JPH04144688A

JPH04144688A - 新規ｄｎａ化合物

Info

Publication number: JPH04144688A
Application number: JP26829690A
Authority: JP
Inventors: Akio Matsuda; 昭生松田; Kokichi Sugiura; 杉浦　弘吉; Rei Soga; 曽我　令
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1990-10-08
Filing date: 1990-10-08
Publication date: 1992-05-19

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、アクレモニウム・クリソゲナム由来であり、
セファロスポリンＣをデアセチルセファロスポリンＣに
変換する酵素であるセファロスポリンＣアセチルエステ
ラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片に関する。

（従来の技術）セファロスポリンＣは、糸状菌であるアクレモニウム・
クリソゲナムを用いた発酵法により製造されている。ま
た、セファロスポリンＣ発酵中にセファロスポリンＣの
一部もしくは全部がアクレモニウム・クリソゲナムが精
製するセファロスポリンＣアセチルエステラーゼによっ
て酵素的に脱アセチル化されデアセチルセファロスポリ
ンＣとなることが報告されている（　Ｆｕｊｉｓａｉｙ
ａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７３）　２４６．１５４−１
５５　、Ｎｕｅｓｃｈら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　１
ｎｄｕｓｔｒｉａｌ　　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
　：ｐｒｏｃｅｅｄｒｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｅｃｏ
ｎｄ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
　１９７４．　　（１９７６）　ｐｐ４５１−４７２）
　、　　しかし、該セファロスポリンＣアセチルエステ
ラーゼに関する従来の知見は、部分的な精製に留まって
いて（Ｈｉｎｎｅｎ　ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ。

Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ　（１９７６）　９
．８２４−８３０）　、今日まで該酵素の純化ならびに
該酵素遺伝子の単離の報告はない。

（発明が解決しようとする課題）本発明は、アクレモニウム・クリソゲナム由来のセファ
ロスポリンＣアセチルエステラーゼをコードするＤＮＡ
化合物を提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段）本発明者らは、アクレモニウム・クリソゲナム由来のセ
ファロスポリンＣアセチルエステラーゼについて鋭意研
究を重ねた結果、該酵素を純化し、該酵素のアミノ酸配
列の一部を決定し、そのアミノ酸配列の常法を基に該酵
素をコードするＤＮＡ化合物を単離し、その塩基配列を
決定し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明
は、（１）アクレモニウム・クリソゲナム由来のセファ
ロスポリンＣアセチルエステラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ
断片（２）第１図に示す制限酵素地図により規定される上記
（＋）記載のＤＮＡ断片（３）第１図における下線部の塩基配列が第２図で示さ
れる上記（２）記載のＤＮＡ断片（４）上記（１）、　（２）、　（３）記載のＤＮＡ断
片をベクターに組み込んだ組換え体ＤＮＡを提供するものである。

本発明に係るＤＮＡおよび紺換え体微生物は、おおよそ
下記の工程によって造成することができる。

■、セファロスポリンＣアセチルエステラーゼの部分ア
ミノ酸配列の決定（１）アクレモニウム・クリソゲナムの培養液上澄を硫
酸アンモニウム沈澱法により濃縮する。

（２）　　（１）で得た濃縮液を弱塩基性陰イオン交換
クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾
過、弱塩基性陰イオン交換樹脂を用いた高速液体クロマ
トグラフィーの４つのクロマトグラフィーに供する。

（３）　　（２）で得たセファロスポリンＣアセチルエ
ステラーゼ゛活性画分を５ＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動に供し、該酵素ハンドを切り出し、抽出する。以
北により純品セファロスポリンＣアセチルエステラーゼ
を得ることができる。

（４）　　（３）で得た純化セファロスポリンＣアセチ
ルエステラーゼをトリプシン消化する。

（５）　　（４）で得た分解ペプチド断片を逆相高速液
体クロマトグラフィーで分離する。

（６）　　（３）で得た純品セファロスポリンＣアセチ
ルエステラーゼ、（５）で得たペプチド断片のアミノ酸
配列を決定する。

以上により、セファロスポリンＣアセチルエステラーゼ
Ｎ末端アミノ酸配列、および下記３種のアミノ酸断片が
該酵素に含まれることが判った。

１、Ｘ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ
−Ａｌａ−Ｔｙｒ２、　　Ｌｅｕ−Ａｓｎ−八５ｐ−Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−＾５ｐ−Ａｌａ３、Ｇｌｙ−Ａ
ｓｎ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌ
ａＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ａｓｐ（Ｎ末端）Ｓｅｒ−Ｐｒｏ− ４、）ｌｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌ
ａ−５ｅｒ−シａｌ−Ｇｌｕ−ＡｓｎＸ：不明（酵素活性測定法）セファロスポリンＣアセチルエステラーゼ活性はセファ
ロスポリンＣを基質として反応を行い、生成するデアセ
チルセファロスポリンＣを高速液体クロマトグラフィー
で定量し、その生成量から活性を算出して行う。すなわ
ち、４８ｍＭセファロスポリンＣを含む０．２Ｍリン酸
カリウムバッファー（ｐＨ７，０）１−中に０．００１
〜０゜０１Ｕの酵素存在下で実施し、２５°Ｃで６０分
間反応を行う。Ｉｄのメタノールを添加して直ちに水冷
して反応を停止し、１１００００Ｘ　　２分間遠心分離
し、上清中に生成するデアセチルセファロスポリンＣを
、下記の条件で高速液体クロマトグラフィーによって分
析を行う。

高速液体クロマトグラフィー分析条件は、カラムはＺＯ
ＲＢＡＸ−ＢＰＮＨ２カラム（デュポン社、４゜５Ｉｌ
！Ｉ×２５ｃ１！ｌ）、移動相は８％酢酸−４％メタノ
ールー１２％アセトニトリル−７６％水、流速は１．５
〜２．　　Ｏ〆／分、検出波長は２５４ｎｍとする。

（タンパク質濃度測定法）タンパク￥を濃度の測定は、牛血清アルブミンを標準と
して用い、ブラッドフォード（Ｂｒａｄ　ｆｏｒｄＭ、
Ｍ、、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｌｌｌ、（１９７６）
　７２．２４８−２５４）の方法にしたがって測定する
。

（アミノ酸配列決定法）アミノ酸配列の解析は、純化ペプチド断片を通常の条件
でエドマン分解反応を行い、各サイクルで得られるアミ
ノ酸フェニルチオヒダントイン誘導体を定量することに
よって求める。

アミノ酸のフェニルチオヒダントイン誘導体の定量には
、カラムとしてＰＴＨ−Ｃ１８（アプライド　バイオシ
ステム社）を用い、検出は波長２６９ｎｍで行う。

■、セファロスポリンＣアセチルエステラーゼ遺伝子の
単離（１）アクレモニウム・クリソゲナムから染色体ＤＮＡ
を抽出し、適当な制限酵素（例えばＭｂｏｌ等）で部分
切断する。

（２）　　（１）で得られたＤＮＡ断片を適当なファー
ジベクター（例えばＥＭＢＬ３．ＥＭＢＬ４等）に組み
込み、アクレモニウム・クリソゲナムの染色体ＤＮＡラ
イブラリーを構築する。

（３）上記セファロスポリンＣアセチルエステラーゼＮ
末端、もしくはトリプシン分解ペプチドのアミノ酸配列
をコードし得る塩基配列をもつＤＮＡオリゴマーを合成
する。

（４）　　（２）で得たライブラリーの中から、（３）
で得たＤＮＡオリゴマーをプローブとしたプラークハイ
ブリダイゼーションにより、目的とするファージを選択
分離する。

（５）選択したファージからＤＮＡを抽出し、同上のプ
ローブを用いてサザンハイプリダイゼーションを行い、
適当なサイズの制限酵素断片上に目的の遺伝子を位置づ
け、それをプラスミトベクターにサブクローニングする
。

（６）かくして得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し
、既知のアミノ酸配列との比較によりセファロスポリン
ＣアセチルエステラーゼゲノムＤＮＡの存在を確認する
。

（７）セファロスポリンＣアセチルエステラーゼの全コ
ード領域を含む適当な大きさのＤＮＡ断片（該遺伝子の
プロモーター、ターミネータ−等の領域も含むことが推
定される断片）をアクレモニウム・クリソゲナム形質転
換用ベクターに組み込んで、組換え体ＤＮＡを作製する
。

（８）上記組換え体ＤＮＡを用いて、アクレモニウム・
クリソゲナムを形質転換する。

（９）上記（８）により得られた形質転換体のセファロ
スポリンＣアセチルエステラーゼ活性もしくは類似化合
物を基質としたエステラーゼ活性を測定し、（７）でベ
クターに組み込んだＤＮＡ断片を導入することにより、
酵素活性が上昇することを確認する。

上記の工程中でＤＮＡ、組換え体宿主としての大腸菌等
の取り扱いに必要な一般的な操作は、当業者間で通常行
われているものであり、例えば、ＭａｎｉａＬｉｓらの
実験操作書（Ｔ、ＭａｎｉａＬｉｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８２＋　１
９８９　）にしたがえば、容易に実施できる。使用され
る酵素、試薬類もすべて市販の製品を用いることができ
、特に断らない限り、製品で指定されている使用条件に
したがえば、完全にそれらの目的を達成することができ
る。

例えば、上記（１）において、ＤＮＡ抽出源としては、
アクレモニウム・クリソゲナム１１５５０、アクレモニ
ウム・クリソゲナムＩ　Ｓ−５等の菌株が使用できる。

なお、アクレモニウム・クリソゲナムＩ　Ｓ−５株は、
平成２年２月５日付で通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研菌寄第１１２３２号の寄託番号で寄
託されている。

また、該菌からの全ＤＮＡ抽出は、例えば、Ｊｏｈｎｓ
　ｔｏｎｅ　ら（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ　ｅｔ、ａｌ、＋
　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ（１９８５）　４．１３０７
−１３１１　）の方法、もしくはＭｉｎｕｔｈら（Ｍｉ
ｎｕｔｈ　ｅｔ、ａｌ、、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ（１９８２）　５．２２７−２３１　）の方法
に準じて行うことができる。

上記（３）において、ＤＮＡオリゴマーの合成は、市販
のＤＮＡ合成機を用い、その操作手順にしたがって実施
することができる。上記（６）におけるＤＮＡ塩基配列
の決定法も、公知であるジデオキシ法　（Ｓａｎｇｅｒ
　　ｅｔ、ａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｉ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９７７）　７３．５４６３　）を
用いることができる。上記（７）におけるアクレモニウ
ム・クリソゲナム形質転換用ベクターとしては、例えば
、ｐＰＧＫＭ５ｐＡＣＴＨＹ８３．ｐＥＧＡＰ８３　（
特願平２１６６５６６号）等を使用することができる。

また、（８）におけるアクレモニウム・クリソゲナムの
形質転換は、例えば、Ｑｕｅｅｎｅｒらの方法（（ｌｕ
ｅｅｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ　：　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ　１９８５．ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙ　ｆｏ
ｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８５）　ｐｐ４６
８−４７２）あるいはＩｓｏｇａｉ　らの方法（Ｉｓｏ
ｇａｉ　ｅｔ　ａｌ　　：　Ａｇｒｉｃ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｍ　（１９８７）　５１２３２１−
２３２９）に準して実施することかできる。

（実施例）以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明は、該
実施例によって限定されるものではない。

なお、実施例に記載の略称ないし略号は、以下のとおり
である。

マニアティスの実験書：　　（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　
ｅｔ　ａｌ、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８２　）Ｎ
−３シード培地：コーンスティーブリ力−４０ｇ／ビー
ト２０　ｇ／酢酸アンモニウム２ｇ／スイトース４０ｇ
を水ＩＩｌに溶解したもの。

メイン培地：ビート３０ｇ／脱脂大豆４０ｇ／コーンス
テイープリカー１０　ｇ／酢酸アンモニウム５ｇ／硫酸
アンモニウム７ｇ／硫酸カルシウム８ｇ／炭酸カルシウ
ム１５ｇ／スイトース６０ｇ／メチルオレイト４１．５
ｇを水１２に含むもの。

ＣＭ培地：ショ１２０ｇ／リン酸二水素カワウム０．５
ｇ／リン酸水素二カリウム０．５ｇ／塩化カリウム０．
５ｇ／硫酸マグネシウム（７水塩）０．５ｇ／硫酸鉄（
ＩＩ）（７水塩）０．０１ｇ／硝酸ナトリウム３ｇ／イ
ーストエキストラクト４ｇ／ペプトン１０ｇを水１！に
溶解したもの。

ＣＭ固形培地：１．５％の寒天を含有するＣＭ培地。

ＧＡ（ｊ＠地：グリセロール４０呂／アスパラギン４ｇ
／塩化カルシウム０．１ｇ／塩化ナトリウム０．１ｇ／
微量金属溶液〔硫酸マグネシウム（７水塩）４ｇ／硫酸
鉄（ＩＩ）（７水塩）０．４ｇ／硫酸マンガン（４水塩
）０．１６ｇ／硫酸亜鉛（７水塩）０．４ｇ／無水硫酸
銅０．０４ｇを水Ｉｆに溶解したもの〕２５ｍ１０．１
Ｍリン酸バッフｙ−（ｐＨ７，０）３０ｒＩＩｌを水１
１に含有する培地。

Ｐ−バッファー：０．６Ｍ塩化カリウム１０゜０１Ｍ塩
化マグネシウム１０．０２５Ｍ塩化カルシウム。

ＰＥＧ溶液：２５％ポリエチレングリコール（約４００
０）１０．ＯＩＭＩ−リス（ｐＨ８゜０）１０．０５Ｍ
塩化カルシ’７　ム／　０　、　６　Ｍ塩化カリウム。

６ｘＳＥＴ：０．９Ｍ　　ＮａＣ１１０，１２ＭＴｒｉ
ｓ−（１！　（ｐＨ７，８）／６ｍＭ　　ＥＤＡ６ＸＳＳＣ：０．９Ｍ　　ＮａＣ１１０，０９Ｍクエン
酸３ナトリウム５Ｘデンハルツ二〇、１％フィコール１０．１％ポリビ
ニルピロリドン１０９１％牛血清アルブミン実施例１アクレモニウム・クリソゲナムの培養アクレモニウム・クリソゲナムの培養は、２０！のジャ
ーファーメンタ−（丸菱社）中１５１．の下記培地を入
れて、２５°Ｃで１６８時間培養した。

培養した菌液６０００ｇを１０分間遠心分離し、セファ
ロスポリンＣアセチルエステラーゼ活性のある上清画分
を回収した。

培地：シュクロース２％、炭酸カルシウム０゜５％、硫
酸カルシウム１．２５％、酢酸アンモニウム０．８％、
コーンスターチ３％、ビートモラセス５％、脱脂大豆６
％、メチルオレート３％（ｐＨ６，４）実施例２酵素の精製セファロスポリンＣアセチルエステラーゼ活性を持つ培
養液上清画分１０ｆを、３ｍＭジチオスレイトール存在
下５０ｍＭリン酸カリウムハンファー（ｐＨ７，０）系
にした。以下の操作はすべて５°Ｃ以下で行った。

上記酵素液を６０００Ｘｇで１０分間遠心分離し、上清
を回収し、粗酵素液とした。粗酵素液は総タンパク’！
６７０００■、総括性１２Ｕであった。

粗酵素液に３０％飽和となるように硫酸アンモニウムを
加え、３０分間攪拌し、６０００Ｘｇで１時間遠心分離
し、その上清を回収した。回収液にさらに硫酸アンモニ
ウムを加え、７０％飽和硫酸アンモニウムとして３０分
間攪拌し、６０００×ｇで１時間遠心分離した。遠心分
離後、上清を除いた沈澱を３６０ｔｌｆ！の５０ｍＭリ
ン酸カリウムバンフｙ　　（ｐＨ７，０）、３ｍＭジチ
オスレイトール（以下、ＰＤ溶液と呼ぶ）に懸濁して、
これをＰＤ溶液に対して３６時間透析した。得られた透
析液の２分の１量を、予めＰＤ溶液で平衡化しておいた
ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラム（４，１ｃｍ
Ｘ３７．５ｃｍ、ファルマシア社）に吸着させ、ＰＤ溶
液中０〜０．６Ｍの塩化ナトリウムリニアグラジェント
（総量２５００ｄ）で溶離した。流速は、３．３ｄ／分
で行った。セファロスポリンＣアセチルエステラーゼは
塩化ナトリウム０．３０〜０．３５Ｍの間で溶出した。

上記の操作を２回繰り返し、総タンパク！１１０００■
、総括性８．５Ｕを回収した。

回収された活性画分に硫酸アンモニウムを３０％飽和に
なるまで加え、３０分間攪拌した。予め３０％飽和硫酸
アンモニウムを含むＰＤ溶液で平ｉ化させたフェニルセ
ファ０−スＣＬ−４Ｂ　カラム（３，１ｃｍＸ２３ｃｍ
、ファルマシア社）に、上記セファロスポリンＣアセチ
ルエステラーゼ活性画分を吸着させ、ＰＤ溶液中硫酸ア
ンモニウム３０〜０％およびエチレングリコールＯ〜７
０％のリニアグラジェント（総容量１７００ｍＭ）で／
８離した。流速は２．５ｄ／分で行った。回収された活
性画分は総タンパク質６９０■。総括性６．　０Ｕてあ
った。

回収されたセファロスポリンＣアセチルエステラーゼ活
性画分をセントリプレツブ１０（アミコン社）にて２５
ｄまで濃縮し、得られた濃縮液を、予めＰＤｆ４液で平
衡化したセファクリルＳ−２００ＳＦカラム（３，０Ｃ
ＩＩＸ７５Ｃ１＋１、ファルマシア社）に５ＩＩｌｌ！
充填して、流速１．３−でゲル濾過を行った。上記の操
作を５回繰り返し、総タンパク質５８■、総括性４．Ｏ
Ｕのエステラーゼ画分を得た。

上記のエステラーゼ画分をセントリプレツブ１０（アミ
コン社）にて４ｄまで濃縮し、その４分の１を、予めＰ
Ｄ溶液で平衡化させた高速液体クロマトグラフィー用カ
ラムＴＳＫ−ｇｅｌ　　ＤＥＡＥ−５ＰＷ　（２，１ｃ
ｍＸ　１５ｃｍ、東ソー社）に吸着させた。ＰＤ溶液中
０〜０．６Ｍの塩化ナトリウムリニアグラジェントにて
流速２．０ｄ／分、総容量４８０ｄで溶離した。上記の
操作を４回繰り返し、総タンパク質２．　８ｍｇ、総括
性２．５Ｕのエステラーゼ画分を得た。

得られたエステラーゼ画分をセントリカット１０（アミ
コン社）にて１−まで濃縮し、その５分の１量を５ＤＳ
−ポリアクリルアミド電気泳動（ゲルサイズ１３．８ｃ
ｍＸ１３．０ｃｍＸ０．２ｃｍ）に供した。泳動後、分
子量２９０００に相当するハンドを切り出し、ゲル容量
の１０倍量の１０ｍＭ炭酸水素アンモニウムに切り出し
たゲルを浸した。２４時間かけて該酵素を溶出し、総タ
ンパク質０．０８■、総括性１．６Ｕのほぼ１００％の
セファロスポリンＣアセチルエステラーゼを得た。精製
したセファロスポリンＣアセチルエステラーゼ１０μｇ
をｉ　ｏ　ｏ　’ｃで５分間処理し、直ちに水中で２、
冷した後、０．５μｇのトリプシン（約１１０　Ｕ／［
、ヘーリンガー・マンハイム社）を加え、３７°Ｃで１
２時間反応を行った。反応液をコスモシール５Ｃ８−３
００（４，６ｗｘ１５０ｍ）の高速液体クロマトグラフ
ィーにかけ、分解ペプチド断片を細分した。細分、回収
されたペプチド断片の内３種、および未分解セファロス
ポリンＣアセチルエステラーゼについて、そのＮ末端ア
ミノ酸配列を決定した。決定されたアミノ酸配列を下に
示す。

１　、　Ｘ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ　　（Ｎ末端）２、　Ｌｅｕ−Ａ
ｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｌ
ａ３、　Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｐｒ。

Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ａｓｐ４、　Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌ
ａ−５ｅｒ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ−ＡｓｎＸ：不明実施例３アクレモニウム・クリソゲナム由来のセファロスポリン
Ｃアセチルエステラーゼ遺伝子の単離（１）　　アクレ
モニウム・クリソゲナムの遺伝子ライブラリー作製アクレモニウム・クリソゲナムＩ　Ｓ−５株（微工研菌
寄第１１２３２号）の全ＤＮＡをジョンストン（１，Ｌ
、Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ　）らがアスペルギルス・ニデユ
ランスについて用いた方法（文献：　ＥＭＢＯＬ（１９
８５）　４．１３０７−１３１１）に準じて抽出した。

そして、この全ＤＮＡ約６０μｇをＭｂｏＩで部分消化
し、次いで、アルカリホスファターゼで処理した。一方
、ラムダベクターＥＭＢＬ３　（プロメカバイオチック
社）１０μｇをＢａｍＨＩとＥｃ。

ＲＩで完全に消化し、イソプロパツール沈澱により、短
いＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩリンカ一部分を除去した。次
いで、上記部分消化ＤＮＡ断片約１μｇとＢａｍＨＩ末
端を有するベクター約２μｇとをＴ４・リガーゼを用い
て連結せしめ、ラムダファージ粒子内へ封入した。こう
して得た組換えファージ懸濁液を適当に希釈し、ニジエ
リシア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ　）ＮＭ５９３　（プロメ
ガバイオチック社）に感染させ、出現するプラーク数を
計測した。その結果、この懸ｌｆＢ液は、３ＸＩ０５個
の組換えファージを含をすることが判明した。このファ
ージ液をアクレモニウム・クリソゲナムの遺伝子ライブ
ラリーとし、４°Ｃに保存した。なお、上述の供与体Ｄ
ＮＡおよびベクターの調製、そして、両者の結合等に関
する詳細な方法、条件は、フリラシャオフ（Ｆｒ１ｓｃ
ｈａｕｆ　）らが記載したものを採用した〔文献：ジャ
ーナル・オフ・モレキュラーバイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ　）（１９８３）　１７０．８２７−８４２
　）。また、ＤＮＡのラムダ粒子内への封入は、プロメ
ガバイオチック社のバンケイジングエクストラクトを用
い、それに添付されたプロトコールにしたがって行った
。

（２）プローブの作製実施例２で決定されたセファロスポリンＣアセチルエス
テラーゼ中のアミノ酸配列の内、下式１および２に示し
たアミノ酸配列を基にＤＮＡプローブを作製した。

式１　、　　Ｘ−Ｌｅｕ−Ｘ　　−Ａｓ　　−３ｅｒ−
Ｌ　　５−Ｌｅｕ−八１ａ−Ｔ　　ｒ式２．　Ｌｅｕ−
Ａｓｎ−Ａｓ　−Ｌ　５−Ｇｌ　−Ｐｈｅ−Ａｓ　−Ａ
ｌａ上弐上申１中線を施したアミノ酸配列から推定され
る遺伝子上の可能なりＮＡ塩基配列の内、これまでに塩
基配列の決定されているアクレモニウム・クリソゲナム
由来の遺伝子において殆ど使用されていないコドンを除
いて、オリゴヌクレオチド混合物を３種に分けて合成し
、ＥＳＴ　１、ＥＳＴ２およびＥＳＴ３と称した。ＥＳ
Ｔｌは１８ａ＋ｅｒ、１２８種のオリゴヌクレオチド混
合物、ＥＳＴ２およびＥＳＴ３は１８ｍｅｒ、６４種の
オリゴヌクレオチド混合物で、それぞれ下記の配列を有
する。

ＥＳＴｌ：ＧＡ　（ＴＣ）　ＴＣ（ＴＣ）　ＡＡ　（ＡＧ）　ＣＴ
　（ＴＣＡＧ）　ＧＣ（ＴＣＡＧ）　ＴＡＣＥＳＴ２　
：ＧＡ　（ＴＣ）　ＴＣＧＡＡ　（ＡＧ）　ＣＴ　（ＴＣ
ＡＧ）　ＧＣ（ＴＣＡＧ）　ＴＡＣＥＳＴ３　：ＧＡ　（ＴＣ）　ＡＧＣＡＭ　（ＡＧ）　ＣＴ　（ＴＣ
ＡＧ）　ＧＣ（ＴＣＡＧ）　ＴＡＣ括弧内の塩基は、塩
基の混合物を用いた場所を示す。

上式２中、下線を施したアミノ酸配列から推定される遺
伝子上の可能なりＮＡ塩基配列をすべて含むオリゴヌク
レオチド混合物を２種に分けて合成し、ＥＳＴ２１およ
びＥＳＴ２２と称した。ＥＳＴ２１およびＥＳＴ２２は
２Ｏｎ＋ｅｒ、６４種のオリゴヌクレオチド混合物で、
それぞれ下記の配列を有する。

ＥＳＴ２１　：へへ（ＴＣ）ＧＡ　（ＴＣ）へＡ（八Ｇ）ＧＧ　（ＴＣ
）ＴＴ　（ＴＣ）ＧＡ（ＴＣ）ＧＣＥＳＴ２２：ＡＡ　（ＴＣ）　ＧＡ　（ＴＣ）　ＡＡ　（ＡＧ）　Ｇ
Ｇ　（ＡＧ）　ＴＴ　（ＴＣ）　ＧＡ　（ＴＣ）　ＧＣ
括弧内の塩基は、塩基の混合物を用いた場所を示す。

上記のごとく得られたＥＳＴ　１、ＥＳＴ２、ＥＳＴ３
、ＥＳＴ２１、ＥＳＴ２２を各々マニアナイスの実装置
に記載された方法にしたがって、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼと７−３２Ｐ−ＡＴ　Ｐを用いてラヘルし、以
下に述べるハイブリダイゼーション実験に使用した。以
下、上記のごとくラヘルされたプローブを３２Ｐ−ＥＳ
Ｔｌ、３２ＰＥＳＴ２．３２　Ｐ−ＥＳＴ３．３２　Ｐ
−ＥＳＴ２１．３２　Ｐ−ＥＳＴ２２と称する。

（３）　　ハイブリダイゼーションによるスクリーニン
グ（１）で得られたファージ液（ＤＮＡライブラリー）の
一部をＬＥ３９２に怒染させ、９枚のプレート上に各々
２６００個のプラークを形成させた。

これらプラークをベントン（Ｂｅｎｔｏｎ　Ｗ、Ｄ、）
らの方法〔文献：　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９７７）　１
９６．１８０−１８２　）にしたがって、ニトロセルロ
ースフィルターに転写し、アルカリ変性、中和処理を行
い、ＤＮＡを固定した後、上記（２）で得た３　２　Ｐ
−ＥＳＴｌ、３２Ｐ−ＥＳＴ２もしくは３２Ｐ−ＥＳＴ
３とプレート３枚分ずつハイブリダイゼーションさせた
。

ハイブリダイゼーションは、５×デンハルツ、６ＸＳＥ
Ｔ、０．２％ＳＤＳ、Ｏ，１ｍｇ／ｄ変性サケ精子ＤＮ
Ａおよび終濃度Ｉ　Ｘ　１０Ｓｃｐｍ　／ｄで３２Ｐ−
ＥＳＴＩ、３２Ｐ−ＥＳＴ２もしくは３２Ｐ−ＥＳＴ３
を含有する溶液を用いて、４８°Ｃで２時間行った。次
いで、フィルターを６ＸＳＳＣ溶液中、室温で１０分間
洗浄し、５ｘＳＳＣ／ｇ液中４８゛Ｃで１０分間洗浄し
た。次いで、インテンシファイヤー・スクリーンを用い
て、−８０°Ｃで４８時間オートラジオグラフィーを行
った。その結果、３２Ｐ−ＥＳＴｌ、もしくは３２　Ｐ
−ＥＳＴ３とハイブリダイゼーションさせたものからは
陽性スポットは見いだされなかったが、３２ＰＥＳＴ２
とハイブリダイゼーションさせたものから６個の陽性ス
ポットが見出された。このうち、５個の陽性スポットに
相応する寒天領域よりファージを抽出し、再度上記の工
程にしたがってプラークハイブリダイゼーションを行い
、５個の純化ポジティブファージクローンを得た。これ
らのクローンをそれぞれλＥＳＴＣ１、λＥＳＴＣ２、
λＥＳＴＣ３、λＥＳＴＣ４、λＥＳＴＣ５と命名した
。

（４）セファロスポリンＣアセチルエステラーゼ遺伝子
のサブクローニングおよびその位置の限定（３）で得た
ファージクローン５種より、グロスバーガー（Ｇｒｏｓ
ｓｂｅｒｇｅｒ　）記載の方法〔文献：Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８７）　１５
．６７３７）にしたがってＤＮＡを抽出した。次いで、
このラムダＤＮＡをＢｇｌＩＩ、５ａｉｌで切断して、
アガロースゲル電気泳動を行った後、３２Ｐ−ＥＳＴ２
を用いてサザンハイプリダイゼーション（方法について
は文献：サザン（５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｌ（Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、）（１９７５）　９８．５０３−５１７）を
行った。なお、ハイブリダイゼーションおよびフィルタ
ー洗浄等は、（３）に記載したものと同様に行った。そ
の結果、ＢｇｌＩＩ切断物では、すべてのクローンに存
在する約６．５Ｋｂの断片のみが、５ａｌＩ切断物では
、すべてのクローンに存在する約１．４Ｋｂの断片のみ
が該プローブとハイブリダイズすることが判明した。ま
た、λＥＳＴＣ１のＤＮＡを５ａｃｌ。

Ｋｐｎ　Ｌ　Ｓｍａ　Ｉ、ＢａｍＨ１，、Ｘｂａ　１．
、ＰｓｔＩで切断してアガロースゲル電気泳動を行った
後、３２　Ｐ−ＥＳＴ２もしくは３２　Ｐ−ＥＳＴ２１
と３２　Ｐ−ＥＳＴ２２の混合物を用いてサザンハイプ
リダイゼーションを行った。その結果、いずれの制限酵
素切断物でも、３２　Ｐ−ＥＳＴ２を用いた場合と３２
Ｐ−ＥＳＴ２１と３２　Ｐ−ＥＳＴ２２の混合物を用い
た場合とで、同し大きさの断片にハイブリダイズするこ
とが判明した。そこで、３２　Ｐ−ＥＳＴ２とハイブリ
ダイズするＢｇｌＩＩ切断物である約６．５Ｋｂの断片
をシーンクリーン（ＧＥＮＥ　−ＣＬＥＡ、Ｎ”、　　
フナコシ社販）を用いて、その添付プロトコールにした
がって、アガロースゲルから回収、精製した。一方、ベ
クターとして用いるｐＵｃｌＢは、ＢａｍＨ［で切断し
た後、アルカリホスファターゼ処理を行った。次いで、
両者をＴ４−リガーゼにより連結し、マニアナイスの実
験書に記載の方法に準して、Ｅ、　Ｃｏ１１　ＪＭ１０
５に導入した。アンピシリン（１００μｇ／ｄ）　、５
−ブロム−４−クロル−３−インドリル−β−ガラクト
シド（０，００４％）を含有するＬ−ブロス寒天培地上
に生育してきた白色コロニーを６個選び、簡便法（マニ
アナイスの実験書）でプラスミドＤＮＡを抽出し、Ｋｐ
ｎＩもしくはＳａ　ｌ　［消化による解析を行い、目的
の断片と同じ大きさの断片が挿入されているクローンを
選択した。かくして得られたプラスミドの１つをｐＥｓ
ＴｌｏｌＬ、その逆向きに断片が挿入されているものを
ｐＥｓＴｌｏｌＲと命名した。

ｐＥｓＴｌｏｌＬのＫｐｎＩ消化による解析から、ｐＥ
ｓＴｌｏｌＬは３２Ｐ−ＥＳＴ２，３２ＰＥＳＴ２１お
よび３２Ｐ−ＥＳＴ２２の混合物とハイブリダイズする
λＥＳＴＣ１のＫｐｎｌ切断物である０、７Ｋｂの断片
をふ（むことが予想されたので、該断片の塩基配列をサ
ンガーらの方法に基づき決定した。塩基配列決定の具体
的実験手法は、タカラ（宝酒造社）のシーフェンシング
キットを用いて、その添付プロトコールにしたがって行
った。その結果、（２）弐１、式２のアミノ酸配列を同
一フレーム内にコードし得る塩基配列が存在し、また、
その箇所の配列はＥＳＴ２中の１種およびＥＳＴ２１中
の１種と一致していることが判明した。

ｐＥｓＴｌｏｌを種々の制限酵素で切断し、アガロース
ゲル電気泳動により解析した結果、第１図で示される６
、５Ｋｂインサートの制限酵素地図が得られた。

（５）セファロスポリンＣアセチルエステラーゼ遺伝子
の塩基配列上記Ｋｐｎｌ断片を内部に含む２６７４ｂｐの塩基配列
をサンガーらの方法に基づき決定した。

塩基配列決定の具体的実験手法は、タカラ（宝酒造社）
のシーフェンシングキットを用いて、その添付プロトコ
ールにしたがって行った。その結果、実施例２に示した
４つのアミノ酸配列を同一フレーム内にコードし得る塩
基配列が存在していることが判明した。

実施例４ｐＴＥＳＴ４の構築第３図に示す工程にしたがって、セファロスポリンＣア
セチルエステラーゼ遺伝子の付加コピーをアクレモニウ
ム・クリソゲナムに導入するためのプラスミドρＴＥＳ
Ｔ４を構築した。以下に該工程を説明する。まず、実施
例３−＜４＞で得たプラスミドｐＥｓＴｌｏＩＲをＥｃ
ｏＲＩと５ｃａｌで同時に消化した後、ＤＮＡポリメラ
ーゼクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）断片と４種のデオキシ
ヌクレオチド３リン酸を作用させ、切断端を平滑末端に
変換した。次いで、該反応液をアガロースゲル電気泳動
に供した後、セファロスポリンＣアセチルエステラーゼ
遺伝子を含む約２Ｋｂの断片をゲルから回収、精製した
。該断片とＳｍａ　Ｉで切断しアルカリホスファターゼ
処理を行ったｐＡＣＴＨＹ８３とを、Ｔ４−リガーゼで
連結することによりｐＴＥＳＴ４を得た。なお、上記工
程において、制限酵素消化により生ずるＤＮＡ断片の分
離精製、ＤＮＡ断片間の結合反応、該反応により生ずる
プラスミドによる大腸菌の形質転換、得られた形質転換
体からのプラスミドの調製およびその解析等の基本操作
は、実施例３ならびにマニアナイスの実験書に記載され
た方法に準して行った。また、本実施例において使用し
たプラスミドＩ）ＡＣＴＨＹ８３は、アクレモニウム・
クリソゲナム内で機能しうるハイグロマイシンＢホスホ
トランスフェラーゼ発現単位（アクレモニウム・クリソ
ゲナム由来アクチン遺伝子のプロモーターおよびターミ
ツ−ター、細菌由来のハイグロマイシンＢホスホトラン
スフェラーゼ遺伝子が発現に好適な配置で結合した発現
単位）を有するアクレモニウム・クリソゲナム形質転換
用ベクターであり、その造成法は、特願平２−１６６５
６６号に記載されている。

実施例５ｐＴＡＴＦｌによるアクレモニウム・クリソゲナムの形
質転換ｐＴＥＳＴ４をアクレモニウム・クリソゲナムＩ　Ｓ、
−５株に導入することにより、エステラーゼ活性が強化
された形質転換体を取得した。以下にその詳細を説明す
る。

（１）　　プロトプラストの調製ＣＭ固形培地上で３０°Ｃ５日間生育させたアクレモニ
ウム・クリソゲナムＩ　Ｓ−５の菌糸体を０Ｍ培地５０
ｄに接種し、回転式振とう機（２５０ｒ、ρ、ｖｌ）上
、３０°Ｃで３日間培養した。さらに、該菌液１−を５
０１ｄのＧＡＧ培地に接種して、３０°Ｃで２０時間培
養した。得られた培養液５０−を３５００ｒ、ｐ、ｍで
１０分間遠心し、菌糸体を沈澱させた後、０．９％のＮ
ａ　Ｃ１溶液で洗浄した。

０．０１Ｍジチオスレイトールを含んだマクイルベイン
緩衝液（０，１Ｍクエン酸、０．２Ｍリン酸ナトリウム
、ｐＨ７，３）２０ｄに懸濁し、３０°Ｃで１時間、お
だやかに振とうした。次いで、菌糸体を３２０　Ｏｒ、
ｐ、ｍ　１０分間の遠心で沈澱させ、Ｐ−ハソファーで
洗浄した後、ノボザイム（Ｎｏｖｏ社）を１０■／戚の
濃度で含有するＰバッファ−１０ｄに懸濁し、３０°Ｃ
で１時間おだやかに振とうした。該反応液を８０　Ｏｒ
、ｐ、ｌ１１で３０秒間遠心して得た上清を、濾紙（Ｔ
ＯＹＯＦＩＬＴＥＲＰＡＰＥＲ５Ａ　）を用いて濾過す
ることにより、菌糸体とプロトプラストを分離した。次
いで、該濾液を３０００　ｒ、ｐ、Ｉ＠で５分間遠心し
、プロトプラストを沈澱させた後、Ｐ−バッファーで１
回洗浄し、プロトプラストが３Ｘ１０ｆ１個／戚の濃度
となるようにＰ−バッファーに懸濁した。

（２）　　ｐ　Ｔ　Ｅ　Ｓ　Ｔ　４によるプロトプラス
ト形質転換上記（１）で得たプロトプラスト懸濁液０．１ｄに、ｐ
ＴＥＳＴ４を１０μｇ含む溶８１０μ！を加えた後、０
．０５ｄのＰＥＧ溶液を加え、かるく混合した。該混合
液を氷上に２５分間静置した後、同上のＰＥＧ溶液をＩ
Ｉｄ加えて、室温でさらに３０分間静置した。

かくして得られた形質転換プロトプラスト懸濁液を０．
２ｄずつ、プロトプラスト再生培地に〔文献（イソガイ
ら：　Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　１９８７．
５Ｌ２３２１−２３２９　）に記載されているＢＲＭ培
地〕を２５戚含有するプレート上に広げ、１５℃で２０
時間培養した。次いで、該プレートに４．５■のハイグ
ロマイシンＢを含み、５０°Ｃに保温した同上のＢＲＭ
培地５−を重層した後、２８°Ｃで１４日間培養した。

その結果、ハイグロマイシンＢに耐性となった形質転換
体（以下、ＨＹＢ形質転換体と略す）が７０株出現した
。

（３）エステラーゼ活性の検出セファロスポリンＣアセチルエステラーゼはアクレモニ
ウム・クリソゲナム培養液上清に存在するが、同上清に
は該酵素の基質であるセファロスポリンＣ１および生成
物であるデアセチルセファロスポリンＣが存在するため
に、両化合物を除去することなしに直接セファロスポリ
ンＣアセチルエステラーゼ活性を測定することは困難で
ある。

また、該酵素はセファロスポリンＣの類似化合物である
セファロチンにも作用し、デアセチルセファロチンを生
成する。したがって、セファロチンを基質としたエステ
ラーゼ活性を測定することにより、ｐＴＥＳＴ４による
形質転換体の該酵素量増加を推定することにした。

上記（２）で得たＨＹＢ形質転換体より２５株をうンダ
ムに選択し、その各々を２０μｇ／ｍｌのハイグロマイ
シンＢを含むＣＭ固形培地に接種し、室温で１４日間培
養した。その中から５株をランダムに選択し、ｌ５−５
　（ＴＥＳＴ４）１、Ｉｓ５　（ＴＥＳＴ４）２、ｌ５
−５　（ＴＥＳＴ４）３、ｌ５−５　（ＴＥＳＴ４）４
およびＩｓ−”＋　（ＴＥ。

５Ｔ４）５と命名した。その各々と親株であるｌ５−５
株をＣＭ固形培地に接種し、室温で３日間培養した。そ
の各々の生育した菌体をＮ−３シード培地５０ｄに接種
し、２５°Ｃで４日間振とう培養した（　２２０　ｒ、
ｐ、ｍ）。その各々の培養液２踵をメイン培地３０ｄに
接種し、７日間振とう培養した（２２　Ｏｒ、ｐ、ｍ）
。該培養液ｌＩｎ１を遠心分離により菌体を除去し、培
養液上清を得た。該培養液上清０．１２ｄと１Ｍリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）０．０４ｄ、１００■／
−セファロチン０．０４−を混合し、２５°Ｃで９０分
間反応させた後、メタノール０．２−を加えて反応を停
止した。該反応液を遠心分離して得られる上清を高速液
体クロマトグラフィーに供し、反応生成物であるデアセ
チルセファロチンを検出した。なお、高速液体クロマト
グラフィー〇カラムは、ＺＯＲＢＡＸ　　ＢＰＮＨ２カ
ラム（デュポン社、４．　５ｍｎＸ２５Ｃ１１）を用い
、移動相としては８％酢酸−４％メタノール−１２％ア
セトニトリル−７６％水からなる溶液を用いて、流速は
２ｄ／分、さらに検出波長は２５４　ｎｍで行った。そ
の結果、第１表に示したように、調べた５株中４株の形
質転換体に由来する培養液上清には、親株に由来する培
養液上清に存在する２倍以上のセファロチンを基質とす
るエステラーゼ活性が存在していた。また、培養液上清
中のセファロスポリンＣとデアセチルセファロスポリン
Ｃを定量するために、培養液上清を高速液体クロマトグ
ラフィーに供した。なお、高速液体クロマトグラフィー
のカラムはＺＯＲＢＡＸ−ＢＰＮＨ２カラム（デュポン
社、４．５ＢＸ２５ｃｍ）を用い、移動相としては４％
酢酸−４％メタノール−８％アセトニトリル−８４％水
からなる溶液を用いて、流速は２緘／分、さらに検出波
長は２５４　ｎｍで行った。その結果、第１表に示した
ように、調べた５株中４株の形質転換体に由来する培養
液上清には、親株に由来する培養液上清に存在する半分
以下のセファロスポリンＣしか存在しておらず、セファ
ロチンを基質とするエステラーゼ活性が高いほどデアセ
チルセファロスポリンＣ／セファロスポリンＣ比も高い
という関係があることが判明した。すなわち、この結果
は、本発明のＤＮＡ断片を使用することにより、アクレ
モニウム・クリソゲナム由来のセファロスポリンＣアセ
チルエステラーゼ活性を上昇させることが可能となるこ
とを示している。また、該結果は、上記２ＫｂのＥｃｏ
Ｒｌ−３ｃａｌ断片上にセファロスポリンＣアセチルエ
ステラーゼ遺伝子のプロモーター、タンパク質コード領
域ならびにターミネータ−が含まれていることを示唆し
ている。なお、反応１分間に１μ５ｏｌｅのセファロス
ポリンＣを生成する酵素量を１単位（Ｕ）と定め、培養
液上清１ＭＮ当たりの活性として第１表に示した。

第表Ｉｓ−５ＩＳ−５（ＴＥＳＴ４）ＩＩＳ−５（ＴＥＳＴ４）２ＩＳ−５（ＹＥＳＴ４）３Ｉｓ−５（ＴＥＳＴ４）４Ｉｓ−５（ＴＥＳＴ４）５７．１７．３２２．３３８．７２４．１７．９４１．５２．８３．０１１．５１２．０８．１４．５１９．４（発明の効果）実施例に開示したとおり、本発明のＤＮＡ断片を利用す
ることにより、セファロスポリンＣをデアセチルセファ
ロスポリンＣに変換する反応を触媒する酵素であるセフ
ァロスポリンＣアセチルエステラーゼの合成能が高まっ
た新規アクレモニウム・クリソゲナムを創製することが
可能となった。

該アクレモニウム・クリソゲナムを使用することにより
、デアセチルセファロスポリンＣ発酵生産の収率向上が
期待できる。また、本発明のＤＮＡ断片を利用してアク
レモニウム・クリソゲナム内に存在するセファロスポリ
ンＣアセチルエステラーゼ遺伝子を破壊することにより
、デアセチルセファロスポリンＣと共にセファロスポリ
ン系抗生物質の重要な出発原料となっているセファロス
ポリンＣを効率よく生産しうる新規アクレモニウム・ク
リソゲナムを創製することが可能となる。また、本発明
のＤＮＡ断片に含まれるセファロスポリンＣアセチルエ
ステラーゼ遺伝子のプロモーターならびにターミ♀−タ
一部分は、アクレモニウム・クリソゲナム用発現ベクタ
ーの構成要素として利用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はアクレモニウム・クリソゲナム由来のセファロ
スポリンＣアセチルエステラーゼＩ　転子を含むＤＮＡ
断片の制限酵素地図、第２図は第１図にわける下線部の
領域の塩基配列を示し、第３図はセファロスポリンＣア
セチルエステラーゼ遺伝子の付加コピーをアクレモニウ
ム・クリソゲナムに導入するためのブラスミ）”　ｐ　
Ｔ　Ｅ　Ｓ　Ｔ　４の構築方法を示す説明図である。（ほか１名）第１図ＪＭメ１−４配ろ−１」ン大】コＥミ１譚Ｕ＊第３図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アクレモニウム・クリソゲナム由来のセファロス
ポリンＣアセチルエステラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片
。
（２）第１図に示す制限酵素地図により規定される請求
項１記載のＤＮＡ断片。
（３）第１図における下線部の塩基配列が第２図で示さ
れる請求項２記載のＤＮＡ断片。（４）請求項１，２，
３記載のＤＮＡ断片をベクターに組み込んだ組換え体Ｄ
ＮＡ。