JPH041304B2 - - Google Patents
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Description
生物学的な系たとえば動物および人においては
多数の過程がプロテイナーゼ（蛋白質分解酵素）
の活性化により調停されている。これらの過程の
あるものは構成的な過程たとえば血液凝固系であ
り、他方は分解的でたとえば胃腸管における食物
消化酵素である。間接的な証拠は血栓症または伝
染された静脈内の凝固または他の炎症状態におい
て生起するような蛋白質分解酵素の不適当なまた
は制御されていない活性化により組織の損傷およ
び人の疾患が引き起こされることを示唆してい
る。血液および他の体液中の活性なプロテイナー
ゼを同定し且つ定量する能力は、これらの酵素が
血液中で活性化されるか、または細胞により体液
中に遊離された場合に、種々の天然に存在する阻
害剤と複合体を形成するようになるという事実に
より制限されていた。 少なくとも８種の異なつた血液蛋白質が蛋白質
を解裂する酵素の阻害剤として定性されている。
これらの阻害剤はまた種々の体液中にも見い出さ
れている。これらの阻害剤のうちで最も重要であ
るのはアルフア２−プラスミン阻害剤、アルフア
２−マクログロブリン、アルフア１−アンチトリ
プシン、Cl阻害剤およびアンチトロンビン−ヘパ
リン補因子であると考えられる。これらの阻害剤
は広い特異性を有し、そこにおいて蛋白質である
これらの阻害剤はそれぞれ種種の蛋白質分解酵素
と複合体を形成することができる。これらの酵素
阻害剤複合体を測定する能力は酵素の活性化を含
む疾患の診断および治療において助けとなるであ
ろう。酵素阻害剤との複合体中の酵素を同定し且
つ定量するための方法は満足できるほどに開発さ
れてはいなかつた。 他の研究者により利用された方法にはいずれか
一方の成分だけとしかかかわりあつていない酵素
阻害剤複合体中の抗原に指向している抗体の成分
が含まれる。これらの抗体はプロウ氏ら〔「J.
Lab.Clin.Med.」第93巻第199〜209頁（1979年）〕
によりアルフア２−プラスミン阻害剤、プラスミ
ン複合体に対して、そして数人の研究者〔Lau氏
ら、J.Biol.Chem.」第254巻第8751〜8761頁
（1980年）〕によりアンチトロンビン、トロンビン
複合体に対して生成された。前者の方法はラテツ
クス凝集反応法によるプラスミン−抗プラスミン
複合体の検出法を使用し、そして後者はラジオイ
ムノアツセイ（放射線免疫検定法）を使用してい
る。これらの方法は有望であるが、しかしながら
酵素阻害剤複合体中の新規な抗原に指向している
抗体を動物において発現させるのは困難であるこ
とが証明されている。 本明細書中で以下に示されるようにアルフア２
−マクログロブリン（α2Ｍ）、プロテイナーゼ複
合体は本発明の範囲内に含まれる特に有用な複合
体群である。α2Ｍと複合体を形成したプロテイナ
ーゼの大部分はそれらの検出用抗体との反応性を
大部分喪失している。したがつて免疫学的検出系
により結合された酵素の定量を行なうことはでき
ないであろう。 α2Ｍは広いスペクトルのプロテイナーゼ阻害活
性を有する血漿蛋白質である〔Harpel氏ら著
「Progress in Hemostasis and Thrombosis」
T.H.Spaet氏編（Grune ＆ Stratton社発行）
第３巻第145〜189頁（1976年）参照〕。Harpel氏
により、そしてさらにStarkey氏ら
〔「Proteinases in Mammalian Cells and
Tissues」A.J.Barrett氏編（Elsevier社発行）第
663〜696頁（1977年）参照〕によりまとめられて
いるように、α2Ｍは血液、循環している白色血液
細胞、組織、侵入する細菌、植物および蛇毒から
誘導された著しく雑多な一群の蛋白質解裂酵素と
結合することが多数の研究者により示された。
Schultz氏ら〔「Z.Naturforsch」第10b巻第８号
第463〜473頁（1955年）参照〕は人血清からα2Ｍ
を単離し、そしてWallenius氏ら〔「J.Biol.
Chem.」第225巻第253〜267頁（1957年）参照〕
はIgMすなわち沈降定数が19Sである他の血清グ
ロブリンからα2Ｍを区別した。Haverback氏ら
〔「J.Clin.Invest.」第41巻第972〜980頁（1962年）
参照〕は初めてα2Ｍが結合しているトリプシンま
たはキモトリプシンを証明し、そして複合体を形
成した酵素の加水分解活性は低分子量の基質に対
しては保持されているが、大きい基質たとえば蛋
白質に対してはほぼ完全に阻害されることを認め
た〔またHarpel氏ら著「J.Clin.Invest.」第52巻
第2175〜2184頁（1973年）参照〕。その結合され
た酵素の活性な酵素部位を完全に阻害することな
くプロテイナーゼと結合するα2Ｍの能力は、プロ
テイナーゼの活性部位を完全に不活性化する他の
血液プロテイナーゼ阻害剤と比較すれば顕著であ
る。 生物学的液体におけるα2Ｍ−プロテイナーゼ複
合体の同定は、α2Ｍ酵素複合体が遊離の複合体を
形成していないα2Ｍとは異なつた等電点を有する
という観察に基づいてOhlssen氏ら〔「Clin.Chim.
Acta」第66巻第１〜７頁（1976年）参照〕によ
り行なわれた。本発明者を含めて他の研究者はク
ロマトグラフ技術により血液からα2Ｍを単離し、
そして分子量の小さいプロテイナーゼ基質を使用
して推定上のα2Ｍ酵素複合体の活性を測定した。 第１図は液相または固相の抗体が結合したα2Ｍ
−β−トリプシン複合体によるBzPhe−Val−
Arg−NHNpの加水分解に関するラインウイー
バーバーク（Lineweaver−Burk）のプロツトで
ある。α2Ｍ−β−トリプシン複合体の加水分解活
性は実施例に示されたようにして測定される。す
べての測定は２回反復して行なわれ、そして点は
線形回帰分析により適合せしめられている。 第２図は固相のα2Ｍ抗体による血漿中のα2Ｍの
結合形成をグラフにより表示したものである。エ
レクトロイムノアツセイにより測定されるように
1.5mg／mlのα2Ｍを含有する血漿をPBSで希釈す
る。一定痕跡量の125I−α2Ｍを各希釈液（0.1μg）
に加える。インキユベーシヨン系あたり加えられ
た血漿の量は図の１番上に示されている。一部分
（0.2ml）を固相のα2Ｍ抗体（充填ゲル10μ）と
ともに２時間インキユベートし、この操作を２回
反復して行なう。遠心分離によりゲルを分離した
のち上澄み液をエレクトロイムノアツセイにより
α2Ｍの抗原濃度について測定し、そしてビーズに
結合された125I−α2Ｍを測定する。不溶化された
抗体に結合された血漿からの標識付けされていな
いα2Ｍは、最初に抗体ゲルに加えられたα2Ｍの量
からエレクトロイムノアツセイにより測定された
上澄み液中に残存しているα2Ｍを差し引いた値と
して決定される。結合された計数値は最初に不溶
化された抗体に加えられた総計数値のパーセント
として表わされる。 第３図は固相のα2Ｍ抗体による血漿中のα2Ｍの
結合形成に及ぼすインキユベーシヨン時間の影響
をグラフにより表わしたものである。1.5mg／ml
のα2Ｍを含有する血漿を痕跡量の125I−α2Ｍを含
有するPBS（0.1μg／系）で４、20および64％に希
釈する。一部分（0.2ml）を不溶化されたα2Ｍ抗
体（10μの充填ゲル）とともにインキユベート
し、この操作を２回反復して行ない、そして横座
標に示された間隔で遠心分離により反応を停止す
る。1.0mlのPBS中で４回洗浄したのちガンマ計
数器で125Iに対してペレツトを計数し、そして結
合された計数値を最初に不溶性の抗体に加えられ
た総計数値のパーセントとして表示する。それぞ
れのインキユベーシヨン混合物に加えられた血漿
中に含まれるα2Ｍの量が示される。 第４図は固相のα2Ｍ抗体による血漿のα2Ｍ−
131I−トリプシン複合体の結合形成をグラフによ
り表示したものである。種々の濃度の（横座標に
示されたような）131I−トリプシンを125I−α2Ｍお
よび（1/4に希釈された）血漿の混合物に加える。
10分間インキユベートしたのち一部分（0.2ml）
を固相のα2Ｍ抗体（50μの充填ゲル）と２時間
混合する。遠心分離によりペレツトを得、
PBS1.0mlで４回洗浄し、二重チヤンネルガンマ
計数器で125Iおよび131Iに対して計数する。つぎ
に実施例に示されたような基質BzPhe−Val−
Arg−NHNpを使用してアミド分解
（amidolytic）活性に対して上記のゲルを検定す
る。その活性はトリプシンが加えられていない血
漿と関連した本来的活性に対して補正される。そ
れらの点は線形回帰分析により適合せしめられ
る。 第５図は131I−β−トリプシン、125I−α2Ｍおよ
び血漿の混合物のゲル過クロマトグラフイーを
グラフにより表わしたものである。血漿1.0mlに
125I−α2Ｍ（36μg）および131I−β−トリプンシ
（13μg）を加え、そして室温で５分間インキユベ
ートする。0.16Mくえん酸および0.1M NaClを含
有するpH8.0の0.05Mトリス−HCl中で４℃に保
持されたセフアクリル（Sephacryl）Ｓ−200ゲ
ル過用物質（フアルマシア社製品）のカラム
（1.4×70cm）にこの混合物を加える。1.6mlのフ
ラクシヨンで集取し、γ計数器で125Iおよび131I
に対して計数し、そして280nmにおける吸光度を
測定する。 本発明は酵素たとえば蛋白質分解酵素を検出
し、同定し且つ定量するための方法に関する。そ
の方法は概して酵素（Ｅ）、酵素阻害剤（Ｉ）を
含む不溶性の複合体（Ｅ−Ｉ−アンチ−Ｉ）を形
成し、つぎにその複合体に結合された１種または
数種の酵素を検出し、同定し、そして好ましくは
定量することからなる。好ましい態様において
は、マトリツクス（Ｍ）たとえば固体状または半
固体状の表面または浸透性の基質は酵素阻害剤−
抗体または酵素阻害剤−抗体の免疫学的に活性で
ある（阻害剤に結合している）そのような抗体の
フラグメント（アンチＩ）をそこに付着せしめて
いる。つぎにこの不溶性のマトリツクスを生物学
的な液体たとえば体液と接触させてその生物学的
な液体中で１種または数種の予定または予想され
た酵素阻害剤−酵素複合体（Ｉ−Ｅ）と結合させ
る。つぎに結合された酵素を検出し、同定し、そ
して好ましくは定量する。 本発明の目的に対して定義されたような、そし
て本発明において有用である酵素阻害剤（Ｉ）に
は、酵素と複合体を形成して生物学的系における
酵素の本来的機能を本質的に抑制するような物質
が含まれるばかりでなく、また酵素の酵素活性を
制限するが完全には阻害しないような酵素複合体
を形成する阻害剤たとえばα2Ｍも含まれる。たと
えばα2Ｍ、プロテイナーゼ複合体は低分子量の基
質に対しては加水分解活性を保持するが、大きい
基質たとえば蛋白質に対してはほぼ完全に酵素的
反応性を示さない。 結合された酵素を検出し且つ定量するのに適当
な方法は一般的に知られている。一般的に不溶化
されたＥ−Ｉ−抗Ｉ複合体を生物学的液体との接
触物から除去したのち、１種または２種の一般的
方法で結合された酵素を反応させることができ
る。第一の方法は検出を容易にする物質と反応さ
せることからなり、そのような物質は求められて
いる結合された酵素または結合されたＥ−Ｉ複合
体に特異的な部位と反応し、そしてそれは分析技
術により測定しうる検出可能な基または原子たと
えば放射性標識原子、赤外線または紫外線を吸収
する基を有するか、可視的な色の変化を引き起こ
すか、または検出可能な解裂生成物、脱離性化合
物またはイオンを生成し、つぎにそれを分析技術
により測定することができる。この種の反応は酵
素の酵素作用によるものではなく、酵素はＥ−Ｉ
複合体において生物学的には不活性であつてもよ
い。第二の方法は結合された酵素が選ばれた基質
に対して活性を保持しているような（たとえばα2
Ｍのような）場合に、結合された酵素が酵素的に
反応することからなる。そのような場合には不溶
化されたＥ−Ｉ−抗Ｉ複合体を結合された酵素と
反応しうる基質と接触させる。その基質は反応せ
しめられた場合に色の変化または容易に測定しう
る系すなわち分析的に検出可能である特殊な解裂
生成物の生成により分析的な測定を可能にする。 抗Ｉの製造におけるいくつかの場合において、
たとえば家兎の抗人α2Ｍ抗血清のIgGフラクシヨ
ンが酵素を検出する基質に対して活性を示すよう
な実施例の場合には、実施例におけるように抗Ｉ
と反応させるか、たとえばクロマトグラフイーの
ような技術を使用することにより抗Ｉをさらに精
製してその後の分析を妨害しないようにする必要
がある。また少なくともいくつかの場合にはこの
偽性の活性を測定し、そして分析的な測定におい
て補正することができる。 さらに多数の阻害剤は１種以上の特定の酵素と
結合できることが認められている。不動化された
Ｅ−Ｉ−抗Ｉ複合体は安定であるので、不溶化さ
れたＥ−Ｉ−抗Ｉ複合体中のそれぞれの結合され
た酵素を区別できるような数種の技術を順次に使
用することができる。このことは特に検出機構が
結合性または封鎖性の反応部位よりもむしろ測定
可能な脱離生成物を生成する場合に当てはまる。
またこのことは特に上記の第二の検出反応に適用
することができる。なぜならば選ばれた基質が酵
素的に活性なＥ−Ｉ−抗Ｉ複合体中に潜存的に存
在する酵素のただ１個のか、または数個の特定の
基に対して反応性を有するような基質であるから
である。 本発明の方法に関しては、分析結果の定量は一
般的に当業者の技術範囲内である。少なくとも１
種のそのような方法はＥ−Ｉ−抗Ｉ複合体に結合
されたＩを定量することからなるので、最終的な
定量は結合された阻害剤（Ｉ）の関数として表わ
すことができる。これは少量の標識付けされた阻
害剤を生物学的液体に加えることにより行なわれ
る。つぎにＥ−Ｉ−抗Ｉ複合体中の標識の量が測
定される。これは本来の阻害剤の結合に比例して
いる。 好ましくは不溶化された阻害剤、酵素複合体に
おいて複合体を形成した酵素の同定および定量
は、２つの方法の一方により行なわれる。複合体
がたとえばα2Ｍのように酵素的に活性である場合
には、基質との反応が使用される。酵素的に活性
でない酵素複合体に対しては興味を持たれている
特定の酵素に対して抗体が製造される。従つてた
とえば抗体は家兎または山羊において人の血液プ
ロテイナーゼ、プラスミン、トロンビン、カリク
レイン、Cl（補体の第一成分）、第Xa因子、ハゲ
マン（Hageman）因子に対してか、または人の
膵臓の酵素であるトリプシン、エラスターゼまた
はキモトリプシンに対してか、人の多形核白血球
（白色血液細胞）の中性プロテイナーゼたとえば
エラスターゼ、コラゲナーゼおよびカテプシンＧ
に対してか、または損傷を受けた組織から遊離さ
れたプロテイナーゼたとえばカテプシンＢに対し
て製造することができる。そのような抗体は多く
の実験室で製造されている。 つぎに所望によりたとえばアフイニテイクロマ
トグラフイーにより単離された抗血清または特定
の抗体分子の免疫グロブリン分画は、Engvall氏
ら〔「Immunochemistry」第８巻第871頁（1971
年）参照〕により詳述された方法によりアルカリ
性ホスフアターゼまたは他の検出作用酵素を用い
てか、または別法としては放射性標識物質たとえ
ばNaI125を使用することにより標識付けされる。 つぎに免疫を獲得した不溶性の酵素、阻害剤複
合体をたとえば上記と同様にして特定の抗酵素抗
体とともにインキユベートし、そして適当な時間
ののちに結合されていない抗体を洗浄除去する。
抗酵素抗体は不溶化された阻害剤複合体中で酵素
に結合されたままである。つぎにたとえば検出作
用性抗酵素抗体に結合されているアルカリ性ホス
フアターゼの活性または放射能を測定することに
より抗酵素抗体を測定する。結合された酵素の量
はたとえば精製された阻害剤、酵素複合体から得
られた標定曲線を使用して定量される。検出作用
抗体の使用はそれ自体の既知の技術であり、それ
は本発明の免疫獲得技術の情況において充分に役
立つ。 測定される生物学的液体は影響を及ぼすものが
存在するために測定することが求められている状
態ののちに、酵素平衡または含有量が変化する可
能性のある動的な系であることが指摘される。た
とえば人の血液試科中の酵素に関して研究が行な
われる場合、凝血が血液の酵素またはＥ−Ｉ複合
体の含有量を大きく変えることが認められてい
る。従つてその場合には凝血を阻止するように注
意しなければならない。同様に反応成分および装
置である物質を適当に選ぶことにより、すべての
酵素またはＥ−Ｉ複合体変更因子を可能な程度に
避けるべきである。あるいは可能な場合には処理
および操作過程の間に引き起こされる外的な酵素
の変化を説明し、そして分析結果を適当に考慮す
るかまたは補正することができる。 本発明の不溶化されたかまたは不溶性の複合体
は（Ｅ−Ｉ−抗Ｉ）すなわち酵素、酵素阻害剤お
よび阻害剤の抗体またはその活性フラグメントを
含む。好ましい態様においてはその複合体は固体
状または半固体状のマトリツクスに付着せしめら
れる。唯一の本質的な要求は最終的に得られたＥ
−Ｉ−抗Ｉ複合体が不溶化されていることであ
る。このことはＥまたはＥ−Ｉ複合体を最終的に
抗Ｉと結合させてたとえば沈澱を生成することに
よつてのみ初めて得られる。しかし不溶化された
マトリツクス−抗Ｉ結合体を前もつて生成し、つ
ぎにＥ−Ｉ複合体を含有する生物学的液体と接触
させるのが好ましい。もう一つの可能な方法はＥ
−Ｉ複合体を含有する生物学的液体に抗Ｉを加
え、つぎにたとえばマトリツクスに付着させるこ
とにより、前もつて生成された可動性のＥ−Ｉ−
抗Ｉ結合体を不溶化することである。 マトリツクスの正確な性質は抗Ｉの部分がある
手段によりたとえば化学的なたとえば共有結合に
よるか、または吸収によるか、吸着によるか、ま
たは同様の手段により、抗ＩがＥ−Ｉ複合体との
反応性を残しているような方法でそれに付着する
ことができるような方法で、抗Ｉがマトリツクス
に付着することができるという以上には臨界的で
はない。マトリツクスは固体状であるかまたは浸
透性であつてもよく、そして微粒子の形態であつ
てもよく、またたとえば少なくとも容器の構造の
一部分を構成するかまたは除去できるように容器
と組み合わされた単位であつてもよい。 測定される生物学的液体は実質的には酵素また
はＥ−Ｉ複合体を含有する任意の人または動物の
液体、微生物学的液体または植物の液体であるこ
とができる。体液たとえば血液、尿または胸膜、
関節および腹膜の液体はこの技術により分析する
ことができる。 実施例 この実施例では精製されたα2Ｍならびにα2Ｍ−
トリプシン複合体が、ゲルマトリツクス上で不溶
化された家兎の抗人α2Ｍ抗体に定量的に結合され
うることが証明される。さらにこの実施例ではそ
の抗体が結合しているα2Ｍ−トリプシン複合体は
アミド分解活性を有し、その活性は微粒子性ゲル
に付着したままで容易に検定できることが証明さ
れる。これらの不溶化されたα2Ｍ−トリプシン複
合体の酵素活性は液相のα2Ｍ酵素複合体のそれと
同一である。精製された系を使用するこれらの技
術は放射性物質で標識付けされたトリプシンおよ
び痕跡量の放射性物質で標識付けされたα2Ｍを加
えた人の血漿に拡張される。本発明の不溶性抗体
の技術を使用するとα2Ｍ−トリプシン複合体は血
漿から定量的に回収され、それは結合された放射
能および抗体に結合された複合体が合成トリペプ
チドである色素生成基質を加水分解する能力の両
方により測定される。 α2−マクログロブリンの精製 以前に記載されたようにして〔Harpel氏著
「Methods Enzymol」第45巻第639〜652頁
（1976年）参照〕大豆のトリプシン阻害剤の存在
下で新鮮な人の血漿からα2−マクログロブリンを
単離する。McFarlane氏の方法〔「Biochem.J.
（London）」第62巻第135〜143頁（1956年）参照〕
によりα2Ｍを125Iで標識付けする。担体を含まな
い沃化（125I）ナトリウム0.5mciを、塩化ナトリ
ウム（0.16M）を含有するPH8.0の硼酸緩衝液
（0.2M）1.0ml中のα2M1.7mgに加える。一塩化沃
素（0.05ml、0.007マイクロモルの一塩化沃素を
含有する）を混合しながら加える。室温で10分間
インキユベートしたのち結合していない沃化物を
セフアデツクスＧ−25（フアルマシア社製）のゲ
ル過クロマトグラフイーにより除去する。放射
性物質で標識付けされたα2Ｍの比活性は0.2μCi／
ｇである。 β−トリプシンの精製 β−トリプシンはYungおよびTrowbridge両
氏〔「Biochem.Biophys.Res.Commun.」第65巻
第927〜930頁（1975年）〕により記載されたよう
にして、結晶化し、透析により塩不含にして凍結
乾燥した牛型のトリプシン（Worthington）から
製造される。最終生成物の比活性は活性部位をｐ
−ニトロフエニル−p′−グアニジノベンゾエート
塩酸塩で滴定することにより決定した場合94％で
ある〔Chase氏ら「Methods Enzymol.」第19巻
第20〜27頁（1970年）参照〕。還元したのちこの
調製物はドデシルスルフエートゲル（９％アクリ
ルアミド）電気泳動〔Weber氏ら「Methods
Enzymol.」第26巻第３〜27頁（1972年）参照〕
により示されるようにただ１個の蛋白質吸着帯か
らなる。このことはα−およびβ−トリプシンお
よび不活性物質からなる最初の混合物からβ型の
結合鎖だけが単離されたことを示している。この
トリプシンを塩化カルシウム（10mM）および塩
化ナトリウム（0.1M）を含有する塩酸（1mM）
中−70℃で保存する。上記のMcFarlane氏の方
法によりβ−トリプシンを131Iで標識付けする。
β−トリプシンをベンズアミジン（0.01M、アル
ドリツチ・ケミカル社製品）および塩化ナトリウ
ム（0.16M）を含有するPH8.0の硼酸緩衝液
（0.2M）に対して透析する。0.5mCiの担体不含
131I−沃化ナトリウムを総容量1.0mlの硼酸−ベン
ズアミジン緩衝液中1.5mgのβ−トリプシンに加
える。一塩化沃素（0.05ml、0.1マイクロモルの
IClを含有する）を混合しながら加える。室温で
10分間インキユベートしたのち遊離の沃化物およ
びベンズアミジンをゲル過クロマトグラフイー
により除去する。この標識付けされた調製物を塩
化ナトリウム（0.1M）を含有する塩酸（1mM）
に対して透析し、その後−70℃で貯蔵する。この
放射性物質で標識付けしたβ−トリプシンの比活
性は0.2μCi／μgである。 家兎の抗人α2Ｍ抗血清の製造 ニユージーランド系白色家兎がフロインド補助
液と混合したα2Ｍを皮内注射することにより免疫
化される。抗血清は人血漿に対する二重拡散分析
において１個の免疫沈澱線を生じ、そして出発抗
原と同一の反応を示す。抗血清のIgGフラクシヨ
ンはDEAE−セルロースのクロマトグラフイーに
より製造される。このIgGフラクシヨンはＮ−ベ
ンゾイル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−バリル−
Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩
（BzPhe−Val−Arg−NHNp、Ｓ−2160）を加
水分解することが見い出されているが、そのIgG
物質を４℃で３日間α−Ｎ−ｐ−トシル−Ｌ−リ
ジンクロロメチルケトン塩酸塩（TLCK）
（0.01M）で処理し、ついで完全に透析すること
によりその活性は阻害される。TLCKで処理され
たIgGはMarch氏ら〔「Anal.Biochem.」第60巻
第149〜152頁（1974年）〕により詳述されている
ような臭化シアン法によりバイオ−ゲル（Bio−
Gel）Ａ−5m（バイオ−ラツド・ラボラトリーズ
製品）にカツプリングせしめられる。その活性化
されたゲルへのカツプリングは活性化されたゲル
１mlあたりIgG6.0mgを使用してPH6.5のくえん酸
緩衝液（0.2M）中で行なわれる。カツプリング
の効率は90％以上である。カツプリング操作のの
ちそのゲルをPH8.0の1.0Mエタノールアミン中で
１時間インキユベートして残存しているすべての
蛋白質結合性の基を中和する。正常な家兎血清の
IgGフラクシヨンおよび人のアルブミンまたは人
のハプトグロビンに指向している家兎の抗血清も
また上記に詳述されたようにして製造され、そし
てバイオ−ゲルＡ−5mにカツプリングせしめら
れる。 不溶化された家兎の抗人α2Ｍ抗体とのα2Ｍの結合
に関する研究 結合されたα2Ｍ抗体を含有するゲルを塩化ナト
リウム（0.1M）を含有するpH7.2の燐酸緩衝液
（0.05M）（PBS）で２倍（ｖ／ｖ）に希釈する。
このカツプリングされた抗体を125I−α2Ｍ、125I−
α2Ｍ−β−トリプシン複合体とともにか、または
痕跡量の125I−α2Ｍを含有する血漿および添付図
面の凡例に示されたような種々の濃度の131I−β
−トリプシンとともにインキユベートする。すべ
てのインキユベーシヨンは1.0mlまたはそれ以下
の容量でラブクエークミキサー（Labquake
mixer、ラブ・インダストリーズ製品）を使用し
て端と端を反転することにより一定速度で混合し
ながら室温で行なわれる。遠心分離によりインキ
ユベーシヨンを終結させ、ペレツト状の不溶性α2
Ｍ抗体ゲルをPBS1.0mlずつでくり返し洗浄する。
サール（Searle）1185二重チヤンネルγ計数器を
用いて125Iまたは131Iの放射能に関してそれらの
ペレツトを計数する。 液相中でかまたは不溶化されたα2Ｍ抗体に結合さ
れたα2Ｍ−β−トリプシン複合体のアミド分解活
性の検定 可溶性トリプシンまたはα2Ｍ−トリプシン複合
体を前記に詳述されたのと同様の方法
〔Svendsen氏ら「Thromb.Res.」第１巻第267〜
278頁（1972年）参照〕により検定する。基質で
あるＮ−ベンゾイル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ
−バリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド
塩酸塩（BzPhe−Val−Arg−NHNp＝Ｓ−
2160、オルト・ダイアグノステイツクス社または
ベガ・バイオケミカルズ社から得られる）を蒸留
水に溶解する（0.7mg／ml）。β−トリプシンまた
はα2Ｍ−トリプシン複合体を塩化カルシウム
（1.25mM）を含有するPH8.3のトリス−HCl
（0.1M）で容量0.4mlとなす。基質（0.2ml）を加
え、そしてその混合物を室温でインキユベートす
る。30％酢酸（0.2ml）の添加により種々の間隔
で反応を終わらせ、つぎにトリス−塩化カルシウ
ム緩衝液0.6mlを加えて最終容量1.4mlとなす。ギ
ルフオード（Gilford）240型分光光度計を用いて
405nmにおける吸光度を測定する。10500の分子
吸光度を使用して遊離したｐ−ニトロアニリドの
濃度を測定する〔Aurell氏ら「Thromb.Res.」第
11巻第595〜609頁（1977年）参照〕。 ゲルカツプリングした家兎の抗人α2−トリプシ
ン複合体（それはゲルカツプリングした家兎の抗
人α2MIgGに結合している）に結合されたα2Ｍ−
トリプシン複合体のアミド分解活性を測定するた
めに、トリス−塩化カルシウム緩衝液（0.4ml）
およびBzPhe−Val−Arg−NHNp（0.2ml）を、
α2Ｍ−トリプシン複合体とともにインキユベート
され不動化された抗体ゲルに加える。室温で種々
の時間インキユベートしたのち抗体を含有するゲ
ルを遠心分離により除去する。上澄み液に30％酢
酸（0.2ml）を加え、つぎにトリス−塩化カルシ
ウム緩衝液0.6mlを加える。405nmにおける吸光
度を測定し、そして遊離したｐ−ニトロアニリド
のマイクロモル数／／分としてか、または結合
されたα2Ｍの量が測定される場合にはマイクロモ
ル／／分／mgα2Ｍとして結果を表わす〔その後
基質（ブランク）に対して補正する〕。 ミカエリス−メントン（Michaelis−Menton）
定数を誘導するために、β−トリプシン
（0.25μg／ml）、α2Ｍ（50μg／ml）および痕跡量の
125I−α2ＭをPBS中０℃でインキユベートする。
高分子量の微粒子性基質であるレマゾルブリリア
ント・ブルー・ハイド（Remazolbrilliant blue
hide）〔Hayes氏ら著「The Physiological
Inhibitors of Blood Coagulation and
Fibrinolysis」Collen氏ら著（エルスビア社発行）
第273〜280頁（1979年）参照〕を使用してこのイ
ンキユベーシヨン混合物を遊離のβ−トリプシン
について測定すると陰性であることが示され、こ
のことはすべてのβ−トリプシンがα2Ｍにより結
合されたことを示している。つぎにα2Ｍ−β−ト
リプシンのインキユベーシヨン混合物の一部分
（0.2ml）をバイオーゲルＡ−5m（10μの充填ゲ
ル）にカツプリングした家兎の抗α2Ｍ−IgGとと
もにインキユベートし、この操作を２回反復して
行なう。２回の反復操作で得られたゲルインキユ
ベーシヨン混合物をそれぞれPBS1.0mlで４回洗
浄し、ゲルに結合されたα2Ｍの尺度である125Iを
測定する。つぎに不溶化されたα2Ｍ−β−トリプ
シン複合体を、種々の濃度のBzPhe−Val−Arg
−NHNpを加水分解する能力について２回反復
して測定する。不溶化されたα2Ｍ−酵素複合体に
関して連続的な動力学的測定を行なうことができ
なかつたという事実により、各基質濃度において
不連続的な５、10および15分間隔で２回の反復測
定を終え、そして遊離したｐ−ニトロアニリドの
濃度を決定する。 上記の抗体ゲルに結合されたのと等量の放射能
を含有する最初の可溶性α2Ｍ−β−トリプシンの
一部を種々の基質濃度で２回反復して測定する。
この場合ｐ−ニトロアニリドの生成はハネーウエ
ル（Honeywell）1800記録計を装備したギルフ
オード（Gilford）240記録分光光度計により
405nmにおいて連続的に追跡される。可溶性およ
び不動化α2Ｍ−β−トリプシン複合体に対する
KmおよびVmaxは初期の反応速度および基質濃
度のラインウイーバー−バークの線変換から得ら
れる。血漿中のかまたは不動化されたα2Ｍ抗体と
ともにインキユベートしたのちの血漿上澄み液中
の自然のα2Ｍの濃度は、エレクトロイムノアツセ
イすなわちLaurell氏〔「Scand.J.Clin.Lab.
Invest.」第29巻（補遺124）第21〜37頁（1972
年）〕により記載されたロケツト法により測定さ
れる。 液相中のかまたは不動化された家兎の抗人α2Ｍ抗
体に結合されたα2Ｍ−トリプシン複合体のアミド
分解活性 α2Ｍ−トリプシン複合体の加水分解活性は色素
生成基質であるBzPhe−Val−Arg−NHNpを使
用して検定される。β−トリプシンを標識付けさ
れていないα2Ｍおよび125Iで標識付けされたα2Ｍ
の混合物とともにトリプシン：α2Ｍのモル比0.6、
0.3および0.15でインキユベートするが、α2M1モ
ルあたりβ−トリプシン２モル以下でα2Ｍは充分
に結合能力を有することが以前の研究において立
証されている。これらの混合物のアミド分解活性
は時間に関して直線的であり、そしてその系のβ
−トリプシン濃度に比例することが見い出され
た。またそのβ−トリプシン−α2Ｍ混合物はバイ
オ−ゲルＡ−5mにカツプリングした家兎の抗人
α2Ｍ抗血清のIgGフラクシヨンとともにインキユ
ベートされる。ゲルのペレツトを充分に洗浄した
のちγ計数器で125Iに対して計数すると、最初の
インキユベーシヨン混合物に含まれる125I−α2Ｍ
の放射能の88％が結合されたことがわかる。この
ことはインキユベーシヨン混合物中の大部分の
125I−α2Ｍが不動化された抗体に結合されている
ことを示している。α2Ｍ−トリプシン混合物が存
在しない場合のその固相抗体はBzPhe−Val−
Arg−NHNpを加水分解しないが、トリプシン
−α2Ｍ複合体とともにインキユベートされた固相
のα2Ｍ抗体はアミド分解活性を獲得し、それは最
初の液相インキユベーシヨン混合物中に含まれる
トリプシンの量に比例する。α2Ｍの不在下に固相
の抗体をβ−トリプシンとともにインキユベート
してもアミド分解活性はそのゲルに与えられない
し、また正常な家兎血清から誘導された不動化さ
れたIgGフラクシヨンもα2Ｍまたはα2Ｍ−トリプ
シン複合体と結合しない。従つて不動化された抗
人α2Ｍ抗体を上記のα2Ｍ−トリプシン混合物とと
もにインキユベートした場合に得られた活性はそ
のα2Ｍ−トリプシン複合体の特異的な結合を反映
している。 液相中でのα2Ｍ−トリプシン複合体による基質
の加水分解に関する速度論的分析を固相複合体と
比較しても有意の差は示されない（第１図）。ラ
インウイーバー−バークプロツトにより決定され
た液相複合体のミカエリス−メントン定数はKm＝
0.079mMおよびVmax1707m-1であり、そして固
相α2Ｍ−トリプシン複合体のそれはKm＝
0.078mMおよびVmax＝1700min-1である。この
ことはこれらの検定について詳述された実験条件
下では、α2Ｍ−トリプシン複合体の表面との結合
形成はそのアミド分解活性に影響を及ぼさないこ
とを示している。 固相抗体が結合しているα2Ｍ−トリプシン複合体
のアミド分解活性に及ぼすPHおよびイオン強度の
影響 可溶性のα2Ｍ−トリプシン複合体および固相の
抗体が結合しているα2Ｍ−トリプシン複合体は両
方ともPH8.0および9.0の間で同様のアミド分解活
性のピークを示す。より高いPHにおいては基質の
加水分解は有意に低下する。他の実験においては
塩化ナトリウム濃度の変化（０〜0.5M）が不動
化されたα2Ｍ−トリプシン複合体の触媒活性に及
ぼす影響について研究されている。0.05Mから
0.3Mの塩化ナトリウム濃度において幅広い不変
のピークが認められたが、同時に0Mおよび0.5M
の塩化ナトリウムの両方においてアミド分解活性
の低下が認められた。可溶性および不動化された
α2Ｍ−トリプシン複合体は両方とも同様の挙動を
示す。 固相抗体が結合しているα2Ｍ−トリプシン複合体
のアミド分解活性に及ぼす反復検定の影響 不動化された抗体が結合しているα2Ｍ−トリプ
シン複合体の安定性を評価するために、不動化さ
れたα2Ｍ抗体の４個の部分を、痕跡量125I−α2Ｍ
を含有するα2Ｍ−トリプシン混合物とともにイン
キユベートする。くり返し洗浄したのち結合され
たα2Ｍの量を測定するためにそのゲルを計数す
る。つぎに不溶化された抗体のα2Ｍ−トリプシン
複合体をBzPhe−Val−Arg−NHNpの加水分解
活性について検定する。この操作を４回くり返
す。表Ｉに示されるように不動化された抗体が結
合しているα2Ｍ−トリプシン複合体の比活性は反
復検定により変化しない。このことはトリプシン
それ自体が色素生成基質の存在下において複合体
から解離しないことを示している。反復検定にお
いてα2Ｍおよびアミド分解活性のわずかな程度の
喪失が認められるが、それは洗浄中かまたはα2Ｍ
−トリプシン複合体を溶出する間にゲルの損失が
生じたものと考えられる。
多数の過程がプロテイナーゼ（蛋白質分解酵素）
の活性化により調停されている。これらの過程の
あるものは構成的な過程たとえば血液凝固系であ
り、他方は分解的でたとえば胃腸管における食物
消化酵素である。間接的な証拠は血栓症または伝
染された静脈内の凝固または他の炎症状態におい
て生起するような蛋白質分解酵素の不適当なまた
は制御されていない活性化により組織の損傷およ
び人の疾患が引き起こされることを示唆してい
る。血液および他の体液中の活性なプロテイナー
ゼを同定し且つ定量する能力は、これらの酵素が
血液中で活性化されるか、または細胞により体液
中に遊離された場合に、種々の天然に存在する阻
害剤と複合体を形成するようになるという事実に
より制限されていた。 少なくとも８種の異なつた血液蛋白質が蛋白質
を解裂する酵素の阻害剤として定性されている。
これらの阻害剤はまた種々の体液中にも見い出さ
れている。これらの阻害剤のうちで最も重要であ
るのはアルフア２−プラスミン阻害剤、アルフア
２−マクログロブリン、アルフア１−アンチトリ
プシン、Cl阻害剤およびアンチトロンビン−ヘパ
リン補因子であると考えられる。これらの阻害剤
は広い特異性を有し、そこにおいて蛋白質である
これらの阻害剤はそれぞれ種種の蛋白質分解酵素
と複合体を形成することができる。これらの酵素
阻害剤複合体を測定する能力は酵素の活性化を含
む疾患の診断および治療において助けとなるであ
ろう。酵素阻害剤との複合体中の酵素を同定し且
つ定量するための方法は満足できるほどに開発さ
れてはいなかつた。 他の研究者により利用された方法にはいずれか
一方の成分だけとしかかかわりあつていない酵素
阻害剤複合体中の抗原に指向している抗体の成分
が含まれる。これらの抗体はプロウ氏ら〔「J.
Lab.Clin.Med.」第93巻第199〜209頁（1979年）〕
によりアルフア２−プラスミン阻害剤、プラスミ
ン複合体に対して、そして数人の研究者〔Lau氏
ら、J.Biol.Chem.」第254巻第8751〜8761頁
（1980年）〕によりアンチトロンビン、トロンビン
複合体に対して生成された。前者の方法はラテツ
クス凝集反応法によるプラスミン−抗プラスミン
複合体の検出法を使用し、そして後者はラジオイ
ムノアツセイ（放射線免疫検定法）を使用してい
る。これらの方法は有望であるが、しかしながら
酵素阻害剤複合体中の新規な抗原に指向している
抗体を動物において発現させるのは困難であるこ
とが証明されている。 本明細書中で以下に示されるようにアルフア２
−マクログロブリン（α2Ｍ）、プロテイナーゼ複
合体は本発明の範囲内に含まれる特に有用な複合
体群である。α2Ｍと複合体を形成したプロテイナ
ーゼの大部分はそれらの検出用抗体との反応性を
大部分喪失している。したがつて免疫学的検出系
により結合された酵素の定量を行なうことはでき
ないであろう。 α2Ｍは広いスペクトルのプロテイナーゼ阻害活
性を有する血漿蛋白質である〔Harpel氏ら著
「Progress in Hemostasis and Thrombosis」
T.H.Spaet氏編（Grune ＆ Stratton社発行）
第３巻第145〜189頁（1976年）参照〕。Harpel氏
により、そしてさらにStarkey氏ら
〔「Proteinases in Mammalian Cells and
Tissues」A.J.Barrett氏編（Elsevier社発行）第
663〜696頁（1977年）参照〕によりまとめられて
いるように、α2Ｍは血液、循環している白色血液
細胞、組織、侵入する細菌、植物および蛇毒から
誘導された著しく雑多な一群の蛋白質解裂酵素と
結合することが多数の研究者により示された。
Schultz氏ら〔「Z.Naturforsch」第10b巻第８号
第463〜473頁（1955年）参照〕は人血清からα2Ｍ
を単離し、そしてWallenius氏ら〔「J.Biol.
Chem.」第225巻第253〜267頁（1957年）参照〕
はIgMすなわち沈降定数が19Sである他の血清グ
ロブリンからα2Ｍを区別した。Haverback氏ら
〔「J.Clin.Invest.」第41巻第972〜980頁（1962年）
参照〕は初めてα2Ｍが結合しているトリプシンま
たはキモトリプシンを証明し、そして複合体を形
成した酵素の加水分解活性は低分子量の基質に対
しては保持されているが、大きい基質たとえば蛋
白質に対してはほぼ完全に阻害されることを認め
た〔またHarpel氏ら著「J.Clin.Invest.」第52巻
第2175〜2184頁（1973年）参照〕。その結合され
た酵素の活性な酵素部位を完全に阻害することな
くプロテイナーゼと結合するα2Ｍの能力は、プロ
テイナーゼの活性部位を完全に不活性化する他の
血液プロテイナーゼ阻害剤と比較すれば顕著であ
る。 生物学的液体におけるα2Ｍ−プロテイナーゼ複
合体の同定は、α2Ｍ酵素複合体が遊離の複合体を
形成していないα2Ｍとは異なつた等電点を有する
という観察に基づいてOhlssen氏ら〔「Clin.Chim.
Acta」第66巻第１〜７頁（1976年）参照〕によ
り行なわれた。本発明者を含めて他の研究者はク
ロマトグラフ技術により血液からα2Ｍを単離し、
そして分子量の小さいプロテイナーゼ基質を使用
して推定上のα2Ｍ酵素複合体の活性を測定した。 第１図は液相または固相の抗体が結合したα2Ｍ
−β−トリプシン複合体によるBzPhe−Val−
Arg−NHNpの加水分解に関するラインウイー
バーバーク（Lineweaver−Burk）のプロツトで
ある。α2Ｍ−β−トリプシン複合体の加水分解活
性は実施例に示されたようにして測定される。す
べての測定は２回反復して行なわれ、そして点は
線形回帰分析により適合せしめられている。 第２図は固相のα2Ｍ抗体による血漿中のα2Ｍの
結合形成をグラフにより表示したものである。エ
レクトロイムノアツセイにより測定されるように
1.5mg／mlのα2Ｍを含有する血漿をPBSで希釈す
る。一定痕跡量の125I−α2Ｍを各希釈液（0.1μg）
に加える。インキユベーシヨン系あたり加えられ
た血漿の量は図の１番上に示されている。一部分
（0.2ml）を固相のα2Ｍ抗体（充填ゲル10μ）と
ともに２時間インキユベートし、この操作を２回
反復して行なう。遠心分離によりゲルを分離した
のち上澄み液をエレクトロイムノアツセイにより
α2Ｍの抗原濃度について測定し、そしてビーズに
結合された125I−α2Ｍを測定する。不溶化された
抗体に結合された血漿からの標識付けされていな
いα2Ｍは、最初に抗体ゲルに加えられたα2Ｍの量
からエレクトロイムノアツセイにより測定された
上澄み液中に残存しているα2Ｍを差し引いた値と
して決定される。結合された計数値は最初に不溶
化された抗体に加えられた総計数値のパーセント
として表わされる。 第３図は固相のα2Ｍ抗体による血漿中のα2Ｍの
結合形成に及ぼすインキユベーシヨン時間の影響
をグラフにより表わしたものである。1.5mg／ml
のα2Ｍを含有する血漿を痕跡量の125I−α2Ｍを含
有するPBS（0.1μg／系）で４、20および64％に希
釈する。一部分（0.2ml）を不溶化されたα2Ｍ抗
体（10μの充填ゲル）とともにインキユベート
し、この操作を２回反復して行ない、そして横座
標に示された間隔で遠心分離により反応を停止す
る。1.0mlのPBS中で４回洗浄したのちガンマ計
数器で125Iに対してペレツトを計数し、そして結
合された計数値を最初に不溶性の抗体に加えられ
た総計数値のパーセントとして表示する。それぞ
れのインキユベーシヨン混合物に加えられた血漿
中に含まれるα2Ｍの量が示される。 第４図は固相のα2Ｍ抗体による血漿のα2Ｍ−
131I−トリプシン複合体の結合形成をグラフによ
り表示したものである。種々の濃度の（横座標に
示されたような）131I−トリプシンを125I−α2Ｍお
よび（1/4に希釈された）血漿の混合物に加える。
10分間インキユベートしたのち一部分（0.2ml）
を固相のα2Ｍ抗体（50μの充填ゲル）と２時間
混合する。遠心分離によりペレツトを得、
PBS1.0mlで４回洗浄し、二重チヤンネルガンマ
計数器で125Iおよび131Iに対して計数する。つぎ
に実施例に示されたような基質BzPhe−Val−
Arg−NHNpを使用してアミド分解
（amidolytic）活性に対して上記のゲルを検定す
る。その活性はトリプシンが加えられていない血
漿と関連した本来的活性に対して補正される。そ
れらの点は線形回帰分析により適合せしめられ
る。 第５図は131I−β−トリプシン、125I−α2Ｍおよ
び血漿の混合物のゲル過クロマトグラフイーを
グラフにより表わしたものである。血漿1.0mlに
125I−α2Ｍ（36μg）および131I−β−トリプンシ
（13μg）を加え、そして室温で５分間インキユベ
ートする。0.16Mくえん酸および0.1M NaClを含
有するpH8.0の0.05Mトリス−HCl中で４℃に保
持されたセフアクリル（Sephacryl）Ｓ−200ゲ
ル過用物質（フアルマシア社製品）のカラム
（1.4×70cm）にこの混合物を加える。1.6mlのフ
ラクシヨンで集取し、γ計数器で125Iおよび131I
に対して計数し、そして280nmにおける吸光度を
測定する。 本発明は酵素たとえば蛋白質分解酵素を検出
し、同定し且つ定量するための方法に関する。そ
の方法は概して酵素（Ｅ）、酵素阻害剤（Ｉ）を
含む不溶性の複合体（Ｅ−Ｉ−アンチ−Ｉ）を形
成し、つぎにその複合体に結合された１種または
数種の酵素を検出し、同定し、そして好ましくは
定量することからなる。好ましい態様において
は、マトリツクス（Ｍ）たとえば固体状または半
固体状の表面または浸透性の基質は酵素阻害剤−
抗体または酵素阻害剤−抗体の免疫学的に活性で
ある（阻害剤に結合している）そのような抗体の
フラグメント（アンチＩ）をそこに付着せしめて
いる。つぎにこの不溶性のマトリツクスを生物学
的な液体たとえば体液と接触させてその生物学的
な液体中で１種または数種の予定または予想され
た酵素阻害剤−酵素複合体（Ｉ−Ｅ）と結合させ
る。つぎに結合された酵素を検出し、同定し、そ
して好ましくは定量する。 本発明の目的に対して定義されたような、そし
て本発明において有用である酵素阻害剤（Ｉ）に
は、酵素と複合体を形成して生物学的系における
酵素の本来的機能を本質的に抑制するような物質
が含まれるばかりでなく、また酵素の酵素活性を
制限するが完全には阻害しないような酵素複合体
を形成する阻害剤たとえばα2Ｍも含まれる。たと
えばα2Ｍ、プロテイナーゼ複合体は低分子量の基
質に対しては加水分解活性を保持するが、大きい
基質たとえば蛋白質に対してはほぼ完全に酵素的
反応性を示さない。 結合された酵素を検出し且つ定量するのに適当
な方法は一般的に知られている。一般的に不溶化
されたＥ−Ｉ−抗Ｉ複合体を生物学的液体との接
触物から除去したのち、１種または２種の一般的
方法で結合された酵素を反応させることができ
る。第一の方法は検出を容易にする物質と反応さ
せることからなり、そのような物質は求められて
いる結合された酵素または結合されたＥ−Ｉ複合
体に特異的な部位と反応し、そしてそれは分析技
術により測定しうる検出可能な基または原子たと
えば放射性標識原子、赤外線または紫外線を吸収
する基を有するか、可視的な色の変化を引き起こ
すか、または検出可能な解裂生成物、脱離性化合
物またはイオンを生成し、つぎにそれを分析技術
により測定することができる。この種の反応は酵
素の酵素作用によるものではなく、酵素はＥ−Ｉ
複合体において生物学的には不活性であつてもよ
い。第二の方法は結合された酵素が選ばれた基質
に対して活性を保持しているような（たとえばα2
Ｍのような）場合に、結合された酵素が酵素的に
反応することからなる。そのような場合には不溶
化されたＥ−Ｉ−抗Ｉ複合体を結合された酵素と
反応しうる基質と接触させる。その基質は反応せ
しめられた場合に色の変化または容易に測定しう
る系すなわち分析的に検出可能である特殊な解裂
生成物の生成により分析的な測定を可能にする。 抗Ｉの製造におけるいくつかの場合において、
たとえば家兎の抗人α2Ｍ抗血清のIgGフラクシヨ
ンが酵素を検出する基質に対して活性を示すよう
な実施例の場合には、実施例におけるように抗Ｉ
と反応させるか、たとえばクロマトグラフイーの
ような技術を使用することにより抗Ｉをさらに精
製してその後の分析を妨害しないようにする必要
がある。また少なくともいくつかの場合にはこの
偽性の活性を測定し、そして分析的な測定におい
て補正することができる。 さらに多数の阻害剤は１種以上の特定の酵素と
結合できることが認められている。不動化された
Ｅ−Ｉ−抗Ｉ複合体は安定であるので、不溶化さ
れたＥ−Ｉ−抗Ｉ複合体中のそれぞれの結合され
た酵素を区別できるような数種の技術を順次に使
用することができる。このことは特に検出機構が
結合性または封鎖性の反応部位よりもむしろ測定
可能な脱離生成物を生成する場合に当てはまる。
またこのことは特に上記の第二の検出反応に適用
することができる。なぜならば選ばれた基質が酵
素的に活性なＥ−Ｉ−抗Ｉ複合体中に潜存的に存
在する酵素のただ１個のか、または数個の特定の
基に対して反応性を有するような基質であるから
である。 本発明の方法に関しては、分析結果の定量は一
般的に当業者の技術範囲内である。少なくとも１
種のそのような方法はＥ−Ｉ−抗Ｉ複合体に結合
されたＩを定量することからなるので、最終的な
定量は結合された阻害剤（Ｉ）の関数として表わ
すことができる。これは少量の標識付けされた阻
害剤を生物学的液体に加えることにより行なわれ
る。つぎにＥ−Ｉ−抗Ｉ複合体中の標識の量が測
定される。これは本来の阻害剤の結合に比例して
いる。 好ましくは不溶化された阻害剤、酵素複合体に
おいて複合体を形成した酵素の同定および定量
は、２つの方法の一方により行なわれる。複合体
がたとえばα2Ｍのように酵素的に活性である場合
には、基質との反応が使用される。酵素的に活性
でない酵素複合体に対しては興味を持たれている
特定の酵素に対して抗体が製造される。従つてた
とえば抗体は家兎または山羊において人の血液プ
ロテイナーゼ、プラスミン、トロンビン、カリク
レイン、Cl（補体の第一成分）、第Xa因子、ハゲ
マン（Hageman）因子に対してか、または人の
膵臓の酵素であるトリプシン、エラスターゼまた
はキモトリプシンに対してか、人の多形核白血球
（白色血液細胞）の中性プロテイナーゼたとえば
エラスターゼ、コラゲナーゼおよびカテプシンＧ
に対してか、または損傷を受けた組織から遊離さ
れたプロテイナーゼたとえばカテプシンＢに対し
て製造することができる。そのような抗体は多く
の実験室で製造されている。 つぎに所望によりたとえばアフイニテイクロマ
トグラフイーにより単離された抗血清または特定
の抗体分子の免疫グロブリン分画は、Engvall氏
ら〔「Immunochemistry」第８巻第871頁（1971
年）参照〕により詳述された方法によりアルカリ
性ホスフアターゼまたは他の検出作用酵素を用い
てか、または別法としては放射性標識物質たとえ
ばNaI125を使用することにより標識付けされる。 つぎに免疫を獲得した不溶性の酵素、阻害剤複
合体をたとえば上記と同様にして特定の抗酵素抗
体とともにインキユベートし、そして適当な時間
ののちに結合されていない抗体を洗浄除去する。
抗酵素抗体は不溶化された阻害剤複合体中で酵素
に結合されたままである。つぎにたとえば検出作
用性抗酵素抗体に結合されているアルカリ性ホス
フアターゼの活性または放射能を測定することに
より抗酵素抗体を測定する。結合された酵素の量
はたとえば精製された阻害剤、酵素複合体から得
られた標定曲線を使用して定量される。検出作用
抗体の使用はそれ自体の既知の技術であり、それ
は本発明の免疫獲得技術の情況において充分に役
立つ。 測定される生物学的液体は影響を及ぼすものが
存在するために測定することが求められている状
態ののちに、酵素平衡または含有量が変化する可
能性のある動的な系であることが指摘される。た
とえば人の血液試科中の酵素に関して研究が行な
われる場合、凝血が血液の酵素またはＥ−Ｉ複合
体の含有量を大きく変えることが認められてい
る。従つてその場合には凝血を阻止するように注
意しなければならない。同様に反応成分および装
置である物質を適当に選ぶことにより、すべての
酵素またはＥ−Ｉ複合体変更因子を可能な程度に
避けるべきである。あるいは可能な場合には処理
および操作過程の間に引き起こされる外的な酵素
の変化を説明し、そして分析結果を適当に考慮す
るかまたは補正することができる。 本発明の不溶化されたかまたは不溶性の複合体
は（Ｅ−Ｉ−抗Ｉ）すなわち酵素、酵素阻害剤お
よび阻害剤の抗体またはその活性フラグメントを
含む。好ましい態様においてはその複合体は固体
状または半固体状のマトリツクスに付着せしめら
れる。唯一の本質的な要求は最終的に得られたＥ
−Ｉ−抗Ｉ複合体が不溶化されていることであ
る。このことはＥまたはＥ−Ｉ複合体を最終的に
抗Ｉと結合させてたとえば沈澱を生成することに
よつてのみ初めて得られる。しかし不溶化された
マトリツクス−抗Ｉ結合体を前もつて生成し、つ
ぎにＥ−Ｉ複合体を含有する生物学的液体と接触
させるのが好ましい。もう一つの可能な方法はＥ
−Ｉ複合体を含有する生物学的液体に抗Ｉを加
え、つぎにたとえばマトリツクスに付着させるこ
とにより、前もつて生成された可動性のＥ−Ｉ−
抗Ｉ結合体を不溶化することである。 マトリツクスの正確な性質は抗Ｉの部分がある
手段によりたとえば化学的なたとえば共有結合に
よるか、または吸収によるか、吸着によるか、ま
たは同様の手段により、抗ＩがＥ−Ｉ複合体との
反応性を残しているような方法でそれに付着する
ことができるような方法で、抗Ｉがマトリツクス
に付着することができるという以上には臨界的で
はない。マトリツクスは固体状であるかまたは浸
透性であつてもよく、そして微粒子の形態であつ
てもよく、またたとえば少なくとも容器の構造の
一部分を構成するかまたは除去できるように容器
と組み合わされた単位であつてもよい。 測定される生物学的液体は実質的には酵素また
はＥ−Ｉ複合体を含有する任意の人または動物の
液体、微生物学的液体または植物の液体であるこ
とができる。体液たとえば血液、尿または胸膜、
関節および腹膜の液体はこの技術により分析する
ことができる。 実施例 この実施例では精製されたα2Ｍならびにα2Ｍ−
トリプシン複合体が、ゲルマトリツクス上で不溶
化された家兎の抗人α2Ｍ抗体に定量的に結合され
うることが証明される。さらにこの実施例ではそ
の抗体が結合しているα2Ｍ−トリプシン複合体は
アミド分解活性を有し、その活性は微粒子性ゲル
に付着したままで容易に検定できることが証明さ
れる。これらの不溶化されたα2Ｍ−トリプシン複
合体の酵素活性は液相のα2Ｍ酵素複合体のそれと
同一である。精製された系を使用するこれらの技
術は放射性物質で標識付けされたトリプシンおよ
び痕跡量の放射性物質で標識付けされたα2Ｍを加
えた人の血漿に拡張される。本発明の不溶性抗体
の技術を使用するとα2Ｍ−トリプシン複合体は血
漿から定量的に回収され、それは結合された放射
能および抗体に結合された複合体が合成トリペプ
チドである色素生成基質を加水分解する能力の両
方により測定される。 α2−マクログロブリンの精製 以前に記載されたようにして〔Harpel氏著
「Methods Enzymol」第45巻第639〜652頁
（1976年）参照〕大豆のトリプシン阻害剤の存在
下で新鮮な人の血漿からα2−マクログロブリンを
単離する。McFarlane氏の方法〔「Biochem.J.
（London）」第62巻第135〜143頁（1956年）参照〕
によりα2Ｍを125Iで標識付けする。担体を含まな
い沃化（125I）ナトリウム0.5mciを、塩化ナトリ
ウム（0.16M）を含有するPH8.0の硼酸緩衝液
（0.2M）1.0ml中のα2M1.7mgに加える。一塩化沃
素（0.05ml、0.007マイクロモルの一塩化沃素を
含有する）を混合しながら加える。室温で10分間
インキユベートしたのち結合していない沃化物を
セフアデツクスＧ−25（フアルマシア社製）のゲ
ル過クロマトグラフイーにより除去する。放射
性物質で標識付けされたα2Ｍの比活性は0.2μCi／
ｇである。 β−トリプシンの精製 β−トリプシンはYungおよびTrowbridge両
氏〔「Biochem.Biophys.Res.Commun.」第65巻
第927〜930頁（1975年）〕により記載されたよう
にして、結晶化し、透析により塩不含にして凍結
乾燥した牛型のトリプシン（Worthington）から
製造される。最終生成物の比活性は活性部位をｐ
−ニトロフエニル−p′−グアニジノベンゾエート
塩酸塩で滴定することにより決定した場合94％で
ある〔Chase氏ら「Methods Enzymol.」第19巻
第20〜27頁（1970年）参照〕。還元したのちこの
調製物はドデシルスルフエートゲル（９％アクリ
ルアミド）電気泳動〔Weber氏ら「Methods
Enzymol.」第26巻第３〜27頁（1972年）参照〕
により示されるようにただ１個の蛋白質吸着帯か
らなる。このことはα−およびβ−トリプシンお
よび不活性物質からなる最初の混合物からβ型の
結合鎖だけが単離されたことを示している。この
トリプシンを塩化カルシウム（10mM）および塩
化ナトリウム（0.1M）を含有する塩酸（1mM）
中−70℃で保存する。上記のMcFarlane氏の方
法によりβ−トリプシンを131Iで標識付けする。
β−トリプシンをベンズアミジン（0.01M、アル
ドリツチ・ケミカル社製品）および塩化ナトリウ
ム（0.16M）を含有するPH8.0の硼酸緩衝液
（0.2M）に対して透析する。0.5mCiの担体不含
131I−沃化ナトリウムを総容量1.0mlの硼酸−ベン
ズアミジン緩衝液中1.5mgのβ−トリプシンに加
える。一塩化沃素（0.05ml、0.1マイクロモルの
IClを含有する）を混合しながら加える。室温で
10分間インキユベートしたのち遊離の沃化物およ
びベンズアミジンをゲル過クロマトグラフイー
により除去する。この標識付けされた調製物を塩
化ナトリウム（0.1M）を含有する塩酸（1mM）
に対して透析し、その後−70℃で貯蔵する。この
放射性物質で標識付けしたβ−トリプシンの比活
性は0.2μCi／μgである。 家兎の抗人α2Ｍ抗血清の製造 ニユージーランド系白色家兎がフロインド補助
液と混合したα2Ｍを皮内注射することにより免疫
化される。抗血清は人血漿に対する二重拡散分析
において１個の免疫沈澱線を生じ、そして出発抗
原と同一の反応を示す。抗血清のIgGフラクシヨ
ンはDEAE−セルロースのクロマトグラフイーに
より製造される。このIgGフラクシヨンはＮ−ベ
ンゾイル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−バリル−
Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩
（BzPhe−Val−Arg−NHNp、Ｓ−2160）を加
水分解することが見い出されているが、そのIgG
物質を４℃で３日間α−Ｎ−ｐ−トシル−Ｌ−リ
ジンクロロメチルケトン塩酸塩（TLCK）
（0.01M）で処理し、ついで完全に透析すること
によりその活性は阻害される。TLCKで処理され
たIgGはMarch氏ら〔「Anal.Biochem.」第60巻
第149〜152頁（1974年）〕により詳述されている
ような臭化シアン法によりバイオ−ゲル（Bio−
Gel）Ａ−5m（バイオ−ラツド・ラボラトリーズ
製品）にカツプリングせしめられる。その活性化
されたゲルへのカツプリングは活性化されたゲル
１mlあたりIgG6.0mgを使用してPH6.5のくえん酸
緩衝液（0.2M）中で行なわれる。カツプリング
の効率は90％以上である。カツプリング操作のの
ちそのゲルをPH8.0の1.0Mエタノールアミン中で
１時間インキユベートして残存しているすべての
蛋白質結合性の基を中和する。正常な家兎血清の
IgGフラクシヨンおよび人のアルブミンまたは人
のハプトグロビンに指向している家兎の抗血清も
また上記に詳述されたようにして製造され、そし
てバイオ−ゲルＡ−5mにカツプリングせしめら
れる。 不溶化された家兎の抗人α2Ｍ抗体とのα2Ｍの結合
に関する研究 結合されたα2Ｍ抗体を含有するゲルを塩化ナト
リウム（0.1M）を含有するpH7.2の燐酸緩衝液
（0.05M）（PBS）で２倍（ｖ／ｖ）に希釈する。
このカツプリングされた抗体を125I−α2Ｍ、125I−
α2Ｍ−β−トリプシン複合体とともにか、または
痕跡量の125I−α2Ｍを含有する血漿および添付図
面の凡例に示されたような種々の濃度の131I−β
−トリプシンとともにインキユベートする。すべ
てのインキユベーシヨンは1.0mlまたはそれ以下
の容量でラブクエークミキサー（Labquake
mixer、ラブ・インダストリーズ製品）を使用し
て端と端を反転することにより一定速度で混合し
ながら室温で行なわれる。遠心分離によりインキ
ユベーシヨンを終結させ、ペレツト状の不溶性α2
Ｍ抗体ゲルをPBS1.0mlずつでくり返し洗浄する。
サール（Searle）1185二重チヤンネルγ計数器を
用いて125Iまたは131Iの放射能に関してそれらの
ペレツトを計数する。 液相中でかまたは不溶化されたα2Ｍ抗体に結合さ
れたα2Ｍ−β−トリプシン複合体のアミド分解活
性の検定 可溶性トリプシンまたはα2Ｍ−トリプシン複合
体を前記に詳述されたのと同様の方法
〔Svendsen氏ら「Thromb.Res.」第１巻第267〜
278頁（1972年）参照〕により検定する。基質で
あるＮ−ベンゾイル−Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ
−バリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド
塩酸塩（BzPhe−Val−Arg−NHNp＝Ｓ−
2160、オルト・ダイアグノステイツクス社または
ベガ・バイオケミカルズ社から得られる）を蒸留
水に溶解する（0.7mg／ml）。β−トリプシンまた
はα2Ｍ−トリプシン複合体を塩化カルシウム
（1.25mM）を含有するPH8.3のトリス−HCl
（0.1M）で容量0.4mlとなす。基質（0.2ml）を加
え、そしてその混合物を室温でインキユベートす
る。30％酢酸（0.2ml）の添加により種々の間隔
で反応を終わらせ、つぎにトリス−塩化カルシウ
ム緩衝液0.6mlを加えて最終容量1.4mlとなす。ギ
ルフオード（Gilford）240型分光光度計を用いて
405nmにおける吸光度を測定する。10500の分子
吸光度を使用して遊離したｐ−ニトロアニリドの
濃度を測定する〔Aurell氏ら「Thromb.Res.」第
11巻第595〜609頁（1977年）参照〕。 ゲルカツプリングした家兎の抗人α2−トリプシ
ン複合体（それはゲルカツプリングした家兎の抗
人α2MIgGに結合している）に結合されたα2Ｍ−
トリプシン複合体のアミド分解活性を測定するた
めに、トリス−塩化カルシウム緩衝液（0.4ml）
およびBzPhe−Val−Arg−NHNp（0.2ml）を、
α2Ｍ−トリプシン複合体とともにインキユベート
され不動化された抗体ゲルに加える。室温で種々
の時間インキユベートしたのち抗体を含有するゲ
ルを遠心分離により除去する。上澄み液に30％酢
酸（0.2ml）を加え、つぎにトリス−塩化カルシ
ウム緩衝液0.6mlを加える。405nmにおける吸光
度を測定し、そして遊離したｐ−ニトロアニリド
のマイクロモル数／／分としてか、または結合
されたα2Ｍの量が測定される場合にはマイクロモ
ル／／分／mgα2Ｍとして結果を表わす〔その後
基質（ブランク）に対して補正する〕。 ミカエリス−メントン（Michaelis−Menton）
定数を誘導するために、β−トリプシン
（0.25μg／ml）、α2Ｍ（50μg／ml）および痕跡量の
125I−α2ＭをPBS中０℃でインキユベートする。
高分子量の微粒子性基質であるレマゾルブリリア
ント・ブルー・ハイド（Remazolbrilliant blue
hide）〔Hayes氏ら著「The Physiological
Inhibitors of Blood Coagulation and
Fibrinolysis」Collen氏ら著（エルスビア社発行）
第273〜280頁（1979年）参照〕を使用してこのイ
ンキユベーシヨン混合物を遊離のβ−トリプシン
について測定すると陰性であることが示され、こ
のことはすべてのβ−トリプシンがα2Ｍにより結
合されたことを示している。つぎにα2Ｍ−β−ト
リプシンのインキユベーシヨン混合物の一部分
（0.2ml）をバイオーゲルＡ−5m（10μの充填ゲ
ル）にカツプリングした家兎の抗α2Ｍ−IgGとと
もにインキユベートし、この操作を２回反復して
行なう。２回の反復操作で得られたゲルインキユ
ベーシヨン混合物をそれぞれPBS1.0mlで４回洗
浄し、ゲルに結合されたα2Ｍの尺度である125Iを
測定する。つぎに不溶化されたα2Ｍ−β−トリプ
シン複合体を、種々の濃度のBzPhe−Val−Arg
−NHNpを加水分解する能力について２回反復
して測定する。不溶化されたα2Ｍ−酵素複合体に
関して連続的な動力学的測定を行なうことができ
なかつたという事実により、各基質濃度において
不連続的な５、10および15分間隔で２回の反復測
定を終え、そして遊離したｐ−ニトロアニリドの
濃度を決定する。 上記の抗体ゲルに結合されたのと等量の放射能
を含有する最初の可溶性α2Ｍ−β−トリプシンの
一部を種々の基質濃度で２回反復して測定する。
この場合ｐ−ニトロアニリドの生成はハネーウエ
ル（Honeywell）1800記録計を装備したギルフ
オード（Gilford）240記録分光光度計により
405nmにおいて連続的に追跡される。可溶性およ
び不動化α2Ｍ−β−トリプシン複合体に対する
KmおよびVmaxは初期の反応速度および基質濃
度のラインウイーバー−バークの線変換から得ら
れる。血漿中のかまたは不動化されたα2Ｍ抗体と
ともにインキユベートしたのちの血漿上澄み液中
の自然のα2Ｍの濃度は、エレクトロイムノアツセ
イすなわちLaurell氏〔「Scand.J.Clin.Lab.
Invest.」第29巻（補遺124）第21〜37頁（1972
年）〕により記載されたロケツト法により測定さ
れる。 液相中のかまたは不動化された家兎の抗人α2Ｍ抗
体に結合されたα2Ｍ−トリプシン複合体のアミド
分解活性 α2Ｍ−トリプシン複合体の加水分解活性は色素
生成基質であるBzPhe−Val−Arg−NHNpを使
用して検定される。β−トリプシンを標識付けさ
れていないα2Ｍおよび125Iで標識付けされたα2Ｍ
の混合物とともにトリプシン：α2Ｍのモル比0.6、
0.3および0.15でインキユベートするが、α2M1モ
ルあたりβ−トリプシン２モル以下でα2Ｍは充分
に結合能力を有することが以前の研究において立
証されている。これらの混合物のアミド分解活性
は時間に関して直線的であり、そしてその系のβ
−トリプシン濃度に比例することが見い出され
た。またそのβ−トリプシン−α2Ｍ混合物はバイ
オ−ゲルＡ−5mにカツプリングした家兎の抗人
α2Ｍ抗血清のIgGフラクシヨンとともにインキユ
ベートされる。ゲルのペレツトを充分に洗浄した
のちγ計数器で125Iに対して計数すると、最初の
インキユベーシヨン混合物に含まれる125I−α2Ｍ
の放射能の88％が結合されたことがわかる。この
ことはインキユベーシヨン混合物中の大部分の
125I−α2Ｍが不動化された抗体に結合されている
ことを示している。α2Ｍ−トリプシン混合物が存
在しない場合のその固相抗体はBzPhe−Val−
Arg−NHNpを加水分解しないが、トリプシン
−α2Ｍ複合体とともにインキユベートされた固相
のα2Ｍ抗体はアミド分解活性を獲得し、それは最
初の液相インキユベーシヨン混合物中に含まれる
トリプシンの量に比例する。α2Ｍの不在下に固相
の抗体をβ−トリプシンとともにインキユベート
してもアミド分解活性はそのゲルに与えられない
し、また正常な家兎血清から誘導された不動化さ
れたIgGフラクシヨンもα2Ｍまたはα2Ｍ−トリプ
シン複合体と結合しない。従つて不動化された抗
人α2Ｍ抗体を上記のα2Ｍ−トリプシン混合物とと
もにインキユベートした場合に得られた活性はそ
のα2Ｍ−トリプシン複合体の特異的な結合を反映
している。 液相中でのα2Ｍ−トリプシン複合体による基質
の加水分解に関する速度論的分析を固相複合体と
比較しても有意の差は示されない（第１図）。ラ
インウイーバー−バークプロツトにより決定され
た液相複合体のミカエリス−メントン定数はKm＝
0.079mMおよびVmax1707m-1であり、そして固
相α2Ｍ−トリプシン複合体のそれはKm＝
0.078mMおよびVmax＝1700min-1である。この
ことはこれらの検定について詳述された実験条件
下では、α2Ｍ−トリプシン複合体の表面との結合
形成はそのアミド分解活性に影響を及ぼさないこ
とを示している。 固相抗体が結合しているα2Ｍ−トリプシン複合体
のアミド分解活性に及ぼすPHおよびイオン強度の
影響 可溶性のα2Ｍ−トリプシン複合体および固相の
抗体が結合しているα2Ｍ−トリプシン複合体は両
方ともPH8.0および9.0の間で同様のアミド分解活
性のピークを示す。より高いPHにおいては基質の
加水分解は有意に低下する。他の実験においては
塩化ナトリウム濃度の変化（０〜0.5M）が不動
化されたα2Ｍ−トリプシン複合体の触媒活性に及
ぼす影響について研究されている。0.05Mから
0.3Mの塩化ナトリウム濃度において幅広い不変
のピークが認められたが、同時に0Mおよび0.5M
の塩化ナトリウムの両方においてアミド分解活性
の低下が認められた。可溶性および不動化された
α2Ｍ−トリプシン複合体は両方とも同様の挙動を
示す。 固相抗体が結合しているα2Ｍ−トリプシン複合体
のアミド分解活性に及ぼす反復検定の影響 不動化された抗体が結合しているα2Ｍ−トリプ
シン複合体の安定性を評価するために、不動化さ
れたα2Ｍ抗体の４個の部分を、痕跡量125I−α2Ｍ
を含有するα2Ｍ−トリプシン混合物とともにイン
キユベートする。くり返し洗浄したのち結合され
たα2Ｍの量を測定するためにそのゲルを計数す
る。つぎに不溶化された抗体のα2Ｍ−トリプシン
複合体をBzPhe−Val−Arg−NHNpの加水分解
活性について検定する。この操作を４回くり返
す。表Ｉに示されるように不動化された抗体が結
合しているα2Ｍ−トリプシン複合体の比活性は反
復検定により変化しない。このことはトリプシン
それ自体が色素生成基質の存在下において複合体
から解離しないことを示している。反復検定にお
いてα2Ｍおよびアミド分解活性のわずかな程度の
喪失が認められるが、それは洗浄中かまたはα2Ｍ
−トリプシン複合体を溶出する間にゲルの損失が
生じたものと考えられる。
【表】
【表】
人血漿中のα2Ｍの不動化された抗人α2Ｍ抗体と
の結合形成に関する研究 精製されたα2Ｍまたはα2Ｍ−トリプシン複合体
の固相抗人α2Ｍ抗体による結合形成が複雑な生物
学的液体たとえば血漿にまで拡張できるかどうか
を試験するために実験が考案された。第２図に示
されたこの研究においては、125I−α2Ｍを加えた
血漿の連続希釈液とともに固相のα2Ｍ抗体をイン
キユベートする。不溶性の抗体に結合された放射
能を測定する。出発血漿中の自然のα2Ｍおよび吸
収後の血漿上澄み液中に残存しているα2Ｍをエレ
クトロイムノアツセイにより同様に定量する。そ
の結果は血漿に加えられた125I−α2Ｍの不動化さ
れた抗体による結合形成は自然の血漿中に含まれ
るα2Ｍの結合形成と匹敵することを示している。 血漿に加えられた125I−α2Ｍの固相a2Ｍ抗体に
よる結合形成の特異性もまた、変更されていない
バイオーゲルＡ−5m、または正常な家兎血清の
精製されたIgGフラクシヨンまたは人のアルブミ
ンまたはハプトグロビンに指向している家兎の抗
血清のIgGフラクシヨンがカツプリングせしめら
れたこの同一のゲルとともに、125I−α2Ｍを含有
する血漿をインキユベートすることにより試験さ
れる。95％以上の放射能が不溶性のα2Ｍ抗体に結
合するようになる条件下では、２％以下の125I−
α2Ｍ放射能がこれらの他のゲル調製物と関連して
いる。 固相α2Ｍ抗体を含む血漿のインキユベーシヨン
時間がα2Ｍのゲルとの結合に及ぼす影響について
研究が行なわれた（第３図）。それぞれα2Ｍを12、
60および192μg含有する３種の異なつた血漿希釈
液とともに上記の抗体ゲルを種種の時間インキユ
ベートする。α2Ｍのすべての濃度において６時間
のインキユベーシヨン時間の間ずつと結合形成は
漸進的に増大する。α2Ｍの最低濃度（12μg／系）
においては６時間後に91.7％のα2Ｍが結合せしめ
られる。α2Ｍの最大濃度においては49％すなわち
94μgのα2Ｍが結合する。このことは1.0mlのα2Ｍ
抗体ゲルは少なくとも9.4mgのα2Ｍと結合する能
力を有することを示している。 血漿中のα2Ｍ−トリプシン複合体の固相α2Ｍ抗体
による結合形成に関する研究 血漿中のα2Ｍが不動化されたα2Ｍ抗体により定
量的に除去できることが証明されたので、外因性
の131I−β−トリプシンが血漿系のα2Ｍに結合す
ることに関する研究が可能となつた。1.5mg／ml
のα2Ｍを含有する血漿に131I−β−トリプシンを
加えてトリプシン濃度を0.10〜1.65μg／ml血漿と
なす。これはトリプシン／α2Ｍのモル比が0.002
〜0.035であることを表わす。その血漿はまた痕
跡量の125I−α2Ｍを含有している。血漿の一部分
を固相のα2Ｍ抗体とともに２時間インキユベート
する。ペレツトを洗浄し、125Iおよび131Iの両方の
放射能を計数し、そしてアミド分解活性を測定す
る（第４図）。そのインキユベーシヨン混合物中
に含まれる125I−α2Ｍの86.7％が抗体を含むゲル
に結合されるのに対して、131I−β−トリプシン
の50.3％だけが同様に結合されている。このこと
はトリプシンはまた他の血漿蛋白質とも結合する
ことを示唆している。α2Ｍおよびトリプシンの両
方の結合形成パーセントは血漿に加えられたトリ
プシンの種々の濃度により影響されない。固相抗
体ゲルに結合された131Iの放射能は最初の混合物
中に含まれる131I−トリプシンの量に比例してい
る。 内因性のアミド分解活性を制御するために、固
相α2Ｍ抗体は131I−トリプシンを添加していない
血漿−125I−α2Ｍ混合物とともにインキユベート
される。生成したα2Ｍ抗体ゲルはα2M1mgあたり
基質2.4マイクロモル／／分を加水分解し、そ
れは１mlあたり約142ngのβ−トリプシンを血漿
に加えたことに相当する。このバツクグラウンド
の活性は血漿、トリプシン混合物とともにインキ
ユベートされたゲルのアミド分解活性から差し引
かれる。131I−トリプシン、血漿混合物とともに
インキユベートされたα2Ｍ抗体ゲルのアミド分解
活性は加えられたトリプシンの初期濃度に比例し
ており、そしてゲルに結合された131Iの計数値に
匹敵する（第４図）。131 I−β−トリプシン、血漿混合物の分子ふるい
クロマトグラフイーによる分析 第４図に示された実験におけるα2Ｍの固相α2Ｍ
抗体との結合形成（86.7％）を131I−トリプシン
の結合形成（50.3％）と比較することにより、血
漿中の全体のα2Ｍは血漿に加えられたトリプシン
の58.0％と結合しているものと結論することがで
きる。従つてトリプシンの約42％が他の血漿蛋白
質と複合体を形成しており、それゆえにα2Ｍに利
用できないと考えられる。この可能性を証明する
ために131I−トリプシン、125I−α2Ｍおよび血漿の
混合物を分子ふるいクロマトグラフイーにより分
画する（第５図）。131Iの総計数値の57.4％を含む
131I−トリプシンの主ピークは最初に125I−α2Ｍ
（すなわち高分子量の蛋白質ピーク）とともに溶
出する。第二の131I−トリプシンピークは131Iの
総計数値の40.3％を含有しており、そしてアルブ
ミンのピークよりも先にトリプシンおよび血漿蛋
白質との複合体形成と一致する位置に溶出する。 さらに不溶性α2Ｍ抗体の特異性すなわちα2Ｍ−
トリプシン相互作用を確認し、そしてゲル過カ
ラムから得られた131I−トリプシンのピークの性
質を同定するために、131I−トリプシンの各ピー
クフラクシヨン0.6mlを固相α2Ｍ抗体（0.1mlの充
填ゲル）とともにインキユベートする。18時間イ
ンキユベートしたのちα2Ｍのピークフラクシヨン
No.36に含まれる125I−α2Ｍの99％および131I−ト
リプシンの94％は不動化された抗体に結合されて
いる。５％以下の131I−トリプシンは第二の131I
−トリプシンピーク（フラクシヨンNo.46）のイン
キユベーシヨン混合物に含まれる抗体に結合され
ている。従つて第一の高分子量ピークに含まれる
131I−トリプシンの大部分はα2Ｍと複合体を形成
している。第二の放射性ピークに含まれる131I−
トリプシンがα2Ｍ抗体ゲルと結合できないことに
より、トリプシンがα2Ｍ以外の蛋白質と反応して
いたことのもう一つの証拠が提供される。 本発明の方法により生物学的液体中に存在する
酵素および阻害剤−酵素複合体に関する研究が可
能となり、人の血漿α2−マクログロブリンの生理
学的な機能を研究するための新規な手がかりが広
く且つ明確に提供される。本発明の方法はさらに
精製された系および複雑な生物学的液体の両方に
おける阻害剤−酵素複合体、特にα2Ｍのプロテア
ーゼ結合能力を定性することを可能にする。たと
えば固相抗体が結合しているα2Ｍ−β−トリプシ
ン複合体は可溶性複合体のそれと同一のミカエリ
ス−メントン定数を有するトリペプチドである色
素生成基質すなわちBzPhe−Val−Arg−NHNp
を加水分解する能力を保有している。このことは
α2Ｍ−トリプシン複合体の不動化された抗体との
結合が結合されたプロテアーゼのアミド分解活性
に対して認めうるほどには影響しないことを示し
ている。抗体が結合しているα2Ｍ−トリプシン複
合体は著しく安定であることが証明された。なぜ
ならばそれらはくり返し洗浄し、そしてアミド分
解活性について検定してもアガロ−スゲルマトリ
ツクスと結合したままであるからである。トリプ
シンが基質の存在下においてα2Ｍに結合されたま
まであるという発見は、トリプシンがその接触的
位置とは異なる部位でα2Ｍに結合していることの
もう一つの証拠を提供する。 実施例におけるような基質の加水分解を最適化
するために必要な条件に関する研究により、可溶
性のα2Ｍ−トリプシン複合体ならびに固相の抗体
が結合している複合体の両方に対する反応の至適
PHは８〜９であることが示された。これとは対照
的にRindernecht氏ら〔「Biochem.Biophys.
Acta」第377巻第158〜165頁（1975年）〕は異な
つた色素生成基質であるＮ−カルボベンゾキシ−
グリシル−グリシル−Ｌ−アルギニン−２−ナフ
チルアミド塩酸塩を使用して、触媒作用はPH10.0
において最大であることを見い出した。彼等はこ
の程度のアルカリ度はα2Ｍ−トリプシン複合体内
のトリプシン活性部位の微小環境を変えるために
必要であるので、基質は遊離のトリプシンと同様
の速度で加水分解されうると仮定している。彼等
の研究および本発明者の研究との至適PHの相違が
本研究において使用された精製β−トリプシンの
挙動、基質の相違または他の要因を反映している
かどうか明らかではない。 α2Ｍ−トリプシン複合体の不動化されたα2Ｍ抗
体による結合形成は、検定系が人の血漿に適用さ
れた場合にも生起することが本発明者により証明
された。Haverback氏ら〔「J.Clin.Invest.」第41
巻第972〜980頁（1962年）〕による以前の研究は
トリプシンおよびα2の電気泳動移動度を有する血
清蛋白質との間で行なわれた。Mehl氏ら
〔「Science」第145巻第821〜822頁（1964年）〕は
α2Ｍがこの酵素結合活性に由来する蛋白質である
という直接の証拠を提供した。本研究においては
痕跡量の125I−α2Ｍを含有する血漿を不動化され
たα2Ｍ抗体とともにインキユベートした場合に、
放射性物質で標識付けされたα2Ｍおよび自然のα2
Ｍの両方が結合される。125I−α2Ｍの固相α2Ｍ抗
体との結合形成が標識付けされていない自然のα2
Ｍの結合された量に比例することを立証するため
にLaurell氏のエレクトロイムノアツセイの技術
が使用される。従つて放射性物質で標識付けされ
た抗原を血漿に加えることにより、血漿α2Ｍの固
相抗体との結合を定量できるようになつた。血漿
α2Ｍの抗体を含有する不溶性ゲルとの結合は特異
的である。なぜならば他の不動化された抗体たと
えば抗アルブミン、抗ハプトグロビンまたは正常
な家兎血清のIgGフラクシヨンは有意量の血漿α2
Ｍと結合しなかつたからである。 本研究において詳述された固相抗体の技術によ
り生物学的な液体たとえば血漿中のα2Ｍ−酵素複
合体を検出できることを立証するために、種々の
濃度の131I−β−トリプシンが痕跡量の125I−α2
Ｍを含有する血漿に加えられる。その後の検定試
験によりβ−トリプシンは不動化されたα2Ｍ抗体
に見い出されること、および結合された131I−ト
リプシンの量および固相抗体と関連のあるアミド
分解活性は最初に血漿に加えられたトリプシンの
濃度に直線的に関係していることが証明された。
対照研究によりβ−トリプシンそれ自体は抗体ゲ
ルに結合しないことが立証されたので、本発明者
により測定されたトリプシンの活性はα2−トリプ
シン複合体の特定の尺度である。血漿に加えられ
たトリプシンの各濃度において58％がα2Ｍに結合
され、残りのトリプシンが他の蛋白質（おそらく
はα1−抗トリプシン）と結合していることがゲル
過の研究により示された。これらの結果は
Ganrot氏〔「Arkiv For Kemi」第26巻第50号第
577〜582頁（1967年）〕の発見と比較され、彼等
はトリプシンのα2Ｍに対する親和性が血漿中の他
のトリプシン阻害剤に対するそれよりも大きいこ
とを証明している。 α2Ｍは独特の血漿プロテアーゼ阻害剤であり、
それは血漿、細胞または微生物から誘導されたセ
リン、チオール、カルボキシルおよび金属プロテ
アーゼを含めて例外的に多種のプロテアーゼと複
合体を形成する〔Harpel氏ら（1976年）上記文
献参照、Starkey氏ら上記文献参照〕。α2Ｍおよ
び数種の異なつたプロテアーゼとの複合体形成は
血漿中で〔Harpel氏ら「J.Clin.Invest.」第52巻
第2175〜2184（1973年）、Nilehn氏ら「Scand.J.
Clin.Lab.Invest.第20巻第113〜121頁（1967年）
参照〕、腹膜内で〔Ohlsson氏著「Bayer Symp.
V.Proteinase Inhibitors」Fritz氏ら編（スプリ
ンガー−フエルラーク社発行）第96〜105頁
（1974年）〕、胸膜内において〔Bieth氏ら「Clin.
Chim.Acta」第22巻第639〜642頁（1968年）、
Bieth氏ら「Clin.Chim.Acta」第30巻第621〜626
頁（1970年）〕、および滑液の滲出液中で
〔Shtacher氏ら「Biochim.Biophys.Acta」第303
巻第138〜147頁（1973年）、Abe氏ら「J.
Biochem（Tokyo）」第71巻第919〜922頁（1973
年）、Abe氏ら「J.Biochem.（Tokyo）」第73巻第
897〜900頁（1973年）〕生起することが示されて
いる。しかしながらこれらの複合体の定量分析に
適した便利な方法は以前には得られていなかつ
た。本研究において記載された固相α2Ｍ抗体の技
術は一般的には酵素−酵素阻害剤複合体の、特定
的にはα2Ｍ−プロテアーゼ複合体の迅速な単離お
よび濃縮、および種々の生理学的および病理学的
状態の生物学的液体におけるそれらの存在およ
び／または触媒能力の測定を容易にする。検定条
件を変更することにより生理学的に重要な酵素お
よび酵素阻害剤特にプロテアーゼたとえばトロン
ビン、プラスミンおよび血漿カリクレインのα2Ｍ
に結合された場合の活性を測定することが可能に
なるであろう。 本発明およびその好ましい態様と考えられると
ころについて上記に記載したが、本発明は他のマ
トリツクス、不動化されたＥ−Ｉ−抗Ｉ複合体、
酵素、阻害剤および阻害剤の抗体またはその反応
性フラグメントを用いて、そして同様に異なつた
分析技術および反応条件を使用して種々の変形が
可能であることを理解すべきである。
の結合形成に関する研究 精製されたα2Ｍまたはα2Ｍ−トリプシン複合体
の固相抗人α2Ｍ抗体による結合形成が複雑な生物
学的液体たとえば血漿にまで拡張できるかどうか
を試験するために実験が考案された。第２図に示
されたこの研究においては、125I−α2Ｍを加えた
血漿の連続希釈液とともに固相のα2Ｍ抗体をイン
キユベートする。不溶性の抗体に結合された放射
能を測定する。出発血漿中の自然のα2Ｍおよび吸
収後の血漿上澄み液中に残存しているα2Ｍをエレ
クトロイムノアツセイにより同様に定量する。そ
の結果は血漿に加えられた125I−α2Ｍの不動化さ
れた抗体による結合形成は自然の血漿中に含まれ
るα2Ｍの結合形成と匹敵することを示している。 血漿に加えられた125I−α2Ｍの固相a2Ｍ抗体に
よる結合形成の特異性もまた、変更されていない
バイオーゲルＡ−5m、または正常な家兎血清の
精製されたIgGフラクシヨンまたは人のアルブミ
ンまたはハプトグロビンに指向している家兎の抗
血清のIgGフラクシヨンがカツプリングせしめら
れたこの同一のゲルとともに、125I−α2Ｍを含有
する血漿をインキユベートすることにより試験さ
れる。95％以上の放射能が不溶性のα2Ｍ抗体に結
合するようになる条件下では、２％以下の125I−
α2Ｍ放射能がこれらの他のゲル調製物と関連して
いる。 固相α2Ｍ抗体を含む血漿のインキユベーシヨン
時間がα2Ｍのゲルとの結合に及ぼす影響について
研究が行なわれた（第３図）。それぞれα2Ｍを12、
60および192μg含有する３種の異なつた血漿希釈
液とともに上記の抗体ゲルを種種の時間インキユ
ベートする。α2Ｍのすべての濃度において６時間
のインキユベーシヨン時間の間ずつと結合形成は
漸進的に増大する。α2Ｍの最低濃度（12μg／系）
においては６時間後に91.7％のα2Ｍが結合せしめ
られる。α2Ｍの最大濃度においては49％すなわち
94μgのα2Ｍが結合する。このことは1.0mlのα2Ｍ
抗体ゲルは少なくとも9.4mgのα2Ｍと結合する能
力を有することを示している。 血漿中のα2Ｍ−トリプシン複合体の固相α2Ｍ抗体
による結合形成に関する研究 血漿中のα2Ｍが不動化されたα2Ｍ抗体により定
量的に除去できることが証明されたので、外因性
の131I−β−トリプシンが血漿系のα2Ｍに結合す
ることに関する研究が可能となつた。1.5mg／ml
のα2Ｍを含有する血漿に131I−β−トリプシンを
加えてトリプシン濃度を0.10〜1.65μg／ml血漿と
なす。これはトリプシン／α2Ｍのモル比が0.002
〜0.035であることを表わす。その血漿はまた痕
跡量の125I−α2Ｍを含有している。血漿の一部分
を固相のα2Ｍ抗体とともに２時間インキユベート
する。ペレツトを洗浄し、125Iおよび131Iの両方の
放射能を計数し、そしてアミド分解活性を測定す
る（第４図）。そのインキユベーシヨン混合物中
に含まれる125I−α2Ｍの86.7％が抗体を含むゲル
に結合されるのに対して、131I−β−トリプシン
の50.3％だけが同様に結合されている。このこと
はトリプシンはまた他の血漿蛋白質とも結合する
ことを示唆している。α2Ｍおよびトリプシンの両
方の結合形成パーセントは血漿に加えられたトリ
プシンの種々の濃度により影響されない。固相抗
体ゲルに結合された131Iの放射能は最初の混合物
中に含まれる131I−トリプシンの量に比例してい
る。 内因性のアミド分解活性を制御するために、固
相α2Ｍ抗体は131I−トリプシンを添加していない
血漿−125I−α2Ｍ混合物とともにインキユベート
される。生成したα2Ｍ抗体ゲルはα2M1mgあたり
基質2.4マイクロモル／／分を加水分解し、そ
れは１mlあたり約142ngのβ−トリプシンを血漿
に加えたことに相当する。このバツクグラウンド
の活性は血漿、トリプシン混合物とともにインキ
ユベートされたゲルのアミド分解活性から差し引
かれる。131I−トリプシン、血漿混合物とともに
インキユベートされたα2Ｍ抗体ゲルのアミド分解
活性は加えられたトリプシンの初期濃度に比例し
ており、そしてゲルに結合された131Iの計数値に
匹敵する（第４図）。131 I−β−トリプシン、血漿混合物の分子ふるい
クロマトグラフイーによる分析 第４図に示された実験におけるα2Ｍの固相α2Ｍ
抗体との結合形成（86.7％）を131I−トリプシン
の結合形成（50.3％）と比較することにより、血
漿中の全体のα2Ｍは血漿に加えられたトリプシン
の58.0％と結合しているものと結論することがで
きる。従つてトリプシンの約42％が他の血漿蛋白
質と複合体を形成しており、それゆえにα2Ｍに利
用できないと考えられる。この可能性を証明する
ために131I−トリプシン、125I−α2Ｍおよび血漿の
混合物を分子ふるいクロマトグラフイーにより分
画する（第５図）。131Iの総計数値の57.4％を含む
131I−トリプシンの主ピークは最初に125I−α2Ｍ
（すなわち高分子量の蛋白質ピーク）とともに溶
出する。第二の131I−トリプシンピークは131Iの
総計数値の40.3％を含有しており、そしてアルブ
ミンのピークよりも先にトリプシンおよび血漿蛋
白質との複合体形成と一致する位置に溶出する。 さらに不溶性α2Ｍ抗体の特異性すなわちα2Ｍ−
トリプシン相互作用を確認し、そしてゲル過カ
ラムから得られた131I−トリプシンのピークの性
質を同定するために、131I−トリプシンの各ピー
クフラクシヨン0.6mlを固相α2Ｍ抗体（0.1mlの充
填ゲル）とともにインキユベートする。18時間イ
ンキユベートしたのちα2Ｍのピークフラクシヨン
No.36に含まれる125I−α2Ｍの99％および131I−ト
リプシンの94％は不動化された抗体に結合されて
いる。５％以下の131I−トリプシンは第二の131I
−トリプシンピーク（フラクシヨンNo.46）のイン
キユベーシヨン混合物に含まれる抗体に結合され
ている。従つて第一の高分子量ピークに含まれる
131I−トリプシンの大部分はα2Ｍと複合体を形成
している。第二の放射性ピークに含まれる131I−
トリプシンがα2Ｍ抗体ゲルと結合できないことに
より、トリプシンがα2Ｍ以外の蛋白質と反応して
いたことのもう一つの証拠が提供される。 本発明の方法により生物学的液体中に存在する
酵素および阻害剤−酵素複合体に関する研究が可
能となり、人の血漿α2−マクログロブリンの生理
学的な機能を研究するための新規な手がかりが広
く且つ明確に提供される。本発明の方法はさらに
精製された系および複雑な生物学的液体の両方に
おける阻害剤−酵素複合体、特にα2Ｍのプロテア
ーゼ結合能力を定性することを可能にする。たと
えば固相抗体が結合しているα2Ｍ−β−トリプシ
ン複合体は可溶性複合体のそれと同一のミカエリ
ス−メントン定数を有するトリペプチドである色
素生成基質すなわちBzPhe−Val−Arg−NHNp
を加水分解する能力を保有している。このことは
α2Ｍ−トリプシン複合体の不動化された抗体との
結合が結合されたプロテアーゼのアミド分解活性
に対して認めうるほどには影響しないことを示し
ている。抗体が結合しているα2Ｍ−トリプシン複
合体は著しく安定であることが証明された。なぜ
ならばそれらはくり返し洗浄し、そしてアミド分
解活性について検定してもアガロ−スゲルマトリ
ツクスと結合したままであるからである。トリプ
シンが基質の存在下においてα2Ｍに結合されたま
まであるという発見は、トリプシンがその接触的
位置とは異なる部位でα2Ｍに結合していることの
もう一つの証拠を提供する。 実施例におけるような基質の加水分解を最適化
するために必要な条件に関する研究により、可溶
性のα2Ｍ−トリプシン複合体ならびに固相の抗体
が結合している複合体の両方に対する反応の至適
PHは８〜９であることが示された。これとは対照
的にRindernecht氏ら〔「Biochem.Biophys.
Acta」第377巻第158〜165頁（1975年）〕は異な
つた色素生成基質であるＮ−カルボベンゾキシ−
グリシル−グリシル−Ｌ−アルギニン−２−ナフ
チルアミド塩酸塩を使用して、触媒作用はPH10.0
において最大であることを見い出した。彼等はこ
の程度のアルカリ度はα2Ｍ−トリプシン複合体内
のトリプシン活性部位の微小環境を変えるために
必要であるので、基質は遊離のトリプシンと同様
の速度で加水分解されうると仮定している。彼等
の研究および本発明者の研究との至適PHの相違が
本研究において使用された精製β−トリプシンの
挙動、基質の相違または他の要因を反映している
かどうか明らかではない。 α2Ｍ−トリプシン複合体の不動化されたα2Ｍ抗
体による結合形成は、検定系が人の血漿に適用さ
れた場合にも生起することが本発明者により証明
された。Haverback氏ら〔「J.Clin.Invest.」第41
巻第972〜980頁（1962年）〕による以前の研究は
トリプシンおよびα2の電気泳動移動度を有する血
清蛋白質との間で行なわれた。Mehl氏ら
〔「Science」第145巻第821〜822頁（1964年）〕は
α2Ｍがこの酵素結合活性に由来する蛋白質である
という直接の証拠を提供した。本研究においては
痕跡量の125I−α2Ｍを含有する血漿を不動化され
たα2Ｍ抗体とともにインキユベートした場合に、
放射性物質で標識付けされたα2Ｍおよび自然のα2
Ｍの両方が結合される。125I−α2Ｍの固相α2Ｍ抗
体との結合形成が標識付けされていない自然のα2
Ｍの結合された量に比例することを立証するため
にLaurell氏のエレクトロイムノアツセイの技術
が使用される。従つて放射性物質で標識付けされ
た抗原を血漿に加えることにより、血漿α2Ｍの固
相抗体との結合を定量できるようになつた。血漿
α2Ｍの抗体を含有する不溶性ゲルとの結合は特異
的である。なぜならば他の不動化された抗体たと
えば抗アルブミン、抗ハプトグロビンまたは正常
な家兎血清のIgGフラクシヨンは有意量の血漿α2
Ｍと結合しなかつたからである。 本研究において詳述された固相抗体の技術によ
り生物学的な液体たとえば血漿中のα2Ｍ−酵素複
合体を検出できることを立証するために、種々の
濃度の131I−β−トリプシンが痕跡量の125I−α2
Ｍを含有する血漿に加えられる。その後の検定試
験によりβ−トリプシンは不動化されたα2Ｍ抗体
に見い出されること、および結合された131I−ト
リプシンの量および固相抗体と関連のあるアミド
分解活性は最初に血漿に加えられたトリプシンの
濃度に直線的に関係していることが証明された。
対照研究によりβ−トリプシンそれ自体は抗体ゲ
ルに結合しないことが立証されたので、本発明者
により測定されたトリプシンの活性はα2−トリプ
シン複合体の特定の尺度である。血漿に加えられ
たトリプシンの各濃度において58％がα2Ｍに結合
され、残りのトリプシンが他の蛋白質（おそらく
はα1−抗トリプシン）と結合していることがゲル
過の研究により示された。これらの結果は
Ganrot氏〔「Arkiv For Kemi」第26巻第50号第
577〜582頁（1967年）〕の発見と比較され、彼等
はトリプシンのα2Ｍに対する親和性が血漿中の他
のトリプシン阻害剤に対するそれよりも大きいこ
とを証明している。 α2Ｍは独特の血漿プロテアーゼ阻害剤であり、
それは血漿、細胞または微生物から誘導されたセ
リン、チオール、カルボキシルおよび金属プロテ
アーゼを含めて例外的に多種のプロテアーゼと複
合体を形成する〔Harpel氏ら（1976年）上記文
献参照、Starkey氏ら上記文献参照〕。α2Ｍおよ
び数種の異なつたプロテアーゼとの複合体形成は
血漿中で〔Harpel氏ら「J.Clin.Invest.」第52巻
第2175〜2184（1973年）、Nilehn氏ら「Scand.J.
Clin.Lab.Invest.第20巻第113〜121頁（1967年）
参照〕、腹膜内で〔Ohlsson氏著「Bayer Symp.
V.Proteinase Inhibitors」Fritz氏ら編（スプリ
ンガー−フエルラーク社発行）第96〜105頁
（1974年）〕、胸膜内において〔Bieth氏ら「Clin.
Chim.Acta」第22巻第639〜642頁（1968年）、
Bieth氏ら「Clin.Chim.Acta」第30巻第621〜626
頁（1970年）〕、および滑液の滲出液中で
〔Shtacher氏ら「Biochim.Biophys.Acta」第303
巻第138〜147頁（1973年）、Abe氏ら「J.
Biochem（Tokyo）」第71巻第919〜922頁（1973
年）、Abe氏ら「J.Biochem.（Tokyo）」第73巻第
897〜900頁（1973年）〕生起することが示されて
いる。しかしながらこれらの複合体の定量分析に
適した便利な方法は以前には得られていなかつ
た。本研究において記載された固相α2Ｍ抗体の技
術は一般的には酵素−酵素阻害剤複合体の、特定
的にはα2Ｍ−プロテアーゼ複合体の迅速な単離お
よび濃縮、および種々の生理学的および病理学的
状態の生物学的液体におけるそれらの存在およ
び／または触媒能力の測定を容易にする。検定条
件を変更することにより生理学的に重要な酵素お
よび酵素阻害剤特にプロテアーゼたとえばトロン
ビン、プラスミンおよび血漿カリクレインのα2Ｍ
に結合された場合の活性を測定することが可能に
なるであろう。 本発明およびその好ましい態様と考えられると
ころについて上記に記載したが、本発明は他のマ
トリツクス、不動化されたＥ−Ｉ−抗Ｉ複合体、
酵素、阻害剤および阻害剤の抗体またはその反応
性フラグメントを用いて、そして同様に異なつた
分析技術および反応条件を使用して種々の変形が
可能であることを理解すべきである。
第１図は液相または固相の抗体が結合したα2Ｍ
−β−トリプシン複合体によるBzPhe−Val−
Arg−NHNpの加水分解に関するラインウイー
バーバーク（Lineweaver−Burk）のプロツトで
あり、第２図は固相のα2Ｍ抗体による血漿中のα2
Ｍの結合形成をグラフにより表示したものであ
り、第３図は固相のα2Ｍ抗体による血漿中のα2Ｍ
の結合形成に及ぼすインキユベーシヨン時間の影
響をグラフにより表わしたものであり、第４図は
固相のα2Ｍ抗体による血漿のα2Ｍ−131I−トリプ
シン複合体の結合形成をグラフにより表示したも
のでありそして第５図は131I−β−トリプシン、
125I−α2Ｍおよび血漿の混合物のゲル過クロマ
トグラフイーをグラフにより表わしたものであ
る。
−β−トリプシン複合体によるBzPhe−Val−
Arg−NHNpの加水分解に関するラインウイー
バーバーク（Lineweaver−Burk）のプロツトで
あり、第２図は固相のα2Ｍ抗体による血漿中のα2
Ｍの結合形成をグラフにより表示したものであ
り、第３図は固相のα2Ｍ抗体による血漿中のα2Ｍ
の結合形成に及ぼすインキユベーシヨン時間の影
響をグラフにより表わしたものであり、第４図は
固相のα2Ｍ抗体による血漿のα2Ｍ−131I−トリプ
シン複合体の結合形成をグラフにより表示したも
のでありそして第５図は131I−β−トリプシン、
125I−α2Ｍおよび血漿の混合物のゲル過クロマ
トグラフイーをグラフにより表わしたものであ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ (a)酵素阻害剤の抗体または酵素阻害剤と反応
する前記抗体のフラグメントを不溶性マトリツク
スに付着させ、(b)得られた酵素阻害剤と反応する
マトリツクスを生物学的液体と接触させてその液
体中の酵素阻害剤−酵素複合体と結合させ、(c)そ
の結合した酵素阻害剤−酵素複合体またはその中
に含まれる酵素を同定または定量することを特徴
とする生物学的液体の分析法。 ２ 酵素阻害剤がα2−マクログロブリンである特
許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 酵素阻害剤がα2−マクログロブリンであり、
そしてマトリツクスがアガロースゲルである特許
請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 結合した酵素阻害剤−酵素複合体が酵素的反
応性を有し、そして同定または定量が、結合した
複合体を該複合体に含まれる酵素に反応性を有す
る基質と反応させることからなる特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ５ 結合した酵素阻害剤−酵素複合体が酵素的反
応性を示さず、そして同定または定量が、結合し
た複合体を検出を容易にする物質と反応させ、該
物質が複合体に含まれる酵素または酵素阻害剤−
酵素複合体に特異的な部位と反応するものである
ことからなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 生物学的液体が人の生物学的液体である特許
請求の範囲第１項記載の方法。 ７ 酵素が蛋白質分解酵素である特許請求の範囲
第６項記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US19216680A | 1980-09-30 | 1980-09-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5794660A JPS5794660A (en) | 1982-06-12 |
| JPH041304B2 true JPH041304B2 (ja) | 1992-01-10 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP (1) | JPS5794660A (ja) |
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-
1981
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