）〕したプラスミドで、コリネバク
テリウム・グルタミクム225−57（ATCC31808、
FERM−P5865）から分離されたプラスミド
pCG1における制限酵素Bgのただ一つの切断
部位に、コリネバクテリウム・グルタミクム225
−250（ATCC31830、FERM−P5939）から分離
されたプラスミドpCG4のストレプトマイシンお
よび／またスペクチノマイシン耐性（SmR／
SpecR）遺伝子を含むBamHI断片を両者の同一
接着末端を利用して結合させたプラスミドであ
る。 pCG11は、分子量約6.8Kbのプラスミドで単一
な制限部位としてBg、Pstを有しSmR／
SpecRの表現型を与える。 pEC54は次のようにして作成することができ
る。まず、pCG2をその保有菌コリネバクテリウ
ム・グルタミクム225−218株（FERM−P5954、
ATCC31832）の培養菌体から特願昭56−133557
（特開昭58−35197）開示した方法で、pGA22を
その保有大腸菌の培養菌体から通常用いられる方
法で濃縮単離する。両プラスミドDNAを各分子
中１箇所の切断点をもつ制限酵素たとえばPst
で完全消化して直鎖状化した後、プラスミド分子
の両端に単鎖として突き出た同一接着末端で両
DNA分子の連結した和合分子を生成させるため
にT4フアージDNAリガーゼを作用させる。この
DNA混成物中から両プラスミド分子の和合連結
した組換え体プラスミドの取得は、一旦、
pGA22に由来する薬剤耐性で選択されるコリネ
バクテリウム属あるいはブレビバクテリウム属菌
種の形質転換株を分離し、これら形質転換株の保
有するプラスミドを解析することによつて達成さ
れる。 DNA混成物による形質転換は、本発明者らが
先に開示したコリネバクテリウム属およびブレビ
バクテリウム属菌種のプロトプラストを使用する
形質転換法〔特願昭56−58187（特開昭57−
186492）および特願昭56−65777（特開昭57−
186489）〕により実施することができる。選択に
用いる薬剤はpGA22に由来する薬剤耐性遺伝子
のうち、pGA22との連結部位となるため挿入不
活化されるアンピシリン耐性遺伝子を除いた他の
耐性遺伝子に対応するテトラサイクリン（Tc）、
クロラムフエニコール（Cm）あるいはカナマイ
シン（Km）を使用すればよい。形質転換株は
DNA無添加系で受容菌プロトプラストが正常細
胞へ復帰増殖できない濃度の薬剤（通常、テトラ
サイクリン0.4−1.6μg／ml、クロラムフエニコー
ル2.5−5μg／mlおよびカナマイシン100−800μg／
ml）を含む高張寒天培地上で復帰するコロニーを
分離するか、あるいは、一旦非選択的に再生培地
上で正常細胞に復帰増殖させた後にかき集め、こ
の再懸濁液を受容菌正常細胞が生育できない濃度
の薬剤（通常、テトラサイクリン0.5−4μg／ml、
クロラムフエニコール２−15μg／mlおよびカナ
マイシン２−25μg／ml）を含む寒天培地上で生
育するコロニーを分離することによつて得られ
る。テトラサイクリン、クロラムフエニコールあ
るいはカナマイシン耐性（TcR，CmR，KmRとそ
れぞれいう）により選択された形質転換株の中に
は、pGA22由来の他の薬剤耐性形質をも同時に
獲得しているものがある。 こうして得られる形質転換株の保有するプラス
ミドDNAは、本発明他らが特願昭56−18101（特
開昭57−134500）および特願昭56−65777（特開昭
57−186489）に開示した方法で培養菌体から単離
精製でき、さらに各種制限酵素で消化して生成す
るDNA断片をアガロースゲル電気泳動で解析す
る常法により構造を知ることができる。形質転換
株の一株から分離されたプラスミドでpCE54であ
る。 pCE54は大きさ約14.5kbのプラスミドで、単一
制限部位としてEcoR，Sal、Sma、Xho
などを有し、TcR，CmR，KmRの表現型を与え
る。XhoはKmR遺伝子中にあり、いわゆる挿
入不活化（DNA断片の挿入により当該表現型の
発現が妨げられる現象）による選択も可能であ
る。 プラスミド保有菌株からのプラスミドの採取
は、たとえば特願昭56−18101（特開昭57−
134500）、同56−58186（特開昭57−183799）およ
び同56−133557（特開昭58−35197）に記載の方法
に従つて行えばよい。 遺伝子を含むDNA断片とベクターDNAとの組
換え体の作製は、公知の試験管内組換えDNA技
法を駆使することにより実施できる。 試験管内のDNA組換えは、通常、目的の遺伝
子を含む供与体DNAとベクターDNAの切断と再
結合により行われる。DNAの切断は、制限酵素
を用いれば容易にできる。試験管内組換えに使わ
れる制限酵素は生物種を問わずすべての２本鎖
DNA上で特定の塩基配列部分を認識し切断する。
その塩基配列は、制限酵素の種類により異なつて
いる。従つて適当な制限酵素を使用することによ
り目的の遺伝子は発現機能を損うことなく一つの
DNA切断片として切り出される。同一制限酵素
により切断された供与体DNAとベクターDNAの
切断片の末端構造は同一構造を持ち、ある種の制
限酵素の場合には１本鎖が突き出た接着末端を与
え、別の制限酵素では、平滑末端を与える。いず
れの末端であれ同一制限酵素で切断する限り供与
体DNAの切断片とベクターDNAの切断片は、
T4フアージDNAリガーゼにより連結することが
できる。 両DNAを異なる制限酵素で切断した場合も、
例えば、接着末端をDNAポリメラーゼで修復し
て２本鎖として、平滑末端になおしてから結合し
たり、ターミナルトランスフエラーゼで相補的な
ホモポリマーを付与して接着末端としてから結合
したり、あるいは、ある種の制限酵素切断部位を
含んだ合成オリゴヌクレオチドリンカーを連結さ
せてから、その内部を切断して接着末端を作つて
から結合させることができる。これらの連結法に
より目的の遺伝子を含むDNA断片とベクター
DNA切断片の組換え体が生成する。 リガーゼ反応により目的の組換え体以外に他の
組換え体も生成するが、目的の組換え体を取得す
るにはこのDNA混成液を用いてコリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属菌種を直接形
質転換し、目的の遺伝子の遺伝情報に由来する遺
伝形質を付与された形質転換株を選択分離し、そ
の培養菌体から抽出単離することによつて達成で
きる。コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属菌種を直接形質転換しないで例えば大腸
菌のような他の微生物の宿主ベクター系にて目的
の遺伝子を一旦クローン化し、しかる後にコリネ
バクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種
のベクターとの組換え体を試験管内で作製してか
らコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属菌種を形質転換し前記と同様に形質転換株を
選択分離しても組換え体を取得できる。 組換え体製造のためには下記文献の記載が広く
応用できる。 S.N.Cohen，et alU.S Patent 4237224、遺伝
子操作実験法〔高木康敬編著、講談社サンエンテ
イフィツク（1980）〕、Method in Enzymology
68，Recombinant DNA edited by Rey Wu，
Academic Press 1979 本発明の宿主微生物としては、コリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属に属しDNA
取り込み能を有する菌株ならばいかなる菌株を用
いてもよい。好適には本発明者らが先に特願昭56
−151464（特開昭58−56678）において開示したリ
ゾチーム感受性微生物を用いる。具体的な菌株の
一例としては次の菌株があげられる。 【表】 宿主微生物の組換え体DNAによる形質転換は
１）培養細胞からのプロトプラストの調製、２）
プロトプラストの組換え体DNAによる形質転換
処理、３）プロトプラストの正常細胞への復帰再
生と形質転換株の選択、からなる工程にて行われ
る。具体的方法の例を以下に示す。 １ 培養細胞からのプロトプラストの調製 プロトプラスト形成は、微生物を細胞壁溶解酵
素リゾチームに感受性にする条件下で増殖させ、
この培養細胞を高張液中でリゾチーム作用させ細
胞壁を溶解除去ることによつて行われる。微生物
をリゾチーム感受性型細胞にするには各種細胞壁
合成阻害剤が用いられる。例えば、微生物培養の
対数増殖期の中途で生育を抑制しないかあるいは
半制御する濃度のペニシリンを添加し、さらに数
世代増殖させることによつて微生物細胞をリゾチ
ーム感受性にすることができる。 このとき使用する培地は微生物が増殖できる培
地であればよく、例えば栄養培地NB（粉末ブイ
ヨン20g、酵母エキス5gを純水１に含み、PH7.2
に調整した培地）あるいは半合成培地SSM〔グル
コース10g、NH4Ｃ 4g、尿素2g、酵母エキス
1g、KH2PO4 1g、K2HPO4 3g、MgC2・
6H2Ｏ 0.4g、FeSO4・7H2Ｏ 10mg，MnSO4・
４〜6H2Ｏ 0.2mg、ZnSO4・7H2Ｏ 0.9mg、
CuSO4・5H2Ｏ 0.4mg、Na2B4O7・10H2Ｏ
0.09mg、（NH4）6Mo7O24・4H2Ｏ 0.04mg、ビオ
チン30μg、サイアミン塩酸塩１mgを水１に含
み、PH7.2に調整した培地〕などが用いられる。 この培地に微生物を接種し、振盪培養する。 比色計によつて660nmにおける吸光度（OD）
を測定し対数増殖期の初期（OD＝0.1〜0.4）に
培養液中0.1〜2.0単位／mlの濃度になるようにペ
ニシリンＧなどのペニシリン類を添加する。培養
をさらに続けて、ODが0.3〜0.5に増加したとこ
ろで細胞を集菌しSSM培地で洗浄する。次いで
細胞を適当な高張培地、例えばPFM培地
（SSM2倍希釈液中にシヨ糖0.4M、MgC2・6H2
O0.01Mを含み、PH7.0〜8.5に調整した培地）あ
るいはRCG培地〔グルコース5g、カゼイン加水
分解物5g、酵母エキス25g、K2HPO4 3.5g、
KH2PO4 1.5g、MgC2・6H2Ｏ 0.41g
FeSO4・7H2Ｏ 10mg、MnSO4・４〜6H2Ｏ ２
mg、ZnSO4・7H2Ｏ 0.9mg、CuSO4・5H2Ｏ 0.4
mg、Na2B4O7・10H2Ｏ 0.09mg、（NH4）6MO7
O24・4H2Ｏ 0.04mg、ビオチン30μg、サイアミ
ン塩酸塩２mg、コハク酸二ナトリウム1.35gを水
１に含み、PH7.0〜8.5に調整した培地〕に再懸
濁する。この細胞懸濁液に最終濃度0.2〜10mg／
mlとなるようにリゾチームを加え30〜37℃で反応
する。プロトプラスト化は反応時間が進むつれて
進行し、その経過は光学顕微鏡で観察できる。顕
微鏡下でほとんどの細胞がプロトプラスト化され
るに要する時間は、細胞培養時の添加ペニシリン
濃度および用いるリゾチームの濃度によつて変わ
るが、前記条件にて３〜24時間である。 生成したプロトプラストは低張条件で破裂死す
るので、プロトプラストの形成度は低張条件で生
残する正常細胞の残存度で間接的に知ることがで
きる。通常、正常細胞はリゾチーム処理供試正常
細胞の約10-4の残存度に抑えることができる。 このようにして調製したプロトプラストは適当
な高張寒天培地上でコロニー形成能（再生能）を
有する。この寒天培地として栄養培地、半合成培
地あるいは数種類のアミノ酸を補充した合成培地
に0.3〜0.8Mコハク酸二ナトリウムおよび0.5〜６
％ポリビニルピロリドン（分子量10000あるいは
40000）を含有させたものが好適に用いられる。 通常、半合成培地RCGP培地〔RCG培地に３
％のポリビニルピロリドン（分子量10000）と1.4
％の寒天を添加した培地、PH7.2〕を用いること
ができる。培養は25〜35℃で行うのが好ましい。
再生コロニーの出現が認められるのに要する培養
日数は菌株により差があるが、釣菌できるまでの
大きさになるのは10〜14日である。 RCGP培地でのプロトプラストの再生は菌種、
培養中途ペニシリン添加濃度およびリゾチーム処
理濃度によつて異なるが、リゾチーム処理供試正
常細胞あたり10-2〜10-4の効率である。 ２ プロトプラストへの組換え体DNAによる形
質転換 プロトプラストへの組換え体DNAの取り込み
は細胞がプロトプラスト状態を保持できる高張液
中でプロトプラストと組換え体DNAとを混合し、
これにDNA取り込み媒介作用のあるポリエチレ
ングリコール（PEG、平均分子量1540〜6000）
あるいはポリビニルアルコール（PVA、重合度
500〜1500）と二価金属陽イオンを加えて処理す
ることによつて行われる。高張条件を与える安定
化剤としては、微生物のプロトプラストの保持に
一般に使われるものでよく、例えがシヨ糖やコハ
ク酸二ナトリウムを用いることができる。PEG
およびPVAの使用可能な濃度範囲は最終濃度で
各々５〜60％、１〜20％である。二価金属陽イオ
ンは最終濃度１〜100mMのCa++、Mg++，
Mn++、Ba++、Sr++などが効果的で単独あるいは
併用することができる。処理の温度は０〜25℃が
好適である。 ３ プロトプラストの正常細胞への復帰再生と形
質転換株の選択 組換え体DNAで形質転換処理したプロトプラ
ストの再生は、前記のプロトプラストの再生と同
様に、コハク酸二ナトリウムとポリピロリドンを
含有する高張寒天培地（例えばRCGP培地）上に
プロトプラストを塗布し、正常細胞が生育できる
温度、一般に25〜35℃で培養することによつて行
われる。形質転換株は供与体DNAに由来する遺
伝子が菌に付与する形質について選択することに
よつて取得できる。この特徴的形質獲得に基づく
選択は、高張寒天培地上で再生と同時に行つても
よく、あるいは一旦非選択的に再生させてから再
生正常細胞を集め普通の低張寒天培地上で行つて
もよい。 本発明における具体的に好適な宿主菌株として
示したリゾチーム感受性菌株を用いる場合には形
質転換は上記行程１）におけるペニシリン処理を
行なわずに単に培養増殖させた細胞を直接リゾチ
ーム処理する以外は上記工程１）〜３）と同様に
行えばよい。リゾチーム感受性微生物を用いる場
合の形質転換株は再生菌あたり10-4〜10-6の高頻
度で得られる。 形質転換株は通常の栄養培地に培養することに
より導入した組換え体DNAの形質を発現させる
ことができる。組換え体DNAに遺伝子DNAまた
はベクターDNA由来の性質が付与されている場
合は、その性質にあわせて培地に薬剤を補給する
ときもある。 本発明の形質発現方法により生産されるアミノ
酸などの有用物質の採取は、発酵液からのこれら
の物質を採取する常法により行なわれる。 本発明によりコリネバクテリウム属、ブレビバ
クテリウム属微生物におけるアミノ酸、核酸、ビ
タミン、抗生物質 酵素、ペプタイド、蛋白質の
生産性の増大または新たな生産性の付与が可能と
なつた。また微生物の代謝活性を強化し、基質の
利用能を増大させ、新たな代謝活性を与え、新し
い基質の利用性を与えるなどの製造法の改良も可
能になつた。 さらに本発明における特徴は、異種遺伝子ある
いは外来性の組換えDNAをコリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属微生物において発
現させるのに成功した点にある。すなわち、実施
例に示すような大腸菌のスレオニンオペロン、フ
オスホエノールピンビン酸カルボキシラーゼ
（PPC）遺伝子、枯草菌およびブドウ状球菌で発
現する遺伝子pUB110〔Keggins K.M.，et al，．
Proc.Natl Acad.Sci.，U.S.A.75， 1423
（1978）〕のカナマイシン耐性遺伝子、コリネバク
テリウム・グルタミクムのリジン生合成に関与す
る遺伝子、ブレビバクテリウム・フラブムのアン
スラニレート合成酵素遺伝子がコリネバクテリウ
ム属菌において発現した。 例示したいずれの遺伝子も単にコリネバクテリ
ウム・グルタミクムのプラスミドに連結した形で
導入されており、コリネバクテリウム・グルタミ
クムで発現させるための特殊な操作は施していな
い。また、遺伝子を含むDNA断片を、コリネバ
クテリウム・グルタミクムのプラスミドに対し
て、いずれの向きに連結しても、コリネバクテリ
ウム・グルタミクム内で発現することから、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムは、導入された遺
伝子の転写・翻訳の開始点を正確に認識し、転
写・翻訳を遂行できる機能をもつことが明白であ
る。周知のように全ての遺伝子は、正確に転写・
翻訳が開始されるために必要な塩基配列のレベル
で類似性のある部位を有していることを考慮する
と、コリネバクテリウム・グルタミクムは、例示
した遺伝子以外の遺伝子の転写・翻訳開始点をも
認識して発現しうることが容易に推察される。 グルタミン酸高生産能を有するいわゆるグルタ
ミン酸生産菌は、主な菌学的性質を同じくしてい
るにもかかわらず、産業上の重要性から各研究者
により、種々の菌名が付されており属名までもコ
リネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウム
属などさまざまである。しかしながら、これらの
菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やDNAの塩基組
成が画一的であることから、同一の菌種であるこ
とが指摘されていた。さらに、最近、これらの菌
種間には、70〜80％以上のDNAの相同性がある
ことが明らかにされ、非常に近縁な微生物である
ことが明白である〔Komatsu，Y.：Report of
the Fermentative Research Institute，No.55，
１（1980）、およびSuzuki，K.，Keneko，T.，
and Komagata，K.：Int.J.Syst.Bacteriol.，31，
131（1981）参照〕。本明細書では組換えDNA実験
に使用できる宿主が規制されているため、本発明
の有用性はコリネバクテリウム・グルタミクムＬ
−22の誘導株を宿主として示したが上記の事実を
踏まえれば、グルタミン酸生産菌全般にそのまま
適用できることが容易に類推される。組換え体
DNAがこれら菌種において安定に保持される、
発現されためにはDNAの相同性など宿主菌の性
質における若干の相違は問題でなく、これら菌種
が当該プラスミドの自律複製と導入遺伝子の発現
を可能にする機能を有していればよい。しかる
に、これらの菌種がこの両機能を共有しているこ
とは、本発明者らが、先に開示〔特願昭56−
58186（特開昭57−183799）〕したコリネバクテリ
ウム・グルタミクム225−250から分離され、スト
レプトマイシンおよび／またはスペクチノマイシ
ン耐性遺伝子を有するプラスミドpCG4がコリネ
バクテリウム属およびブレビバクテリウム属菌種
など、グルタミン酸生産菌内で同じく複製でき、
また、その耐性遺伝子が発現される〔特願昭56−
58187（特開昭57−186492〕ことから明らかであ
る。従つて、本発明を適用し得る宿主菌として
は、コリネバクテリウム・グルタミクムに限ら
ず、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリ
ウム属菌種を含むグルタミン酸生産菌全てが包括
される。 以下に本発明の実施例および参考例を示す。 参考例 １ リジン生産菌コリネバクテリウム・グルタミク
ムATCC21543のリジン生合成に関与する遺伝子
のコリネバクテリウム・グルタミクムでのクロー
ン化と、その遺伝子の発現を利用したコリネバク
テリウム・グルタミクムによるリジンの生産： (1) コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC21543の染色体DNAとベクターpCG11の
調製： コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032から誘導され、リジンアナログであ
るＳ−（２−アミノエチル）−システイン（以下
AECと略す）に耐性を有するリジン生産性変異
株コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC21543の染色体DNAを次のようにして抽出
単離する。 400ml半合成培地SSM〔グルコース20g、（NH4）
2SO4 10g、尿素3g、酵母エキス1g、KH2PO4
1g、MgC2・6H2Ｏ 0.4g、FeSO4・7H2Ｏ 10
mg、MnSO4・４〜6H2Ｏ 0.2mg、ZnSO4・7H2
Ｏ 0.9mg、CuSO4・5H2Ｏ 0.4mg、Na2B4O7・
10H2Ｏ 0.09mg、（NH4）6Mo7O24・4H2Ｏ 0.04
mg、ビオチン30μg、サイアミン塩酸塩１mgを水
１に含みPH7.2に調整した培地〕にスレオニン
を100μg／mlとなるように補つた培地に種培養を
接種して30℃で振盪培養する。東京光電比色計で
660nmにおける吸光度（OD）を測定し、OD0.2
になつた時点で培養液中0.5単位／mlの濃度とな
るようにペニシリンＧを添加する。さらに培養を
継続しOD約0.6になるまで生育させる。 培養液から菌体を集菌し、TES緩衝液〔0.03M
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下
トリスと略す）、0.005M EDTA 、0.05M NaC
：PH8.0〕で洗浄後、リゾチーム液（25％シヨ
糖、0.1M NaC、0.05Mトリス、0.8mg／mlリゾ
チーム：PH8.0以下同じ）10mlに懸濁し37℃で４
時間反応させる。集菌した菌体から斉藤らの方法
〔Saito，H.et al：Biochim.Beiophys.Acta，72，
619（1963）〕に従つて高分子染色体DNAを単離す
る。 一方、ベクタープラスミドとして用いるpCG11
は、コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−22株
の誘導株LA103のpCG11保有株LA103／pCG11
（ATCC39022）から次のようにして単離する。 400mlNB培地（粉末ブイヨン20g、酵母エキス
5gを水１に含みPH7.2に調整した培地）で30℃
で振盪培養しOD約0.7になるまで生育させる。菌
体を集菌し、TES緩衝液で洗浄後、リゾチーム
液10mlに懸濁し、37℃で２時間反応させる。反応
液5M NaC2.4ml、0.5M EDTA（PH8.5）0.6ml、
４％ラウリ硫酸ナトリウムと0.7M NaCからな
る溶液4.4mlを順次添加し、緩やかに混和してか
ら氷水中に15時間置く。 溶菌物全体を遠心管に移し４℃で60分間、
69400×ｇの遠心分離にかけ上澄液を回収する。
これに重量百分率10％相当のポリエチレングリコ
ール（PEG）6000（半井化学薬品社製）を加え、
静かに混和して溶解後、氷水中に置く。10時間後
1500×ｇで10分間遠心分離してペレツトを回収す
る。TES緩衝液５mlを加えてペレツトを静かに
再溶解してから1.5mg／mlエチジウムブロマイド
2.0mlを添加し、これに塩化セシウムを加えて静
かに溶解し密度を1.580に合わせる。この溶液を
105000×ｇ、18℃で48時間超遠心分離にかける。
この密度勾配遠心により共有結合で閉じられた環
状のDNAは、紫外線照射することによつて遠心
チユーブ中下方の密度の高いバンドとして見出さ
れる。このバンドを注射器で遠心チユーブの側面
から抜きとることによつてpCG11DNAが分離さ
れる。次いで分画液を等容量のイソプロピルアル
コール液〔容量百分率90％イソプロピルアルコー
ル、10％TES緩衝液（この混液中に飽和溶解量
の塩化セシウムを含む）〕で５回処理してエチジ
ウムブロマイドを抽出除去し、しかる後にTES
緩衝液に対して透析する。 (2) コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC21543のリジン生合成に関与する遺伝子
のクローン化 上記で調整したpCG11プラスミドDNA3μgを
含む制限酵素Bg用反応液（10mMトリス塩
酸、7mM MgC2、60mM NaC、7mM ２−
メルカプトエタノールPH7.5）60μに６単位の
Bg（宝酒造社製）を添加し、37℃で60分間
反応後65℃で10分間加温して反応を停止する。一
方コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC21543の染色体DNA8μgを含む制限酵素
BamH反応液（10mMトリス塩素、7mM
MaC2、100mM NaC、2mM2−メルカプト
エタノール、0.01％ウシ血清アルブミン、PH8.0）
140μに４単位のBamHを添加し、37℃で60
分間反応後、65℃で10分間加温して反応を停止さ
せる。 両消化物を混合し、T4リガーゼ用緩衝液（ト
リス塩酸660mM，MaC2 66mM、ジチオスレ
イトール100mM、PH7.6）40μ、ATP（5mM）
40μ，T4リガーゼ（宝酒造社製、１単位／μ
）0.3μおよびH2Ｏ 120μを加え、12℃で
16時間反応させる。この混合物をTES緩衝液で
飽和したフエノール400μで２回抽出し、TES
緩衝液に対して透析してフエノールを除外する。 このリガーゼ反応混合物を、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムＬ−22株から誘導させたAEC
感受性のLP4株の形質転換に供する。形質転換は
LP4株のプロトプラストを用いて行なう。LP4株
の種培養をNB培地に植菌し30℃で振盪培養す
る。OD0.6になつた時点で集菌し、該細胞を
RCGP培地〔グルコース5g、カザミノ酸5g、酵母
エキス2.5g、K2HPO43.5g、KH2PO4 1.5g、
MgC2・6H2Ｏ 0.41g、FeSO4・7H2Ｏ 10mg，
MnSO4・４〜6H2Ｏ ２mg、ZnSO4・7H2Ｏ
0.9mg、（NH4）6MO7O24・4H2Ｏ 0.04mg、ビオチ
ン30μg、サイアミン塩酸塩２mg、コハク酸二ナ
トリウム135g、ポリビニルピロリドン（分子量
10000）30gを水１に含む培地〕に１mg／mlの
リゾチームを含む液（PH7.6）に約109細胞／mlと
なるように懸濁し、Ｌ型試験管に移し30℃で５時
間緩やかに振盪反応してプロトプラスト化する。 このプロトプラスト菌液0.5mlを小試験管にと
り2500×ｇで５分間遠心分離しTSMC緩衝液
（10mM塩化マグネシウム、30mM塩化カルシウ
ム、50mMトリス、40mMシヨ糖、PH7.5）１ml
に再懸濁して遠心洗浄後、TSMC緩衝液0.1mlに
再懸濁する。この菌液に２倍高濃度のTSMC緩
衝液と上記リガーゼ反応DNA混合物の１対１混
合液100μを加えて混和し、次いでTSMC緩衝
液中に20％PEG6000を含む液0.8mlを添加して混
合する。３分後、RCGP培地（PH7.2）2mlを添加
し、2500×ｇで５分間遠心分離にかけて上澄み液
を除去し、沈降したプロトプラストを１mlの
RCGP培地に懸濁してから0.2mlをスペクチノマ
イシン400μg／mlを含むRCGP寒天培地（RCGP
培地に1.4％寒天を含む培地、PH7.2）に塗抹し、
30℃で７日間培養する。 寒天培地上に生育した菌全量をかき集め生理食
塩水で洗浄後、１mlの生理食塩水に懸濁する。こ
の菌液をスレオニン２mg／ml、AEC2mg／mlおよ
びストレプトマイシン12.5μg／ml相当を含有する
最少寒天培地M1〔グルコース10g、NH4H2PO4
1g、KC 0.2g、MgSO4・7H2Ｏ 0.2g、
FeSO4・7H2Ｏ 10mg、MnSO4・４〜6H2Ｏ
0.2mg、ZnSO4・7H2Ｏ 0.9mg、CuSO4・5H2Ｏ・
0.4mg、Na2B4O7・10H2Ｏ 0.09mg、（NH4）6Mo7
O24・4H2Ｏ 0.04mg、ビオチン50μg、ｐ−アミ
ノ安息香酸2.5mg、サイアミン塩酸塩1mg、寒天
16gを水１中に含みPH7.2に調整した培地〕上に
再塗布して30℃で３日培養する。出現したコロニ
ーの中からAEC、スペクチノマイシンおよびス
トレプトマイシンに耐性の株が得られる。 これらの形質転換株の保有するプラスミドは、
前記のpCG11を単離したのと同様の方法で単離さ
れる。これらのプラスミドDNA1μgを用い、
pCG11上に切断部位のある制限酵素EcoRで完
全消化後、アガロースゲル電気泳動で解析し、生
成断片の和から分子量を同定した。分子量は同一
アガロースゲル上で同時に泳動したラムダフアー
ジDNAの制限酵素Hind消化で生成する分子量
既知の各断片の泳動距離で描かれる標準曲線に基
づいて算定する。形質転換株の一株から得られた
プラスミドpAec5は分子量10.7KbでpCG11のBg
切断部位に3.9KbのDNA断片が挿入された
組換え体屈曲プラスミドである。 pAec5DNAを用い上記と同様な方法でLP4株
のプロトプラストを形質転換してスペクチノマイ
シン耐性で選択される形質転換株は同時にAEC
耐性形質を付与されたEcoRの切断様式で判定
されるpAec5と同一のプラスミドを保有してい
る。即ちpAec5にコリネバクテリウム・グルタミ
クムATCC21543のAEC耐性形質を支配する遺伝
子がクローン化されていることが明らかである。
pAec5保有菌株は米国アメリカン・タイプ・カル
チヤー・コレクシヨンにCorynebacterium
glutamicum K17ATCC39032として寄託されて
いる。 (3) pAec5保有株によるリジンの生産 コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−22株か
ら誘導されたLP4株のpAec5保有株
（ATCC39032）と非保有株のリジン生産試験を行
なう。NB寒天培地上で生育させた菌を１白金耳
ずつ5mlの生産培地P1〔グルコース100g、（NH4）
2SO4 24.5g、 KH2PO4 1g、MgSO4・7H2Ｏ
0.4g、FeSO4・7H2Ｏ 10mg、MnSO4・４〜
6H2Ｏ 10mg、ビオチン50μg、サイアミン塩酸塩
200μg、パントテン酸カルシウム500μg、ニコチ
ン酸500μg、大豆加水分解物10g、炭酸カルシウ
ム30gを水１に含みPH7.2に調整した培地〕の入
つた試験管に植菌し30℃で75時間振盪培養する。
培養後、培地中のＬ−リジン生成量を酸性−銅ニ
ンヒドリン反応を用いる比色法によつて測定した
結果を第１表に示す。 【表】 参考例 ２ 大腸菌のスレオニン生合成に関与する遺伝子の
クローン化とその遺伝子の発現を利用したコリネ
バクテリウム・グルタミクムによるスレオニンの
生産： (1) 大腸菌スレオニンオペロンを含有するDNA
断片のクローン化とコリネバクテリウム・グル
タミクムへの導入： クローン化は大腸菌の宿主ベクター系にて実施
する。ベクターとして用いたpGA22は本プラス
ミドを作製したアンらが用いている方法〔An.G.
et al：J.Bacteriol.，140，400（1979）〕に従い、
本プラスミドを保有する大腸菌Ｋ−12株亜株の培
養菌体から単離する。供与DNAとなる高分子染
色体DNAは大腸菌Ｋ−12株（ATCC23740）の培
養菌体からスミスのフエノール抽出法〔Smith.
M.G：Method in Enzy−mology，12，part
Ａ，545（1967）〕に従つて単離する。 pGA22プラスミドDNA4μgを含む制限酵素
Hind反応液（10mMトリス塩酸、7mM MgC
2，60mM NaC、PH7.5）60μに0.4単位の
Hind（宝酒造社製、６単位／μ）を添加し
37℃で30分間反応後65℃で10分間加温して反応を
停止する。pGA22には２ケ所のHind切断部位
が存在するが、同一条件でHind消化した試料
をアガロースゲル電気泳動で調べた結果、一断片
に切断されていることが確認される。別に、染色
体DNA 8μgを含む制限酵素Hind反応液140μ
に４単位のHindを添加し37℃で60分間反応後
65℃で10分間加温して反応を停止させる。 両消化物を混合し、T4リガーゼ用緩衝液40μ
、ATP（5mM）40μ、T4リガーゼ0.3μおよ
びH2Ｏ 120μを加え、12℃で16時間反応させ
る。この混合物をTES緩衝液で飽和したフエノ
ール400μで２回抽出し、TES緩衝液に対して
透析してフエノールを除去する。 このリガーゼ反応混合物を大腸菌Ｋ−12株亜株
GT−３〔J.Bacteriol・117，133−143（1974）〕
（ホモセリンおよびジアモミピメリン酸要求性）
の形質転換に供与する。 GT−３株のコンピテント・セル（DNA取り
込み能を有する菌体）はダジエルトらの方法
〔Dagert.M.，et al：Gene.６，23（1979）〕で調
製する。即ち100μg／mlとなるようにジアミノピ
メリン酸を補つたＬ培地（バクトトリプトン
10g、酵母エキス5gを水１に含みPH7.2に調整し
た培地）50mlに植菌し、OD0.6になるまで37℃で
培養する。培養液を氷水で10分間冷却してから遠
心集菌する。冷却した0.1M塩化カルシウム20ml
に再懸濁し、０℃に20分間置く。細胞を再遠心
し、0.1M塩化カルシウム0.5mlに懸濁し０℃で18
時間置く。 塩化カルシウム処理した菌液400μに前記リ
ガーゼ反応混合物200μを添加混合し、０℃に
10分間置いてから37℃で５分間加温する。次いで
Ｌ培地９mlを添加し、37℃で２時間振盪培養す
る。生理食塩水で２回遠心洗浄後、12.5μg／ml相
当のカナマイシンを添加したM9最少寒天培地
（ブドウ糖2g、NH4Ｃ 1g，Na2HPO4 6g、
KH2PO4 3g、MgSO4・7H2Ｏ 0.1g、CaC
２・2H2O15mg、サイアミン塩酸塩４mgおよび寒天
15gを水１に含み、PH7.2に調整した培地）に塗
布し37℃で３日培養する。出現したただ一つのコ
ロニーは、アンピシリン25μg／ml、クロラムフ
エニコール25μg／mlあるいはカナマイシン
25μg／mlを含むＬ寒天培地上でも生育すること
が確認される。 この形質転換株の培養菌体から上記でpGA22
を単離したのと同一の方法によりプラスミド
DNAを単離する。このプラスミドDNAを用い制
限酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析した
結果、第１図にpGH2として示した構造を有して
いる。pGA22に挿入されたDNA断片は既にクス
ーン化された大腸菌オペスン含有DNA断片
〔Cossart，P.，et al：Molec.Gen.，Genet.，
175，39（1979）参照〕と同一の制限酵素切断部位
を有していることからpGH2がスレオニンオペロ
ンを含有することが確認される。 次にpCG11とpGH2の組換え体を作製する。ま
ず、pCG11とpGH2を各々Bg、および
BamHで適正条件下完全消化する。各プラス
ミドDNA2μgを含む消化物を混合し、総容量
200μに対してT4リガーゼ用緩衝液40μ、
ATP（5mM）40μ，T4リガーゼ0.2μおよび
H2Ｏ 120μを加え12℃で16時間反応させる。
この混合物をTES緩衝液で飽和したフエノール
400μで２回抽出しTES緩衝液に対して透析し
てフエノールを除去する。続いて２倍高濃度の
TSMC緩衝液と前記リガーゼ反応混合物の１対
１混合液100μを供与DNAとして用い、参考例
１(1)と同様な方法でコリネバクテリウム・グルタ
ミクムLA201株（LA103の誘導株、ホモセリン、
ロイシン要求株）のプロトプラストを形質転換し
た後、RCGP寒天培地に塗抹し、30℃で６日間培
養して再生増殖させる。寒天培地上全面に生育し
た菌をかき集め、生理食塩水で遠心洗浄後、ロイ
シン50μg／mlを補充した最少寒天培地M1上に再
塗布して、30℃で３日間培養する。出現したコロ
ニーの中からカナマイシン12μg／mlあるいはス
ペクチノマイシン100μg／mlを含むNB寒天培地
上で生育できる株が得られる。 これらの形質転換株から参考例１(1)記載のエチ
ジウムブロマイド、セシウムクロライド密度勾配
遠心によりプラスミドを単離する。 これらのプラスミドDNA0.5μgを用い各種制限
酵素による単独消化および二種類の制限酵素によ
る二重消化で生成するDNA断片をアガロースゲ
ル電気泳動で解析し、分子量およびプラスミド分
子中の各制限酵素切断部位を同定する。一株から
得られたプラスミドをpEthr1と命名した。制限
酵素pst、EcoR，およびXhoの切断部位で
特徴づけられる構造を第３図に示す。pEthr1は
pCG11にpGH2のスレオニンオペロンを含む、
BamH切断片を結合した構造を有することが
判明した。 pEthr1DNAを用いて、コリネバクテリウム・
グルタミクムLA103株を前記と同様に再形質転換
した結果、ホモセリン非要求性とカナマイシンお
よびスペクチノマイシン耐性形質が連関して導入
され、それらの形質転換株は、各種制限酵素切断
様式で特徴づけられるpEthr1と同一のプラスミ
ドを保有している。ホモセリンデヒドロゲナーゼ
の欠失に起因するLA103株のホモセリン要求性が
pEthr1によるホモセリン非要求性に復帰するの
は、大腸菌スレオニンオペロン上にあるホモセリ
ンデヒドロゲナーゼが発現しているためにほかな
らない。 (2) pEthr1保有株の造成 コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−22株よ
り誘導したスレオニン生産菌、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムLA−106（メチオニン要求性、
AEC耐性、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸
耐性）のpEthr1保有株は、LA−106のプロトプ
ラストをpEthr1で形質転換することによつて得
られる。 プロトプラストはLA−106株を半合成培地
SSMに100μg／ml相当のメチオニンを補つた培地
で培養し、OD約0.6まで生育させた細胞を参考例
１(2)と同様な工程で処理することにより調製す
る。形質転換も参考例１(2)と同様に行ないスペク
チノマイシン400μg／mlを含むRCGP寒天培地上
で選択して形質転換株を取得する。pEthr1保有
菌株は米国アメリカン・タイプ・カルチヤー・コ
レクシヨンにCorynebacterium glutamicum
K19 ATCC39034として寄託されている。 (3) pEthr1保有株によるスレオニンの生産 上記のようにして得たLA−106株のpEthr1保
有株（ATCC39034）と非保有株のスレオニン生
産試験を行なう。NB寒天培地上で生産させた菌
を１白金耳ずつ5mlの生産培地P2〔グルコース
100g、（NH4）2SO420g、KH2PO40.5g、K2HPO4
0.5g、MgSO4・7H2O1g、FeSO4・7H2O10mg、
MnSO4・４〜6H2O10mg、ビオチン100μg、炭酸
カルシウム20g、メチオニン100mgを水１に含
みPH7.2に調整した培地〕の入つた試験管に植菌
し30°Cで75時間振盪培養する。培養後、培養液
をペーパークロマトグラフイーにかけニンヒドリ
ン発色後、比色定量してＬ−スレオニン生成量を
測定した。結果を第２表に示す。 【表】 参考例 ３ 大腸菌のフオスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼ（PPC）遺伝子を含む組換え体プラス
ミドを保有するコリネバクテリウム・グルタミク
ムによるグルタミン酸の生産： (1) 大腸菌のPPC遺伝子（本遺伝子は大腸菌で
Glu-をGlu+にすることが知られているグルタ
ミン酸生合成に関与する遺伝子である）を含有
するDNA断片のクローン化とコリネバクテリ
ウム・グルタミクムへの導入： クローン化は大腸菌の宿主・ベクター系にて実施
する。ベクターとして用いたpBR322は参考例２
(1)でpGA22を調製したのと同一の方法で大腸菌
Ｋ−12株亜株の培養菌体から単離する。供与
DNAとなる高分子染色体DNAは参考例２(1)で大
腸菌Ｋ−12株（ATCC23740）から調製したもの
を使用する。 pBR322プラスミドDNA3μgおよび染色体
DNA9μgを含む制限酵素Sal用反応液（10mM
トリス塩酸、7mM MgC2、100mM NaC、
7mM ２−メルカプトエタノール、0.01％ウシ血
清アルブミン、PH7.5）200μに10単位のSal
（宝酒造社製）を添加し、37℃で60分間反応後、
65℃で10分間加温して反応を停止させる。この混
合消化物にT4リガーゼ用緩衝液40μ、ATP
（5mM）40μ、T4リガーゼ0.4μおよび水120μ
を加え、12℃で16時間反応させる。この混合物
をTES緩衝液で飽和したフエノール400μで２
回抽出し、TES緩衝液に対して透析しフエノー
ルを除去する。 このリガーゼ反応混合物を大腸菌Ｋ−12株亜株
PPC2〔Glansdorff，N.，Genetics，51，167
（1965）〕（arg-，thr-，leu-，his-，Thi-，
PPC-，STR）の形質転換に供する。PPC2株のコ
ンピテント・セルは２mg／mlのグルタミン酸を補
つたＬ培地で培養し、参考例２(1)でGT−３株の
コンピテント・セルを得たのと同様に調製する。
形質転換は前記リガーゼ反応混合物200μを使
用し、参考例２(1)と同様に行う。Ｌ培地９mlを添
加し、37℃で２時間振盪培養して形質発現させ
る。次いで生理食塩水で２回遠心洗浄後、アルギ
ニン、スレオニン、ロイシン、ヒスチジン各
50μg／mlを補つたM9最少寒天培地に塗布し、37
℃で３日間培養する。出現したコロニーをアンピ
シリン25μg／mlあるいはテトラサイクリン
25μg／mlを含むＬ寒天培地上にレプリカし、37
℃で24時間培養してアンピシリン耐性でテトラサ
イクリン感受性のものを選び出す。 これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様
の方法でプラスミドDNAを単離する。形質転換
株の一株から得られたプラスミドpPC1を制限酵
素消化とアガロースゲル電気泳動で解析した結
果、pBR322のSal1切断部位に4.4KbのDNA断片
が挿入されたゲノムサイズ8.8Kbの組換え体プラ
スミドであることが判明した。 このpPC1プラスミドを用いてPPC2株を前記と
同様な方法で形質転換し、アンピシリン耐性で選
択される形質転換株は全てグルタミン酸非要求性
で、制限酵素切断様式で特徴づけられるpPC1と
同一構造のプラスミドを保有している。このこと
はpPC1プラスミド上に大腸菌のPPC遺伝子がク
ローン化されていることを示す。 クローン化されたPPC遺伝子をコリネバクテ
リウム・グルタミクムに導入するために、pCG11
とpPC1の組換え体を宿主大腸菌で調製する。
pCG11およびpPC1プラスミドDNAを各々2μg含
む制限酵素Pst用反応緩衝液〔20mMトリス塩
酸、10mM MgC2、50mM（NH4）2SO4、0.01％
ウシ血清アルブミン、PH7.5〕200μに４単位の
Pst（宝酒造社製）を添加し、30℃で60分間反
応後、65℃で10分間加温して反応を停止させる。
この反応混合物にT4リガーゼ用緩衝液40μ、
ATP（5mM）40μ，T4リガーゼ0.2μおよび水
120μを加え、12℃で16時間反応させる。前記
と同様にフエノール抽出後、透析してフエノール
を除去する。このリガーゼ反応混合物100μを
使用し、前記と同様にPPC2株を形質転換した。 生じたコロニーから前記の方法でプラスミドを
分離し、その大きさをアガロースゲル電気泳動で
調べた。大きさが約15〜16Kbのプラスミドを選
択し、そのプラスミドで再度PPC2株を形質転換
しPPC遺伝子の存在を確認した。先の形質転換
株の一株から得られたプラスミドpEppc1を制限
酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析した結
果、pCG11とpPC1が両者のPst切断部位で和合
連結したゲノムサイズ15.6Kbの組換え体プラス
ミドであることが明示された。こうして大腸菌で
調製されたpEppc1プラスミドDNAを用い、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムＬ−22株から誘導
されたLP4株を形質転換する。形質転換は参考例
１(2)と同様に行い、形質転換株はスペクチノマイ
シン400μg／mlを含むPCGP寒天培地上で生育す
るコロニーの中から取得される。これらの形質転
換株から単離されるプラスミドを制限酵素Sal
あるいはPstの単独消化または両者の２重消化
し、アガロースゲル電気泳動で解析することによ
りpEppc1を保有していることが確認される。 pEppc1保有菌株は米国アメリカン・タイプ・
カルチヤー・コレクシヨンにCorynebacteruim
glutamicum Ｋ−18ATCC39033として寄託され
ている。 (2) pEppc1保有株によるグルタミン酸の生産： コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−22株から
誘導されたLP4株pEppc1保有株（ATCC39033）
と非保有株のグルタミン酸生産試験を行つた。
NB寒天培地上で生育させた菌をかき集め、生理
食塩水で洗浄後、5mlの生産培地P3〔グルコース
50g、（NH4）2SO4 3g，尿素3g、KH2PO4
0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4・7H2Ｏ 0.5g、
FeSO4・7H2Ｏ 10mg、MnSO4・４〜6H2Ｏ 10
mg、ビオチン3μg、サイアミン塩酸塩500μg、フ
エノールレツド10mgを純水１に含み、PH7.2に
調整した培地〕の入つた試験管に植菌し、30℃で
振盪培養する。培養中、20％尿素液を0.2mlずつ
３回添加し、40時間培養する。培養後、培養液
をペーパークロマトグラフイーにかけ、ニンヒド
リン発色後、比色定量してＬ−グルタミン酸の生
成量を測定した。 結果を第３表に示す。 【表】 参考例４ ブレビバクテリウム・フラブム ATCC14067のアンスラニル酸合成酵素遺伝子
のコリネバクテリウム・グルタミクムでのクロ
ーン化と発現： ブレビバクテリウム・フラブムATCC14067の染
色体DNAを参考例１(1)と同様の方法で調製する。
ベクターとして用いるpCE53は参考例１(1)で
pCG11を単離したのと同様の方法でその保有株コ
リネバクテリウム・グルタミクムＬ−22株の培養
菌体から単離する。pCE53は本発明者らが先に開
示したコリネバクテリウム・グルタミクムのプラ
スミドpCG1〔特願昭56−18101（特開昭57−
134500）〕と大腸菌のプラスミドpGA22〔An，G.
et al.：J.Bacteriol.，140，400（1979）参照〕を
和合連結させたプラスミドである。詳しくは
pCG1上に１ケ所しかないBg切断部位と
pGA22上に２ケ所あるBamH切断部位のうち
テトラサイクリン耐性遺伝子内でないBamH
切断部位とで、両制限酵素の同一接着末端を利用
して連結したものである。pCE53はpGA22由来
のカナマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーを
有し、制限酵素Salに対する切断部位は１ケ所
である。 上記で調製したpCE53プラスミドDNA3μgおよ
び染色体DNA9μgを含む制限酵素Sal反応液
200μに10単位のSalを添加し、37℃で60分間
反応後、65℃で10分間加温して反応を停止させ
る。この混合消化物にT4リガーゼ用緩衝液40μ
、ATP（5mM）40μ，T4リガーゼ0.4μおよ
びH2O120μを加え、12℃で16時間反応させる。
この混合物をTES緩衝液で飽和したフエノール
400μで抽出し、TES緩衝液に対して透析し、
フエノールを除去する。 このリガーゼ反応混合物を形質転換に供する。
形質転換する受容菌としてコリネバクテリウム・
グルタミクムＬ−22株から誘導されたアンスラニ
ル酸要求性変異株LA105（アンスラニル酸合成酵
素欠損変異株）を用いる。アンスラニル酸要求性
変異株は、常法の変異処理により、M1寒天培地
上で生育できず、アンスラニル酸（30μg／ml相
当）を補つたM1寒天培地上で生育できる菌を選
択することによつて取得される。LA105株のプロ
トプラストの調製および形質転換は、生育培地
NBに100μg／ml相当のアンスラニル酸を補つた
培地を使用する以外は参考例１(2)と同様に行う。
形質転換株は、カナマイシン200μg／ml相当を含
むRCGP寒天培地上で生育するコロニーとして選
択される。出現したコロニーの中からM1寒天培
地上で生育できる形質転換株が得られる。 これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様
にプラスミドDNAを単離する。形質転換株の一
株から得られたプラスミドpTrp2−３を各種制限
酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析した結
果、pCE53の唯一のSal切断部位に約7.1Kbの
SalDNA切断片が挿入されたプラスミドである
ことがわかつた。 pTrp2−３を用い、同様な方法でLA105株を再
形質転換したところ、トリプトフアン100μg／ml
およびカナマイシン400μg／mlを含むRCGP寒天
培地上で生育するコロニーは、同時にアンスラニ
ル酸非要求性となり、それらは、Salの切断様
式で判定されるpTrp2−３と同一のプラスミドを
保有している。 以上の結果は、クローン化された約7.1Kbの
SalDNA切断片にはブレビバクテリウム・フラ
ブムATCC14067のアンスラニル酸合成酵素をコ
ードする遺伝子が存在し、それがコリネバクテリ
ウム・グルタミクムLA105株中で発現しているこ
とを示す。 pTrp2−３保有菌株は米国アメリカン・タイ
プ・カルチヤー・コレクシヨンに
Corynebacterium glutamicum K20ATCC39035
として寄託されている。 プラスミドpCE52を用いて上記と同様の処理を
行い、ブレビバクテリウム・フラバム
ATCC14067のアンスラニル酸合成酵素をコード
する遺伝子を有するプラスミドpTrp4−３を得
る。 pEC52は本発明者らが先に開示したコリネバク
テリウム・グルタミクムのプラスミドpCG1〔特願
昭56−18101（特開昭57−134500）〕と大腸菌のプ
ラスミドpGA22〔An，G.et al．：J.Bacteriol.
140，400（1979）参照〕を和合連結させたプラス
ミドである。詳しくはpCG1上に１カ所しかない
Bg切断部位とpGA22上に２カ所あるBamH
切断部位のうちテトラサイクリン耐性遺伝子内
のBamH切断部位とで、両制限酵素の同一接
着末端を利用して連結したものである。pCE52は
pGA22由来のカナマイシン耐性遺伝子などの選
択マーカーを有し、制限酵素Salに対する切断
部位は１カ所である。 pCE52は参考例１(1)でpCG11を単離したのと同
様の方法でpCE52保有株コリネバクテリウム・グ
ルタミクムＬ−22株の培養菌体から単離する。 上記と同様にトリプトフアン生産性のコリネバ
クテリウム・グルタミクムK36株（FERM BP−
451）をpTrp4−３で形質転換する。得られた形
質転換株は米国アメリカン・タイプ・カルチヤ
ー・コレクシヨンにCorynebacterium
glutamicum K31，ATCC39280として寄託され
ている。 pTrp2−３保有株コリネバクテリウム・グルタ
ミクムK20，ATCC39035およびpTrp4−３保有
株同 K31，ATCC39280によるＬ−トリプトフ
アン生産試験を下記のとおり行う。 菌株をNB液体培地中で30℃、16時間振盪培養
した菌液0.5mlを５mlの生産培地P4〔廃糖蜜100g／
、（NH4）2SO4 20g／、KH2PO4 0.5g／
、K2HPO4 0.5g／、MgSO4・7H2Ｏ
0.25g／、CaCO3 20g／、PH7.2〕の入つた
試験管に植菌し、30℃で96時間振盪培養する。 培養後、培養液をペーパークロマトグラフイ
ーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量して、
Ｌ−トリプトフアンの生成量を測定する。 対照として、LA−105株およびLAR−１株を
同様に処理する。 結果を第４表に示す。 【表】 参考例５ pCB101の作製： (1) CG11とpUB110の分離 pCG11は、本プラスミドを保有するコリネバ
クテリウム・グルタミクムLA103／pCG11
（ATCC39022）を400mlNB培地でOD約0.8に
なるまで生育させ、その培養細胞から、参考例
１(1)でpCG2を単離したのと同一の方法で単離
する。 pUB110は、グリクザンらの方法〔Gryczan，T.
J.et al，：J.Bacteriol.，134，318（1978）参照〕
により、本プラスミドを保有するバチルス・サチ
ルスBR151／pUB110〔Proc.Natl.Acad.Sci，
USA，75，1423（1978）〕の培養菌体から単離す
る。 (2) CG11とpUB110の試験管内組換え 上記で調製したpCG11プラスミドDNA2μg
を含む制限酵素Bg反応緩衝液（10mMト
リス塩酸、7mM MgC2，60mM NaC，
7mM ２−メルカプトエタノール，PH7.5）
100μに２単位のBg（宝酒造社製、６単
位／μ）を添加し、37℃で60分間反応させ
る。また、pUB110プラスミドDNA2μgを含む
制限酵素BamH反応緩衝液（10mMトリス塩
酸、7mM MgC2、100mM NaC、2mMメ
ルカプトエタノール、0.01％ウシ血清アルブミ
ン、PH8.0）100μに２単位のBamH（宝酒
造社製、６単位／μ）を添加し、37℃で60分
間反応させる。 両制限酵素消化物を混合し、T4リガーゼ緩
衝液40μ、ATP（5mM）40μT4リガーゼ
0.2μおよびH2Ｏ 120μを加え、12℃で16
時間反応させる。この混合物を、TES緩衝液
で飽和したフエノール400μで２回抽出し、
TES緩衝液に対して透析したフエノールを除
外する。 (3) pCB101の取得 ２倍高濃度のTSMC緩衝液と上記リガーゼ
反応混合物の１対１混合液100μを供与DNA
として用い、参考例１(3)と同様な方法で、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムLA103を形質転
換し、カナマイシン耐性株を選択する。出現し
たコロニーをカナマイシン12.5μg／mlあるいは
スペクチノマイシン100μg／mlを含むNB寒天
培地上にレプリカし、30℃で２日培養して生育
した二重耐性形質転換株３株を任意に選び、同
一寒天培地上で純化する。この３株を400μ
NB培地で、OD約0.8になるまで生育させ、集
菌後、その培養細胞から参考例１(1)記載のエチ
ジウムブロマイド−セシウムクロライド密度勾
配遠心によりプラスミドを単離する。いずれの
形質転換株からも30〜35μgのプラスミドDNA
が得られる。 これらのプラスミドDNAを参考例１(3)と同
じように制限酵素消化とアガロースゲル電気泳
動で解析し、分子量と制限酵素Pst、EcoR
、HincおよびBgの切断点を同定す
る。３株のプラスミドは全てpCG11とpUB110
が和合連結した構造を有し、そのうち二種は第
２図にpCB101で示した構造であるが、他の一
種は結合向きが逆向きである。 いずれのプラスミドを有する形質転換株も
pCG11由来のスペクチノマイシン耐性形質と
pUB110由来のカナマイシン耐性形質を有して
いる。 これらのプラスミドDNAを用い、コリネバ
クテリウム・グルタミクムLA103株を再形質転
換した結果得られたカナマイシン耐性形質転換
株は、スペクチノマイシン耐性形質を同時に獲
得しており、各種制限酵素切断様式で特徴付け
られる供与プラスミド同一のプラスミドを保有
している。 実施例 １ コリネバクテリウム・グルタミクムC156株の
Ｌ−ヒスチジン生合成に関与する遺伝子のクロ
ーン化および該遺伝子の発現を利用したコリネ
バクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリ
ウム、ハーキユリス、ブレビバクテリウム・フ
ラブムおよびブレビバクテリウム・ラクトフア
ーメンタムによるＬ−ヒスチジンの生産： (1) コリネバクテリウム・グルタミクムC156株
の染色体DNAとプラスミドpCG11の調製： １，２，４−トリアゾール−３−アラニン耐性
でヒスチジン生産能をコリネバクテリウム・グル
タミクムC156株（FERM BP−453）の染色体
DNAを参考例１(1)と同様の方法で調製する。 一方、ベクタープラスミドとして用いるpCG11
は、コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−22株
の誘導株LA103のpCG11保有株LA103／pCG11
（ATCC39022）から参考例１(1)と同様にして単離
する。 (2) コリネバクテリウム・グルタミクムC156株
のヒスチジン生合成に関与する遺伝子のクロー
ン化： 上記で調製したpCG11プラスミドDNA3μgお
よび上記染色体DNA9μgを含む制限酵素Bg
用反応液〔10mMトリス（PH7.5）、7mM MgC
２、60mM NaC、7mM2−メルカプトエタノー
ル〕200μに10単位のBg（宝酒造社製）を
添加し、37℃で60分間反応後、65℃で10分間加温
して反応を停止させる。この混合消化物にT4リ
ガーゼ用緩衝液（トリス200mM、MgC2
66mM，ジチオスレイトール100mM、PH7.6）
40μ、5mMATP溶液40μ、T4リガーゼ（宝
酒造社製、１単位／μ）0.3μおよび水120μ
を加え、12℃で16時間反応させる。 T4リガーゼ反応混合物をコリネバクテリウ
ム・グルタミクムLH33株（ヒスチジン要求性、
リゾチーム感受性）の形質転換に供する。 形質転換はLH33株のプロトプラストを用いて
行う。プロトプラストの調製は参考例１(2)と同様
に行う。 プロトプラスト懸濁液0.5mlを小試験管にとり
2500×ｇで５分間遠心分離し、TSMC緩衝液
（10mM塩化マグネシウム、30mM塩化カルシウ
ム、50mMトリス、400mM シヨ糖、PH7.5）１
mlに再懸濁して遠心洗浄後、TSMC緩衝液0.1ml
に再懸濁する。この懸濁液に２倍濃度のTSMC
緩衝液と上記リガーゼ反応DNA混合物の１対１
混合液100μを加えて混和し、次いでTSMC緩
衝液中に20％PEG6000を含む液0.8mlを添加して
混合する。３分後、RCGP培地（PH7.2）2mlを添
加し、2500×ｇで５分間遠心分離にかけて上澄み
液を除去し、沈降したプロトプラストを１mlの
RCGP培地に懸濁してから0.2mlをスペクチノマ
イシン400μg／mlを含むRCGP寒天培地（RCGP
培地に1.4％寒天を含む培地、PH7.2）に塗抹し、
30℃で７日間培養する。 選択プレート上に生育したスペクチノマイシン
耐性コロニーをかき集め、生理食塩水を用いて２
回遠心洗浄後、スペクチノマイシン100μg／mlを
含む最少寒天培地M1に塗布して30℃で２日間培
養し、スペクチノマイシン耐性でかつヒスチジン
非要求性となつた形質転換株を選択する。 形質転換株の１株から参考例１(1)記載のエチジ
ウムブロマイド・セシウムクロライド密度勾配遠
心によりプラスミドを単離する。各種制限酵素に
よる単独消化および２種類の制限酵素による二重
消化で生成するDNA断片をアガロースゲル電気
泳動で解析し、このプラスミドDNAの制限酵素
切断様式を同定する。このプラスミドをpPH8と
命名した。pPH8はpCG11のBg切断部位に約
10.6KbのDNA断片が挿入された構造である。 さらにpPH8DNAを用いてH33株〔LH33株の
親株（ヒスチジン要求性、リゾチーム耐性）：
FERM BP−452〕を再形質転換したところスペ
クチノマイシン耐性株として選択される形質転換
株のすべてがヒスチジン非要求性となつていた。
これらのことより、ヒスチジン生産菌C156株の
ヒスチジン生合成に関与する遺伝子がクローン化
されていることが明白である。 ヒスチジン生成に関与する遺伝子のクローニン
グは最初からH33株を宿主菌株として用いて行う
こともできる。 (3) pPH8を保有するコリネバクテリウム・グル
タミクム菌体によるＬ−ヒスチジンの生産： コリネバクテリウム・グルタミクムLA−103株
（FERM Ｐ−5947、ATCC31866）をpPH8DNA
で形質転換し、スペクチノマイシン400μg／mlを
含むRCGP寒天培地上で同薬剤耐性の形質転換株
を選択する。得られた形質転換株を純化後、上記
と同様にプラスミド単離、構造解析を行つて、
pPH8と同じ構造のプラスミドであることを確認
した。 pPH8保有株コリネバクテリウム・グルタミク
ムLA103／pPH8は米国アメリカン・タイプ・カ
ルチヤー・コレクシヨンにCorynebacterium
glutamicumK32，ATCC39281として寄託されて
いる。 コリネバクテリウム・グルタミクムLA103／
pCG11（ATCC39022）および同LA103／pPH8
（ATCC39281）のＬ−ヒスチジン生産試験を以下
のとおり行う。 NB寒天培地上で30℃一晩培養した上記の菌を
それぞれ１白金耳ずつ200μg／mlのアルギニンお
よびメチオニンを補つた5mlの生産培地P5〔糖蜜
12％（糖として）、KH2PO4 0.2％、K2HPO4
0.1％、MgSO4・7H2O0.05％、NaC 0.25％、
（NH4）2SO4 2.3％、尿素0.2％、CaCO3 ２％、
PH7.4（アンモニアで調整）〕に植菌する。30℃で
75時間培養後、培地中のＬ−ヒスチジン生成量を
スルフアニル酸（ポーリー）試薬を用いる比色法
〔H.Pauly、Hoppe−Seylers；Z.Physiolo.
Chem.，42，508（1904），同94，284（1915）〕によ
つて定量した。結果を第５表に示す。 【表】 (4) pPH8を保有するコリネバクテリウム・ハー
キユリス、ブレビバクテリウム・フラブムおよ
びブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
によるＬ−ヒスチジンの生産： コリネバクテリウム・ハーキユリス
ATCC13868、ブレビバクテリウム・フラブム
ATCC14067およびブレビバクテリウム・ラクト
フアーメンタムATCC13869にプラスミドpPH8
を保有させるために各菌株を受容菌として形質転
換を行う。 各菌株をSSM培地で増殖させ、OD660nmが0.2
になつたときにペニシリンＧを0.3単位／mlとな
るように添加する。培養を続け、OD660nmが0.6
まで増加したところで集菌し、１mg／mlリゾチー
ムを含むRCGP培地中で上記の記載と同様にプロ
トプラストを形成させる。pPH8を用い、上記の
方法に従い形質転換を行い、形質転換株をスペク
チノマイシン400μg／mlを含むRCGP寒天培地上
で生育するコロニーとして選択する。 純化したスペクチノマイシン耐性形質転換株の
培養菌体よりプラスミドDNAを特開昭57−
183799、同57−134500の記載に従つて調製し、こ
れらがpPH8と同じ構造をすることが制限酵素切
断様式より確認される。以上のことから、プラス
ミドpCG1の誘導体であるプラスミドpPH8はコ
リネバクテリウム・ハーキユリス、ブレビバクテ
リウム・フラブムおよびブレビバクテリウム・ラ
クトフアーメンタム中でも複製可能であり、プラ
スミドpCG11が広くこれら菌種の細菌で使用可能
であるこがわかる。 pPH8保有株であるコリネバクテリウム・ハー
キユリスK33、ブレビバクテリウム・フラブム
K34、およびブレビバクテリウム・ラクトフアー
メンタムK35はそれぞれ米国アメリカン・タイ
プ・カルチヤー・コレクシヨンにATCC39282、
39283および39284として寄託されている。 これら菌株によるＬ−ヒスチジン生産試験を次
のように行う。 NB寒天培地上で30℃一晩培養させたpPH8保
有株およびそれらの親株をそれぞれ１白金耳ずつ
５mlの生産培地P5に植菌する。30℃で75時間振
盪培養後、培地中のＬ−ヒスチジン生産量をポー
リー法によつて比色定量する。結果を第６表に示
す。 【表】 以上より、コリネバクテリウム・グルタミクム
由来のヒスチジン生成に関与する遺伝子がコリネ
バクテリウム・グルタミクム以外にコリネバクテ
リウム・ハーキユリス、ブレビバクテリウム・フ
ラブム、ブレビバクテリウム・ラクトフアーメン
タムの諸菌種において発現し、ヒスチジンの生産
に寄与していることが明らかであつた。
第１図はプラスミドpPGH2の制限酵素地図を
示す。第２図はプラスミドpCB101の制限酵素地
図を示す。第３図はプラスミドpEthr1の造成の
フローチヤートを示す。
示す。第２図はプラスミドpCB101の制限酵素地
図を示す。第３図はプラスミドpEthr1の造成の
フローチヤートを示す。
Claims (1)
- １ コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属し、コリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属菌種由来でヒスチジン要求性を
示す微生物をヒスチジン非要求性株に変換する活
性を有する遺伝子を含むDNA断片と、コリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種中
で自律複製可能なベクターDNAとの組換え体
DNAを保有する微生物を培地に培養し、培養中
にＬ−ヒスチジンを生成蓄積させ、該培養物から
Ｌ−ヒスチジンを採取することを特徴とするＬ−
ヒスチジンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32995988A JPH02474A (ja) | 1988-12-26 | 1988-12-26 | Ｌ―ヒスチジンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32995988A JPH02474A (ja) | 1988-12-26 | 1988-12-26 | Ｌ―ヒスチジンの製造法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56211908A Division JPS58126789A (ja) | 1981-12-29 | 1981-12-29 | レースレオニンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02474A JPH02474A (ja) | 1990-01-05 |
| JPH0412959B2 true JPH0412959B2 (ja) | 1992-03-06 |
Family
ID=18227180
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32995988A Granted JPH02474A (ja) | 1988-12-26 | 1988-12-26 | Ｌ―ヒスチジンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02474A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59156294A (ja) * | 1983-02-17 | 1984-09-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ヒスチジンの製造法 |
| RU2282660C2 (ru) * | 2003-11-10 | 2006-08-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Мутантная фосфорибозилпирофосфатсинтетаза, фрагмент днк, бактерия рода escherichia - продуцент l-гистидина и способ продукции l-гистидина |
-
1988
- 1988-12-26 JP JP32995988A patent/JPH02474A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02474A (ja) | 1990-01-05 |
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