JPH02474A - Ｌ―ヒスチジンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は遺伝子の新規形質発現方法に関する。

さらに詳細には本発明は少なくとも一種の遺伝子を含む
ＤＮＡ断片とベクターＤ　Ｎ　Ａとの紐換え体で、かつ
両ＤＮＡの少なくとも一方が宿主菌株に対して外来性で
ある組換え体ＤＮＡを用いコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物から選ばれる宿主
菌株を形質転換して得られる形質転換株を培地に培養し
、該遺伝子の形質を発現させることを特徴とする遺伝子
の形質発現方法に関する。

組換え遺伝子技法は大腸菌を宿主として確立され、現在
までにソマトスタチン、インシュリン、ヒト生長ホルモ
ン、ヒトインターフェロン−α、ヒトインターフェロン
−β、口締病ワクチンなどのベブタイドやワクチンなど
の製造が可能であることが示された。生理活性の高いこ
れらペブタイドやワクチンの発現の宿主として大腸菌は
多くの場合十分であると考えられるが、さらに高い生産
性、菌体外への分泌、グリコジル化を求めあるいは菌体
内毒素の混入を避けるため、酵母や枯草菌なども宿主と
して開発されてきている。

ベプタイド、蛋白質などの生理活性物質を生産する場合
は、上記のような既に組換えＤＮＡ技法が確立されてい
るか、その基礎が整っている菌株を利用すればよいが、
アミノ酸、核酸、ビタミン、抗生物質などの物質の工業
的生産性の向上を組換えＤＮＡ技法により行う場合には
、同技法を従来使用されているそれぞれの生産菌に適用
する工夫が必要である。

コリネバクテリウム・グルタミクムは微生物によるアミ
ノ酸の工業的製造に最初に用いられた微生物で、以後コ
リネバクテリウム属を含むコリネフォルムバクテリアに
よるグルタミン酸、リジン、アラニン、ヒスチジン、ト
リプトファン、チロノン、フェニルアラニン、スレオニ
ン、インロイシン、バリン、ロイシン、グルタミン、プ
ロリン、アルギニンなどのアミノ酸の工業的生産が開発
され、今日ではほとんどのアミノ酸は微生物により生産
されるに至っている。

従ってこれら微生物における４１１換えＤＮＡ技法の確
立は、今後アミノ酸生産の向上のために極めて重要であ
ると考えられる。

組換えＤＮＡ技法は、例えば （１）制限酵素による目的遺伝子を含むＤＮＡの断片化 （２）同一制限酵素によるベクターＤＮＡの単一切断に
よる直鎖状化 （３）上記（１）、（２）の生成物の混合によるアニー
リングとＤＮＡ！Ｊガーゼを用いる連結による組換え体
ＤＮＡの作成 （４）上記組換え体ＤＮＡの宿主菌株への導入（形質転
換） （５）目的遺伝子を含む組換え体の選択と選択されたク
ローンの純化 の各段階によりなる。このようにして得られる組換え体
保有株の造成の効率は、上記各段階の積ともいうべきも
ので各段階を検証する手段をｔφ備し、各段階の効率を
知りこれを向上することなしには目的遺伝子の発現可能
な形質転換株を得ることができない。またこのようにし
て目的遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを有する形質転換株
が得られたとしても、該遺伝子が宿主菌株に対して外来
性である場合には該遺伝子の発現に際し種々の障壁があ
ることか知られており〔“化学と生物”１８．１１０〜
１ｌｌｉ　（１９７８）　）その発現を行−わせること
は非常に困難である。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物を宿主として用い、これに該宿主に対して外
来性である目的遺伝子またはベクターを含む組換え体Ｄ
ＮＡを導入して該目的遺伝子の形質を発現させた例は今
まで全く知られていない。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物を宿主とする組換えＤＮＡ技法においても、
これら微生物中で自律複製し、選択可能な表現型を有し
、多（の遺伝子のクローニングに用いうるベクター系の
造成と、効率のよい形質転換系の確立が必要である。さ
らに上記したような障壁の解消方法の確立が必要である
。

本発明者らは先にコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物中で自律複製し、選択可能
な表現型と適当なりローニング部位を有するプラスミド
ベクターを造成する一方効率の高い形質転換系を開発し
た〔特願昭５６−５８１８６（特開昭５７−１８３７９
９）　、同５６−５８１８７　（特開昭５７−１８６４
９２）　、同５６−６５７７７　（特開昭５７−１８６
４８９）　）。

そこで本発明者らは該プラスミドベクターに既に知られ
ているインビトロにおけるＤＮ八へ換え技法（Ｕ、Ｓ、
　Ｐａｔｅｎｔ　４，２３７，２２４）を用い、アミノ
酸の生合成に関与する外来性遺伝子を含むＤＮＡｖｆｒ
片を連結し、開発した形質転換系を用いてコリネバクテ
リウム・グルタミクムし一２２株またはその誘導株を形
質転換したところ、該外来性遺伝子が該宿主中で形質を
発現され、アミノ酸などの有用物質の生産の増大に利用
することができることを見出し本発明を完成するに至っ
た。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明は少な（とも一種の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベ
クターＤＮＡとの組換え体で、かつ両ＤＮＡの少なくも
一方が宿主菌株に対して外来性である組換え体ＤＮＡを
用いコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
に属する微生物から選ばれる宿主菌株を形質転換して得
られる形質転換株を培地に培養し、該遺伝子の形質を発
現させる方法を提供する。

本発明に用いる遺伝子を含むＤＮＡ断片としては、真核
生物、原核生物、ウィルス、バタテリオファージまたは
プラスミドに由来し少なくとも一種の完全な遺伝子を含
むＤＮＡ断片があげられる。

真核生物に由来する遺伝子としては哺乳類とくにヒトの
インターフェロン、インンユリン、生長ホルモンなどの
ベブタイドをコードする遺伝子などがあげられる。原核
生物に由来する遺伝子としては細菌とくにエッシェリヒ
ア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、
バチルス属またはスタフィロコッカス属に属する細菌の
菌株に由来する遺伝子で、細胞の代謝、と（に合成活性
に関与する遺伝子などがあげられる。細胞の代謝または
合成活性とは、アミノ酸、ビタミン、核酸または抗生物
質などの合成ならびにその合成に関与する代謝系を意味
し、本発明においてはアミノ酸とくにグルタミン酸、リ
ジン、スレオニン、ヒスチジンまたはトリプトファンの
生合成活性が好適にあげられる。

また目的とするベブタイド、蛋白質などのアミノ酸組成
が知られているときは、相当するＤＮＡを合成して用い
ることもできる。ＤＮＡ合成方法はたとえば、Ｋ、　Ｉ
ｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ＬＬ　５ｃｉｅｎｃｅ　１９１．
１０５６（＋９７７＞に記載の方法に従って行なうこと
ができる。

本発明に用いるベクターとしては、宿主菌と和合性（ｃ
ｏｍｐａｔｉｂｌｅ）で自律増殖できるものでなくては
ならない。具体例としては本発明者らがコリネバクテリ
ウム属に属する微生物から採取した、または採取したも
のを誘導して造成したｐｃＧｌ〔特願昭５６−１８１０
１（特開昭５７−１３４５００）　）　、ρＣＧ２〔特
願昭５６−１３３５５７　（特開昭５８−３５１９７）
）　、ｐＣＧ４〔特願昭５６−５８１８６　（特開昭５
７−１８３７９９）　）、ｐＣε５３、ｐＣε５４、ｐ
ｃＧｌｌ、ｐｃＢｌｏＬ　＋）εｔｈｒｌなどがあげら
れる。

これらプラスミドを保有する菌株はそれぞれ下記の寄託
番号で工業技術院微生物工業技術研究所ならびに米国ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託さ
れている。

プラスミド　　　ＦＥＲｌＪ−Ｐ　　　　　八ＴＣＣｐ
　　ＣＧ　　１　　　　　　　　　５８６５　　　　　
　　　　　３］８０８ｐ　ＣＧ　　２　　　　　　　　
　５９５４　　　　　　　　　　３１８３２ｐ　ＣＧ　
　４　　　　　　　　　５９３９　　　　　　　　　　
３１８３０ｐ　ＣＥ５４　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　３９０１９ｐ　ＣＧ　１１　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３９０２２ｐ
　ＣＢｌｏｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　３９０２０ｐεｔｈｒ　　１　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　３９０２１好適にはρ
ＣＧＩＩ　、　ｐＣＥ５４が用いられる。ｐｃＧｌｌは
本発明者らが先に開示〔特願昭５６−１８１０１（特開
昭５７−１３４５００）　　］　ＬＬたプラスミドで、
コリネバクテリウム・グルタミクム２２５−５７　（＾
ＴＣＣ３１８０８、ＦＥＲＭ−Ｐ５８６５）から分離さ
れたプラスミドρＣＧＩにおける制限酵素８ｇｌのただ
一つの切断部位に、コリネバクテリウム・グルタミクム
２２５−２５０　（＾ＴＣＣ３１８３０、ＦＥＲＭ−Ｐ
５９３９）から分離されたプラスミドｐＣＧ４のストレ
プトマイシンおよび／またはスペクチノマイシン耐性（
Ｓｍ”／５ｐｅｃ”）遺伝子を含むＢａｍＨＩ断片を両
者の同一接着末端を利用して結合させたプラスミドであ
る。

ρＣＧ１１　は、分子量的６．８Ｋｂのプラスミドで単
一な制限部位としてＢｇｉ’ｌｌ、Ｐｓｔ　Ｉを有しＳ
ｍ”／５ｐｅｃ’の表現型を与える。

ｐＥＣ５４は次のようにして作成することができる。

まず、ｐ（：Ｇ２をその保存菌コリネバクテリウム・グ
ルタミクム２２５−２１８株（ＦＥＲＭ−Ｐ５９５４　
、＾ＴＣＣ３１８３２）の培養菌体から特願昭５６−１
３３５５７　（特開昭５８−３５１９７）に開示した方
法で、ｐＧ＾２２をその保有大腸菌の培養菌体から通常
用いられる方法で濃縮単離する。両プラスミドＤＮＡを
各分子中１箇所の切断点をもつ制限酵素たとえばｐｓｔ
　Ｉで完全消化して直鎖状化した後、プラスミド分子の
両端に単鎖として突き出た同一接着末端で両ＤＮＡ分子
の連結した和合分子を生成させるためにＴ４ファージＤ
ＮＡリガーゼを作用させる。このＤＮＡ混成物中からの
両プラスミド分子の和合連結した組換え体プラスミドの
取得は、−旦、ｐＧ＾２２に由来する薬剤耐性で選択さ
れるコリネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウム
属菌種の形質転換株を分離し、これら形質転換株の保有
するプラスミドを解析することによって達成される。

ＤＮＡ混成物による形質転換は、本発明者らが先に開示
したコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属
菌種のプロトプラストを使用する形質転換法〔特願昭５
６−５８１８７（特開昭５７−１８６４９２）および特
願昭５５−６５７７７（特開昭５７−１８６４８９）　
）により実施することができる。選択に用いる薬剤はｐ
ｃ＾２２に由来する薬剤耐性遺伝子のうち、ｐＧＡ２２
との連結部位となるため挿入不活化されるアンピシリン
耐性遺伝子を除いた他の耐性遺伝子に対応するテトラサ
イクリン（Ｔｃ）　、クロラムフェニコール（Ｃｍ）あ
るいはカナマイシン（Ｋｍ）を使用すればよい。形質転
換株はＤ　Ｎ　Ａ無添加系で受容菌プロトプラストが正
常細胞へ復帰増殖できない濃度の薬剤（通常、テトラサ
イクリン０．４−１．６■／ｍｌ、クロラムフェニコー
ル２．５−５　ｇ／ｍＩＪ６よびカナマイシン１００−
８００ｘ／ｍｌ）を含む高張寒天培地上で復帰するコロ
ニーを分離するか、あるいは、−旦非選択的に再生培地
上で正常細胞に復帰増量させた後にかき集め、この再懸
濁液を受容菌正常細胞が生育できない濃度の薬剤（通常
、テトラサイクリン０．５−４　ｇ／ｉ＋Ｌクロラムフ
ェニコール２−１５爬／ｍｌおよびカナマイシン２−２
５ｑ／ｉｔ）を含む寒天培地上で生育するコロニーを分
離することによって得られる。テトラサイクリン、クロ
ラムフェニコールあるいはカナマイシン耐性（Ｔｃ’、
　Ｃｍ”、　Ｋｍ”とそれぞれいう）により選択された
形質転換株の中には、ｐＧ＾２２由来の他の薬剤耐性形
質をも同時に獲得しているものがある。

こうして得られる形質転換株の保有するプラスミドＤＮ
Ａは、本発明者らが特願昭５５−１８１０１（特開昭５
７−１３４５００）および特願昭５６−６５７７７（特
開昭５７−１８６４８９＞　に開示した方法で培養菌体
から単離精製でき、さらに各種制限酵素で消化して生成
するＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で解析する常
法により構造を知ることができる。

形質転換株の一株から分離されたプラスミドでｐＣＥ５
４である。

ｐＣＥ５４は大きさ約１４．５Ｋｂのプラスミドで、単
一制限部位としてＥｃｏＲＩ　、　Ｓａｌ　Ｉ　ＳＳｍ
ａ　Ｉ　５Ｘｈｏ　１などを有し、Ｔｃ”、　Ｃ＋ｎ”
、にＣの表現型を与える。

Ｘｈｏ　ＩはＫｍ”遺伝子中にあり、いわゆる挿入不活
化（ＤＮＡ断片の挿入により当該表現型の発現が妨げら
れる現象）による選択も可能である。

プラスミド保有菌株からのプラスミドの採取は、たとえ
ば特願昭５６−１８１０１（特開昭５７−１３４５００
）、同５６−５８１８６（特開昭５７−１８３７９９）
および同５６１３３５５７　（特開昭５８−３５１９７
）に記載の方法に従って行えばよい。

遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤ　Ｎ　Ａとの組換
え体の作製は、公知の試験管内組換えＤＮＡ技法を駆使
することにより実施できる。

試験管内のＤＮＡ組換えは、通常、目的の遺伝子を含む
供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡの切断と再結合により行
われる。ＤＮＡの切断は、制限酵素を用いれば容易にで
きる。試験管内組換えに使われる制限酵素は生物種を問
わずすべての２本鎖ＤＮＡ上で特定の塩基配列部分を認
識し切断する。

その塩基配列は、制限酵素の種類により異なっている。

従って適当な制限酵素を使用することにより目的の遺伝
子は発現機能を損うことなく一つのＤＮＡ切断片として
切り出される。同一制限酵素により切断された供与体Ｄ
’ＮＡとベクターＤＮＡの切断片の末端構造は同一構造
をもち、ある種の制限酵素の場合には１本鎖が突き出た
接着末端を与え、別の制限酵素では、平滑末端を与える
。いずれの末端であれ同一制限酵素で切断する限り供与
体ＤＮＡの切断片とベクターＤＮＡの切断片は、Ｔ４フ
ァージＤ　Ｎ　Ａリガーゼにより連結することができる
。

両ＤＮＡを異なる制限酵素で切断した場合も、例えば、
接着末端をＤＮＡポリメラーゼで修復して２本鎖として
、平滑末端になおしてから結合したり、ターミナルトラ
ンスフェラーゼで相捕的なホモポリマーを付与して接着
末端としてから結合したり、あるいは、ある種の制限酵
素切断部位を含んだ合成オリゴヌクレオチドリンカーを
連結させてから、その内部を切断して接着末端を作って
から結合させることができる。これらの連結法により目
的の遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤ　Ｎ　Ａ切断
片の組換え体が生成する。

リガーゼ反応により目的の組換え体以外に他の組換え体
も生成するが、目的の組換え体を取得するにはこのＤＮ
Ａ混成液を用いてコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属菌種を直接形質転換し、目的の遺伝子の遺
伝情報に由来する遺伝形質を付与された形質転換株を選
択分離し、その培養菌体から抽出単離することによって
達成できる。コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属菌種を直接形質転換しないで例えば大腸菌のよ
うな他の微生物の宿主ベクター系にて目的の遺伝子を−
Ｈクローン化し、しかる後にコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属菌種のベクターとの組換え体を
試験管内で作製してからコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌種を形質転換し前記と同様に形質
転換株を選択分離しても組換え体を取得できる。

組換え体製造のためには下記文献の記載が広く応用でき
る。

Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ、　　ｖ、Ｌ　ａｌ　　Ｕ、Ｓ、Ｐ
ａｔｅｎｔ　　４．２３７，２２４、　遺伝子操作実験
法〔高木康敬編著、講談社サンエンティフィック　（１
９８０）　）　、Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ６８、　Ｒｅｃｏｍｂ＋ｎａｎｔ　ＤＮ、Ａ　ｅ
ｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｒａｙ　Ｗｕ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ　１９７９ 本発明の宿主微生物としては、コリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属に属しＤＮＡ取り込み能を有
する菌株ならばいかなる菌株を用いてもよい。好適には
本発明者らが先に特願昭５６１５１４６４　（特開昭５
８−５６６７８）において開示したリゾチーム感受性微
生物を用いる。具体的な菌株の一例としては次の菌株が
あげられる。

寄託番号 ＦεＲＩＪ−Ｐ　　ＡＴＣ［： コリネバクテリウム・グルタミクム　Ｌ−１５５９４６
３１８３４コリネバクテリウム・ハーキエリス　Ｌ−１
０３５９４７３１８６６プレビバクテリウム・デイバリ
カラム　Ｌ−２０４５９４８３１８６７プレビバクテー
乃ム・ラクトプアーメンタム　Ｌ−３１２５９４９３１
８６８宿主微生物の組換え体ＤＮＡによる形質転換はｌ
）培養細胞からのプロトプラストの調製、２）プロトプ
ラストの組換え体ＤＮＡによる形質転換処理、３）プロ
トプラストの正常細胞への復帰再生と形質転換株の選択
、からなる工程にて行われる。具体的方法の例を以下に
示す。

■）培養細胞からのプロトプラストの調製プロトプラス
ト形成は、微生物を細胞壁溶解酵１９ゾチームに感受性
にする条件下で増殖させ、この培養細胞を高張液中でリ
ゾチーム作用させ細胞壁を溶解除去することによって行
われる。微生物をリゾチーム感受性型細胞にするには各
種細胞壁合成阻害剤が用いられる。例えば、微生物培養
の対数増殖期の中途で生育を抑制しないかあるいは半抑
制する濃度のペニシリンを添加し、さらに数世代増殖さ
せることによって微生物細胞をリゾチーム感受性にする
ことができる。

このとき使用する培地は微生物が増殖できる培地であれ
ばよく、例えば栄養培地ＮＢ（粉末ブイヨン２０ｇ、酵
母エキス５ｇを純水１１に含み、ｐＨ７，２に調整した
培地）あるいは半合成培地ＳＳＭ〔グルコース１０ｇ、
　′ＩＨ，ＣＩ！　　４　ｇ、尿素２ｇ、酵母エキスＩ
ｇ、に）１２ＰＯ４１ｇ、　ＫＪＰＯｓ　３ｇ１！、Ｉ
ｇＣｆｉ・６Ｈ２００，４ｇＳ　ｐｅｓｏ４’７Ｈ２ｏ
　　１０ｍｇ、　　Ｍｎ５Ｏａ’４−６１’１ｚ００、
２　ｍｇ、　ＺｎＳＯ４４Ｈ２００，９ｍｇｑ　Ｃｕ５
Ｏ＜・５ＨｚＯｏ、　４　ｍｇｓＮａ２Ｂ４０ｔ’１（
ＩＬＯｏ、ｏ　９ｍｇ、　（ＮＨＪｇ！Ｊ（ｈＯｚ＜’
４Ｈａ００、０４　ｍｇ、ビオチン３０■、サイアミン
塩酸塩ｌｆｆ１ｇを水ｌＩ！に含み、ｐＨ７，２に調整
した培地〕などが用いられる。

この培地に微生物を接種し、振盪培養する。

比色計によって６６０ｎｍにおける吸光度（００）を測
定し対数増殖期の初期（ＯＤ＝０．１〜０．４）に培養
液中０．１〜２．０単位／ｍｌの濃度になるようにペニ
シリンＧなどのペニシリン類を添加する。培養をさらに
続けて、ＯＤが０．３〜０．５に増加したところで細胞
を集菌しＳ３Ｍ培地で洗浄する。次いで細胞を適当な高
張培地、例えばＰＦＭ培地（３３Ｍ２倍希釈液中にシヨ
糖０．４　Ｍ、　ＭｇＣ１２・６Ｈ２００，０１Ｍを含
み、ｐＨ７，０〜８．５に調整した培地）あるいはＲＣ
Ｇ培地〔グルコース５ｇ１カゼイン加水分解物５ｇ、酵
母エキス２５ｇ１に２ＨＰＯ４３，５ｇ、　ＫＨ２ＰＯ
４１，５ｇ、　ｌＪｇｃＬ・６Ｈ２００，４１ｇｐｅｓ
ｏｔ・７Ｈｚ０１０ｍｇ、　１ＪｎｓＯ４・４−６Ｈｚ
０　２　ｍｇ、　ＺｎＳＯｓ・７１１．０　０．９　ｍ
ｇ、　Ｃｕ５Ｏ＜４Ｌ００．４　ｍｇ、　Ｎａ２ＬＯｉ
−１０ＬＩＩＩＯ，０９ｍｇ、（ＮＨ４）ａＭＯｔＯｙ
ａ・４Ｎ２００．０４　ｍｇ、ビオチン３０ｄ１サイア
ミン塩酸塩２ＩＩ１ｇ、コハク酸二ナトリウム１．３５
ｇを水１ｒに含み、ｐＨ７，０〜８．５に調整した培地
〕に再懸濁する。この細胞懸濁液に最終濃度０．２〜１
０ｍｇ／ｍｌ　となるようにリゾチームを加え３０〜３
７℃で反応する。プロトプラスト化は反応時間が進むに
つれて進行し、その経過は光学顕微鏡で観察できる。顕
＠鏡下でほとんどの細胞がプロトプラスト化されるに要
する時間は、細り包培養時の添加ペニシリン濃度および
用いるリゾチームの濃度によって変わるが、前記条件に
て３〜２４時間である。

生成したプロトプラストは低張条件で破裂列するので、
プロトプラストの形成度は低張条件で生残する正常細胞
の残存度で間接的に知ることができる。通常、正常細胞
はりゾチーム処理供試正常細胞の約１０−４の残存度に
抑えることができる。

このようにして調製したプロトプラストは適当な高張寒
天培地上でコロニー形成能（再生能）を有する。この寒
天培地としては栄養培地、半合成培地あるいは数種類の
アミノ酸を補充した合成培地に０．３〜０．８Ｍコハク
酸ニナトリウムおよび０．５〜６％ポリビニルピロリド
ン（分子ｌ１１０．０００あるいは４０．０００　’）
を含有させたものが好適に用いられる。

通常、半合成培地ＲＣＧＰ培地ＣＲＣＧ培地に３％のポ
リビニルピロリドン（分子１１０．０００＞と１，４％
の寒天を添加した培地、ｐＨ７，２）を用いることがで
きる。培養は２５〜３５℃で行うのが好ましい。

再生コロニーの出現が認められるのに要する培養日数は
菌株により差があるが、釣菌できるまでの大きさ１こな
るのは１０〜１４日である。

ＲＣＧＰ培地でのプロトプラストの再生は菌種、培養中
途ペニシリン添加濃度およびリゾチーム処理濃度によっ
て異なるが、リゾチーム処理供試正常細胞あたり１０１
〜１０−４の効率である。

２）プロトプラストへの組換え体ＤＮＡによる形質転換 プロトプラストへの組換え体ＤＮＡの取り込みは細胞が
プロトプラスト状態を保持できる高張液中でプロトプラ
ストと組換え体ＤＮＡとを混合し、これにＤＮＡ取り込
み媒介作用のあるポリエチレングリコール（ＰＥＧ、平
均分子量１，５４０〜６．０００）あるいはポリビニル
アルコール（ＰＶＡ、重合度５００〜１，５００）と二
価金属陽イオンを加えて処理することによって行われる
。高張条件を与える安定化剤としては、微生物のプロト
プラストの保持に一般に使われるものでよく、例えばシ
ョ糖やコハク酸二ナトリウムを用いることができる。Ｐ
ＥＧおよびＰＶＡの使用可能な濃度範囲は最終濃度で各
々５〜６０％、１〜２０％である。二価金属陽イオンは
最終濃度１〜１００ｍＭのＣａ”、Ｍｇ”、Ｍｎ”、Ｂ
ａ”Ｓｒ″２などが効果的で単独あるいは併用すること
ができる。処理の温度は０〜２５℃が好適である。

３）プロトプラストの正常細胞への復帰再生と形質転換
株の選択 組換え体Ｄ　Ｎ　Ａで形質転換処理したプロトプラスト
の再生は、前記のプロトプラストの再生と同様に、コハ
ク酸二ナトリウムとポリピロリドンを含有する高張寒天
培地（例えばＲＣＧＰ培地）上にプロトプラストを塗布
し、正常細胞が生育できる温度、一般に２５〜３５℃で
培養することによって行われる。形質転換株は供与体Ｄ
ＮＡに由来する遺伝子が菌に付与する形質について選択
することによって取得できる。この特徴的形質獲得に基
づく選択は、高張寒天培地上で再生と同時に行ってもよ
く、あるいは−旦非選択的に再生させてから再生正常細
胞を集め普通の低張寒天培地上で行ってもよい。

本発明における具体的に好適な宿主菌株として示したリ
ゾチーム感受性菌株を用いる場合には形質転換は上記工
程１）におけるペニシリン処理を行なわずに単に培養増
殖させた細胞を直接リゾチーム処理する以外は上記工程
１）〜３）と同様に行えばよい。リゾチーム感受性微生
物を用いる場合の形質転換株は再生菌あたり１Ｏ−４〜
１Ｏ−６の高頻度で得られる。

形質転換株は通常の栄養培地に培養することにより導入
した組換え体ＤＮＡの形質を発現させることができる。

組換え体ＤＮＡに遺伝子ＤＮＡまたはベクターＤＮＡ由
来の性質が付与されている場合は、その性質にあわせて
培地に薬剤を補給するときもある。

本発明の形質発現方法により生産されるアミノ酸などの
有用物質の採取は、発酵液からのこれらの物質を採取す
る常法により行なわれる。

本発明によりコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウ
ム属微生物におけるアミノ酸、核酸、ビタミン、抗生物
質、酵素、ペブタイド、蛋白質の生産性の増大または新
たな生産性の付与が可能となった。また微生物の代謝活
性を強化し、基質の利用能を増大させ、新たな代謝活性
を与え、新しい基質の利用性を与えるなどの製造法の改
良も可能になった。

さらに本発明における特徴は、異種遺伝子あるいは外来
性の組換えＤＮＡをコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属微生物において発現させるのに成功した
点にある。すなわち、実施例に示すような大腸閑のスレ
オニンオペロン、フォスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼ＜ｐｐｃ＞遺伝子、枯草菌およびブドウ状球菌
で発現する遺伝子ｐｔｌＢｌｌ（１（にｅｇｇ＋ｎｓ　
Ｋ、Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ＾
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　［１，Ｓ、Ａ、　ｈ　１４２３
（１９７８）　）のカナマイシン耐性遺伝子、コリネバ
クテリウム・グルタミクムのリジン生合成に関与する遺
伝子、ブレビバクテリウム・フラブムのアンスラニレー
ト合成酵素遺伝子がコリネバクテリウム属菌において発
現した。

例示したいずれの遺伝子も単にコリネバクテリウム・グ
ルタミクムのプラスミドに連結した形で導入されており
、コリネバクテリウム・グルタミクムで発現させるため
の特殊な操作は施していない。また、遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を、コリネバクテリウム・グルタミクムのプラス
ミドに対して、いずれの向きに連結しても、コリネバク
テリウム・グルタミクム内で発現することから、コリネ
バクテリウム・グルタミクムは、導入された遺伝子の転
写・翻訳の開始点を正確に認識し、転写・翻訳を遂行で
きる機能をもつことが明白である。周知のように全ての
遺伝子は、正確に転写・翻訳が開始されるために必要な
塩基配列のレベルで類似性のある部位を有していること
を考慮すると、コリネバクテリウム・グルタミクムは、
例示した遺伝子以外の遺伝子の転写・翻訳開始点をも認
識して発現しうることが容易に推察される。

グルタミン酸高生産能を有するいわゆるグルタミン酸生
産菌は、主な菌学的性質を同じ（しているにもかかわら
ず、産業上の重要性から各研究者により、種々の１名が
付されており属名までもコリネバクテリウム属あるいは
ブレビバクテリウム属などさまざまである。しかしなが
ら、これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やＤＮＡの
塩基組成が画一的であることから、同一の菌種であるこ
とが指摘されていた。さらに、最近、これらの菌種間に
は、７０〜８０％以上のＤＮＡの相同性があることが明
らかにされ、非常に近縁な微生物であることが明白であ
る〔にｏｍａｔｓｕ、　Ｙ、　：Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　
ｔｈｅＦｅｒｍｅｎｔａｔ＋ｖｅ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
　　Ｉｎｓ【１ｔｕｔｅ、　　Ｎｏ、５５．　１（１９
８Ｑ）　　、および５ｕｚｕｋｉ、に、、　Ｋａｎｅｋ
ｏ、　Ｔ、、　ａｎｄ　Ｋｏｍａｇａｔａ。

Ｋ、　　：　　Ｉｎｔ、Ｊ、５ｙｓｔ、　　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、、３１．　１３１（１９８１）参照〕。本明
細書では組換えＤＮＡ実験に使用できる宿主が規制され
ているため、本発明の有用性はコリネバクテリウム・グ
ルタミクムＬ−２２の誘導株を宿主として示したが上記
の事実を踏まえれば、グルタミン酸生産菌全般にそのま
ま適用できることが容易に類推される。組換え体ＤＮＡ
がこれら菌種において安定に保持され、発現されるため
にはＤＮＡの相同性など宿主菌の性質に右ける若干の相
違は問題でなく、これら菌種が当該プラスミドの自律Ｉ
１１と導入遺伝子の発現を可能にする機能を有していれ
ばよい。しかるに、これらの菌種がこの両機能を共有し
ていることは、本発明者らが、先に開示〔特願昭５６−
５８１８６（特開昭５７−１８３７９９）　）　したコ
リネバクテリウム・グルタミクム２２５−２５０から分
離され、ストレプトマイシンおよび／またはスペクチノ
マイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＣＧ４がコリ
ネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属菌種など
、グルタミン酸生産菌内で同じく復製でき、また、その
耐性遺伝子が発現される〔特願昭５６−５８１８７（特
開昭５７−１８６４９２）　）ことから明らかである。

従って、本発明を適用し得る宿主菌としては、コリネバ
クテリウム・グルタミクムに限らず、コリネバクテリウ
ム属およびブレビバクテリウム属閑種を含むグルタミン
酸生産菌全てが包括される。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１．　リジン生産菌コリネバクテリウム・グルタ
ミクムＡＴＣＣ２１５４３のリジン生合成に関与する遺
伝子のコリネバクテリウム・グルタミクムでのクローン
化と、その遺伝子の発現を利用したコリネバクテリウム
・グルタミクムによるリジンの生産： （１）　　コリネバクテリウム・グルタミクム＾ＴＣＣ
２１５４３の染色体ＤＮＡとベクターｐｃＧ１１の調！
！：コリネバクテリウム・グルタミクム＾ＴＣＣ１３０
３２から誘導され、リジンアナログであるＳ−（２−ア
ミノエチル）−システィン（以下ＡＥＣと略す）に耐性
を有するリジン生産性変異株コリネバクテリウム・グル
タミクム＾ＴＣＣ２１５４３の染色体Ｄ　Ｎ　Ａを次の
ようにして抽出単離する。

４０　Ｑｍｌ半合成培地ＳＳＭ［グルコース２０ｇ１（
ＮＨ４）　２Ｓ０４１０　ｇ、尿素３ｇ、酵母エキスＩ
ｇ、ＫＨ，Ｐｏ、　　１　ｇ、　！ＪｇＣＬ−６Ｌ００
．４　ｇ、　Ｆｅ５０．−７１１，０１０ｍｇ１！Ｊｎ
ＳＯ４−４−６１１，Ｏｏ、　２　ｍｇ、　Ｚｎ５Ｏ＋
４Ｈ＊００．９ｍｇ、ＣｕＳ口４’５Ｈ２００，４２１
ｇ、　　Ｎａ、Ｂ４Ｏ１−１０１１２００，０９ｍｇ、
　（Ｎｌ（４）　ｉＭ（ｈ口７．・４ＨｆｆＯ０，０４
■、ピオチン３０μｇ１サイアミン塩酸塩ｌａｇを水１
１に含みｌ］Ｈ７，２に調整した培地〕にスレオニンを
１００　ｇ／ｍｌとなるように補った培地に種培養を接
種して３０℃で振盪培養する。東京光電比色計で６６０
ｎｍにおける吸光度（０口）を測定し、ＯＤｏ、２にな
った時点で培養液中０．５単位／ｍ　Ｉの濃度となるよ
うにベニンリンＧを添加する。さらに培養を継続しＯＤ
約０．６になるまで生育させる。

培養液から菌体を集菌し、ＴＢＳ緩衝液〔０，０３Ｍト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと
略す）　、０．００５Ｍ巳ＤＴＡ、　０．０５ＭＮａＣ
／　：　ｐＨ８，０）で洗浄後、リゾチーム液（２５％
ショ塘、０．ＩＭＮａＣｌ、０．０５Ｍ）リス、０，８
ｍｇ　７ｍ　Ｉリゾチーム：ｐＨ８，０以下同じ）　ｌ
Ｑｍｌに懸濁し３７℃で４時間反応させる。集菌した菌
体から斉藤らのｉ法１”５ａｉｔｏ、　）１．ｅｔ　ａ
上：　Ｂｉｏｃｈｉｍ。

［１ｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　７２　、６１９（１
９６３）　）に従って高分子染色体ＤＮＡを単離する。

一方、ベクタープラスミドとして用いるρＣＧＩＩは、
コリネバクテリウム・グルタミクムし一２２株の誘導法
ＬＡＩ（１３のｐｃＧｌｌ保有株ＬＡ１０３／ｐＣＧ　
１１（ＡＴＣＣ３９（１２２）から次のようにして単離
する。

４００ｍＩＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ、酵母エキス
５ｇを水１１に含みｐＦ１７．２に調整した培地）で３
０℃で振盪培養しＯＤ約０．７になるまで生育させる。

菌体を集菌し、ＴＥＳ緩衝液で洗浄後、リゾチーム液Ｉ
Ｑ＋ｎｌに懸濁し、３７℃で２時間反応させる。反応液
に５Ｍ　ＮａＣ１２，４ｍｌ、０．５ＭＥＤＴ＾（ｐＨ
８，５）　　０．６＋＋＋ｌ、４％ラウリル硫酸ナトリ
ウムと０．７ＭＮａＣ１からなる溶液４．４ｍｌを順次
添加し、緩やかに混和してから氷水中に１５時間置く。

溶菌物全体を遠心管に移し４℃で６０分間、６９、４０
０　ｘ　ｇの遠心分離にかけ上澄液を回収する。

これに重量百分率１０％相当のポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）　６．０００　（牛丼化学薬品社製）を加え
、静かに混和して溶解後、氷水中に置く。ｌＯ時間後１
．５００　ｘ　ｇで１０分間遠心分離してペレットを回
収する。ＴＥＳ緩衝緩衝液５警ｌえてペレットを静かに
再溶解してから１．５　ｍｇ／ｍｌエチジウムブロマイ
ド２．Ｑｍｌを添加し、これに塩化セシウムを加えて静
かに溶解し密度を１．５８０に合わせる。この溶液を１
０５．０００　ｘ　ｇ　、　１８℃で４８時間超遠心分
離にかける。この密度勾配遠心により共有結合で閉じら
れた環状のＤＮＡは、紫外線照射することによって遠心
チューブ中下方の密度の高いバンドとして見出される。

このバンドを注射器で遠心チューブの側面から抜きとる
ことによってＪ）ＣＧＩＩ　ＤＮＡが分離される。次い
で分画液を等容量のイソプロピルアルコール液〔容ｆｆ
ｉ百分率９０％イソプロピルアルコール、１０％ＴＥＳ
媛衡液（この混液中に飽和溶解量の塩化セシウムを含む
）〕で５回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し
、しかる後にＴＢＳ緩衝液に対して透析する。

（２）　　コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ
２１５４３のリジン生合成に関与する遺伝子のクローン
化 上記で調製したｐｃＧ１１プラスミドＤＮＡ３■を含む
制限酵素ＢｇｌＵ用反応液（１０ｍＭトリス塩酸、７ｍ
Ｍ　ＭｇＣＬ　、６０ｍＭ　　ＮａＣｊ！、７ｍＭ　２
−メルカプトエタノール、ｐＨ７，５）　６０ｔｌｌに
６単位のＢｇＩＩ［（宝酒造社！ｌ）を添加し、３７℃
で６０分間反応後６５℃で１０分間加温して反応を停止
する。一方コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ
２１５４３の染色体ＤＮＡ８■を含む制限酵素Ｒａｍ）
Ｉ　Ｉ反応液（ｌｏｍＭ　ｌ−リス塩酸、７ｍＭ　Ｍｇ
ＣＬ　。

１００ｍＭ　ＮａＣ１，２ＩＩＩＭ２−メルカプトエタ
ノール、０．０１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ８，０）
　１４０薦に４単位のＢａｍＨＩを添加し、３７℃で６
０分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止さ
せる。

雨滴化物を混合し、Ｔ４１Ｊガーゼ用緩衝液（トリス塩
酸６６０ｍ１Ｊ、　ＭｇＣＬ　　６６ｍＭ　、ジチオス
レイトール１００ｍ＆ｌ　、　ｐＨ７，６）　４０Ａ＋
’、ＡＴＰ（５ｍＭ）　４０ｍ、Ｔ４リガーゼ（宝酒造
社製、１単位／ρ）０．３ｊｔＩ！および）１２０１２
ｈｊ！を加え、１２℃で１６時間反応させる。この混合
物をＴＢＳ緩衝液で飽和したフェノール４００．ｄで２
回抽出し、ＴＢＳ緩衝液に対して透析してフェノールを
除外する。

このリガーゼ反応混合物を、コリネバクテリウム・グル
タミクムし一２２株から誘導させたΔＥＣ感受性のＬＰ
４株の形質転換に供する。

形質転換はＬＰ４株のプロトプラストを用いて行なう。

ＬＰ４株の種培養をＮＢ培地に植菌し３０℃で振盪培養
する。ＯＤ　Ｏ，６になった時点で集菌し、該細胞をＲ
ＣＧＰ培地〔グルコース５ｇ。

カザミノ酸５ｇ、酵母エキス２．５ｇ、に、ＨＰｏ。

３、５　ｇ、　ＫＨｉＰＯｎ　１．５　ｇＳＭｇＣｊ！
２・６ｔ＋、ｏ　Ｏ，４１ｇ　、　ＦｅＳＯ４’７Ｈｚ
０１０ｍｇ、　Ｍｎ５Ｏ＊・４”６Ｈ２０２ｆｆ１ｇ、
２ｎＳＯａ’７Ｈｚ０　０．９　ｍｇ、　　（ＮＨＪａ
Ｍｏ７０＊ｓ・４Ｈ２００，０４ｍｇ、ビオチン３０Ｊ
ｔｇ、サイアミン塩酸塩２ｍｇ、コハク酸二ナトリウム
１３５　ｇ　、ポリビニルピロリドン（分子遣１０００
０）　３０　ｇを水１１に含む培地〕に１ｍｇ／ｍｌの
りゾチームを含む液（ｐＨ７，６）に約１０’細胞／ｍ
　Ｉとなるように懸濁し、Ｌ型試験管に移して３０℃で
５時間緩やかに振盪反応してプロトプラスト化する。

このプロトプラスト菌液Ｑ、５ｍｌを小試験管にとり２
５００　Ｘ　ｇで５分間遠心分離しＴ　Ｓ　Ｍ　Ｃ緩衝
液（１０ｍＭ塩化マグネシウム、３０ｍＭ塩化カルシウ
ム、５ＱｍＭ　）リス、４ＱＱ＋ｎＭショ糖、ｐＨ７，
５）１ｍｌに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＩＪＣ緩衡液
Ｑ、１ｍｌに再懸濁する。この菌液に２倍高濃度のＴＳ
！ＡＣ緩衝液と上記リガーゼ反応ＤＮＡ混合物のｌ対ｌ
混合液１００４を加えて混和し、次いでＴＳＭＣ緩衝液
中に２０％Ｐ　Ｅ　Ｇ６．０００を含む液Ｑ、３ｍｌを
添加して混合する。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，２
）　２ｍｌを添加し、２．５００　Ｘ　ｇで５分間遠心
分離にかけて上澄み液を除去し、沈降したプロトプラス
トを１ｍｌのＲＣＧＰ培地に懸濁してから０．２１１１
１をスベクチノマイシン４００　Ｊｔｇ／ｍｌを含むＲ
ＣＧＰ寒天培地（ＲＣＧＰ培地に１．４％寒天を含む培
地、ｐＨ７，２＞に塗抹し、３０℃で７日間培養する。

寒天培地上に生育した菌全量をかき集め生理食塩水で洗
浄後、１ｍｌの生理食塩水に懸濁する。

この菌液をスレオニン２ｍｇ／ｍｌ　、Ａ［ｉＣ２＋ｎ
ｇ／ｍｌおよびストレプトマイシン１２．５■／ｍ　Ｉ
相当を含有する最少寒天培地Ｍ１［グルコース１０ｇ１
ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１ｇ　、　ＫＣｊ！　　０．２　ｇ　
Ｓ’、４ｇＳＯ４・７Ｈ２００，２ｇ　、　　Ｆｅ５ｏ
４４ｔ＋２ｏ　　１０ｍｇ、！ＪｎＳＯｎ・４〜６１１
２００６２ｍｇ　％　Ｉｎ５Ｌ　・ＴＮ　２００−９　
ｍｇ−、ＣｕＳＯ４・５８２０　ｏ、　４　ｍｇ　５Ｎ
ａ２Ｂ４０ｉ’１ＯＨ２００，０９ｍｇ、　　（ＮＨｓ
）Ｊｏｔ口２．・４Ｈ２００、０４ｍｇ、ビオチン５０
ｘＳｐ−アミノ安息香酸２．５ｍｇ、サイアミン塩酸塩
１ｍｇ、寒天１６ｇを水２中に含みｐＨ７，２に調整し
た培地〕上に再塗布して３０℃で３日培養する。出現し
たコロニーの中からＡＢＣ，スベクチノマイシンおよび
ストレプトマイシンに耐性の株が得られる。

これらの形質転換株の保有するプラスミドは、前記のｐ
ｃＧｌｌを単離したのと同様の方法で単離される。これ
らのプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　１■を用い、ｐｃＧｌｌ上
に切断部位のある制限酵素ＥＣＯＲＩで完全消化後、ア
ガロースゲル電気泳動で解析し、生成断片の和から分子
量を同定した。分子量は同一アガロースゲル上で同時に
泳動したラムダファージＤＮＡの制限酵素旧ｎｄｌＩ［
消化で生成する分子量既知の各断片の泳動距離で描かれ
る標準曲線に基づいて算定する。形質転換株の一株から
得られたプラスミドｐＡｅｃ　５は分子！　１０．７Ｋ
ｂでｐｃＧｌｌ　のＢｇｆ■切断部位に３．９ＫｂのＤ
ＮＡ断片が挿入された組換え体プラスミドである。

ｐＡｅｃ５ＤＮＡを用い上記と同様な方法でＰ４株のプ
ロトプラストを形質転換しスベクチノマインン耐性で選
択される形質転換株は同時にへＥＣ耐性形質を付与され
たＥｃｏＲＩの切断様式で判定されるｐＡｅｃ　５と同
一のプラスミドを保有している。即ちｐＡｅｃ　５にコ
リネバクテリウム・グルタミクム＾ＴＣＣ２１５４３の
ＡＢＣ耐性形質を支配する遺伝子がクローン化されてい
ることが明らかである。ｐＡｅｃ　５保育園株は米国ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒ　ｉｕａ＋ｇｌｕｔａｍｉｃｃｕｎ
　Ｋ１７　ＡＴＣＣ３９０３２として寄託されている。

（３）　　ｐＡｅｃ　５保有株によるリジンの生産コリ
ネバクテリウム・グルタミクムし一２２株から誘導され
たＰ４株のｐＡｅｃ　５保有株（ＡＴＣＣ３９０３２）
と非保有株のリジン生産試験を行なう。ＮＢ寒天培地上
で生育させた菌を１白金耳ずつ５ｍＭの生産培地ＰＩ（
グルコース１００ｇ、　０ＪＨｓ）２ｓｏ＜２４、５　
ｇ　、に８２Ｐ０４　１　ｇ、　ｌＪｇｓｏ、・７１（
２００，４ｇ。

Ｆｅ５０＜−７１１ｚ０１０ｍｇ、　Ｍｎ５Ｏ＊−４−
６８２０１０ｍｇ、ビオチン５０刈、サイアミン塩酸塩
２０ｈｇ、パントテン酸カルシウム５００■、ニコチン
酸５００Ｉｔｇ、大豆加水分解物１０ｇ１炭酸カルシウ
ム３０ｇを水１１に含みｐＨ１，２に調整した培地〕の
入った試験管に植菌し３０℃で７５時間振盪培養する。

培養後、培地中のＬ−’Ｊジン生成量を酸性−銅ニンヒ
ドリン反応を用いる比色法によって測定した結果を第」
表に示す。

第　　　　１　　　　表 菌　　　株　　　　　　Ｌ−リジン生成遣（ｉｇ／ｍｌ
） Ｐ−４ 実施例２．大腸菌のスレオニン生合成に関与する遺伝子
のクローン化とその遺伝子の発現を利用したコリネバク
テリウム・グルタミクムによるスレオニンの生産： （１１大腸菌スレオニンオペロンを含有するＤＮＡ断片
のクローン化とコリネバクテリウム・グルタミクムへの
導入： クローン化は大腸菌の宿主ベクター系にて実施する。ベ
クターとして用いたｐＧ＾２２は本プラスミドを作製し
たアンらが用いている方法〔＾ｎ、　　Ｇ、　　ｅｔ　
　ａｌ　　：　　Ｊ、　　　Ｂａｃｔｅｒ＋ｏ１．、　
　　Ｉｉｌ、　　　４００（１９７９）　］に従い、本
プラスミドを保有する大腸菌に一１２株亜株の培養菌体
から単離する。供与ＤＮＡとなる高分子染色体ＤＮＡは
大腸菌に１２株（ＡＴＣＣ２３７４０）の培養菌体から
スミスのフェノール抽出法［Ｓ＋ｎ１ｔｈ、　Ｍ、　Ｇ
、　　：　！Ｊｅｔｈｏｄ　１ｎＥｎｚｙ−＋ｎｏｌｏ
ｇｙ、　１２．　ｐａｒｔ　Ａ、　５４５（１９６７）
）に従って単離する。

ｐＧＡ２２プラスミドＤＮＡ４■を含む制限酵素旧ｎｄ
ＩＩＩ反応液（ｌｏｍ！Ｊ　）リス塩酸、７ｍＭ　！Ｊ
ｇＣｌ　２゜６０ｍＭ　ＮａＣＲ、ｐｔ（７，５）　６
０ｍに０．４単位の旧ｎｄｌｌ（宝酒造社製、６単位／
４）を添加し３７℃で３０分間反応後６５℃で１０分間
加温して反応を停止する。ｐＧＡ２２には２ケ所のＨｉ
ｎｄ［［切断部位が存在するが、同一条件でＨｉｎｄｌ
ｌｌ消化した試料をアガロースゲル電気泳動で調べた結
果、−断片に切断されていることが確認される。別に、
染色体ＯＮ＾８Ｊ１ｇを含む制限酵素Ｈｉｎｄｌ］１反
応液１４０誠に４単位の旧ｎｄｌＩ［を添加し３７℃で
６０分間反応後６５℃で１０分間加温して反応を停止さ
せる。

画情化物を混合し、Ｔ４リガーゼ用緩衝液４０ガ、＾Ｔ
Ｐ（５ｍＭ）　４０ｉｔ１、Ｔ４リガーゼ０．３ｔｔｔ
ｔおよびＨ，０１２０ｄを加え、１２℃で１６時間反応
させる。

この混合物をＴＥＳＩ衝液で飽和したフェノール４００
４で２回抽出し、ＴＥＳ緩衝液に対して透析してフェノ
ールを除去する。

このリガーゼ反応混合物を大腸菌に一１２株亜株ＧＴ−
３（Ｊ、　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１１７．　１３
３−１４３（１９７４）　　）（ホモセリンおよびジア
ミノピメリン酸要求性）の形質転換に供与する。

ＧＴ−３株のコンピテント・セル（ＤＮＡ取り込み能を
有する菌株）はダジェルトらの方法〔口ａｇｅｒｔ、　
　１１．、　　ｅｔ　　ＬＬ　：　　Ｇｅｎｅ、　６．
　２３（１９７９）　　）で調製する。即ち１００ｘｒ
／ｍｌとなるようにジアミノピメリン酸を補ったし培地
（バタトトリブトン１０ｇ、酵母エキス５ｇを水１１に
含みｐＨ７，２に調整した培地＞　５ｇｍｌに植菌し、
０００．６になるまで３７℃で培養する。培養液を氷水
で１０分間冷却してから遠心集菌する。冷却した０、１
Ｍ塩化カルシウム２０ｍ１に再懸濁し、０℃に２０分間
置く。

細胞を再遠心し、０．１　Ｍ塩化カルウシラム０．５ｍ
ｌに懸濁し０℃で１８時間置く。

塩化カルシウム処理した菌液４００ｍに前記リガーゼ反
応混合物２００〃を添加混合し、０℃に１０分間置いて
から３７℃で５分間加温する。次いでＬ培地９ｍｌを添
加し、３７℃で２時間振盪培養する。生理食塩水で２回
遠心洗浄後、１２．５ｑ／ｍｌ相当のカナマイシンを添
加したＭ９最少寒天培地（ブドウ糖２　ｇ、　ＮＨ＊Ｃ
７！１　ｇ、　ＮａＪＰ口４６ｇ１Ｋｌ１２ＰＯ４３ｇ
ＳＭｇＳＯ４・７Ｎ２００．　ｌ　ｇＳＣａＣＬ・２Ｈ
２０１５ａ＋ｇ、サイアミン塩酸塩４ＩＩＩｇおよび寒
天１５ｇを水ｉｚに含み、ｐＨ７，２に調整した培地〉
に塗布し３７℃で３日培養する。出現したただ一つのコ
ロニーは、アンピシリン２５４／ｍｌ、　クロラムフェ
ニコール２５　ｕ　／ｍ　Ｉあるいはカナマイシン２５
■／ｍ　ｌを含むし寒天培地上でも生育することが確認
される。

この形質転換株の培養菌体から上記（１）でｐＧ＾２２
を単離したのと同一の方法によりプラスミドＤＮＡを単
離する。このプラスミドＤＮＡを用い制限酵素消化とア
ガロースゲル電気泳動で解析した結果、第１図にｐＧＨ
２として示した構造を有している。ｐＧ＾２２に挿入さ
れたＤＮＡ断片は既にクスーン化された大腸菌オベスン
含有ＤＮＡ断片１：Ｃｏ５５ａｒｔ、　Ｐ、、　ｅＬ　
ａｌ　：　！Ｊｏｌｅｃ、　Ｇｅｎ、。

Ｇｅｎｅｔ、　、　Ｅ電ヨ３９　（１９７９）参照〕と
同一の制限酵素切断部位を有していることからｐＧＨ２
がスレオニンオペロンを含有することが確認される。

次にｐｃＧｌｌとｐＧＨ２の組換え体を作製する。まず
、ｐｃＧｌｌ　とｐＧＨ２を各々Ｂｇｉ、およびＢａｍ
ＨＩで適正条件下完全消化する。各プラスミドＤＮＡ２
Ｊｉｇを含む消化物を混合し、総容１２００ｍに対して
Ｔ４リガーゼ用緩衝液４０．ｄ、Ａ　Ｔ　Ｐ　（５ｍＭ
）４０ＪＪＩ！、Ｔ４リガーゼ０．２ρおよびＨ，０１
２０ｍを加え１２℃で１６時間反応させる。この混合物
をＴＢＳ緩衝液で飽和したフェノール４００威で２回抽
出しＴＢＳ緩衝液に対して透析してフェノールを除去す
る。続いて２倍高濃度のＴＳＭＣ緩衝液と前記リガーゼ
反応混合物の１対１混合液１００ＡＩ＋を供与ＤＮＡと
して用い、実施例１（１）と同様な方法でコリネバクテ
リウム・グルタミクム上Ａ２０１株（ＬＡ１０３の誘導
株、ホモセリン、ロイシン要求株）のプロトプラストを
形質転換した後、ＲＣＧＰ寒天培地に塗抹し、３０℃で
６日間培養して再生増殖させる。寒天培地上全面に生育
した菌をかき集め、生理食塩水で遠心洗浄後、ロイシン
５０■／ｍｌを補充した最少寒天培地Ｍｌ上に再塗布し
て、３０℃で３日間培養する。出現したコロニーの中か
らカナマイシン１２．５■／ｍｌあるいはスペクチノマ
イシン１０ｈｇ／…１を含むＮＢ寒天培地上で生育でき
る株が得られる。

これらの形質転換株から実施例１（１）記載のエチジウ
ムブロマイド、セシウムクロライド密度勾配遠心により
プラスミドを単離する。

これらのプラスミドＤＮＡ０．５ｇを用い各種制限酵素
による単独消化および二種類の制限酵素による二重消化
で生成するＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で解析
し、分子量およびプラスミド分子中の各制限酵素切断部
位を同定する。−株から得られたプラスミドをｐＥｔｈ
ｒ　１　と命名シタ、　制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ　、Ｅｃｏ
ＲＩ　、およびＸｈｏ　１の切断部位で特徴づけられる
構造を第３図に示す。ｐＥｔｈｒ　１　はｐｃＧｌｌに
ｐＧＨ２のスレオニンオペロンを含む、３ａｍＨＩ切断
片を結合した構造を有することが判明した。

ｐＨ：ｔｈｒ　Ｉ　ＤＮＡを用いて、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムＬＡ１０３株を前記と同様に再形質転
換した結果、ホモセリン非要求性とカナマイシンおよび
スペクチノマイシン耐性形質が連関して導入され、それ
らの形質転換株は、各種制限酵素切断様式で特徴づけら
れるｐＥｔｈｒ　１　と同一のプラスミドを保有してい
る。ホモセリンデヒドロゲナーゼの欠失に起因するＬＡ
１０３株のホモセリン要求性がｐｌＥｔｈｒ　１により
ホモセリン非要求性に復帰するのは、大腸菌ヌレオニン
オペロン上にあるホモセリンデヒドロゲナーゼが発現し
ているためにほかならない。

（２）　　ｐ［！ｔｈｒ　１保有株の造成コリネバクテ
リウム・グルタミクムし一２２株より誘導したスレオニ
ン生産菌、コリネバクテリウム・グルタミクムＬＡ−１
０６（メチオニン要求性、ＡＢＣ耐性、α−アミノ−β
−ヒドロキシ吉草酸耐性）のｐＥｔｈｒ　１保有株は、
ＬＡ−１０６のプロトプラストをｐＥｔｈｒ　１で形質
転換することによって得られる。

プロトプラストはＬＡ−１０６株を半合成培地ＳＳＭに
１０ｈｇ／ｍｌ相当のメチオニンを補った培地で培養し
、ＯＤ約０．６まで生育させた細胞を実施例１（２）と
同様な工程で処理することにより調製する。形質転換も
実施例１（２）と同様に行ないスペクチノマイシン４０
０　鴻／ｍ　ｌを含むＲＣＧＰ寒天培地上で選択して形
質転換株を取得する。

ｐＥｔｈｒｌ保有菌株は米国アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ　ｉ
ｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｋ１９＾ＴＣＣ３９０３４
として寄託されている。

（３）　　ｐＥｔｈｒ　ｌ保有株によるスレオニンの生
産上記のようにして得たＬＡ−１０６株のｐＥｔｈｒ　
１保有株（ＡＴＣＣ３９０３４＞と非保有株のスレオニ
ン生産試験を行なう。ＮＢ寒天培地上で生産させた菌を
１白金耳ずつ５＋ｎｌの生産培地Ｐ２（グルコース１０
０　ｇ、　（ＮＨｓ）ｚｓｏ＜　２０ｇ、　ＫＩＬ、Ｐ
ｏ、　０．５　ｇ。

Ｋ２ＨＰＯ４０，５ｇ、　Ｍｇ５Ｏ＊’７ＬＯｉｇ、　
ｐｅｓｏ４・７Ｈ２゜１０ｍｇ、　Ｍｎ５Ｏｎ・４〜６
Ｈ２０１０１０ｌｌ１ビオチン１００埒、炭酸カルシウ
ム２０ｇ１メチオニン１００ｍｇを水１ｒに含みｐＨ７
，２に調整した培地〕の入った試験管に植菌し３０℃で
７５時間振盪培養する。

培養後、培養洲液をペーパークロマトグラフィーにかけ
ニンヒドリン発色後、比色定量してＬ−スレオニン生成
量を測定した。結果を第２表に示す。

第　　　　２　　　　表 ＬＡ−１０６ ６，１ ＬＡ　−１０６／ｐＥｔｈｒ　１　　　　１３．４実施
例３、 大腸菌のフォスホエノールビルビン酸カルボキシラーゼ
（ＰＰＣ）遺伝子を含む組換え体プラスミドを保有する
コリネバクテリウム・グルタミクムによるグルタミン酸
の生産： （１）大腸菌のＰＰＣ遺伝子（本遺伝子は大腸菌でＧｌ
ｕ−をＧｌｕ＋にすることが知られているグルタミン酸
生合成に関与する遺伝子である）を含有するＤＮＡ断片
のクローン化とコリネバクテリウム・グルタミクムへの
導入： クローン化は大腸菌の宿主・ベクター系にて実施する。

ベクターとして用いたｐＢＲ３２２は実施例１（１）で
ｐＧＡ２２を調製したのと同一の方法で大腸菌に一１２
株亜株の培養菌体から単離する。供与ＤＮＡとなる高分
子染色体ＤＮＡは実施例２（１）で大腸菌に一１２株（
ＡＴＣＣ２３７４０）から調製したものを使用する。

ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ３４および染色体ＤＮＡ
９埒を含む制限酵素５ａｌｌ用反応液（ｌＱｍＭ　）リ
ス塩酸、？＋ｎＭ　！ＪｇＣＩ１２．１００ｍＭ　Ｎａ
ＣＲ。

７ＴＩＩＭ　　２−メルカプトエタノール、０．０１％
ウシ血清アルブミン、ｐｔ１７．５　＞　２００ＡＩ＋
にＩＯ小単位５ａｌｌ（宝酒造社製）を添加し、３７℃
で６０分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停
止させる。この混合消化物に７４１Ｊガーゼ用緩衝液４
０β、Ａ　Ｔ　Ｐ　（５ｍＭ）　４に、　Ｔ　４リガー
ゼ０．４廣および水１２０ｍを加え、１２℃で１６時間
反応させる。この混合物をＴＢＳ［ｉ液で飽和したフェ
ノール４００ｍで２回抽出し、ＴＥＳ緩衝液に対して透
析しフェノールを除去する。

このリガーゼ反応混合物を大腸菌に一１２株亜株ＰＰＣ
２ＣＧＩａｎｓｄｏｒｆｆ、　Ｎ、、　Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、　５１．　１６７（１９６５）］　（ａｒｇ−，ｔ
ｈｒ−、１ｅｕ−、ｈａｓ−、Ｔｔｕ−、ＰＰＣ−。

ＳＴ’）の形質転換に供する。ＰＰＣ２株のコンピテン
ト・セルは２ｍｇ／ｍｌ　のグルタミン酸を補ったし培
地で培養し、実施例２（１）で６Ｔ−３株のコンピテン
ト・セルを得たのと同様に調製する。形質転換は前記リ
ガーゼ反応混合物２００ＪＬ１を使用し、実施例２（１
）と同様に行う。Ｌ培地９ｍｌを添加し、３７℃で２時
間振盪培養して形質発現させる。次いで生理食塩水で２
回遠心洗浄後、アルギニン、スレオニン、ロイシン、ヒ
スチジン各５０　ｔｔｇ　／ｍ　ｌを補ったＭ９最少寒
天培地に塗布し、３７℃で３日間培養する。出現したコ
ロニーをアンピシリン２５　Ｍ　／ｍ　ｌあるいはテト
ラサイタリン２５　Ｍ　／ｍ　１を含むし寒天培地上に
レプリカし、３７℃で２４時間培養してアンピシリン耐
性でテトラサイタリン感受性のものを選び出す。

これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様の方法で
プラスミドＤＮＡを単離する。形質転換株の一株から得
られたプラスミドｐｐｃ　ｌを制限酵素消化とアガロー
スゲル電気泳動で解析した結果、ｐ８Ｒ３２２のＳａｌ
　ｌ切断部位に４．４にｂのＤＮＡ断片が挿入されたゲ
ノムサイズ８．８にｂの組換え体プラスミドであること
が判明した。

このｐＰＣ１プラスミドを用いてＰＰＣ２株を前記と同
様な方法で形質転換し、アンピシリン耐性で選択される
形質転換株は全てグルタミン酸非要求性で、制限酵素切
断様式で特徴づけられるｐＰＣ１と同一構造のプラスミ
ドを保有している。このことはＰＰＣ１プラスミド上に
大腸菌のＰＰＣ遺伝子がクローン化されていることを示
す。

クローン化されたＰＰＣ遺伝子をコリネバクテリウム・
グルタミクムに導入するために、ｐｃＧｌｌとｐＰＣ１
の組換え体を宿主大腸菌で調製する。

ρＣＧＩＩおよびｐＰＣｌ　プラスミドＤＮＡを各々２
絹含む制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ用反応緩衝液〔２０ｍＭトリ
ス塩酸、１０ｍＭ　！ＪｇＣｆ　２．５Ｑｍ旧ＮＨ，）
２ＳＯ，，０，０１％ウシ血清アルブミン、Ｉ）８７．
５３２００ｎに４単位のＰｓｔｌ（宝酒造社製）を添加
し、３０℃で６０分間反応後、６５℃で１０分間加温し
て反応を停止させる。この反応混合物に７４１Ｊガ一ゼ
用緩衝液４０ｍ、　ＡＴＰ（５ｄ）　４０Ａ１＋、Ｔ４
リガーゼ０．２ｄおよび水１２０頭を加え、１２℃で１
６時間反応させる。前記と同様にフ二ノール抽出後、透
析してフェノールを除去する。このリガーゼ反応混合物
１００．ｄを使用し、前記と同様にＰＰＣ２株を形質転
換した。

生じたコロニーから前記の方法でプラスミドを分離し、
その大きさをアガロースゲル電気泳動で調べた。大きさ
が約１５〜１５Ｋｂのプラスミドを選択し、そのプラス
ミドで再度ＰＰＣ２株を形質転換しＰＰＣ遺伝子の存在
を確認した。先の形質転換株の一株から得られたプラス
ミドｐＥｐｐｃ　１を制限酵素消化とアガロースゲル電
気泳動で解析した結果、ｐｃｃｔｔ　とｐＰｃｌが両者
のＰｓｔ　ｌ切断部位で和合連結したゲノムサイズ１５
．６にｂの組換え体プラスミドであることが明示された
。こうして大腸菌で調製されたｐＢｐｐｃ　ｌ　プラス
ミドＤ　Ｎ　Ａを用い、コリネバクテリウム・グルタミ
クムＬ〜２２株から誘導されたＬＰ４株を形質転換する
。形質転換は実施例１（２）と同様に行い、形質転換株
はスペクチノマイシン４０１ｂｃｇ／ｍｌを含むＲＣＧ
Ｐ寒天培地上で生育するコロニーの中から取得される。

これらの形質転換株から単離されるプラスミドを制限酵
素５ａｌｔあるいはＰｓｔ　Ｔの単独消化または両者の
２重消化し、アガロースゲル電気泳動で解析することに
よりｐεｐ９Ｃ１を保をしていることが確認される。

ｐＢｐｐｃ　１保育園株は米国アメリカン・タイプ・カ
ルテ＋−−コレクションにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｕ
　ｉｎｇｌｕｔａｍｉｃｕａ＋　Ｋ−１８＾ＴＣＣ’３
９０３３として寄託されている。

（２）ｐＥｐｐｃ　１保有株によるグルタミン酸の生産
：コリネバクテリウム・グルタミクムし一２２株から誘
導されたＬＰ４株のｐＥｐｐｃ　ｌ保有株（＾ＴＣＣ３
９０３３）　と非保有株のグルタミン酸生産試験を行っ
た。ＮＢ寒天培地上で生育させた菌をかき集め、生理食
塩水で洗浄後、５ｍｌの生産培地Ｐ３Ｃグルコース５０
ｇ、　（ＮＨ４）２Ｓ０４　３　ｇ、尿素３　ｇ、　Ｋ
ＨｉＰＯｓ　Ｏ，５ｇ、　Ｋ２ＨＰＯ４０，５ｇ、Ｍｇ
５Ｏｎ・７ＨｚＯｏ、　５　ｇ　５ＦｅＳＯｓ’７Ｈ，
０１０ｍｇ、　Ｍｎ５Ｏ＜・４〜６Ｈ２ｏ　１０１１ｇ
、ビオチン３■、サイアミン塩酸塩５０Ｌｃｇ、フェノ
ールレッド１０ｍｇを純水ｌβに含み、ｐＨ７，２に調
整した培地〕の入った試験管に植菌し、３０℃で振盪培
養する。培養中、２０％尿素液を０．２１１１１ずつ３
回添加し、４０時間培養する。培養後、培養ｐ液をペー
パークロマトグラフィーにかけ、ニンヒドリン発色後、
比色定量してＬ−グルタミン酸の生成量を測定した。

結果を第３表に示す。

第　　　３　　　表 Ｐ−４ １０，１ 実施例４．　ブレビバクテリウム・フラブム＾ＴＣＣ＋
４０６７のアンスラニル酸合成酵素遺伝子のコリネバク
テリウム・グルタミクムでのクローン化と発現： ブレビバクテリウム・フラブムＡＴＣＣ１４０６７の染
色体ＤＮＡを実施例１（１）と同様の方法でｊＪＲ製す
る。

ベクターとして用いるｐＣε５３は実施例１　（１）で
ｐｃｃ；　１１を単離したのと同様の方法でその保有株
コリネバクテリウム・グルタミクムし一２２株の培養菌
体から単離する。ｐＣε５３　は本発明者らが先に開示
したコリネバクテリウム・グルタミクムのプラスミドｐ
ＣＧ１　［特願昭５６−１８１０１（特開昭５７−１３
４５００）　：］と大腸菌のプラスミドｐＧＡ２２　Ｅ
Ａｎ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ　：Ｊ０口ａｃｔｅｒｉｏｌ
、、　１４０．４００（１９７９）参照〕を和合連結さ
せたプラスミドである。詳しくはｐＣＧＩ上に１ケ所し
かない８ｇ！■切断部位とｐＧ＾２２上に２ケ所あるＢ
ａｍＨ［切断部位のうちテトラサイクリン耐性遺伝子内
でない［ｌａｍＨＩ切断部位とで、両制限酵素の同一接
着末端を利用して連結したものである。

ｐＣε５３はｐＧＡ２２由来のカナマイシン耐性遺伝子
などの選択マーカーを存し、制限酵素Ｓａｌ　Ｉに対す
る切断部位は１ケ所である。

上記で調製したｐＣＥ５３プラスミドＤＮＡ３Ｒおよび
染色体ＤＮＡ９ｑを含む制限酵素Ｓａｌ　Ｉ反応液２０
０　ｄにｌＯ単位の５ａｌｌを添加し、３７℃で６０分
間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止させる
。この混合消化物にＴ４リガーゼ用緩衝液４０４、Ａ　
Ｔ　Ｐ　（５１１１Ｍ）　４０Ａｌ！　、　Ｔ　４リガ
ーゼ０．４ｍおよびＨ，０１２０ＪＩｊｌを加え、１２
℃で１６時間反応させる。この混合物をＴＢＳ緩衝液で
飽和したフェノール４００ｍで抽出し、ＴＥＳｔｌ衝液
に対して透析し、フェノールを除去する。

このリガーゼ反応混合物を形質転換に供する。

形質転換する受容菌としてコリネバクテリウム・グルタ
ミクムし一２２株から誘導されたアンスラニル酸要求性
変異株ＬＡ１０５（アンスラニル酸合成酵素欠損変異株
）を用いる。アンスラニル酸要求性変異株は、常法の変
異処理により、Ｍ１寒天培地上で生育できず、アンスラ
ニル酸（３０ｇ／ｍｌ相当）を補ったＭｌ寒天培地上で
生育できる菌を選択することによって取得される。ＬＡ
１０５株のプロトプラストの調製および形質転換は、生
育培地ＮＢにｌ　ＯＯＪ１ｇ／ｍ１相当のアンスラニル
酸を捕った培地を使用する以外は実施例１（２）と同様
に行う。形質転換株は、カナマイシン２００　ｇ／ｍｌ
　相当ヲ含むＲＣＧＰ寒天培地上で生育するコロニーと
して選択される。出現したコロニーの中からＭ１寒天培
地上で生育できる形質転換株が得られる。

これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様にプラス
ミドＤＮＡを単離する。形質転換株の一株から得られた
プラスミドｐＴｒｐ２−３を各種制限酵素消化とアガロ
ースゲル電気泳動で解析した結果、ｐｃＥ５３の唯一の
５ａｉｌ切断部位に約７．１にｂの５ａｌｆＤＮΔ切断
片が挿入されたプラスミドであることがわかった。

ｐＴｒｐ　２−３を用い、同様な方法でＬＡ１０５株を
再形質転検したところ、トリプトファン１００埒／ｍ　
ｌおよびカナマイシン４００　ｇ／ｍｌを含むＲＣＧＰ
寒天培地上で生育するコロニーは、同時にアンスラニル
酸非要求性となり、それらは、Ｓａｌｌの切断様式で判
定されるｐＴｒｐ　２−３と同一のプラスミドを保有し
ている。

以上の結果は、クローン化された約７．　ｌにｂのＳａ
ｌ［）ＮＡ切断片にはブレビバクテリウム・フラブム＾
ＴＣＣ１４０６７のアンスラニル酸合成酵素をコードす
る遺伝子が存在し、それがコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＬＡ　１０５株中で発現していることを示す。

ｐＴｒｐ　２−３保有圀株は米国アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
＋ｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｋ２０＾ＴＣＣ３９０３
５として寄託されている。

プラスミドｐＣＥ５２を用いて上記と同様の処理を行い
、ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣ（１：１４０６
７のアンスラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を有す
るプラスミドｐＴｒｐ　４−３を得る。

ｐＥｃ５２は本発明者らが先に開示したコリネバクテリ
ウム・グルタミクムのプラスミドｐｃＧ１　（特願昭５
６−１８１０１（特開昭５７−１３４５００）　）と大
腸菌のプラスミ　ドρＧ＾２２　〔＾ｎ、Ｇ、ｅｔ−ａ
Ｌ：　　Ｊ、　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１４０、４００（１９７９）参照〕を和合連結させたプ
ラスミドである。詳しくはｐＣＧ　ｌ上に１カ所しかな
いＢｇｌ■切断部位とρＧ＾２２上に２カ所あるＢａｌ
１ｌｌ（ｌ切断部位のうちテトラサイクリン耐性遺伝子
内の［ｌａｍＨｌ切断部位とで、両制限酵素の同一接着
末端を利用して連結したものである。ρＣε５２はρＧ
＾２２由来のカナマイシン耐性遺伝子などの選択マーカ
ーを有し、制限６ｒ素５ａｌｌに対する切断部位は１カ
所である。

ｐｃＥ５２は実施例１　（１）でｐ［Ｇ１１を単離した
のと同様の方法でｐＣε５２保有株コリネバクテリウム
・グルタミクムし一２２株の培養菌体から単離する。

」１記と同様にトリプトファン生産性のコリネバクテリ
ウム・グルタミクムに３６株（ＦＢＲＭ　ＢＰ−４５１
）をｐＴｒｐ４−３で形質転換する。得られた形質転換
株は米国アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉ
ｃｕｍに３１゜＾ＴＣＣ３９２８０として寄託されてい
る。

ｐＴｒｐ　２−３保有株コリネバクテリウム・グルタミ
クムに２０．＾ＴＣＣ３９０３５およびｐＴｒｐ　４−
３保有株同に３１．＾ＴＣＣ３９２８０によるＬ−）リ
ブトファン生産試験を下記のとおり行う。

菌株をＮＢ液体培地中で３０℃、１６時間振盪培養した
菌液Ｑ、５ｍｌを５ｍＭの生産培地Ｐ４Ｃ廃糖蜜１００
ｇ／Ｊ！、（ＮＨ４）　ｉｓＯ＜　２０　ｇ　／　Ｉ！
　、Ｋｌ（ｚＰＯ＊　　０．５　ｇ／ｌＳＫ、１１問４
　０．５ｇ／ｉ’、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２５ｇ／
　ｆ　、　ＣａＣＯ３２０ｇ／　１　、ｐｌ＋’７．２
　）の入った試験管に植菌し、３０℃で９６時間振盪培
養する。

培養後、培養ν液をベーパークロマトグラフィーにかけ
、ニンヒドリン発色後、比色定量して、Ｌ−１ブトフア
ンの生成量を測定する。

対照として、ＬＡ−１０５株およびし＾Ｒ−１株を同様
に処理する。

結果を第４表に示す。

第　　　４　　　表 ＬＡ−１０５ ＬＡ−１０５／ｐＴｒｐ　２−３（に２０．＾ＴＣＣ３
９０３５）　　　０．３４ＬＡＲ−１０，４８ Ｌ＾Ｒ−１／ｐＴｒｐ　４−３（に３１．＾ＴＣＣ３９
２８０）　　　１．１２実施例５．ｐＣＢ１０１の作製
： （＋）　　ρＣＧＩＩ　と１０口１１０の分離ρＣＧＩ
Ｉ　は、本プラスミドを保有するコリネバクテリウム・
グルタミクムＬＡ１０３／ρＣＧＩＩ（＾ＴＣＣ３９０
２２）を４００ｍ１ＮＢ培地でＯＤ約０．８になるまで
生育させ、その培養細胞から、実施例１（１）でｐＣＧ
２を単離したのと同一の方法で単離する。

ｐＵｏｌｌｏは、グリクザンらの方法［Ｇｒｙｃｚａｎ
。

Ｔ、　　Ｊ、　　ｅｔ　　　ａｌ、　　　二　Ｊ、　　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　、、１３４．　３１８（１９７８
）参照〕により、本プラスミドを保有するバチルス・サ
チルスＢＲ１ｓ’／ｐ［ＩＢ”’　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７５．１４２３（１
９７８））の培養菌体から単離する。

（２）ρＣＧＩＩ　とｐｕｅｔｔｏの試験管内組換え上
記で調製したｐｃＧｌｌプラスミドＤＮＡ２■を含む制
限酵素８ｇｆｎ反応緩衝液（１０ａ＋Ｍ　）　！ｊス塩
酸、７ｍＭ　　ＭｇＣｊ！２．６０ａ＋Ｍ　　ＮａＣＬ
　７ｍＭ　２−１ルカプトエタノール、　Ｉ）Ｈ７，５
）　　１００ρに２単位のＢｇｊ！ＩＩ（全酒造社製、
６単位／ＪｄＩ）を添加し、３７℃で６０分間反応させ
る。また、ｐＵＢ１１０プラスミドＤＮＡ　２ｔｔｇを
含む制限酵素［１ａｍＨＩ反応緩衝液（１０ｍＭ　）リ
ス塩酸、７ｎＭ　ＭｇＣＬ　、ｌｏＯｍＭＮａＣｌ、　
　２１１１Ｍメルカプトエタノールウシ血清アルブミン
、ｐＨ８．０）　　ｌ　Ｏ　ＯＪＩＩＩに２単位のＢａ
ｍＨＩ（全酒造社製、６単位／ＪＩＪ１）を添加し、３
７℃で６０分間反応させる。

両制限酵素消化物を混合し、Ｔ４１Ｊガーゼ緩衝液４０
ρ、ＡＴＰ　（５ａ＋Ｍ）４０ＩｄＩ，　Ｔ４リガーゼ
０、２〃およびＨ，０１２０ｍを加え、１２℃で１６時
間反応させる。この混合物を、ＴＥＳ緩衝液で飽和した
フェノール４００４で２回抽出し、Ｔ８ＳＭ衝液に対し
て透析したフェノールを除外する。

（３）　　ｐｃ８１０１の取得 ２倍高濃度のＴＳＭＣｒ！１．新液と上記リガーゼ反応
混合物の１対１混合液１００４を供与ＤＮＡとして用い
、実施例１（３）と同様な方法で、コリネバクテリウム
・グルタミクムＬＡ　１　０　３を形質転換し、カナマ
イシン耐性株を選択する。出現したコロニーをカナマイ
シン１　２．　５　Ｉｔｇ／ｍｌあるいはスベクチノマ
インン１　０　０ｘ／ｍｌを含むＮＢ寒天培地ににレプ
リカし、３０℃で２日培養して生育した二重耐性形質転
換株３株を任意に選び、同一寒天培地上で純化する。こ
の３株を４００ρＮＢ培地で、ＯＤ約０．８になるまで
生育させ、集菌後、その培養細胞から実施例１　（１）
記載のエチジウムブロマイド−セシウムクロライド密度
勾配遠心によりプラスミドを単離する。いずれの形質転
換株からも３０〜３５ＭのプラスミドＤＮＡが得られる
。

これらのプラスミドＤＮＡを実施例１（３）と同じよう
に制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動で解析し、分
子量と制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ　、ＥｃｏＲ　Ｉ、Ｈｉｎｃ
ｌｌおよびＢｇｉの切断点を同定する。３株のプラスミ
ドは全てｐｃＧｌｌとｐＵＢｌｌＯが和合連結した構造
を有し、そのうち二種は第２図にｐｃＢｌｏｌで示した
構造であるが、他の一種は結合向きが逆向きである。

いずれのプラスミドを有する形質転換株もρＣＧＩＩ　
由来のスベクチノマイシン耐性形質とｐＵ８１１０由来
のカナマイシン耐性形質を有している。

これらのプラスミドＤＮＡを用い、コリネバクテリウム
・グルタミクムＬＡ１０３株を再形質転換した結果得ら
れたカナマイシン耐性形質転換株は、スペクチノマイシ
ン耐性形質を同時に獲得しており、各種制限酵素切断様
式で特徴付けられる供与プラスミドと同一のプラスミド
を保有している。

実施例６。

コリネバクテリウム・グルタミクムＣ１５６株のＬ−ヒ
スチジン生合成に関与する遺伝子のクローン化および該
遺伝子の発現を利用したコリネバクテリウム・グルタミ
クム、コリネバクテリウム・ノ＼ー手ユリス、ブレビバ
クテリウム・フラブムおよびブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタムによるＬ−ヒスチジンの生産： （１）　　コリネバクテリウム・グルタミクム［１５６
株の染色体ＤＮＡとプラスミドｐｃＧ１１の調製；１、
　２．　４　−　）リアゾール−３−アラニン耐性でヒ
スチジン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミ
クムＣ１５６株（ＦεＲＭ　ＯＰ−４５３＞の染色体Ｄ
Ｎ八を実施例１　（１）と同様の方法で調製する。

一方、ベクタープラスミドとして用いるｐｃＧｌｌは、
コリネバクテリウム・グルタミクムし一２２株の誘導様
ＬＡ１０３のｐｃＧ１１保有株ＬＡ　１０３　／ＩＩＣ
Ｇ　Ｉ　ｌ（＾ＴＣＣ３９０２２）から実施例１（Ｉ）
と同様にして単離する。

（２）　　コリネバクテリウム・グルタミクムＣ１５６
株のヒスチジン生合成に関与する遺伝子のクローン化； 」１記で調製したｐＣＧ　ｌ　１　プラスミドＤＮＡ３
埒および上記染色体ＤＮＡ９μｇを含む制限酵素Ｂｇ７
！ＩＩ用反応液［１０ｍＭ　）リス（ｐＨ　７．　５　
）　、７ｍＭＭｇＣＬ　、６０ｍＭ　Ｒａｃｅ，　　７
ｍＭ２−メルカプトエタノール）２００ｄにｌＯ単位の
［１ｇｊ！ＩＩ（全酒造社製）を添加し、３７℃で６０
分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止させ
る。この混合消化物にＴ４リガーゼ用緩衝液（トリス２
００ｍＭ　。

ＭｇＣ　ｌ　ｚ　６６ｍＭ、ジチオスレイトール１００
ｍＭ　、　９８７．６）４０ｍ、５ｍ１ＴＰ溶液４０ｄ
、Ｔ４リガーゼ（宝酒造社製、１単位／１１１）０．３
ｔｄｌおよび水１２０ρを加え、１２℃で１６時間反応
させる。

Ｔ４’ｌｌガーゼ反応混合物をコリネバクテリウム・グ
ルタミクム１８３３株（ヒスチジン要求性、リゾチーム
感受性）の形質転換に供する。

形質転換は１１１３３株のプロトプラストを用いて行う
。プロトプラストの調製は実施例１（２）と同様に行う
。

プロトプラスト邸濁液０．５ｍｌを小試験管にとり２５
００　Ｘ　ｇで５分間遠心分離し、７３ＭＣ緩衝液（１
０ｄ塩化マグネシウム、３０ｍ１＋塩化カルシウム、５
０ｍＭ　）リス、４００ｍＭ　ショ糖、ｐＨ７，５＞　
　１ｍｌに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＩＪＣ緩衡液０
．１ｍｌに再懸濁する。この懸濁液に２倍濃度の７３Ｍ
Ｃ緩衝液と上記リガーゼ反応ＤＮＡ混合物の１対ｌ混合
液１００屑を加えて混和し、次いでＴＳＩＩＣ緩衝液中
に２０％Ｐ　Ｅ　Ｇ６．０００を含む液０．８１を添加
して混合する。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐ）１７．２）
　２ｍｌを添加し、２．５００Ｘｇで５分間遠心分離に
かけて上澄み液を除去し、沈降したプロトプラストを１
ｍｌのＲＣＧＰ培地に懸濁してから０．２ｍｌをスペク
チノマイシン４００■／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地（
ＲＣＧＰ培地に１．４％寒天を含む培地、ｐＨ７，２）
に塗抹し、３０℃で７日間培養する。

選択プレート上に生育したスペクチノフイシン耐性コロ
ニーをかき集め、生理食塩水を用いて２回遠心洗浄後、
スベクチノマイシン１００ｇ／ｍＩを含む最少寒天培地
Ｍ１に塗布して３０℃で２日間培養し、スベクチノマイ
シン耐性でかつヒスチジン非要求性となった形質転換株
を選択する。

形質転換株の１株から実施例１　（１）記載のエチジウ
ムブロマイド・セシウムクロライド密度勾配遠心により
プラスミドを単離する。各種制限酵素による単独消化お
よび２種類の制限酵素による二重消化で生成するＤＮＡ
断片をアガロースゲル電気泳動で解析し、このプラスミ
ドＤＮＡの制限酵素切断様式を同定する。このプラスミ
ドをｐＰ４１８と命名した。ｐＰＨ８はｐｃＧｌｌ　の
８ｇＩ！ｆＩ切断部位に約１０．６　ＫｂのＤＮＡ断片
が挿入された構造である。

さらにｐＰＨ８Ｄ　Ｎ　Ａを用いてＨ３３株［ＬＨ３３
株の親株（ヒスチジン要求性、リゾチーム耐性）：ＦＥ
ＲｌＪ　ＢＰ−４５２］を再形質転換したところスペク
チノマイシン耐性株として選択される形質転換株のすべ
てがヒスチジン非要求性となっていた。

これらのことより、ヒスチジン生産菌Ｃｌ５６株のヒス
チジン生合成に関与する遺伝子がクローン化されている
ことが明白である。

ヒスチジン生成に関与する遺伝子のクローニングは最初
から８３３株を宿主菌株として用いて行うこともできる
。

（３）　　ｐ　Ｐ　Ｈ８を保有するコリネバクテリウム
・グルタミクム菌株によるＬ−ヒスチジンの生産：コリ
ネバクテリウム・グルタミクムＬ人−１０３株（ＦＥＲ
藺Ｐ−５９４７、ＡＴＣＣ３１８６６）をｐＰＨ８Ｄ　
ＮＡで形質転換し、スペクチノマイシン４００Ｊｉｇ／
ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地上で同薬剤耐性の形質転換
株を選択する。得られた形質転換株を純化後、上記と同
様にプラスミド単離、構造解析を行って、ｐＰＨ３と同
じ構造のプラスミドであることを確認した。

ｐＰＨ８保有株コリネバクテリウム・グルタミクムＬＡ
　１０３　／ｐＰＨ８は米国アメリカン・タイプ・カル
チャー一：ＩＬ／クションにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　Ｋ３２．＾ＴＣＣ３９２
８１として寄託されている。

コリネバクテリウム・グルタミクムＬ＾１０３／ｐｃＧ
１１　（ＡＴＣＣ３９０２２）および同ＬＡ１０３／ｐ
Ｐ）１ｇ　（ＡＴＣＣ３９２８１）のＬ−ヒスチジン生
産試験を以下のとおり行う。

ＮＢ寒天培地十で３０℃−晩培養した上記の菌をそれぞ
れｌ白金耳ずつ２００　ｇ／ｍｌのアルギニンおよびメ
チオニンを補った５ｍｌの生産培地Ｐ５（糖蜜１２％（
糖として）　、ＫＨ，ＰＯ，０，２％、Ｋ２ＨＰＯ４０
，１％、１１ｇ５口、・７Ｈ２００，０５％、ＮａＣｊ
！　　０．２５％、（Ｎ）１．）　２ＳＯ４２，３％、
尿素０．２％、ＣａＣＬ　　２％、ｐＨ１，４（７ンモ
ニ７テ調整）〕に植菌する。３０℃で７５時間培養後、
培地中のＬ−ヒスチジン生成量をスルファニル酸（ポー
リー）試薬を用いる比色法ＣＨ，Ｐａｕｌｙ。

１（ｏｐｐｅ−３ａｙｌｅｒｓ　；　Ｚ、　Ｐｈｙｓｉ
ｏｌｏ、　Ｃｈｅｍ、、　４２．５０８（１９０４）　
、同９４．２８４（１９１５）　）によって定債した。

結果を第５表に示す。

第　　　５　　　表 ＬＡＩ０３／ｐｃＧ１１　　　　　　０ＬＡ１０３／ｐ
ｐＨ８（Ｋ３２）　　　　２．６（４）　　ｐ　Ｐ　Ｈ
８を保有するコリネバクテリウム・ノ＼−キュリス、ブ
レビバクテリウム・フラブムおよびブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムによるＬ−ヒスチジンの生産： コリネバクテリウム・ハーキュリス＾ＴＣＣ１３８６８
、ブレビバクテリウム・フラブム＾ＴＣＣ１４０６７お
よびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣ
Ｃ１３８６９にプラスミドｐＰＨ８を保有させるために
、各菌株を受容菌として形質転換を行う。

各菌株を５３Ｍ培地で増殖させ、ＯＤ６６０ｎｆ１１が
０．２になったときにペニシリンＧを０．３単位／ｍｌ
となるように添加する。培養を続け、００６６０ｎｍが
０．６まで増加したところで集菌し、１ｍｇ／ｍｌリゾ
チームを含むＲＣＧＰ培地中培土中の記載と同様にプロ
トプラストを形成させる。ｐＰＨ８を用い、上記の方法
に従い形質転換を行い、形質転換株をスペクチノマイシ
ン４００■／ｍ　Ｉを含むＲＣＧＰ寒天培地上で生育す
るコロニーとして選択する。

純化したスペクチノマイシン耐性形質転換株の培養菌体
よりプラスミドＤＮＡを特開昭５７−１８３７９９、同
５７−１３４５００の記載に従って調製し、これらがｐ
ＰＨ８と同じ構造を有することが制限酵素切断様式より
確認される。以上のことから、プラスミドｐｃＧ１１の
誘導体であるプラスミドｐＨ１３はコリネバクテリウム
・ハーキユリス、ブレビバクテリウム・フラブムおよび
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム中でも複製
可能であり、プラスミドｐｃＧ１１が広（これら菌種の
細菌で使用可能であることがわかる。

ｐＰＨ８保有株であるコリネバクテリウム・）ｈ−キ二
リスに３３、ブレビバクテリウム・フラブムに３４、お
よびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムに３５
はそれぞれ米国アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クションに＾ＴＣＣ３９２８２，３９２８３および３９
２８４として寄託されている。

これら菌株によるＬ−ヒスチジン生産試験を次のように
行う。

ＮＢ寒天培地上で３０℃−晩培養させたｐＰＨ８保有株
およびそれらの親株をそれぞれ１白金耳ずつ５ｍｌの生
産培地Ｐ５に植菌する。３０℃で７５時間振盪培養後、
培地中のＬ−ヒスチジン生産惜をボージー法によって比
色定量する。結果を第６表に示す。

以上より、コリネバクテリウム・グルタミクム由来のヒ
スチジン生成に関与する遺伝子がコリネバクテリウム・
グルタミクム以外にコリネバクテリウム・ハーキュリス
、ブレビバクテリウム・フラブム、ブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムの諸菌種において発現し、ヒス
チジンの生産に寄与していることが明らかであった。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＧＨ２の制限酵素地図を示す。 第２図はプラスミドルＣ旧旧の制限酵素地図を示す。 第３図はプラスミドｐＥｔｈｒ　１の造成のフローチャ
ートを示す。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社第　　　６
　　　表 第 図 蕗 目 ＢＩＩＦＴＩＩＩＩ／８Ｎ］Ｉ Ｉシ 属 ■ ｎａｍＩ４Ｘ／ＲｑＩＸ１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
   し、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
   菌種由来でヒスチジン要求性を示す微生物をヒスチジン
   非要求性株に変換する活性を有する遺伝子を含むＤＮＡ
   断片と、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
   ム属菌種中で自律複製可能なベクターＤＮＡとの組換え
   体ＤＮＡを保有する微生物を培地に培養し、培養物中に
   Ｌ−ヒスチジンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−ヒス
   チジンを採取することを特徴とするＬ−ヒスチジンの製
   造法。