JPH02265494A - グリセロアルデヒド３燐酸脱水素酸素遺伝子プロモーターおよびその用途 - Google Patents
グリセロアルデヒド３燐酸脱水素酸素遺伝子プロモーターおよびその用途Info
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- JPH02265494A JPH02265494A JP1342278A JP34227889A JPH02265494A JP H02265494 A JPH02265494 A JP H02265494A JP 1342278 A JP1342278 A JP 1342278A JP 34227889 A JP34227889 A JP 34227889A JP H02265494 A JPH02265494 A JP H02265494A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
産業上の利用分野
本発明はアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅ＋ｍ
ｏｎｉｕｎ＋ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）から得られる
グリセロアルデヒド３燐酸脱水素酵素遺伝子（以下、Ｇ
ＬＤ遺伝子と略称することもある。）プロモーターおよ
びその用途に関する。 微生物学的にカビに分類されるアクレモニウム・クリソ
ゲナムは、多くの臨床上重要な半合成セフェム抗生物質
の製造に使用するセファロスポリンＣやデアセチルセフ
ァロスポリンＣの生産菌として広く使用され、工業的に
重要な微生物である。従って、アクレモニウム・クリソ
ゲナムに適用できる遺伝子操作技術の開発が強く望まれ
ており、それによりセファロスポリンＣやデアセチルセ
７アロスポリンＣなどの既知の抗生物質の生産性の向上
のみならず、新規な抗生物質やそれらの誘導体の生産へ
の利用が期待される。 従来の技術 カビを宿主とする遺伝子操作技術としては、アクレモニ
ウム・クリソゲナムを宿主とする形質転換法として、ハ
イグロマイシンＢ耐性遺伝子（ハイグロマイシンＢホス
フォトランスフェラーゼ遺伝子）を選択マーカーとして
持つ、組換えＤＮＡクローニングベクタープラスミドに
よるプロトプラスト形質転換法［Ｓ、Ｗ、Ｑｕｅｅｎｅ
ｒ ｅｔ ａｌ：Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ−１９８
５，アメリカン・ソサイエテイ・フォーφマイクロバイ
オロジー（Ａｍａｒｉｃａｎ ５ｏｃｉｅｔｙｆｏｒ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ） ｐ、４６８（１９８５）
参照］の報告がある。またアクレモニウム・クリソゲナ
ムの菌体内で異種遺伝子をより効率的に発現させる目的
で、アクレモニウム・クリソゲナムの染色体ＤＮＡから
クローン化した、β−イソプロピルマレート脱水素酵素
遺伝子のプロモーターおよび翻訳開始部位を含む領域を
利用した発現ベクターについて出願されている。（特願
昭６３−５３５０）発明が解決しようとする課題 しかしながら、アクレモニウム・クリソゲナムの菌体内
で異種遺伝子を強力に発現させるには、前者は、酵母由
来のプロモーターおよび翻訳開始部位が使われている点
で難があり、後者においても、アクレモニウム・クリソ
ゲナム由来のプロモーターおよび翻訳開始部位ではある
ものの、異種遺伝子を強力に発現させるには必ずしも十
分ではなく、さらにより強力なプロモーターおよび翻訳
開始部位が望まれている。 課題を解決するための手段 本発明者らは、アクレモニウム・クリソゲナムの染色体
ＤＮＡから解糖系酵素であるＧＬＤ遺伝子を含むＤＮＡ
をクローン化し、その遺伝子の構造を解析した結果、Ｇ
ＬＤ遺伝子のプロモーターおよび翻訳開始部位を含む領
域が、アクレモニウム・クリソゲナムを宿主として、強
力な発現ベクタープラスミドの構築に利用可能であるこ
とを見いだし、さらに研究を重ねた結果本発明を完成し
すなわち本発明は、（１）アクレモニウム・クリソゲナ
ムのグリセロアルデヒド３燐酸脱水素酵素遺伝子プロモ
ーター活性部分を有するＤＮＡフラグメント、（２）ア
クレモニウム・クリソゲナムのグリセロアルデヒド３燐
酸脱水素酵素遺伝子プロモーターを組み込んだプラスミ
ド、（３）アクレモニウム・クリソゲナムのグリセロア
ルデヒド３燐酸脱水素酵素遺伝子プロモーター部位の下
流にグリセロアルデヒド３燐酸脱水素酵素遺伝子翻訳開
始部位を組み込んだプラスミド、（４）プロモーターま
たは翻訳開始部位の下流に構造遺伝子を組み込んだ上記
（２）または（３）のプラスミド、（５）上記（４）の
プラスミドで形質転換したアクレモニウム・クリソゲナ
ム、（６）セファロスポリン類合成能を有する上記（５
）の形質転換体、および（７）上記（６）の形質転換体
を培地に培養して、培養物中にセファロスポリン類を生
成蓄積させることを特徴とするセファロスポリン類の製
造法に関する。 本発明において、アクレモニウム・クリソゲナムのＧＬ
Ｄ遺伝子のブロモ−ター活性部分、ＧＬＤ遺伝子翻訳開
始部位およびＧＬＤをコードする構造遺伝子を含むＤＮ
Ａ、すなわちＧＬＤ遺伝子ＤＮＡは、アクレモニウム・
クリソゲナム菌体から分離採取することができる。 該アクレモニウム・クリソゲナムの具体例としては、ア
クレモニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０株およ
びアクレモニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１４５５３株
等が挙げられる。該ＧＬＤ遺伝子をコードするＤＮＡは
、アクレモニウム・クリソゲナムの染色体ＤＮＡから得
ることができる。該染色体ＤＮＡの調製は、菌体から公
知の方法、たとえばビー・エフ・ハムリン（Ｐ、Ｆ。 １１ａｍｌｙｎ）らの方法［エンザイム・マイクロバイ
オロジカル・テクノロジー（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏ −ｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
’４．３２１ （１９８１）参照１あるいはこれに準じ
た方法によりプロトプラストを調製し、該プロトプラス
トから公知の方法、たとえばデイ−・アール・クライア
−（Ｄ、 Ｒ，Ｃｒｙｅｒ）らの方法［メソッド・イン
・セル・パイオロジ−（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅ１ｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ） ＩＩ［、３９（１９７５）参照１
あるいはこれに準じた方法により得ることができる。 染色体ＤＮＡからＧＬＤ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片を
クローニングするだめの、該ＤＮＡの検出手段としては
、ベクタープラスミドに挿入されたＤＮＡ断片上にＧＬ
Ｄ遺伝子の存在が確認できるものであれば、いかなるも
のであってもよく、たとえば宿主のＧＬＤ遺伝子欠損株
の相補性を利用する方法、既知である酵母またはバクテ
リアのＧＬＤ遺伝子またはその一部を放射能ラベルして
グローブとし、ハイブリダイゼーションによって検出す
る方法などを用いることができる。具体的には、ジエー
・ビー・ホーランド（Ｊ、 Ｐ、 Ｈｏ１ｌａｎｄ）ら
の報告［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、） ２５４．９８３９
（１９７９）参照］にもとづいて、サツカロミセス・
セレビシェ（ＳａｃｃｈａｒｏｌＩｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ） Ｉ Ｆ ＯＩ Ｏ１４７株からＧＬＤ
遺伝子をクローン化することにより、それをプローブと
して好適に用いることができる。 また宿主としては特に限定されないが、通常大腸菌が用
いられ、具体的には市販されているエシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｌ Ｅ ３９
２株
ｏｎｉｕｎ＋ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）から得られる
グリセロアルデヒド３燐酸脱水素酵素遺伝子（以下、Ｇ
ＬＤ遺伝子と略称することもある。）プロモーターおよ
びその用途に関する。 微生物学的にカビに分類されるアクレモニウム・クリソ
ゲナムは、多くの臨床上重要な半合成セフェム抗生物質
の製造に使用するセファロスポリンＣやデアセチルセフ
ァロスポリンＣの生産菌として広く使用され、工業的に
重要な微生物である。従って、アクレモニウム・クリソ
ゲナムに適用できる遺伝子操作技術の開発が強く望まれ
ており、それによりセファロスポリンＣやデアセチルセ
７アロスポリンＣなどの既知の抗生物質の生産性の向上
のみならず、新規な抗生物質やそれらの誘導体の生産へ
の利用が期待される。 従来の技術 カビを宿主とする遺伝子操作技術としては、アクレモニ
ウム・クリソゲナムを宿主とする形質転換法として、ハ
イグロマイシンＢ耐性遺伝子（ハイグロマイシンＢホス
フォトランスフェラーゼ遺伝子）を選択マーカーとして
持つ、組換えＤＮＡクローニングベクタープラスミドに
よるプロトプラスト形質転換法［Ｓ、Ｗ、Ｑｕｅｅｎｅ
ｒ ｅｔ ａｌ：Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ−１９８
５，アメリカン・ソサイエテイ・フォーφマイクロバイ
オロジー（Ａｍａｒｉｃａｎ ５ｏｃｉｅｔｙｆｏｒ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ） ｐ、４６８（１９８５）
参照］の報告がある。またアクレモニウム・クリソゲナ
ムの菌体内で異種遺伝子をより効率的に発現させる目的
で、アクレモニウム・クリソゲナムの染色体ＤＮＡから
クローン化した、β−イソプロピルマレート脱水素酵素
遺伝子のプロモーターおよび翻訳開始部位を含む領域を
利用した発現ベクターについて出願されている。（特願
昭６３−５３５０）発明が解決しようとする課題 しかしながら、アクレモニウム・クリソゲナムの菌体内
で異種遺伝子を強力に発現させるには、前者は、酵母由
来のプロモーターおよび翻訳開始部位が使われている点
で難があり、後者においても、アクレモニウム・クリソ
ゲナム由来のプロモーターおよび翻訳開始部位ではある
ものの、異種遺伝子を強力に発現させるには必ずしも十
分ではなく、さらにより強力なプロモーターおよび翻訳
開始部位が望まれている。 課題を解決するための手段 本発明者らは、アクレモニウム・クリソゲナムの染色体
ＤＮＡから解糖系酵素であるＧＬＤ遺伝子を含むＤＮＡ
をクローン化し、その遺伝子の構造を解析した結果、Ｇ
ＬＤ遺伝子のプロモーターおよび翻訳開始部位を含む領
域が、アクレモニウム・クリソゲナムを宿主として、強
力な発現ベクタープラスミドの構築に利用可能であるこ
とを見いだし、さらに研究を重ねた結果本発明を完成し
すなわち本発明は、（１）アクレモニウム・クリソゲナ
ムのグリセロアルデヒド３燐酸脱水素酵素遺伝子プロモ
ーター活性部分を有するＤＮＡフラグメント、（２）ア
クレモニウム・クリソゲナムのグリセロアルデヒド３燐
酸脱水素酵素遺伝子プロモーターを組み込んだプラスミ
ド、（３）アクレモニウム・クリソゲナムのグリセロア
ルデヒド３燐酸脱水素酵素遺伝子プロモーター部位の下
流にグリセロアルデヒド３燐酸脱水素酵素遺伝子翻訳開
始部位を組み込んだプラスミド、（４）プロモーターま
たは翻訳開始部位の下流に構造遺伝子を組み込んだ上記
（２）または（３）のプラスミド、（５）上記（４）の
プラスミドで形質転換したアクレモニウム・クリソゲナ
ム、（６）セファロスポリン類合成能を有する上記（５
）の形質転換体、および（７）上記（６）の形質転換体
を培地に培養して、培養物中にセファロスポリン類を生
成蓄積させることを特徴とするセファロスポリン類の製
造法に関する。 本発明において、アクレモニウム・クリソゲナムのＧＬ
Ｄ遺伝子のブロモ−ター活性部分、ＧＬＤ遺伝子翻訳開
始部位およびＧＬＤをコードする構造遺伝子を含むＤＮ
Ａ、すなわちＧＬＤ遺伝子ＤＮＡは、アクレモニウム・
クリソゲナム菌体から分離採取することができる。 該アクレモニウム・クリソゲナムの具体例としては、ア
クレモニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０株およ
びアクレモニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１４５５３株
等が挙げられる。該ＧＬＤ遺伝子をコードするＤＮＡは
、アクレモニウム・クリソゲナムの染色体ＤＮＡから得
ることができる。該染色体ＤＮＡの調製は、菌体から公
知の方法、たとえばビー・エフ・ハムリン（Ｐ、Ｆ。 １１ａｍｌｙｎ）らの方法［エンザイム・マイクロバイ
オロジカル・テクノロジー（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏ −ｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
’４．３２１ （１９８１）参照１あるいはこれに準じ
た方法によりプロトプラストを調製し、該プロトプラス
トから公知の方法、たとえばデイ−・アール・クライア
−（Ｄ、 Ｒ，Ｃｒｙｅｒ）らの方法［メソッド・イン
・セル・パイオロジ−（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅ１ｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ） ＩＩ［、３９（１９７５）参照１
あるいはこれに準じた方法により得ることができる。 染色体ＤＮＡからＧＬＤ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片を
クローニングするだめの、該ＤＮＡの検出手段としては
、ベクタープラスミドに挿入されたＤＮＡ断片上にＧＬ
Ｄ遺伝子の存在が確認できるものであれば、いかなるも
のであってもよく、たとえば宿主のＧＬＤ遺伝子欠損株
の相補性を利用する方法、既知である酵母またはバクテ
リアのＧＬＤ遺伝子またはその一部を放射能ラベルして
グローブとし、ハイブリダイゼーションによって検出す
る方法などを用いることができる。具体的には、ジエー
・ビー・ホーランド（Ｊ、 Ｐ、 Ｈｏ１ｌａｎｄ）ら
の報告［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、） ２５４．９８３９
（１９７９）参照］にもとづいて、サツカロミセス・
セレビシェ（ＳａｃｃｈａｒｏｌＩｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ） Ｉ Ｆ ＯＩ Ｏ１４７株からＧＬＤ
遺伝子をクローン化することにより、それをプローブと
して好適に用いることができる。 また宿主としては特に限定されないが、通常大腸菌が用
いられ、具体的には市販されているエシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｌ Ｅ ３９
２株
【ストラタジーン・クローニング書システム（ＳＴ
ＲＡＴＡＧＥＮＥ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）社
製、Ｌ７ＳＡ］が好ましい。ベクターとしては、大腸菌
に導入しうるものであればいかなるものであっても差し
支えないが、ｐＢＲ３２２，ｐＵｃ １８． ｐＵＣ
１９などのプラスミドベクターや、λフアージベクター
などが好んで用いられる。具体的には、市販のＬａｍｂ
ｄａ ＦＩＸ ［ストラタジーン・クローニング・シス
テム（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ Ｃｌｏｎｉｎｇ ５ｙｓ
ｔｅ＋ｎ）社製、ＵＳＡＩなどが例示される。 染色体ＤＮＡ断片をベクターに挿入するには、染色体Ｄ
ＮＡを適当な制限酵素を用いて切断、もしくは部分切断
し、一方ベクターＤＮＡを染色体ＤＮＡの切断に用いた
ものと同じ制限酵素、もしくは切断された染色体ＤＮＡ
と連結可能な切断点を生じさせうる制限酵素を用いて切
断したのち、両者をＤＮＡリガーゼの作用により連結し
て、ベクターＤＮＡに染色体ＤＮＡ断片を挿入した組換
え体ＤＮＡとすればよい。 該組換え体ＤＮＡを宿主に導入するためには、公知の方
法を用いればよく、たとえばプラスミドをベクターとし
て用いた場合は、コンピテントセル法を用いればよく、
λフアージベクターを用いた場合は、インビトロ・バッ
ケイジング法を用いればよい。具体的には、染色体ＤＮ
Ａが組み込まれたＬａｍｂｄａ ＦＩＸを市販のインビ
トロ・バッケイジングキット〔例えば、Ｇｉｇａｐａｃ
ｋ ｇｏｌｄ、ストラタジーン・クローニング・システ
ム（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＣｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅ
ｍ）社製、ＵＳＡＩを用いてインビトロ・バッケイジン
グした後、大腸菌宿主に感染させ、プラークを形成させ
ればよい。目的とするＧＬＤ遺伝子を含むλフアージベ
クターを検出するには、上記サツカロミセス・セレビシ
ェ由来のＧＬＤ遺伝子をグローブとするプラークハイブ
リダイゼーション法によるのが適切である。ハイブリダ
イズすることが認められたプラークからλ７アージを通
常の方法で回収し、それを用いてプラークハイブリダイ
ゼーションの操作を数回繰り返すことにより、ＧＬＤ遺
伝子を含む染色体ＤＮＡ断片が挿入されたλフアージベ
クターを分離することができる。このλ７アージからλ
ＤＮＡを分離し、適当な制限酵素で切断後、ベクタープ
ラスミドにサブクローニングすることができる。サブク
ローニングした染色体ＤＮＡとサツカロミセス・セレビ
シェ由来のＧＬＤ遺伝子がハイブリダイズするか否かを
調べることによりＧＬＤ遺伝子のおおよその位置と大き
さを知ることができる。 これら一連の基本操作は公知であり、文献［メソッズ・
イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ） ６８巻、 １９７９年、モレキュラ
ー・クロニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
） 、 １９８２年］に詳細に記載されている。 ＧＬＤ遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列は、公知の
方法、例えばジデオキシ合成鎖停止法〔添田栄−ら著、
「核酸の塩基配列決定法」第６１〜１１３頁、学会出版
センター、１９８５年、参照］およびＭａｘａｍ−Ｇｉ
ＩｂｅｒＬ法［プロシーデインダス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ
・ユナイテッド・スティソ・オプ・アメリカ（Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ ｏｒ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａ
ｃａｄｅｍｙｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｕｎｉＬｓｄ ５ｔａｔｅｓ ｏｒ Ａｍｅｒｉｃａ）
、７４．５４６３ （１９７７）参照１あるいはそれら
に準じた方法に従って決定できる。決定したＤＮＡ塩基
配列中におけるＧＬＤ遺伝子の正確な位置、ＧＬＤ遺伝
子のプロモーターおよび翻訳開始部位は、その解析から
容易に知ることができる。第５図に、後述する実施例３
で得られたアクレモニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１
５５０由来のＧＬＤのＤＮＡ塩基配列を示す。塩基番号
１２３３のＡＴＧが開始コドンで、その上流の非翻訳領
域に真核生物のプロモーターの共通配列であるＴＡＴＡ
配列［Ｐｒｏｕｄ ｒｏｏ ｔ 、ネイチ＋ −（Ｎａ
ｔｕｒｅ） 、２７９．（１９７９）参照］と類似した
ＴＡＴＴＡ （塩基番号９１１〜９１５）が存在する。 またその上流には、同様の共通配列であるＣＡＡＴ配列
［ＢｒｅａＬｈｎａｃｈ、 ＲａｎｄＣｈａｍｂｏｎ、
Ｐ、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリ
ー（Ａｎｎｕ、 Ｒｅｖ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）￥２．
（１９８１）参照］と類似したＣＧＡＴＴＣＴ （塩基
番号８４２〜８４９）が存在する。このことから第５図
の塩基番号ｌから開始コドン（塩基番号１２３３）まで
のＤＮＡ断片がＧＬＤ遺伝子のプロモーターおよび翻訳
開始部位を含んだＤＮＡ断片として例示されるが、プロ
モーターの機能が失われない限りは、塩基番号１から一
部のＤＮＡ断片を欠失させても差し支えない。またプロ
モーターおよび翻訳開始部位の機能を変化させるように
、例えば発現力が増加するようにプロモーターおよび翻
訳開始部位を含む領域のＤＮＡ塩基配列を改変したもの
であっても好都合に用いることができるし、プロモータ
ーおよび翻訳開始部位の機能に関係しない領域のＤＮＡ
塩基配列を改変させて用いることも可能である。 本発明のＧＬＤ遺伝子プロモーターおよび翻訳開始部位
を用いての、目的とする遺伝子の発現は、該ＧＬＤ遺伝
子のフレームと目的とする遺伝子のフレームとが一致す
るように融合遺伝子を作製することにより行われる。該
目的とする遺伝子としては、例えばセファロスポリン類
合成系に関与する酵素（例、イソペニシリンＮシンセタ
ーゼ、イソペニシリンＮイソメラーゼ、デアセトキシセ
ファロスポリンＣシンセターゼ（エキスパンダーゼ）。 デアセトキシセファ０スポリンＣヒドロキシラーゼ、デ
アセチルセファロスポリンＣアセチルトランスフェラー
ゼ、セファロスポリンＣアセチルヒドロラーゼ等）遺伝
子が挙げられる。また、該セファロスポリン類としては
、具体的に例示するとイソペニシリンＮ、ペニシリンＮ
、デアセトキシセファ０スポリンＣ，デアセチルセファ
ロスポリンＣおよびセファロスポリンＣ等が挙げられる
。 両遺伝子を融合させる位置は、発現しＩ；融合遺伝子産
物が目的とする活性を保持するものであれば、ＧＬＤ遺
伝子の開始コドンから一部のアミノ酸コドンの直後に融
合タンパク質として発現するように連結してもよく、ま
た開始コドンの直後に直接連結してもよい。 発現に使用される遺伝子は、染色体から単離された遺伝
子、ｍ ＲＮ Ａから得られた相補ＤＮＡ。 化学合成遺伝子、半合成遺伝子などいかなるものであっ
てもよいが、好ましくはＤＮＡ塩基配列の明らかなもの
がよい。ＯＬＤ遺伝子との融合遺伝子を作製するときに
融合遺伝子産物が目的とする活性を保持するなら、アミ
ノ基末端から一部のアミノ酸に相当するＤＮＡを除いて
もよい。 両遺伝子を融合させる一連の基本操作は公知であり、文
献［メソッズ・イン・エンサイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ） ６８巻１９７９年
、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、 １９８２年１に詳細に記載されて
いる。また両遺伝子を連結する場合、両遺伝子間にアダ
プターＤＮＡとして合成りＮＡを用いることもできる。 該合成りＮＡとしては、両遺伝子のフレームが一致し、
目的とする遺伝子の活性が失われないものであればいか
なるものでもよい。具体的には、該ＧＬＤ遺伝子の開始
コドンの上流に位置する５ａｕ３Ａ１部位から開始コド
ンを含み、目的とする遺伝子の開始コドンの下流に位置
する適当な制限酵素部位までの合成二本鎖ＤＮＡが、ア
ダプターＤＮＡとして例示される。その一般的な構造を
第１図に示す。 上記のようにして作製した、ＧＬＤ遺伝子プロモーター
および翻訳開始部位をコードする領域の下流に、ＧＬＤ
構造遺伝子と融合するように連結した目的遺伝子を、ア
クレモニウム・クリソゲナムに導入するための宿主とし
ては、アクレモニウム・クリソゲナムに属する菌であれ
ばいかなるものでもよく、その具体例としては、アクレ
モニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０株、アクレ
モニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１４５５３株、アクレ
モニウム・クリソゲナムＮ２株、およびそれらの株から
得られた変異株等が挙げられる。 上記アクレモニウム・クリソゲナムＮ２株は、昭和６３
年１２月１４日に財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託
番号ＩＦＧ ３２１７７として、また本微生物は昭和
６３年１２月２３日にブタペスト条約に基づき通商産業
省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−２２０４として寄託されている。 なお本明細書において、ＩＦＯ番号はＩＦＯにおける寄
託番号を、ＡＴＣＣ番号はアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション［Ａｍｅｒ １ｃａｎＴｙｐｅ Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏｌ １ｅｃＬｉｏｎ （Ａ Ｔ Ｃ
Ｃ）＋ １２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ Ｒ
ｏｃｋｖｉｌ＋ｅ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２］
における寄託番号を示すものとする。 アクレモニウム・クリソゲナムに遺伝子を導入する形質
転換法としては、例えばプロトプラスト形質転換法［Ｓ
、 Ｗ、 Ｑｕｅｅｎｅｒ ａｔ ａｌ：Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ１９８５、アメリカン・ソサイエテイ・フ
ォー・マイクロバイオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ ５ｏ
ｃｉｅｔｙ ｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ） ｐ、
４６８ （１９８５）参照］が挙げられる。 また形質転換株を効率よく分離するために、アクレモニ
ウム・クリソゲナム内で機能する適当な選択マーカー遺
伝子を持つプラスミドに該融合遺伝子を挿入した後、該
プラスミドでアクレモニウム・クリソゲナムを形質転換
してもよい。該選択マーカー遺伝子としては、形質転換
株を選択的に分離できるものならいかなるものでもよく
、その具体例としては、プラスミドｐＧＨ２１（第１５
図参照）に含まれるＧＬＤ−ハイグロマイシンＢ耐性遺
伝子が例示される。 本発明において用いられるセファロスポリン類合成能を
有する形質転換株の培養に際しては、形質転換株が同化
しうる炭素源および資化しうる窒素源等を含有する培地
が用いられる。炭素源としては、該形質転換株が同化し
うるものであれば何テモヨく、例えばグルコース、シェ
ーク０−ス、澱粉、可溶性澱粉、グリセリン、ｎ−パラ
フィンなどのほか、酢酸、７マール酸、安息香酸などの
有機酸類、エタノール、ブタノールなどのアルコール類
、油脂類（例、大豆油、ラード油）などが単独でまたは
混合して用いられる。また窒素源としては例えばペプト
ン、大豆油、肉エキス、綿実粉、乾燥酵母、酵母エキス
、コーン・ステイープ・リカー、プロア０、コーングル
テンミール、尿素、アンモニウム塩類（例、塩化アンモ
ニウム）、硝酸塩類（例、硝酸カリウム）、その他有機
または無機の窒素含有物（例、ＮＺアミン（Ａ）、硫安
）が単独でまたは混合して用いられる。その他培地成分
の無機塩としては、各種リン酸塩（例、リン酸カリウム
）、硫厳塩（例、硫酸ナトリウム）、塩酸塩（例、塩化
マグネシウム）などが用いられる。鉄、マグネシウム、
カルシウム、マンガン、コバルトなどの各イオンの添加
は菌の成育およびセファロスポリン系抗生物質の生産、
安定性などに関係が深い。 これら使用する培地原料は使用する菌株、培養に利用す
る条件などに応じて適宜に組合わせ、もしくは選択され
うる。 実際の培養にあたっての培養温度、培養期間、培地のｐ
Ｈ，通気撹拌などの培養条件は使用する菌株、培地組織
などによって一定しないが、目的とするセファロスポリ
ン類の蓄積量が最大になるように選択調節されればよい
。多くの場合、培養温度は、２０〜３０℃、培養期間は
４〜１４日、培地のｐＨは５．θ〜９．０で好気的に培
養を行なうと、培養液中のセファロスポリン類の蓄積は
最高に達する。 培養の結果得られた培養液中にはセファロスポリン類が
生成蓄積される。セファロスポリン類の大部分は培養ろ
液中に存在するので、培養液を遠心分離あるいはろ過に
より菌体を除去した液体部分からこれを得るのがよい。 セファロスポリン類を分別採取するには、公知の方法、
たとえば弱酸性有機物の一般的な分別採取法が準用でき
る。すなわちイオン交換樹脂（例、アンバーライトＩＲ
Ａ−９００）、活性炭、セルロース、シリカゲルなどを
用いるクロマトグラフィーあるいはゲルろ適法などを組
み合わせことにより有利に目的物を採取することができ
る。なおセファロスポリン類の定量には薄層クロマトグ
ラフィーで各成分を分離後、被検菌に対する抗菌力を測
定する方法、またはネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２４
６巻、１５４頁（１９７３）に記載されているセファロ
スポリナーゼを用いる方法が採用される。またセファロ
スポリン類の同定には元素分析、核磁気共鳴スペクトル
、ろ低電気泳動、薄層クロマトグラフィーなどが採用さ
れる。 犬ｍ男 以下に実施例をもって、本発明の内容をより具体的に説
明するが、これらはいずれも本発明の内容を例示するも
のにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。 なお、実施例における％（パーセント）は特にことわり
のない限り重量％を示すものとする。 実施例１ サツカロミセス・セレビシェのＧＬＤ遺伝子
のクローニング ｌ）サツカロミセス・セレビシェの染色体ＤＮＡの調製 サツカロミセス・セレビシェＩ Ｆ ０ １０１４７の
凍結保存菌体をＹＰＤ培地（酵母エキスｌｏｇ／ｆｆ。 ポリペブト７２０ｇ／（１、グルコ−２２０ｇ／ ｆｆ
）、Ｈｌに接種して回転式振盪機（２００ｒｐｍ）上で
、３０℃、１８時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ、
５分）により得られた菌体からり、 Ｒ，Ｃｒｙｅｒ
らの方法［メソッド・イン・セル・バイオロジー（Ｍｅ
ｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ｘｎ、
３９（１９７５）参照］に従い、約５ ｍｇノ染色体
ＤＮＡを得た。 ２）ＧＬＤ遺伝子検索グローブの調製 Ｊ、 Ｐ、 Ｈｏ１ｌａｎｄの報告［ジャーナル・オブ
φバイオロジカル・ケミストリーＱ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、）、乙ｉ４．９８３９（１９７９）参照］をもと
に、第２図に示すＤＮＡオリゴマーを調製した。 ３）サツカロミセス・セレビシェのシーンライブラリ（
ｇｅｎｅ １ｉｂｒａｒｙ）の作製上記１）項で得た染
色体ＤＮＡ３０μｇに５．４ユニツトの制限酵素Ｍｂｏ
ｌを３７℃で２０分間作用させ部分切断した後、ｄＡＴ
ＰとｄＧＴＰの存在下でＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｉ ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（宝酒造製、日本
）を作用させた。これと７フージベクターλＦｉｘのＸ
ｈｏｌ切断断片、ｐａｒｔｉａｌ ｆｉｌｌ−ｉｎアー
ム（ストラタジーンクローニングシステム社製、ＵＳＡ
）とをＴ ４ Ｄ Ｎ Ａ ｌｉｇａｓｅにより連結し
た。この連結反応液をＧｉｇａｐａｋ ｇｏｌｄ（スト
ラタジーンクローニングシステム社製、ＵＳＡ）を用い
て、ｉｎ ｖｉｔｒ。 ｐａｃｋａｇ ｉｎｇを行なった。以上のようにして作
製したシーンライブラリのタイターは、指示細菌として
大腸菌ＬＥ３９２を用いて調べた結果、１−ＯＸＩＯ＠
ｐｒｕ／１Ｍｌであった。 ４）シーンライブラリからのＧＬＤ遺伝子のスクリーニ
ング 上記３）項で作製したシーンライブラリをプレートあた
り６０００個のプラークが出現するように希釈しＩ；の
ち、指示細菌として大腸菌ＬＥ３９２を用いてプレート
上にプラークを出現させた。このプレートから前記「モ
レキュラー・クローニング」の第３２０〜３２１頁に記
載の方法に従ってプラークを、。 ニトロセルロースフィルターにリフトした。前記、［モ
レキュラー・クローニング」、第３９６頁記載の方法で
第１図のＤＮＡオリゴマーの５′末端をＴ４ポリヌクレ
オチド・キナーゼ、［γ−３！ｐｌＡＴＰを用いてＰで
放射能ラベルした。これをプローブとして、プラーク１
ハイブリダイゼーシヨン（前記、「モレキュラー争クロ
ーニング」、第３２６〜３２８頁参照）を行なった。プ
ローブとハイブリダイズが認められたポジティブプラー
クから（前記、「モレキュラー・クローニングＪ 、第
３７１〜３７２頁記載の方法に従いλＤＮＡを分離した
。得られたλＤＮＡを、制限酵素Ｈ４ｎｄｌｌ！で切断
したのち、アガロースゲル（０，８％）電気泳動した。 この電気泳動ゲルから、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）法
（前記、「モレキュラー・クローニング」、第３８２〜
３８６頁参照）により、ニトロセルロースフィルターに
ＤＮＡを転写した。１！Ｐでラベルした第１図のＤＮＡ
オリゴマーと、上記ＤＮＡ結合ニトロセルロースフィル
ターのサザン雑種形成（前記、［モレキュラー・クロー
ニング」、第３８７〜３８９頁参照）を行なった。その
結果、２．３ＫｂｐのＨｉｎｄＩ［［断片とハイブリダ
イズが認められた。 ５）Ｃ，ＬＤ遺伝子のサブクローニング上記４）項で得
たλＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ［で切断したのち、
２．３ｋｂｐのＨｉｎｄＩ［Ｉ切断をアガロースゲル（
１６０％）電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニ
ング」、第１５０〜１６２頁参照）および電気泳動溶出
法（高木康敬著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講
談社すイエンティフイク、１９８２年、参照）により単
離した。一方ベクタープラスミドｐＵｃ１８を制限酵素
ＨｉｎｄＩＩｌで切断した。このようにして得られた２
種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結
反応を行なっｔ；。この連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ
１０９株を形質転換することにより、ｐＵｃ１８のＨｉ
ｎｄＩ［＋サイトに２．３ｋｂｐのＨｉｎｄｌＩｌ断片
（サツカロミセス・セレビシェのＧＬＤ遺伝子を含む）
が挿入されたプラスミドｐＧＬＤ１９（第３図参照）を
得た。 実施例２ アクレモニウム・クリソゲナムのＧＬＤ遺伝
子のクローニング １）アクレモニウム・クリソゲナムの染色体ＤＮＡの調
製 アクレモニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０株の
凍結保存菌体をサッカロース３０ｇ／Ｑ、肉エキス１５
ｇ／１２、コーン・ステイープ・リカー５ｇ／１２、Ｃ
ａＣＯ５１−５ｇ／（ｉを含む培地（ｐＨ７，０）に接
種し、２８°０で４８時間、回転式振盪機（２０Ｏｒｐ
ｍ）上で培養する。 培養液１１２をろ別して得られる菌体から、Ｐ、 Ｆ。 １１ａｍｌｙｎらの方法［エンザイム・マイクロバイオ
ロジカル・テクノロジー（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） ３．３２
１（１９８１）参照】に従ってプロトゲラストを調製し
た。得られたプロトプラストからり、 Ｒ，Ｃｒｙｅｒ
らの方法
ＲＡＴＡＧＥＮＥ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）社
製、Ｌ７ＳＡ］が好ましい。ベクターとしては、大腸菌
に導入しうるものであればいかなるものであっても差し
支えないが、ｐＢＲ３２２，ｐＵｃ １８． ｐＵＣ
１９などのプラスミドベクターや、λフアージベクター
などが好んで用いられる。具体的には、市販のＬａｍｂ
ｄａ ＦＩＸ ［ストラタジーン・クローニング・シス
テム（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ Ｃｌｏｎｉｎｇ ５ｙｓ
ｔｅ＋ｎ）社製、ＵＳＡＩなどが例示される。 染色体ＤＮＡ断片をベクターに挿入するには、染色体Ｄ
ＮＡを適当な制限酵素を用いて切断、もしくは部分切断
し、一方ベクターＤＮＡを染色体ＤＮＡの切断に用いた
ものと同じ制限酵素、もしくは切断された染色体ＤＮＡ
と連結可能な切断点を生じさせうる制限酵素を用いて切
断したのち、両者をＤＮＡリガーゼの作用により連結し
て、ベクターＤＮＡに染色体ＤＮＡ断片を挿入した組換
え体ＤＮＡとすればよい。 該組換え体ＤＮＡを宿主に導入するためには、公知の方
法を用いればよく、たとえばプラスミドをベクターとし
て用いた場合は、コンピテントセル法を用いればよく、
λフアージベクターを用いた場合は、インビトロ・バッ
ケイジング法を用いればよい。具体的には、染色体ＤＮ
Ａが組み込まれたＬａｍｂｄａ ＦＩＸを市販のインビ
トロ・バッケイジングキット〔例えば、Ｇｉｇａｐａｃ
ｋ ｇｏｌｄ、ストラタジーン・クローニング・システ
ム（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＣｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅ
ｍ）社製、ＵＳＡＩを用いてインビトロ・バッケイジン
グした後、大腸菌宿主に感染させ、プラークを形成させ
ればよい。目的とするＧＬＤ遺伝子を含むλフアージベ
クターを検出するには、上記サツカロミセス・セレビシ
ェ由来のＧＬＤ遺伝子をグローブとするプラークハイブ
リダイゼーション法によるのが適切である。ハイブリダ
イズすることが認められたプラークからλ７アージを通
常の方法で回収し、それを用いてプラークハイブリダイ
ゼーションの操作を数回繰り返すことにより、ＧＬＤ遺
伝子を含む染色体ＤＮＡ断片が挿入されたλフアージベ
クターを分離することができる。このλ７アージからλ
ＤＮＡを分離し、適当な制限酵素で切断後、ベクタープ
ラスミドにサブクローニングすることができる。サブク
ローニングした染色体ＤＮＡとサツカロミセス・セレビ
シェ由来のＧＬＤ遺伝子がハイブリダイズするか否かを
調べることによりＧＬＤ遺伝子のおおよその位置と大き
さを知ることができる。 これら一連の基本操作は公知であり、文献［メソッズ・
イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ） ６８巻、 １９７９年、モレキュラ
ー・クロニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
） 、 １９８２年］に詳細に記載されている。 ＧＬＤ遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列は、公知の
方法、例えばジデオキシ合成鎖停止法〔添田栄−ら著、
「核酸の塩基配列決定法」第６１〜１１３頁、学会出版
センター、１９８５年、参照］およびＭａｘａｍ−Ｇｉ
ＩｂｅｒＬ法［プロシーデインダス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ
・ユナイテッド・スティソ・オプ・アメリカ（Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ ｏｒ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａ
ｃａｄｅｍｙｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｕｎｉＬｓｄ ５ｔａｔｅｓ ｏｒ Ａｍｅｒｉｃａ）
、７４．５４６３ （１９７７）参照１あるいはそれら
に準じた方法に従って決定できる。決定したＤＮＡ塩基
配列中におけるＧＬＤ遺伝子の正確な位置、ＧＬＤ遺伝
子のプロモーターおよび翻訳開始部位は、その解析から
容易に知ることができる。第５図に、後述する実施例３
で得られたアクレモニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１
５５０由来のＧＬＤのＤＮＡ塩基配列を示す。塩基番号
１２３３のＡＴＧが開始コドンで、その上流の非翻訳領
域に真核生物のプロモーターの共通配列であるＴＡＴＡ
配列［Ｐｒｏｕｄ ｒｏｏ ｔ 、ネイチ＋ −（Ｎａ
ｔｕｒｅ） 、２７９．（１９７９）参照］と類似した
ＴＡＴＴＡ （塩基番号９１１〜９１５）が存在する。 またその上流には、同様の共通配列であるＣＡＡＴ配列
［ＢｒｅａＬｈｎａｃｈ、 ＲａｎｄＣｈａｍｂｏｎ、
Ｐ、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリ
ー（Ａｎｎｕ、 Ｒｅｖ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）￥２．
（１９８１）参照］と類似したＣＧＡＴＴＣＴ （塩基
番号８４２〜８４９）が存在する。このことから第５図
の塩基番号ｌから開始コドン（塩基番号１２３３）まで
のＤＮＡ断片がＧＬＤ遺伝子のプロモーターおよび翻訳
開始部位を含んだＤＮＡ断片として例示されるが、プロ
モーターの機能が失われない限りは、塩基番号１から一
部のＤＮＡ断片を欠失させても差し支えない。またプロ
モーターおよび翻訳開始部位の機能を変化させるように
、例えば発現力が増加するようにプロモーターおよび翻
訳開始部位を含む領域のＤＮＡ塩基配列を改変したもの
であっても好都合に用いることができるし、プロモータ
ーおよび翻訳開始部位の機能に関係しない領域のＤＮＡ
塩基配列を改変させて用いることも可能である。 本発明のＧＬＤ遺伝子プロモーターおよび翻訳開始部位
を用いての、目的とする遺伝子の発現は、該ＧＬＤ遺伝
子のフレームと目的とする遺伝子のフレームとが一致す
るように融合遺伝子を作製することにより行われる。該
目的とする遺伝子としては、例えばセファロスポリン類
合成系に関与する酵素（例、イソペニシリンＮシンセタ
ーゼ、イソペニシリンＮイソメラーゼ、デアセトキシセ
ファロスポリンＣシンセターゼ（エキスパンダーゼ）。 デアセトキシセファ０スポリンＣヒドロキシラーゼ、デ
アセチルセファロスポリンＣアセチルトランスフェラー
ゼ、セファロスポリンＣアセチルヒドロラーゼ等）遺伝
子が挙げられる。また、該セファロスポリン類としては
、具体的に例示するとイソペニシリンＮ、ペニシリンＮ
、デアセトキシセファ０スポリンＣ，デアセチルセファ
ロスポリンＣおよびセファロスポリンＣ等が挙げられる
。 両遺伝子を融合させる位置は、発現しＩ；融合遺伝子産
物が目的とする活性を保持するものであれば、ＧＬＤ遺
伝子の開始コドンから一部のアミノ酸コドンの直後に融
合タンパク質として発現するように連結してもよく、ま
た開始コドンの直後に直接連結してもよい。 発現に使用される遺伝子は、染色体から単離された遺伝
子、ｍ ＲＮ Ａから得られた相補ＤＮＡ。 化学合成遺伝子、半合成遺伝子などいかなるものであっ
てもよいが、好ましくはＤＮＡ塩基配列の明らかなもの
がよい。ＯＬＤ遺伝子との融合遺伝子を作製するときに
融合遺伝子産物が目的とする活性を保持するなら、アミ
ノ基末端から一部のアミノ酸に相当するＤＮＡを除いて
もよい。 両遺伝子を融合させる一連の基本操作は公知であり、文
献［メソッズ・イン・エンサイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ） ６８巻１９７９年
、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、 １９８２年１に詳細に記載されて
いる。また両遺伝子を連結する場合、両遺伝子間にアダ
プターＤＮＡとして合成りＮＡを用いることもできる。 該合成りＮＡとしては、両遺伝子のフレームが一致し、
目的とする遺伝子の活性が失われないものであればいか
なるものでもよい。具体的には、該ＧＬＤ遺伝子の開始
コドンの上流に位置する５ａｕ３Ａ１部位から開始コド
ンを含み、目的とする遺伝子の開始コドンの下流に位置
する適当な制限酵素部位までの合成二本鎖ＤＮＡが、ア
ダプターＤＮＡとして例示される。その一般的な構造を
第１図に示す。 上記のようにして作製した、ＧＬＤ遺伝子プロモーター
および翻訳開始部位をコードする領域の下流に、ＧＬＤ
構造遺伝子と融合するように連結した目的遺伝子を、ア
クレモニウム・クリソゲナムに導入するための宿主とし
ては、アクレモニウム・クリソゲナムに属する菌であれ
ばいかなるものでもよく、その具体例としては、アクレ
モニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０株、アクレ
モニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１４５５３株、アクレ
モニウム・クリソゲナムＮ２株、およびそれらの株から
得られた変異株等が挙げられる。 上記アクレモニウム・クリソゲナムＮ２株は、昭和６３
年１２月１４日に財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託
番号ＩＦＧ ３２１７７として、また本微生物は昭和
６３年１２月２３日にブタペスト条約に基づき通商産業
省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−２２０４として寄託されている。 なお本明細書において、ＩＦＯ番号はＩＦＯにおける寄
託番号を、ＡＴＣＣ番号はアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション［Ａｍｅｒ １ｃａｎＴｙｐｅ Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏｌ １ｅｃＬｉｏｎ （Ａ Ｔ Ｃ
Ｃ）＋ １２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ Ｒ
ｏｃｋｖｉｌ＋ｅ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２］
における寄託番号を示すものとする。 アクレモニウム・クリソゲナムに遺伝子を導入する形質
転換法としては、例えばプロトプラスト形質転換法［Ｓ
、 Ｗ、 Ｑｕｅｅｎｅｒ ａｔ ａｌ：Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ１９８５、アメリカン・ソサイエテイ・フ
ォー・マイクロバイオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ ５ｏ
ｃｉｅｔｙ ｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ） ｐ、
４６８ （１９８５）参照］が挙げられる。 また形質転換株を効率よく分離するために、アクレモニ
ウム・クリソゲナム内で機能する適当な選択マーカー遺
伝子を持つプラスミドに該融合遺伝子を挿入した後、該
プラスミドでアクレモニウム・クリソゲナムを形質転換
してもよい。該選択マーカー遺伝子としては、形質転換
株を選択的に分離できるものならいかなるものでもよく
、その具体例としては、プラスミドｐＧＨ２１（第１５
図参照）に含まれるＧＬＤ−ハイグロマイシンＢ耐性遺
伝子が例示される。 本発明において用いられるセファロスポリン類合成能を
有する形質転換株の培養に際しては、形質転換株が同化
しうる炭素源および資化しうる窒素源等を含有する培地
が用いられる。炭素源としては、該形質転換株が同化し
うるものであれば何テモヨく、例えばグルコース、シェ
ーク０−ス、澱粉、可溶性澱粉、グリセリン、ｎ−パラ
フィンなどのほか、酢酸、７マール酸、安息香酸などの
有機酸類、エタノール、ブタノールなどのアルコール類
、油脂類（例、大豆油、ラード油）などが単独でまたは
混合して用いられる。また窒素源としては例えばペプト
ン、大豆油、肉エキス、綿実粉、乾燥酵母、酵母エキス
、コーン・ステイープ・リカー、プロア０、コーングル
テンミール、尿素、アンモニウム塩類（例、塩化アンモ
ニウム）、硝酸塩類（例、硝酸カリウム）、その他有機
または無機の窒素含有物（例、ＮＺアミン（Ａ）、硫安
）が単独でまたは混合して用いられる。その他培地成分
の無機塩としては、各種リン酸塩（例、リン酸カリウム
）、硫厳塩（例、硫酸ナトリウム）、塩酸塩（例、塩化
マグネシウム）などが用いられる。鉄、マグネシウム、
カルシウム、マンガン、コバルトなどの各イオンの添加
は菌の成育およびセファロスポリン系抗生物質の生産、
安定性などに関係が深い。 これら使用する培地原料は使用する菌株、培養に利用す
る条件などに応じて適宜に組合わせ、もしくは選択され
うる。 実際の培養にあたっての培養温度、培養期間、培地のｐ
Ｈ，通気撹拌などの培養条件は使用する菌株、培地組織
などによって一定しないが、目的とするセファロスポリ
ン類の蓄積量が最大になるように選択調節されればよい
。多くの場合、培養温度は、２０〜３０℃、培養期間は
４〜１４日、培地のｐＨは５．θ〜９．０で好気的に培
養を行なうと、培養液中のセファロスポリン類の蓄積は
最高に達する。 培養の結果得られた培養液中にはセファロスポリン類が
生成蓄積される。セファロスポリン類の大部分は培養ろ
液中に存在するので、培養液を遠心分離あるいはろ過に
より菌体を除去した液体部分からこれを得るのがよい。 セファロスポリン類を分別採取するには、公知の方法、
たとえば弱酸性有機物の一般的な分別採取法が準用でき
る。すなわちイオン交換樹脂（例、アンバーライトＩＲ
Ａ−９００）、活性炭、セルロース、シリカゲルなどを
用いるクロマトグラフィーあるいはゲルろ適法などを組
み合わせことにより有利に目的物を採取することができ
る。なおセファロスポリン類の定量には薄層クロマトグ
ラフィーで各成分を分離後、被検菌に対する抗菌力を測
定する方法、またはネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２４
６巻、１５４頁（１９７３）に記載されているセファロ
スポリナーゼを用いる方法が採用される。またセファロ
スポリン類の同定には元素分析、核磁気共鳴スペクトル
、ろ低電気泳動、薄層クロマトグラフィーなどが採用さ
れる。 犬ｍ男 以下に実施例をもって、本発明の内容をより具体的に説
明するが、これらはいずれも本発明の内容を例示するも
のにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。 なお、実施例における％（パーセント）は特にことわり
のない限り重量％を示すものとする。 実施例１ サツカロミセス・セレビシェのＧＬＤ遺伝子
のクローニング ｌ）サツカロミセス・セレビシェの染色体ＤＮＡの調製 サツカロミセス・セレビシェＩ Ｆ ０ １０１４７の
凍結保存菌体をＹＰＤ培地（酵母エキスｌｏｇ／ｆｆ。 ポリペブト７２０ｇ／（１、グルコ−２２０ｇ／ ｆｆ
）、Ｈｌに接種して回転式振盪機（２００ｒｐｍ）上で
、３０℃、１８時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ、
５分）により得られた菌体からり、 Ｒ，Ｃｒｙｅｒ
らの方法［メソッド・イン・セル・バイオロジー（Ｍｅ
ｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ｘｎ、
３９（１９７５）参照］に従い、約５ ｍｇノ染色体
ＤＮＡを得た。 ２）ＧＬＤ遺伝子検索グローブの調製 Ｊ、 Ｐ、 Ｈｏ１ｌａｎｄの報告［ジャーナル・オブ
φバイオロジカル・ケミストリーＱ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、）、乙ｉ４．９８３９（１９７９）参照］をもと
に、第２図に示すＤＮＡオリゴマーを調製した。 ３）サツカロミセス・セレビシェのシーンライブラリ（
ｇｅｎｅ １ｉｂｒａｒｙ）の作製上記１）項で得た染
色体ＤＮＡ３０μｇに５．４ユニツトの制限酵素Ｍｂｏ
ｌを３７℃で２０分間作用させ部分切断した後、ｄＡＴ
ＰとｄＧＴＰの存在下でＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｉ ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（宝酒造製、日本
）を作用させた。これと７フージベクターλＦｉｘのＸ
ｈｏｌ切断断片、ｐａｒｔｉａｌ ｆｉｌｌ−ｉｎアー
ム（ストラタジーンクローニングシステム社製、ＵＳＡ
）とをＴ ４ Ｄ Ｎ Ａ ｌｉｇａｓｅにより連結し
た。この連結反応液をＧｉｇａｐａｋ ｇｏｌｄ（スト
ラタジーンクローニングシステム社製、ＵＳＡ）を用い
て、ｉｎ ｖｉｔｒ。 ｐａｃｋａｇ ｉｎｇを行なった。以上のようにして作
製したシーンライブラリのタイターは、指示細菌として
大腸菌ＬＥ３９２を用いて調べた結果、１−ＯＸＩＯ＠
ｐｒｕ／１Ｍｌであった。 ４）シーンライブラリからのＧＬＤ遺伝子のスクリーニ
ング 上記３）項で作製したシーンライブラリをプレートあた
り６０００個のプラークが出現するように希釈しＩ；の
ち、指示細菌として大腸菌ＬＥ３９２を用いてプレート
上にプラークを出現させた。このプレートから前記「モ
レキュラー・クローニング」の第３２０〜３２１頁に記
載の方法に従ってプラークを、。 ニトロセルロースフィルターにリフトした。前記、［モ
レキュラー・クローニング」、第３９６頁記載の方法で
第１図のＤＮＡオリゴマーの５′末端をＴ４ポリヌクレ
オチド・キナーゼ、［γ−３！ｐｌＡＴＰを用いてＰで
放射能ラベルした。これをプローブとして、プラーク１
ハイブリダイゼーシヨン（前記、「モレキュラー争クロ
ーニング」、第３２６〜３２８頁参照）を行なった。プ
ローブとハイブリダイズが認められたポジティブプラー
クから（前記、「モレキュラー・クローニングＪ 、第
３７１〜３７２頁記載の方法に従いλＤＮＡを分離した
。得られたλＤＮＡを、制限酵素Ｈ４ｎｄｌｌ！で切断
したのち、アガロースゲル（０，８％）電気泳動した。 この電気泳動ゲルから、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）法
（前記、「モレキュラー・クローニング」、第３８２〜
３８６頁参照）により、ニトロセルロースフィルターに
ＤＮＡを転写した。１！Ｐでラベルした第１図のＤＮＡ
オリゴマーと、上記ＤＮＡ結合ニトロセルロースフィル
ターのサザン雑種形成（前記、［モレキュラー・クロー
ニング」、第３８７〜３８９頁参照）を行なった。その
結果、２．３ＫｂｐのＨｉｎｄＩ［［断片とハイブリダ
イズが認められた。 ５）Ｃ，ＬＤ遺伝子のサブクローニング上記４）項で得
たλＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ［で切断したのち、
２．３ｋｂｐのＨｉｎｄＩ［Ｉ切断をアガロースゲル（
１６０％）電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニ
ング」、第１５０〜１６２頁参照）および電気泳動溶出
法（高木康敬著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講
談社すイエンティフイク、１９８２年、参照）により単
離した。一方ベクタープラスミドｐＵｃ１８を制限酵素
ＨｉｎｄＩＩｌで切断した。このようにして得られた２
種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結
反応を行なっｔ；。この連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ
１０９株を形質転換することにより、ｐＵｃ１８のＨｉ
ｎｄＩ［＋サイトに２．３ｋｂｐのＨｉｎｄｌＩｌ断片
（サツカロミセス・セレビシェのＧＬＤ遺伝子を含む）
が挿入されたプラスミドｐＧＬＤ１９（第３図参照）を
得た。 実施例２ アクレモニウム・クリソゲナムのＧＬＤ遺伝
子のクローニング １）アクレモニウム・クリソゲナムの染色体ＤＮＡの調
製 アクレモニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０株の
凍結保存菌体をサッカロース３０ｇ／Ｑ、肉エキス１５
ｇ／１２、コーン・ステイープ・リカー５ｇ／１２、Ｃ
ａＣＯ５１−５ｇ／（ｉを含む培地（ｐＨ７，０）に接
種し、２８°０で４８時間、回転式振盪機（２０Ｏｒｐ
ｍ）上で培養する。 培養液１１２をろ別して得られる菌体から、Ｐ、 Ｆ。 １１ａｍｌｙｎらの方法［エンザイム・マイクロバイオ
ロジカル・テクノロジー（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） ３．３２
１（１９８１）参照】に従ってプロトゲラストを調製し
た。得られたプロトプラストからり、 Ｒ，Ｃｒｙｅｒ
らの方法
【メソッド・イン・セル・バイオロジー（Ｍｅ
ｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ） Ｘ
Ｌ３９（１９７５）参照１に従い、約５ｍｇの染色体Ｄ
ＮＡを得た。 ２）アクレモニウム・クリソゲナムのシーンライブラリ
の作製 上記ｌ）項で得た染色体ＤＮＡ３０μｇに５．４ユニツ
トの制限酵Ｍｂｏｌを３７℃で２０分間作用させ、部分
切断した後、ｄＡＴＰとｄＧＴＰの存在下でＤＮＡｐｏ
ｌｙ＋＊ｅｒａｓｅ Ｉ ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅ
ｎｔ（宝酒造製、日本）を作用させた。これと７フージ
ベクターλＦｉｘのＸｈｏｌ切断断片、ｐａｒｔｉａｌ
ｆｉｌｌ−ｉｎアーム（ストラタジーン・クローニン
グ・システム社１ｉ、ＵＳＡ）とをＴ ４ Ｄ Ｎ Ａ
Ｉｉｇａｓｅにより連結した。この連結反応液を、Ｇ
ｉｇａｐａｃｋ ｇｏｌｄ（ストラタジーン・クローニ
ング・システム社製、ＵＳＡ）を用いて、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇを行なった。以上のようにし
て作製したｇｅｎｅ １ｉｂｒａｒｙのタイターは、指
示細菌として大腸菌ＬＥ３９２を用いて調べた結果、６
．５ＸＩＯ’ ｐｆｕ／−であった。 ３）シーンライブラリからのＧＬＤ遺伝子のスクリーニ
ング 上記２）項で作製したシーンライブラリをプレートあた
り６０００個のプラークが出現するように希釈したのち
、指示細菌として大腸菌ＬＥ３９２を用いてプレート上
にプラークを出現させた。このプレートから前記「モレ
キュラー・クローニング」の第３２０〜３２１頁に記載
の方法に従ってプラークをニトロセルロースフィルター
にり７トした。ニックトランスレージョン法（前記、「
モレキュラ一番クローニング」、第１０９〜１１２頁参
照）により ＄１ｐで放射能ラベルしたプラスミドｐＧ
ＬＤ１９０２．３ｋｂｐのＨｉｎｄｎｌ断片（サツカロ
ミセス・セレビシェのＧＬＤ遺伝子を含む）を、グロー
ブとして、プラークハイブリダイゼーシヨン（前記、「
モレキュラー・クローニング」、第３２６〜３２８頁参
照）を３０％ホルムアミド、０．７５Ｍ塩化ナトリウム
、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム、０．５％ドデシル
硫酸ナトリウム、５０ＩＩＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５）、１００μｇ／ｍ１！熱変性サケ精子ＤＮＡ、を
含むハイブリダイシーンジン溶液中で４２°０．１６時
間行なった。 グローブとハイブリダイズが認められたボジティブプラ
ークから前記、「モレキュラー・クローニング」、第３
７１〜３７２頁記載の方法に従いλＤＮＡを分離した。 得られたλＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ■で切断したのち
アガロースゲル（０，８％）電気泳動した。この電気泳
動ゲルから、サザン （Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）法（前
記、［モレキュラー・クローニング」、第３８２〜３８
６頁参照）により、ニトロセルロースフィルターにＤＮ
Ａを転写した。３２Ｐ放射能ラベルしたプラスミドｐＧ
ＬＤ１９の２．３ｋｂｐの ＨｉｎｄＩＩＩ断片（サツ
カロミセス・セレビシェのＧＬＤ遺伝子を含む）と、上
記ＤＮＡ結合ニトロセルロースフィルターのサザン雑種
形成（前記、「モレキュラー・クローニング」、第３８
７〜３８９頁参照）を、３０％ホルムアミド、０．７５
Ｍ塩化ナトリウム、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム、
０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、５０ＩＩＩＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）および１００μｇ／熱変性サ
ケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中で４
２℃、１６時間行なった。 その結果、４．５ｋｂｐのＢａｍＨＩ断片とハイブリダ
イズが認められた。 ４）ＧＬＤ遺伝子のサブクローニング 上記３）で得たλＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し
たのち、４．５ｋｂｐのＢａｍＨ１断片をアガロースゲ
ル（１，０％）電気泳動（前記、「モレキュラー・クロ
ーニング」、第１５０〜１６２頁参照）および電気泳動
溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁
、講談社すイエンティフィク、１９８２年、参照）によ
り単離した。一方ベクタープラスミドｐｂｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ Ｓ Ｋ＋を制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。こ
のようにして得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼで連結反応を行なった。この連結反応
液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換することによ
り、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ Ｋ＋のＢａｍＨＩサ
イトに４．５ｋｂｐのＢａｍＨＩ断片（アクレモニウム
・クリソゲナムのＧＬＤ遺伝子を含む）が挿入されたプ
ラスミドｐＧＬ １３（第４図参照）を得ｊこ。 実施例３ ＧＬＤ遺伝子のＤＮＡ塩基配列アクレモニ
ウム・クリソゲナムのＧＬＤ遺伝子が存在する、ｐＧＬ
１３のＰｓｔｌ−Ｘｈｏｌ断片（約３゜２ ｋｂｐ）の
ＤＮＡ塩基配列をジデオキシ合成鎖停止法［添田栄−ら
著、［核酸の塩酸配列決定法」第６１−１１３頁、学会
出版センター、１９８５年、参照］に従って決定した。 その結果を第５図に示す。決定したＤＮＡ塩基配列から
予想されるＧＬＤのアミノ酸配列を第６図に示す。 実施例４ ＧＬＤ遺伝子プロモーターおよび翻訳開始
部位を利用してのハイグロマイシ ンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝 子の発現 ｌ）プラスミドｐｃＨ１の作製 ハイクロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子
を含むプラスミドｐＧ Ｌ ６２ ｒｌ、ＧｒｉＬｚ。 ｅＬ ａｌ ；ジーン（Ｇｅｎｅ）２５．１７９（１９
８３）参照］からハイグロマイシンＢホス７オトランス
フエラーセ遺伝子のプロモーターとアミノ基末端から３
個のアミノ酸が欠失したプラスミドｐｃＨ１（第７図参
照）をＫａｓＬｅｒらの方法［カレント・ジェネティク
ス（Ｃｕｒｒｅｎｔ ＧｅｎｅＬｉｃｓ） ８．３５３
（１９８４）参照］に準じて作製した。 ２）プラスミドｐＧＬ６の作製（第８図参照）プラスミ
ドｐＧＬ１３をＥｃｏＲＩとＸｈｏｌで切断したのち、
アガロースゲル（１，０％）電気泳動（前記、「モレキ
ュラー・クローニング」、第１５０〜１６２頁参照）お
よび電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニュア
ル」第３３頁、講談社すイエンティフィク、１９８２年
、参照）により単離した、２．０ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−
Ｘｈｏｌ断片を５ａｕ３ＡＩで切断したのち、アルカリ
７オス７アターゼ（宝酒造製、日本）を作用させた。こ
れをポリアクリルアミドゲル（１０％）電気泳動したの
ち、約８０ｂｐのＥｃｏＲＩ−９ａｕ３ＡＩ断片を、前
記、［モレキュラー・クローニング」、第１７３頁記載
の方法に従って単離した。 一方、２種類の１４ ｍａｒ合成オリゴヌクレオタイド
（５’−ＧＡＴＣＴＡＴＣＡＡＡＡＴＧ、５’−ＧＡＴ
ＣＣＡＴＴＴＴＧＡＴＡ）をそれぞれＴ４ポリヌクレオ
タイド・キナーゼ（宝酒造製、日本）により、５′末端
をリン酸化したのち、アニーリングさせることによりＢ
ｇｌｌｌ−ＢａｍＨＩアダプタ−（第８図参照）を作製
した。 次に、ベクタープラスミドｐＵｃ１９をＢａｍＨＩで切
断したのち、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製、日
本）を作用させ、さらにＥｃｏＲＩで切断したのちアガ
ロースゲル（１，０％）電気泳動（前記、［モレキュラ
ー・クローニング」、第１５０〜１６２頁参照）および
電気泳動溶出法（高木東歌［遺伝子操作マニュアル」第
３３頁、講談社すイエンティフィク、１９８２年、参照
）により、２．７ｋｂｐのＥｃｏＲｌ−ＢａｍＨＩ断片
を単離した。 以上の約８０ｂｐのＥｃｏＲＩ −５ａｕ３ Ａ Ｉ断
片、旦１■−旦明Ｈｌアダプター、及び２．７ｋｂｐの
旦臼Ｒ１−ＢａｍＨＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結することにより、プラスミドｐＧＬ６を作製しＩ
こ。 ３）プラスミドｐＧＬ６９の作製（第９図参照）前項の
プラスミドｐＧＬ６をＥｃｏＲＩとＢａｎ＋Ｈ１で切断
したのち、ポリアクリルアミドゲル（１０％）電気泳動
したのち、約９０ｂｐのＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨ１断片
を、前記、［モレキュラー・クローニング」、第１７３
頁記載の方法に従って単離した。 一方、実施例２−４）記載のプラスミドｐＧＬ１３をＥ
ｃｏＲＩとＰｓＬＩで切断したのち、アガロースゲル（
１６０％）電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニ
ング」、第１５０〜１６２頁参照）および電気泳動溶出
法（高木東歌著［遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講
談社すイエンティフイク１９８２年、参照）１： Ｊ：
す、１．２ｋｂｐノ旦ｃｏＲＩ −Ｐｓｉ Ｉ断片を単
離した。 ベクタープラスミドｐＨＳ Ｇ ３９８（宝酒造製、日
本）をＰｓＬＩとＢａｍＨＩで切断したのち、アガロー
スゲル（１，０％）電気泳動（前記、「モレキュラー・
クローニング」、第１５０〜１８２頁参照）および電気
泳動溶出法（高木東歌「遺伝子操作マニュアル」第３３
頁、講談社すイエンティフィク、１９８２年、参照）に
より、２．２ｋｂｐのＰｓｔ Ｉ −ＢａｍＨＩ断片を
単離した。 以上の約９０ｂｐの旦臼Ｒ１−且斐Ｈ！断片、１．２ｋ
ｂｐの旦ｃｏＲＩ −Ｐｓｉ Ｉ断片、２．２ｋｂｐの
ＰｓＬｒ −且ａｍＨＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結することにより、プラスミドｐＧＬ６９を作製
した。 ４）プラスミドｐＧＨ２の作製（第１θ図参照）前項の
プラスミドｐＧＬ６９をＰｓ口とＢａｎ＋Ｈ１で切断し
たのち、アガロースゲル（１，０％）電気泳動（前記、
［モレキュラー・クローニング」、第１５０〜１６２頁
参照）および電気泳動溶出法（高木東歌「遺伝子操作マ
ニュアル」第３３頁、講談社すイエンティフィク、１９
８２年、参照）により、１．３ｋｂｐのＰｓＬ Ｉ −
ＢａｍＨＩ断片を単離した。 ｌ）項記載のプラスミドｐｃＨ１をＨｉｎｄｌｎとＢａ
ｎ＋Ｈ１で切断したのち、アガロースゲル（１，０％）
電気泳動（前記、［モレキュラー・クローニング］、第
１５０〜１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東
歌「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエン
ティフィク、１９８２年、参照）により、ｌ 、６ｋｂ
ｐのＨ１ｎｄＩ［［−Ｂ ａｍＨＩ断片を単離した。 ベクタープラスミドｐＵｃ１９をＰｓｔｌとＨｉｎｄ■
で切断したのち、アガロースゲル（１，０％）電気泳動
（前記、「モレキュラー・クローニング」、第１５０〜
１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東歌「遺伝
子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエンティフィ
ク、１９８２年、参照）により、２．７ｋｂｐのＰｓＬ
４−Ｈｌｎｄｌｌ［断片を単離した。 以上の１．３ｋｂｐの尺旦１−Ｂａ＋＊ＨＩ断片、１．
６ｋｂｐのＨ１ｎｄｎｌ −Ｂ ａｍＨＩ断片、２．７
ｋｂｐのＰｓｔＩ −Ｈｌｎｄｌｌ［断片をＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結することにより、プラスミドｐＧ
Ｈ２を作製した。 ５）アクレモニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０
株からのプロトプラストの調製アクレモニウム・クリソ
ゲナムＡＴＣＣ１１５５０株の凍結保存しておいた分生
胞子ｌＸｌ０’個を、サッカｏ −２３０ｇ／ Ｑ１肉
エキス１５ｇ／１２、コーン・ステイープ・リカー５ｇ
／ａを含む液体培地（ｐＨ７，０）に接種して回転式振
盪機（２００ｒｐａ＋）上、２８℃で１８時間培養した
。培養液２５０−をろ別して得られた菌体を滅菌水で洗
浄したのち、０．０１Ｍジチオスレイトールを含んだマ
クイルベイン（Ｍｃｌ ＋ｖａｉｎｅ）緩衝液（１３，
５ｍＭクエン酸−１７４＋＋＋Ｍリン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７，３）３０−に懸濁し、２８°０で１時間、穏やか
に振盪した。菌体をろ別、洗浄したのち、Ｚｙｍｏｌｙ
−ａｓｅ２０Ｔ（生化学工業部、日本）３＋ｎｇ／ｍ
、ＬｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅＬ Ｉ （Ｂ Ｄ ＨＣｈｅ
ｎ＋１ｃａｌｓ製、ＵＳＡ）３ｍｇ／ｍ、０．７Ｍ Ｎ
ａＣ４を含んだマクイルベイン緩衝液６０ｄに懸濁した
。菌体懸濁液を３０℃で３時間、穏やかに振盪したのち
、グラスフィルター（Ｇ−１１岩城硝子製）により、菌
糸とプロトプラストを分離しＩ；。ろ液を遠心分離（１
００ＯＧ、 ５分間）することにより、プロトプラスト
を沈殿させたのち、０．７Ｍ ＮａＣＱで２回洗浄し、
プロトプラストが５ｘｌＯ′個／−になるように０．７
Ｍ ＮａＣＱに懸濁した。 ６）ｐＧＨ２によるプロトプラスト形質転換０．１−の
グロトプロト懸濁液に、プラスミドｐＧＨ２（１０μｇ
、５μｇ）を加え、カル＜混合シタのち０．７Ｍ Ｎａ
ＣＱを０．４−と３６％Ｐ Ｅ ｃ、 ４０００（和光
純薬製）、１０６＋＋＋Ｍ ＣａＣＱ＊を含んだ０−０
５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ７，５）を０．！ｍ！加え、
かるく混合した。 室温で１０分間静置したのち、０．７Ｍ ＮａＣＱを５
−加え、遠心分離（１００ＯＧ、 ５分間）した。沈殿
となったプロトプラストを０．７Ｍ ＮａＣＱ ｌｌ１
１２に再懸濁した。この形質転換プロトプラスト懸濁液
（０，ＩＩＬｌｌ）をプロトプラスト再生培地（１０，
３％サッカロースを含んだトリプテイカーゼ・ソイ・ア
ガー（ＢＢＬ−Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｓｙｓｔｅ
ｍｓ）、ベクトン・デキンソン・アンド・カンパニー製
、米国３０−）を含んだプレート上に広げ１５℃で２０
時間培養したのち、ハイグロマイシンＢを３５０ｐｇ／
−含んだプロトプラスト再生培地５ｄ（４５℃に保ｌ）
をオーバーレイした。２５℃で６〜１２日間培養するこ
とにより、ハイグロマイシンＢ耐性となった形質転換株
を選択した。１ｄの形質転換プロトプラスト懸濁液から
１０株のハイグロマイシンＢ耐性形質転換株を得た。 ７）ハイグロマイシンＢ耐性形質転換株のサザンハイブ
リダイゼーション雑種形成法による解析ハイグロマイシ
ンＢ耐性形質転換体から、実施例２−１）記載の方法を
用いて、ＤＮＡを分離しｊ；。このＤＮＡをアガロース
ゲル（０，８％）電気泳動（前期、「モレキュラー・ク
ローニング」、第１５０〜１６２頁参照）したのち、電
気泳動ゲルから、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）法（前記
、「モレキュラー・クローニング」、第３８２〜３８６
頁参照）により、ニトロセルロースフィルターにＤＮＡ
を転写した。ニックトランスレージョン法（前記、「モ
レキュラー・クローニング」、第１０９〜１１２頁参照
）ニヨリ、ａｌｐで放射能ラベルしたｐｃＨｌのＢａｍ
ＨＩ −Ｈ１ｎｄ■断片（１，６ｋｂｐ、ハイグロマイ
シンＢホス７オトランスフエラーゼ遺伝子を含む）と、
上記ＤＮＡ結合ニトロセルロースフィルターのサザン雑
種形成（前記、［モレキュラー・クローニング」、第３
８７〜３８９頁参照）を行なった。アクレモニウム・ク
リソゲナムＡＴＣＣ１１５５０のＤＮＡには、雑種形成
は全く認められなかったが、ハイグロマイシンＢ耐性形
質転換株のＤＮＡには、明確な雑種形成が認められた。 以上、実施例４−５）、６）の事実よりアクレモニウム
・クリソゲナム菌体内でｐＧＨ２ハイグロマイシンＢホ
スフォトランスフェラーゼ遺伝子が、ＧＬＤ遺伝子のプ
ロモーターおよび翻訳開始部位により発現していること
が明らかとなった。 実施例５−■ ＧＬＤ遺伝子のプロモーターおよび翻訳
開始部位とＩＰＭＤＨ遺伝子のプロモーターおよび翻訳
開始部位の発現強度の比較アクレモニウム・クリソゲナ
ムＡＴＣＣ１１５５０株のβ−イングロビルマレート脱
水素酵素遺伝子（Ｉ ＰＭＤＨ遺伝子）のプロモーター
および翻訳開始部位により、アクレモニウム・クリソゲ
ナム内で発現するハイグロマイシンＢホス７オトランス
７エラーゼ遺伝子を保持するプラスミドｐＣＨ２２（第
１１図参照）を用いて、アクレモニウム・クリソゲナム
ＡＴＣＣ１１５５０を実施例４−５）、６）の方法でプ
ロトプラスト形質転換した。 次に、得られるハイグロマイシンＢ耐性形質転換株と実
施例４４）〜６）で得られたｐＧＨ２によるハイグロマ
イシンＢ耐性形質転換株の増殖速度を比較した。即ち、
ｐＧＨ２２による形質転換株とｐＧＨ２による形質転換
株それぞれから胞子を分離し、ハイグロマイシンＢを５
０μｇ／−含んだトリブテイカーゼ・ソイ・アガーグレ
ートに塗布した。ｐＧＨ２２による形質転換株のコロニ
ー（直径３順）を形成するのに要する日数はｌＯ日日間
あった。それに対しｐＧＨ２による形質転換株は、４日
間でコロニー（直径３ｍｍ）を形成した。 すなわち、ＧＬＤ遺伝子のプロモーターおよび翻訳開始
部位は、ＩＰＭＤＨ遺伝子のプロモーターおよび翻訳開
始部位より、ハイグロマイシンＢホス７オトランスフエ
ラーゼ遺伝子を強く発現させていた。 実施例５−［相］ 大腸菌 β−ガラクトシダーゼ遺伝
子を用いての発現強度の比較 １）プラスミドｐＧＨＧ２２の作成（第１８図、第１９
図参照） 実施例３−３）記載のｐＧＬ６９を立並Ｈ１で切断した
のち、アルカリ７オスフアターゼ（宝酒造製）を作用さ
せた。 大腸菌 β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むゲラスミＦ
ｐＭＣ１８７１（ファルマシア製、スウェーデン）をＢ
ａｍＨＩで切断したのち、アガロースゲル（１，０％）
電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニング」、第
１５０〜１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東
歌著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエ
ンティフイク、１９８２年、参照）により、３．０ｋｂ
ｐのＢａｍＨＩ断片を単離した。 ｐＧＬ６９のＢａｍＨＩ断片と９ＭＣ１８７１をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて連結することにより、プラスミド
ｐＧＧ ２を作製した。 上記のプラスミドｐＧＧ２をＨｉｎｄｎ［で切断したの
ち、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させ
た。 実施例６−４）記載のプラスミドｐＧ）（２１を）（ｉ
ｎｄｕｌで切断したのち、アガロースゲル（１，０％）
電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニング」、第
１５０〜１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東
歌著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエ
ンティフィク、１９８２年、参照）により、２．９ｈｂ
ｐのＨ４ｎｄｌｎ断片を単離した。 以上のｐＧＧ２のＨｉｎｄＩ［［と２．９ｋｂｐのＨｉ
ｎｄＩ［Ｉ断片をＴ４リガーゼを用いて連結することに
よりプラスミドｐＧＨＧ２２を作製した。 ２）プラスミドｐＧＨＩＧ２の作製（第２０図、第２１
図参照） 実施例５−■記載のプラスミドｐＣＨ２２をＳａｃ■と
ＢａｍＨＩで切断したのち、アガロースゲル（１，０％
）電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニング」、
第１５０〜１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木
東歌著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイ
エンティフィク、１９８２年、参照）により０．６５ｋ
ｂｐのＳａｃ Ｉ −ＢａｍＨＩ断片を単離した。 大腸菌 β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミド
ｐＭＣ１８７１（ファルマシア製、スウェーデン）をＢ
ａｍＨＩで切断したのち、アガロースゲル（１，０％）
を気泳動（前記、［モレキュラー・クローニングＪ１第
１５０〜１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東
歌著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエ
ンティフィク、１９８２年、参照）により、３．０ｋｂ
ｐのＢａｍＨＩ断片を単離した。 ベクタープラスミドｐＵｃ１９をＢａｍＨＩと５ａｃＩ
で切断しＩ；のち、アガロースゲル（１，０％）電気泳
動（前記、［モレキュラー・クローニング」、第１５０
〜１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東歌著［
遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエンティ
フィク、１９８２年、参照）により、２．７ｋｂｌ）の
ＢａｍＨＩ −Ｓａｃ Ｉ断片を単離した。 以上の０．６５ｋｂｐの５ａｃｌ −ＢａｍＨＩ断片、
３．０ｋｂｐのＢａｍＨＩ断片、２．７ｋｂｐのＢａ＋
ｍＨＩ −５ａｃＩ断片をＴ４リガーゼを用いて連結す
ることによりプラスミドｐＧ １を作製した。 上記のプラスミドｐＧ １をＨｉｎｄｌ［Ｉで切断し
たのち、アルカリ７オスフアターゼ（宝酒造製）を作用
させた。 実施例６−４）記載のプラスミドｐＧＨ２１の且１ｎｄ
ｎＩ断片（２，９ｈｂｐ）とｐＧ １の且肋ｄｌｌｌ
断片をＴ４リガーゼを用いて連結することによりプラス
ミドｐＧＨＩＧ２を作製した。 ３）プラスミドｐＧＨＧ２２とｐＧＨＩＧ２によるプロ
トプラスト形質転換 プラスミドｐＧＨＧ２２とｐＧＨＩＧ２を用いて、アク
レモニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０を実施例
４−５）、６）の方法でプロトゲラスト形質転換し、そ
れぞれから５株のハイグロマイシンＢ耐性形質転換株が
得られた。 ４）３）で得られたハイグロマイシンＢ耐性形質転換株
を３０ｇ／１２サッカロースを含んだトリプテイカーゼ
・ソイ・ブロース［（Ｂ Ｂ Ｌ −Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙｓｙｓｔｅ＋＋＋ｓ）、ベクトン・デキンソン
・アンド・カンパニー製、米国］に接種して、回転式振
盪機（２４０ｒｐ＋ｍ）上で、２８℃で３日間培養した
。培養液１００ｍ１２をろ別した得られた菌体を、０．
７％ＮａＣＱで洗浄後、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μＭ
ＲＭＳＦを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ７，０）に懸濁した。菌体懸濁液を超音波処理（１
６０ワツト、５分間）した後、遠心分離（２００００ｇ
、 １５分間）することにより、粗酵素液を調製した。 Ｊ、 Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒの方法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ ｌ１ａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ１東大出版会発行、１９７２年、第３５２−３５５
頁参照）に従ってβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した
。その結果を第１表に示す。 ＡＴＣＣ１１５５０ｐＧＨに ２２ ５ ４８７
．５本ｕｎｉｔｓ／ｍｇ ＠ｐｒｏｔｅｉｎすなわち、
ＧＬＤ遺伝子のプロモーターおよび翻訳開始部位は、Ｉ
ＰＭＤＨ遺伝子のプロモーターおよび翻訳開始部位より
、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を強く発現させていた。 実施例６ イソペニシリンＮシンセターゼ遺伝子の、Ｇ
ＬＤ遺伝子プロモーターおよび 翻訳開始部位を利用しての発現 ｌ）イソペニシリンＮシンセターゼ遺伝子検索プローブ
の調製 Ｓ、 Ｍ、 Ｓａｍｓｏｎらの報告［ネイチャー （Ｎ
ａｔｕｒｅ）、３１８．１９１． （１９８５）参照】
をもとに、第１２図に示すＤＮＡオリゴマーを調製した
。 ２）シーンライプリからのイソペニシリンＮシンセター
ゼ遺伝子の大腸菌へのクローニング実施例２−２）項記
載の方法と同様の方法で、イソペニシリンＮシンセター
ゼ遺伝子をクローニングし、さらにベクタープラスミド
ｐＵｃ１８のＢａｍＨＩサイトに３．１ｋｂｐのＢａ＋
ｉＨＩ断片（アクレモニウム・クリソゲナムのイソペニ
シリンＮシンセターゼ遺伝子を含む）が挿入されたプラ
スミドｐｉＰＳ ６（第１３図参照）を作製すること
により、サブクローン化した。 ３）ｐＧＨ２の作製（第１４図参照） 実施例４−４）で作製したＩ）ＧＨ２をＢａｍＨＩで切
断したのち、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ（
宝酒造製）を作用させフラッシュエンドに転換した。こ
れをＰｓｔｌで切断したのち、アガロースゲル（１，０
％）電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニング」
、第１５０−１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高
木東歌著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社す
イエンティフイク、 １９８２年、参照）により、■、
３ｋｂｐ（Ｆ） Ｂ ａｍＨＩ −Ｐ ｓＬ Ｉ断片を
単離した。 前項で作製したｐＩＰＳ ６をＮｃｏｌで切断したのち
、 Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ（宝酒造製
）を作用させフラッシュエンドに転換した。Ｂａ＋ｗＨ
Ｉで切断したのち、アガロースゲル（１，０％）電気泳
動（前記、「モレキュラー・クローニング」、第１５０
〜１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東歌著「
遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエンティ
フイク、１９８２年、参照）により、１．９ｋｂｐのＮ
ｃｏｌ −Ｂａ耐目断片を単離した。 ベクタープラスミドｐＵｃ１８をＢａ＋＋＋ＨＩとＰｓ
ｔｌで切断したのち、アガロースゲル（１，０％）電気
泳動（前記、［モレキュラー・クローニング」、第１５
０〜１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東歌著
「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエンテ
ィフイク、１９８２年、参照）により、２．７ｋｂｐの
ＢａｍＨＩ −Ｐｓｔ Ｉ断片を単離した。以上の１゜
Ｔ４リガーゼを用いて連結することによりプラスミドｐ
ＧＩ２を作製した。 ４）ｐＧＨ２１の作製 実施例４−３）で作製したｐＧＬ６９をＢａｅ＋ＨＩと
Ｈｉｎｄｍで切断したのち、アガロースゲル（１，０％
）電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニング」、
第１５０−１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木
東歌著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイ
エンティフィク、１９８２年、参照）により、１．３ｋ
ｂｐのＢａｍＨＩ −Ｈ１ｎｄＩＩ［断片を単離した。 実施例４−１）項記載のプラスミドｐｃｌ（ｌをＨｉｎ
ｄＩ［［とＢａｍＨＩで切断したのち、アガロースゲル
（１，０％）電気泳動（前記、［モレキュラー・クロー
ニング」、第１５０〜１６２頁参照）および電気泳動溶
出法（高木東歌著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、
講談社すイエンティフィク、 １９８２年、参照）によ
り、１．６ｋｂｐの且罰ｄＩ［Ｉ−且朋Ｈ１断片を単離
した。 ベクタープラスミドｐＨＳ Ｇ ３９８（全酒造製）を
Ｈｉｎｄｎ［で切断したのち、アルカリフォスファター
ゼ（全酒造製）を作用させた。 以上の１．３ｋｂｐのＢａｍＨＩ −Ｈ１ｎｄｌ［Ｉ断
片、１．６ｋｂｐのＨ１ｎｄｌｌ −Ｂ ａｍＨＩ断片
、ｐＨ３Ｇ３９８のＨｉｎｄｎｌ断片をＴ４リガーゼを
用いて連結することによりプラスミド、）ＧＨ２１（第
１５図参照）を作製した。 ５）ｐＧＨＩ２２の作製（第１６図参照）前記、３）項
記載のプラスミドｐＧＩ２をＨｉｎｄｎで切断したのち
、アルカリフォスファターゼ（全酒造製）を作用させた
。 前項記載のプラスミドｐＧＨ２１をＨｉｎｄＩｌｌで切
断したのち、アガロースゲル（１，０％）電気泳動（前
記、「モレキュラー・クローニング」、第１５０〜１６
２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東歌著「遺伝子
操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエンティフィク
、１９８２年、参照）により、２．９ｋｂｐのＨｉｎｄ
ｌｌ［断片を単離した。 以上のｐＧＩ２のＨｉｎｄｌ［Ｉ断片と、２．９ｋｂｐ
のＨｉｎｄｌｌ＋断片をＴ４リガーゼを用いて連結する
ことによりプラスミドｐＧＨＩ２２を作製した。 ６）プラスミドｐＧＨＩ２２によるプロトゲラスト形質
転換 プラスミドｐＧＨ！・２２を用いて、アクレモニウム・
クリソゲナムＮ２株（イソペニシリンＮシンセターゼ遺
伝子欠損株）を実施例４−５）、６）記載の方法でプロ
トプラスト形質転換したところ、１２株のハイグロマイ
シンＢ耐性形質転換株が得られた。 ７）ｐｌＧＨ２の作製（第１７図参照）第２）項記載の
プラスミドｐｌＰｓ６をＨｉｎｄＩ［［で切断したのち
、アルカリ７オスフアターゼ（全酒造製）を作用させた
。 前項記載のプラスミドｐＧＨ２１をＨｉｎｄｌｌで切断
したのち、アガロースゲル（１，０％）電気泳動（前記
、「モレキュラー・クローニングＪ 、１１１５０〜１
６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東歌著「遺伝
子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエンティフイ
ク、１９８２年、参照）により、２．９ｋｂｐのＨｉｎ
ｄｌ［［断片を単離した。 以上のｐｌＰｓ６のＨｉｎｄｌｌ［断片と、２．９ｋｂ
ｐのＨｉｎｄｌｎ断片をＴ４リガーゼを用いて連結する
ことによりプラスミドｐＩＧＨ２を作製した。 ８）プラスミドｐｌＧＨ２によるプロトゲラスト形質転
換 プラスミドｐＩＧＨ２を用いて、アクレモニウム・クリ
ソゲナムＮ２株（イソペニシリンＮシンセターゼ遺伝子
欠損株）を実施例４−５）、６）記載の方法でプロトプ
ラスミド形質転換したところ、１２株のハイグロマイシ
ンＢ耐性形質転換株が得られた。 ９）ハイグロマイシンＢ耐性形質転換株の培養６）、８
）項で得られたハイグロマイシンＢ耐性形質転換株を、
ＳＢＦ培地（サッカロース３０ｇ／ｇ。 ＤＬ−メチオニン５ｇ／ Ｑ、ソイ・ビーン・フラワー
３２ｇ／α、コーン・ステイープ・リカー０．５ｇ／
ＬＣａＣＯｓ １．５ｇ／Ｌ ｐＨ６，８）に接種して
、回転式振盪ａ１１（２４０ｒｐｍ）上で、２８℃で５
日間培養した。培養液を遠心分離（１００ＯＯＧ、 １
０分）して得られた上清液中の全セファロスポリン濃度
を酵素法（Ｙ、 Ｆｕｊｉ −ｓａｗａ ｅｔ ａｌ、
ネイチャーｅニュー噛バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ
Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２４６． Ｐ、１５４
〜１５５、１９７３年参照）を用いて調べた。その結果
を第２表に示す。 第２表 ｐＧＨＩ２２ １２ ４２８ｐｌＧＨ
２１２３３８ 第２表から明らかなように、プラスミドｐｔｃＨ２のイ
ソペニシリンＮシンセターゼ遺伝子のプロモーターおよ
び翻訳開始部位を、ＧＬＤ遺伝子プロモーターおよび翻
訳開始部位に交換した構造を持つプラスミドｐＧＨＩ２
２によるハイグロマイシンＢ耐性形質転換株は、ｐｌＧ
Ｈ２によるハイグロマイシンＢ耐性形質転換株に比べ高
い生産性を示していた。 灸肌府例困 本発明のＧＬＤ遺伝子プロモーターは、カビ（例、アク
レモニウム・クリソゲナム）を宿主として、異種遺伝子
を効率的に発現させることができ、したがって、抗生物
質（例えばセファロスポリンＣ１デアセチルセフアロス
セフアロスポリンＣなど）の生産性の向上が期待できる
など、産業上有利に利用できる。
ｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ） Ｘ
Ｌ３９（１９７５）参照１に従い、約５ｍｇの染色体Ｄ
ＮＡを得た。 ２）アクレモニウム・クリソゲナムのシーンライブラリ
の作製 上記ｌ）項で得た染色体ＤＮＡ３０μｇに５．４ユニツ
トの制限酵Ｍｂｏｌを３７℃で２０分間作用させ、部分
切断した後、ｄＡＴＰとｄＧＴＰの存在下でＤＮＡｐｏ
ｌｙ＋＊ｅｒａｓｅ Ｉ ｌａｒｇｅ ｆｒａｇｍｅ
ｎｔ（宝酒造製、日本）を作用させた。これと７フージ
ベクターλＦｉｘのＸｈｏｌ切断断片、ｐａｒｔｉａｌ
ｆｉｌｌ−ｉｎアーム（ストラタジーン・クローニン
グ・システム社１ｉ、ＵＳＡ）とをＴ ４ Ｄ Ｎ Ａ
Ｉｉｇａｓｅにより連結した。この連結反応液を、Ｇ
ｉｇａｐａｃｋ ｇｏｌｄ（ストラタジーン・クローニ
ング・システム社製、ＵＳＡ）を用いて、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇを行なった。以上のようにし
て作製したｇｅｎｅ １ｉｂｒａｒｙのタイターは、指
示細菌として大腸菌ＬＥ３９２を用いて調べた結果、６
．５ＸＩＯ’ ｐｆｕ／−であった。 ３）シーンライブラリからのＧＬＤ遺伝子のスクリーニ
ング 上記２）項で作製したシーンライブラリをプレートあた
り６０００個のプラークが出現するように希釈したのち
、指示細菌として大腸菌ＬＥ３９２を用いてプレート上
にプラークを出現させた。このプレートから前記「モレ
キュラー・クローニング」の第３２０〜３２１頁に記載
の方法に従ってプラークをニトロセルロースフィルター
にり７トした。ニックトランスレージョン法（前記、「
モレキュラ一番クローニング」、第１０９〜１１２頁参
照）により ＄１ｐで放射能ラベルしたプラスミドｐＧ
ＬＤ１９０２．３ｋｂｐのＨｉｎｄｎｌ断片（サツカロ
ミセス・セレビシェのＧＬＤ遺伝子を含む）を、グロー
ブとして、プラークハイブリダイゼーシヨン（前記、「
モレキュラー・クローニング」、第３２６〜３２８頁参
照）を３０％ホルムアミド、０．７５Ｍ塩化ナトリウム
、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム、０．５％ドデシル
硫酸ナトリウム、５０ＩＩＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５）、１００μｇ／ｍ１！熱変性サケ精子ＤＮＡ、を
含むハイブリダイシーンジン溶液中で４２°０．１６時
間行なった。 グローブとハイブリダイズが認められたボジティブプラ
ークから前記、「モレキュラー・クローニング」、第３
７１〜３７２頁記載の方法に従いλＤＮＡを分離した。 得られたλＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ■で切断したのち
アガロースゲル（０，８％）電気泳動した。この電気泳
動ゲルから、サザン （Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）法（前
記、［モレキュラー・クローニング」、第３８２〜３８
６頁参照）により、ニトロセルロースフィルターにＤＮ
Ａを転写した。３２Ｐ放射能ラベルしたプラスミドｐＧ
ＬＤ１９の２．３ｋｂｐの ＨｉｎｄＩＩＩ断片（サツ
カロミセス・セレビシェのＧＬＤ遺伝子を含む）と、上
記ＤＮＡ結合ニトロセルロースフィルターのサザン雑種
形成（前記、「モレキュラー・クローニング」、第３８
７〜３８９頁参照）を、３０％ホルムアミド、０．７５
Ｍ塩化ナトリウム、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム、
０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、５０ＩＩＩＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）および１００μｇ／熱変性サ
ケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中で４
２℃、１６時間行なった。 その結果、４．５ｋｂｐのＢａｍＨＩ断片とハイブリダ
イズが認められた。 ４）ＧＬＤ遺伝子のサブクローニング 上記３）で得たλＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し
たのち、４．５ｋｂｐのＢａｍＨ１断片をアガロースゲ
ル（１，０％）電気泳動（前記、「モレキュラー・クロ
ーニング」、第１５０〜１６２頁参照）および電気泳動
溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁
、講談社すイエンティフィク、１９８２年、参照）によ
り単離した。一方ベクタープラスミドｐｂｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ Ｓ Ｋ＋を制限酵素ＢａｍＨＩで切断した。こ
のようにして得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼで連結反応を行なった。この連結反応
液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換することによ
り、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ Ｋ＋のＢａｍＨＩサ
イトに４．５ｋｂｐのＢａｍＨＩ断片（アクレモニウム
・クリソゲナムのＧＬＤ遺伝子を含む）が挿入されたプ
ラスミドｐＧＬ １３（第４図参照）を得ｊこ。 実施例３ ＧＬＤ遺伝子のＤＮＡ塩基配列アクレモニ
ウム・クリソゲナムのＧＬＤ遺伝子が存在する、ｐＧＬ
１３のＰｓｔｌ−Ｘｈｏｌ断片（約３゜２ ｋｂｐ）の
ＤＮＡ塩基配列をジデオキシ合成鎖停止法［添田栄−ら
著、［核酸の塩酸配列決定法」第６１−１１３頁、学会
出版センター、１９８５年、参照］に従って決定した。 その結果を第５図に示す。決定したＤＮＡ塩基配列から
予想されるＧＬＤのアミノ酸配列を第６図に示す。 実施例４ ＧＬＤ遺伝子プロモーターおよび翻訳開始
部位を利用してのハイグロマイシ ンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝 子の発現 ｌ）プラスミドｐｃＨ１の作製 ハイクロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子
を含むプラスミドｐＧ Ｌ ６２ ｒｌ、ＧｒｉＬｚ。 ｅＬ ａｌ ；ジーン（Ｇｅｎｅ）２５．１７９（１９
８３）参照］からハイグロマイシンＢホス７オトランス
フエラーセ遺伝子のプロモーターとアミノ基末端から３
個のアミノ酸が欠失したプラスミドｐｃＨ１（第７図参
照）をＫａｓＬｅｒらの方法［カレント・ジェネティク
ス（Ｃｕｒｒｅｎｔ ＧｅｎｅＬｉｃｓ） ８．３５３
（１９８４）参照］に準じて作製した。 ２）プラスミドｐＧＬ６の作製（第８図参照）プラスミ
ドｐＧＬ１３をＥｃｏＲＩとＸｈｏｌで切断したのち、
アガロースゲル（１，０％）電気泳動（前記、「モレキ
ュラー・クローニング」、第１５０〜１６２頁参照）お
よび電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニュア
ル」第３３頁、講談社すイエンティフィク、１９８２年
、参照）により単離した、２．０ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−
Ｘｈｏｌ断片を５ａｕ３ＡＩで切断したのち、アルカリ
７オス７アターゼ（宝酒造製、日本）を作用させた。こ
れをポリアクリルアミドゲル（１０％）電気泳動したの
ち、約８０ｂｐのＥｃｏＲＩ−９ａｕ３ＡＩ断片を、前
記、［モレキュラー・クローニング」、第１７３頁記載
の方法に従って単離した。 一方、２種類の１４ ｍａｒ合成オリゴヌクレオタイド
（５’−ＧＡＴＣＴＡＴＣＡＡＡＡＴＧ、５’−ＧＡＴ
ＣＣＡＴＴＴＴＧＡＴＡ）をそれぞれＴ４ポリヌクレオ
タイド・キナーゼ（宝酒造製、日本）により、５′末端
をリン酸化したのち、アニーリングさせることによりＢ
ｇｌｌｌ−ＢａｍＨＩアダプタ−（第８図参照）を作製
した。 次に、ベクタープラスミドｐＵｃ１９をＢａｍＨＩで切
断したのち、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製、日
本）を作用させ、さらにＥｃｏＲＩで切断したのちアガ
ロースゲル（１，０％）電気泳動（前記、［モレキュラ
ー・クローニング」、第１５０〜１６２頁参照）および
電気泳動溶出法（高木東歌［遺伝子操作マニュアル」第
３３頁、講談社すイエンティフィク、１９８２年、参照
）により、２．７ｋｂｐのＥｃｏＲｌ−ＢａｍＨＩ断片
を単離した。 以上の約８０ｂｐのＥｃｏＲＩ −５ａｕ３ Ａ Ｉ断
片、旦１■−旦明Ｈｌアダプター、及び２．７ｋｂｐの
旦臼Ｒ１−ＢａｍＨＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結することにより、プラスミドｐＧＬ６を作製しＩ
こ。 ３）プラスミドｐＧＬ６９の作製（第９図参照）前項の
プラスミドｐＧＬ６をＥｃｏＲＩとＢａｎ＋Ｈ１で切断
したのち、ポリアクリルアミドゲル（１０％）電気泳動
したのち、約９０ｂｐのＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨ１断片
を、前記、［モレキュラー・クローニング」、第１７３
頁記載の方法に従って単離した。 一方、実施例２−４）記載のプラスミドｐＧＬ１３をＥ
ｃｏＲＩとＰｓＬＩで切断したのち、アガロースゲル（
１６０％）電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニ
ング」、第１５０〜１６２頁参照）および電気泳動溶出
法（高木東歌著［遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講
談社すイエンティフイク１９８２年、参照）１： Ｊ：
す、１．２ｋｂｐノ旦ｃｏＲＩ −Ｐｓｉ Ｉ断片を単
離した。 ベクタープラスミドｐＨＳ Ｇ ３９８（宝酒造製、日
本）をＰｓＬＩとＢａｍＨＩで切断したのち、アガロー
スゲル（１，０％）電気泳動（前記、「モレキュラー・
クローニング」、第１５０〜１８２頁参照）および電気
泳動溶出法（高木東歌「遺伝子操作マニュアル」第３３
頁、講談社すイエンティフィク、１９８２年、参照）に
より、２．２ｋｂｐのＰｓｔ Ｉ −ＢａｍＨＩ断片を
単離した。 以上の約９０ｂｐの旦臼Ｒ１−且斐Ｈ！断片、１．２ｋ
ｂｐの旦ｃｏＲＩ −Ｐｓｉ Ｉ断片、２．２ｋｂｐの
ＰｓＬｒ −且ａｍＨＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結することにより、プラスミドｐＧＬ６９を作製
した。 ４）プラスミドｐＧＨ２の作製（第１θ図参照）前項の
プラスミドｐＧＬ６９をＰｓ口とＢａｎ＋Ｈ１で切断し
たのち、アガロースゲル（１，０％）電気泳動（前記、
［モレキュラー・クローニング」、第１５０〜１６２頁
参照）および電気泳動溶出法（高木東歌「遺伝子操作マ
ニュアル」第３３頁、講談社すイエンティフィク、１９
８２年、参照）により、１．３ｋｂｐのＰｓＬ Ｉ −
ＢａｍＨＩ断片を単離した。 ｌ）項記載のプラスミドｐｃＨ１をＨｉｎｄｌｎとＢａ
ｎ＋Ｈ１で切断したのち、アガロースゲル（１，０％）
電気泳動（前記、［モレキュラー・クローニング］、第
１５０〜１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東
歌「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエン
ティフィク、１９８２年、参照）により、ｌ 、６ｋｂ
ｐのＨ１ｎｄＩ［［−Ｂ ａｍＨＩ断片を単離した。 ベクタープラスミドｐＵｃ１９をＰｓｔｌとＨｉｎｄ■
で切断したのち、アガロースゲル（１，０％）電気泳動
（前記、「モレキュラー・クローニング」、第１５０〜
１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東歌「遺伝
子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエンティフィ
ク、１９８２年、参照）により、２．７ｋｂｐのＰｓＬ
４−Ｈｌｎｄｌｌ［断片を単離した。 以上の１．３ｋｂｐの尺旦１−Ｂａ＋＊ＨＩ断片、１．
６ｋｂｐのＨ１ｎｄｎｌ −Ｂ ａｍＨＩ断片、２．７
ｋｂｐのＰｓｔＩ −Ｈｌｎｄｌｌ［断片をＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結することにより、プラスミドｐＧ
Ｈ２を作製した。 ５）アクレモニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０
株からのプロトプラストの調製アクレモニウム・クリソ
ゲナムＡＴＣＣ１１５５０株の凍結保存しておいた分生
胞子ｌＸｌ０’個を、サッカｏ −２３０ｇ／ Ｑ１肉
エキス１５ｇ／１２、コーン・ステイープ・リカー５ｇ
／ａを含む液体培地（ｐＨ７，０）に接種して回転式振
盪機（２００ｒｐａ＋）上、２８℃で１８時間培養した
。培養液２５０−をろ別して得られた菌体を滅菌水で洗
浄したのち、０．０１Ｍジチオスレイトールを含んだマ
クイルベイン（Ｍｃｌ ＋ｖａｉｎｅ）緩衝液（１３，
５ｍＭクエン酸−１７４＋＋＋Ｍリン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７，３）３０−に懸濁し、２８°０で１時間、穏やか
に振盪した。菌体をろ別、洗浄したのち、Ｚｙｍｏｌｙ
−ａｓｅ２０Ｔ（生化学工業部、日本）３＋ｎｇ／ｍ
、ＬｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅＬ Ｉ （Ｂ Ｄ ＨＣｈｅ
ｎ＋１ｃａｌｓ製、ＵＳＡ）３ｍｇ／ｍ、０．７Ｍ Ｎ
ａＣ４を含んだマクイルベイン緩衝液６０ｄに懸濁した
。菌体懸濁液を３０℃で３時間、穏やかに振盪したのち
、グラスフィルター（Ｇ−１１岩城硝子製）により、菌
糸とプロトプラストを分離しＩ；。ろ液を遠心分離（１
００ＯＧ、 ５分間）することにより、プロトプラスト
を沈殿させたのち、０．７Ｍ ＮａＣＱで２回洗浄し、
プロトプラストが５ｘｌＯ′個／−になるように０．７
Ｍ ＮａＣＱに懸濁した。 ６）ｐＧＨ２によるプロトプラスト形質転換０．１−の
グロトプロト懸濁液に、プラスミドｐＧＨ２（１０μｇ
、５μｇ）を加え、カル＜混合シタのち０．７Ｍ Ｎａ
ＣＱを０．４−と３６％Ｐ Ｅ ｃ、 ４０００（和光
純薬製）、１０６＋＋＋Ｍ ＣａＣＱ＊を含んだ０−０
５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ７，５）を０．！ｍ！加え、
かるく混合した。 室温で１０分間静置したのち、０．７Ｍ ＮａＣＱを５
−加え、遠心分離（１００ＯＧ、 ５分間）した。沈殿
となったプロトプラストを０．７Ｍ ＮａＣＱ ｌｌ１
１２に再懸濁した。この形質転換プロトプラスト懸濁液
（０，ＩＩＬｌｌ）をプロトプラスト再生培地（１０，
３％サッカロースを含んだトリプテイカーゼ・ソイ・ア
ガー（ＢＢＬ−Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｓｙｓｔｅ
ｍｓ）、ベクトン・デキンソン・アンド・カンパニー製
、米国３０−）を含んだプレート上に広げ１５℃で２０
時間培養したのち、ハイグロマイシンＢを３５０ｐｇ／
−含んだプロトプラスト再生培地５ｄ（４５℃に保ｌ）
をオーバーレイした。２５℃で６〜１２日間培養するこ
とにより、ハイグロマイシンＢ耐性となった形質転換株
を選択した。１ｄの形質転換プロトプラスト懸濁液から
１０株のハイグロマイシンＢ耐性形質転換株を得た。 ７）ハイグロマイシンＢ耐性形質転換株のサザンハイブ
リダイゼーション雑種形成法による解析ハイグロマイシ
ンＢ耐性形質転換体から、実施例２−１）記載の方法を
用いて、ＤＮＡを分離しｊ；。このＤＮＡをアガロース
ゲル（０，８％）電気泳動（前期、「モレキュラー・ク
ローニング」、第１５０〜１６２頁参照）したのち、電
気泳動ゲルから、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）法（前記
、「モレキュラー・クローニング」、第３８２〜３８６
頁参照）により、ニトロセルロースフィルターにＤＮＡ
を転写した。ニックトランスレージョン法（前記、「モ
レキュラー・クローニング」、第１０９〜１１２頁参照
）ニヨリ、ａｌｐで放射能ラベルしたｐｃＨｌのＢａｍ
ＨＩ −Ｈ１ｎｄ■断片（１，６ｋｂｐ、ハイグロマイ
シンＢホス７オトランスフエラーゼ遺伝子を含む）と、
上記ＤＮＡ結合ニトロセルロースフィルターのサザン雑
種形成（前記、［モレキュラー・クローニング」、第３
８７〜３８９頁参照）を行なった。アクレモニウム・ク
リソゲナムＡＴＣＣ１１５５０のＤＮＡには、雑種形成
は全く認められなかったが、ハイグロマイシンＢ耐性形
質転換株のＤＮＡには、明確な雑種形成が認められた。 以上、実施例４−５）、６）の事実よりアクレモニウム
・クリソゲナム菌体内でｐＧＨ２ハイグロマイシンＢホ
スフォトランスフェラーゼ遺伝子が、ＧＬＤ遺伝子のプ
ロモーターおよび翻訳開始部位により発現していること
が明らかとなった。 実施例５−■ ＧＬＤ遺伝子のプロモーターおよび翻訳
開始部位とＩＰＭＤＨ遺伝子のプロモーターおよび翻訳
開始部位の発現強度の比較アクレモニウム・クリソゲナ
ムＡＴＣＣ１１５５０株のβ−イングロビルマレート脱
水素酵素遺伝子（Ｉ ＰＭＤＨ遺伝子）のプロモーター
および翻訳開始部位により、アクレモニウム・クリソゲ
ナム内で発現するハイグロマイシンＢホス７オトランス
７エラーゼ遺伝子を保持するプラスミドｐＣＨ２２（第
１１図参照）を用いて、アクレモニウム・クリソゲナム
ＡＴＣＣ１１５５０を実施例４−５）、６）の方法でプ
ロトプラスト形質転換した。 次に、得られるハイグロマイシンＢ耐性形質転換株と実
施例４４）〜６）で得られたｐＧＨ２によるハイグロマ
イシンＢ耐性形質転換株の増殖速度を比較した。即ち、
ｐＧＨ２２による形質転換株とｐＧＨ２による形質転換
株それぞれから胞子を分離し、ハイグロマイシンＢを５
０μｇ／−含んだトリブテイカーゼ・ソイ・アガーグレ
ートに塗布した。ｐＧＨ２２による形質転換株のコロニ
ー（直径３順）を形成するのに要する日数はｌＯ日日間
あった。それに対しｐＧＨ２による形質転換株は、４日
間でコロニー（直径３ｍｍ）を形成した。 すなわち、ＧＬＤ遺伝子のプロモーターおよび翻訳開始
部位は、ＩＰＭＤＨ遺伝子のプロモーターおよび翻訳開
始部位より、ハイグロマイシンＢホス７オトランスフエ
ラーゼ遺伝子を強く発現させていた。 実施例５−［相］ 大腸菌 β−ガラクトシダーゼ遺伝
子を用いての発現強度の比較 １）プラスミドｐＧＨＧ２２の作成（第１８図、第１９
図参照） 実施例３−３）記載のｐＧＬ６９を立並Ｈ１で切断した
のち、アルカリ７オスフアターゼ（宝酒造製）を作用さ
せた。 大腸菌 β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むゲラスミＦ
ｐＭＣ１８７１（ファルマシア製、スウェーデン）をＢ
ａｍＨＩで切断したのち、アガロースゲル（１，０％）
電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニング」、第
１５０〜１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東
歌著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエ
ンティフイク、１９８２年、参照）により、３．０ｋｂ
ｐのＢａｍＨＩ断片を単離した。 ｐＧＬ６９のＢａｍＨＩ断片と９ＭＣ１８７１をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて連結することにより、プラスミド
ｐＧＧ ２を作製した。 上記のプラスミドｐＧＧ２をＨｉｎｄｎ［で切断したの
ち、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させ
た。 実施例６−４）記載のプラスミドｐＧ）（２１を）（ｉ
ｎｄｕｌで切断したのち、アガロースゲル（１，０％）
電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニング」、第
１５０〜１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東
歌著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエ
ンティフィク、１９８２年、参照）により、２．９ｈｂ
ｐのＨ４ｎｄｌｎ断片を単離した。 以上のｐＧＧ２のＨｉｎｄＩ［［と２．９ｋｂｐのＨｉ
ｎｄＩ［Ｉ断片をＴ４リガーゼを用いて連結することに
よりプラスミドｐＧＨＧ２２を作製した。 ２）プラスミドｐＧＨＩＧ２の作製（第２０図、第２１
図参照） 実施例５−■記載のプラスミドｐＣＨ２２をＳａｃ■と
ＢａｍＨＩで切断したのち、アガロースゲル（１，０％
）電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニング」、
第１５０〜１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木
東歌著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイ
エンティフィク、１９８２年、参照）により０．６５ｋ
ｂｐのＳａｃ Ｉ −ＢａｍＨＩ断片を単離した。 大腸菌 β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミド
ｐＭＣ１８７１（ファルマシア製、スウェーデン）をＢ
ａｍＨＩで切断したのち、アガロースゲル（１，０％）
を気泳動（前記、［モレキュラー・クローニングＪ１第
１５０〜１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東
歌著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエ
ンティフィク、１９８２年、参照）により、３．０ｋｂ
ｐのＢａｍＨＩ断片を単離した。 ベクタープラスミドｐＵｃ１９をＢａｍＨＩと５ａｃＩ
で切断しＩ；のち、アガロースゲル（１，０％）電気泳
動（前記、［モレキュラー・クローニング」、第１５０
〜１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東歌著［
遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエンティ
フィク、１９８２年、参照）により、２．７ｋｂｌ）の
ＢａｍＨＩ −Ｓａｃ Ｉ断片を単離した。 以上の０．６５ｋｂｐの５ａｃｌ −ＢａｍＨＩ断片、
３．０ｋｂｐのＢａｍＨＩ断片、２．７ｋｂｐのＢａ＋
ｍＨＩ −５ａｃＩ断片をＴ４リガーゼを用いて連結す
ることによりプラスミドｐＧ １を作製した。 上記のプラスミドｐＧ １をＨｉｎｄｌ［Ｉで切断し
たのち、アルカリ７オスフアターゼ（宝酒造製）を作用
させた。 実施例６−４）記載のプラスミドｐＧＨ２１の且１ｎｄ
ｎＩ断片（２，９ｈｂｐ）とｐＧ １の且肋ｄｌｌｌ
断片をＴ４リガーゼを用いて連結することによりプラス
ミドｐＧＨＩＧ２を作製した。 ３）プラスミドｐＧＨＧ２２とｐＧＨＩＧ２によるプロ
トプラスト形質転換 プラスミドｐＧＨＧ２２とｐＧＨＩＧ２を用いて、アク
レモニウム・クリソゲナムＡＴＣＣ１１５５０を実施例
４−５）、６）の方法でプロトゲラスト形質転換し、そ
れぞれから５株のハイグロマイシンＢ耐性形質転換株が
得られた。 ４）３）で得られたハイグロマイシンＢ耐性形質転換株
を３０ｇ／１２サッカロースを含んだトリプテイカーゼ
・ソイ・ブロース［（Ｂ Ｂ Ｌ −Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙｓｙｓｔｅ＋＋＋ｓ）、ベクトン・デキンソン
・アンド・カンパニー製、米国］に接種して、回転式振
盪機（２４０ｒｐ＋ｍ）上で、２８℃で３日間培養した
。培養液１００ｍ１２をろ別した得られた菌体を、０．
７％ＮａＣＱで洗浄後、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μＭ
ＲＭＳＦを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ７，０）に懸濁した。菌体懸濁液を超音波処理（１
６０ワツト、５分間）した後、遠心分離（２００００ｇ
、 １５分間）することにより、粗酵素液を調製した。 Ｊ、 Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒの方法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、 Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ ｌ１ａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ１東大出版会発行、１９７２年、第３５２−３５５
頁参照）に従ってβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した
。その結果を第１表に示す。 ＡＴＣＣ１１５５０ｐＧＨに ２２ ５ ４８７
．５本ｕｎｉｔｓ／ｍｇ ＠ｐｒｏｔｅｉｎすなわち、
ＧＬＤ遺伝子のプロモーターおよび翻訳開始部位は、Ｉ
ＰＭＤＨ遺伝子のプロモーターおよび翻訳開始部位より
、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を強く発現させていた。 実施例６ イソペニシリンＮシンセターゼ遺伝子の、Ｇ
ＬＤ遺伝子プロモーターおよび 翻訳開始部位を利用しての発現 ｌ）イソペニシリンＮシンセターゼ遺伝子検索プローブ
の調製 Ｓ、 Ｍ、 Ｓａｍｓｏｎらの報告［ネイチャー （Ｎ
ａｔｕｒｅ）、３１８．１９１． （１９８５）参照】
をもとに、第１２図に示すＤＮＡオリゴマーを調製した
。 ２）シーンライプリからのイソペニシリンＮシンセター
ゼ遺伝子の大腸菌へのクローニング実施例２−２）項記
載の方法と同様の方法で、イソペニシリンＮシンセター
ゼ遺伝子をクローニングし、さらにベクタープラスミド
ｐＵｃ１８のＢａｍＨＩサイトに３．１ｋｂｐのＢａ＋
ｉＨＩ断片（アクレモニウム・クリソゲナムのイソペニ
シリンＮシンセターゼ遺伝子を含む）が挿入されたプラ
スミドｐｉＰＳ ６（第１３図参照）を作製すること
により、サブクローン化した。 ３）ｐＧＨ２の作製（第１４図参照） 実施例４−４）で作製したＩ）ＧＨ２をＢａｍＨＩで切
断したのち、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ（
宝酒造製）を作用させフラッシュエンドに転換した。こ
れをＰｓｔｌで切断したのち、アガロースゲル（１，０
％）電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニング」
、第１５０−１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高
木東歌著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社す
イエンティフイク、 １９８２年、参照）により、■、
３ｋｂｐ（Ｆ） Ｂ ａｍＨＩ −Ｐ ｓＬ Ｉ断片を
単離した。 前項で作製したｐＩＰＳ ６をＮｃｏｌで切断したのち
、 Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ（宝酒造製
）を作用させフラッシュエンドに転換した。Ｂａ＋ｗＨ
Ｉで切断したのち、アガロースゲル（１，０％）電気泳
動（前記、「モレキュラー・クローニング」、第１５０
〜１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東歌著「
遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエンティ
フイク、１９８２年、参照）により、１．９ｋｂｐのＮ
ｃｏｌ −Ｂａ耐目断片を単離した。 ベクタープラスミドｐＵｃ１８をＢａ＋＋＋ＨＩとＰｓ
ｔｌで切断したのち、アガロースゲル（１，０％）電気
泳動（前記、［モレキュラー・クローニング」、第１５
０〜１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東歌著
「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエンテ
ィフイク、１９８２年、参照）により、２．７ｋｂｐの
ＢａｍＨＩ −Ｐｓｔ Ｉ断片を単離した。以上の１゜
Ｔ４リガーゼを用いて連結することによりプラスミドｐ
ＧＩ２を作製した。 ４）ｐＧＨ２１の作製 実施例４−３）で作製したｐＧＬ６９をＢａｅ＋ＨＩと
Ｈｉｎｄｍで切断したのち、アガロースゲル（１，０％
）電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニング」、
第１５０−１６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木
東歌著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイ
エンティフィク、１９８２年、参照）により、１．３ｋ
ｂｐのＢａｍＨＩ −Ｈ１ｎｄＩＩ［断片を単離した。 実施例４−１）項記載のプラスミドｐｃｌ（ｌをＨｉｎ
ｄＩ［［とＢａｍＨＩで切断したのち、アガロースゲル
（１，０％）電気泳動（前記、［モレキュラー・クロー
ニング」、第１５０〜１６２頁参照）および電気泳動溶
出法（高木東歌著「遺伝子操作マニュアル」第３３頁、
講談社すイエンティフィク、 １９８２年、参照）によ
り、１．６ｋｂｐの且罰ｄＩ［Ｉ−且朋Ｈ１断片を単離
した。 ベクタープラスミドｐＨＳ Ｇ ３９８（全酒造製）を
Ｈｉｎｄｎ［で切断したのち、アルカリフォスファター
ゼ（全酒造製）を作用させた。 以上の１．３ｋｂｐのＢａｍＨＩ −Ｈ１ｎｄｌ［Ｉ断
片、１．６ｋｂｐのＨ１ｎｄｌｌ −Ｂ ａｍＨＩ断片
、ｐＨ３Ｇ３９８のＨｉｎｄｎｌ断片をＴ４リガーゼを
用いて連結することによりプラスミド、）ＧＨ２１（第
１５図参照）を作製した。 ５）ｐＧＨＩ２２の作製（第１６図参照）前記、３）項
記載のプラスミドｐＧＩ２をＨｉｎｄｎで切断したのち
、アルカリフォスファターゼ（全酒造製）を作用させた
。 前項記載のプラスミドｐＧＨ２１をＨｉｎｄＩｌｌで切
断したのち、アガロースゲル（１，０％）電気泳動（前
記、「モレキュラー・クローニング」、第１５０〜１６
２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東歌著「遺伝子
操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエンティフィク
、１９８２年、参照）により、２．９ｋｂｐのＨｉｎｄ
ｌｌ［断片を単離した。 以上のｐＧＩ２のＨｉｎｄｌ［Ｉ断片と、２．９ｋｂｐ
のＨｉｎｄｌｌ＋断片をＴ４リガーゼを用いて連結する
ことによりプラスミドｐＧＨＩ２２を作製した。 ６）プラスミドｐＧＨＩ２２によるプロトゲラスト形質
転換 プラスミドｐＧＨ！・２２を用いて、アクレモニウム・
クリソゲナムＮ２株（イソペニシリンＮシンセターゼ遺
伝子欠損株）を実施例４−５）、６）記載の方法でプロ
トプラスト形質転換したところ、１２株のハイグロマイ
シンＢ耐性形質転換株が得られた。 ７）ｐｌＧＨ２の作製（第１７図参照）第２）項記載の
プラスミドｐｌＰｓ６をＨｉｎｄＩ［［で切断したのち
、アルカリ７オスフアターゼ（全酒造製）を作用させた
。 前項記載のプラスミドｐＧＨ２１をＨｉｎｄｌｌで切断
したのち、アガロースゲル（１，０％）電気泳動（前記
、「モレキュラー・クローニングＪ 、１１１５０〜１
６２頁参照）および電気泳動溶出法（高木東歌著「遺伝
子操作マニュアル」第３３頁、講談社すイエンティフイ
ク、１９８２年、参照）により、２．９ｋｂｐのＨｉｎ
ｄｌ［［断片を単離した。 以上のｐｌＰｓ６のＨｉｎｄｌｌ［断片と、２．９ｋｂ
ｐのＨｉｎｄｌｎ断片をＴ４リガーゼを用いて連結する
ことによりプラスミドｐＩＧＨ２を作製した。 ８）プラスミドｐｌＧＨ２によるプロトゲラスト形質転
換 プラスミドｐＩＧＨ２を用いて、アクレモニウム・クリ
ソゲナムＮ２株（イソペニシリンＮシンセターゼ遺伝子
欠損株）を実施例４−５）、６）記載の方法でプロトプ
ラスミド形質転換したところ、１２株のハイグロマイシ
ンＢ耐性形質転換株が得られた。 ９）ハイグロマイシンＢ耐性形質転換株の培養６）、８
）項で得られたハイグロマイシンＢ耐性形質転換株を、
ＳＢＦ培地（サッカロース３０ｇ／ｇ。 ＤＬ−メチオニン５ｇ／ Ｑ、ソイ・ビーン・フラワー
３２ｇ／α、コーン・ステイープ・リカー０．５ｇ／
ＬＣａＣＯｓ １．５ｇ／Ｌ ｐＨ６，８）に接種して
、回転式振盪ａ１１（２４０ｒｐｍ）上で、２８℃で５
日間培養した。培養液を遠心分離（１００ＯＯＧ、 １
０分）して得られた上清液中の全セファロスポリン濃度
を酵素法（Ｙ、 Ｆｕｊｉ −ｓａｗａ ｅｔ ａｌ、
ネイチャーｅニュー噛バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ
Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２４６． Ｐ、１５４
〜１５５、１９７３年参照）を用いて調べた。その結果
を第２表に示す。 第２表 ｐＧＨＩ２２ １２ ４２８ｐｌＧＨ
２１２３３８ 第２表から明らかなように、プラスミドｐｔｃＨ２のイ
ソペニシリンＮシンセターゼ遺伝子のプロモーターおよ
び翻訳開始部位を、ＧＬＤ遺伝子プロモーターおよび翻
訳開始部位に交換した構造を持つプラスミドｐＧＨＩ２
２によるハイグロマイシンＢ耐性形質転換株は、ｐｌＧ
Ｈ２によるハイグロマイシンＢ耐性形質転換株に比べ高
い生産性を示していた。 灸肌府例困 本発明のＧＬＤ遺伝子プロモーターは、カビ（例、アク
レモニウム・クリソゲナム）を宿主として、異種遺伝子
を効率的に発現させることができ、したがって、抗生物
質（例えばセファロスポリンＣ１デアセチルセフアロス
セフアロスポリンＣなど）の生産性の向上が期待できる
など、産業上有利に利用できる。
第１図は、ＧＬＤ遺伝子の開始コドンの上流に位置する
５ａｕ３Ａ１部位から開始コドンを含み、目的とする遺
伝子の開始コドンの下流に位置する適当な制限酵素部位
までの合成二本鎖ＤＮＡの一般的な構造を、第２図は実
施例１−２）で得られたＤＮＡオリゴマーを、第３図は
実施例１−５）で得られたプラスミドｐＧＬＤ１９の制
限酵素切断地図を、第４図は実施例２−４）で得られた
プラスミドｐＧＬ１３の制限酵素切断地図を、第５図は
実施例３で決定されたプラスミドｐＧＬ１３のＰｓＬｌ
−Ｘｈｏｌ断片のＤＮＡ塩基配列を、第６図は実施例３
において予想されたアクレモニウム・クリソゲナム由来
のＧＬＤのアミノ酸配列を、第７図は実施例４で得られ
たプラスミドｐＣＨＩの制限第１Ｏ図はプラスミドｐＧ
Ｈ２の調製法を、第１１図はプラスミドｐＣＨ２２の制
限酵素切断地図を、第１２図は実施例６で得られたＤＮ
Ａオリゴマーを、第１３図は実施例６−２）で得られた
プラスミドｐｌＰｓ６の制限酵素切断地図を、第１４図
はプラスミドｐＧＩ２の調製法を、第１５図は実施例６
−４）で得られたプラスミドｐＧＨ２１の制限酵素切断
地図を、第１６図はプラスミドｐＧＨ１２２の制限酵素
切断地図を、第１７図はプラスミドｐｌＧＨ２の調製法
を、第１８図はプラスミドｐＧＧ２の調製法を、第１９
図はプラスミドｐＧＨＧ２２の調製法を、第２０図はプ
ラスミドｐＧＩの調製法を、第２１図はプラスミドｐＧ
ＨＩＧ２の調製法をそれぞれ示す。 第１ 図 代理人 弁理士 岩 １） 弘（ほか４名）開始コド
ン ａｕ３ＡＩ 丁τＴでＡ Ａ Ｔ ＣＡ Ａ Ａ Ａ下でＸＸＸ・・
・ＸＸＴＴＡＧＴＴＴＴＡＣＸＸＸ・・・ｘｘｘｘｘｘ
ＸＸＸ ：目的とする遺伝子 第 図 ５° −ＡＴＧＧＴＴＡＧＡＧＴＴＧＣＴＡＴ（１７ｍ
ｅｒ） 第 図 ＡＵＧ ＧＣＣＡＵＣＡＡＧ ＧＬＩＣＧＧＣＡＵＣＡ
ＡＣＧＧＣＬＩＵＣＧＧＵ ＣＧＬＩ ＡＵＵ ＧＧＡ
ＣＧＵ ＡＵＣＭｅｔ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖ
ａｌ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌ
ｙ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ ｌ１ｅＧＵＣＬ
ＪＵＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＡＵＣＧＡＧ ＣＡＣＡＧＣ
ＧＡＣＧＵＣＧＡＧ ＧＵＣＧＵＵ ＧＣＵ ＧＵＣ
Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ
’／ａＩ ’／ａＩ Ａｌａ ＶａｔＡＡＣＧＡ
ＣＣＣＣＵｔＪＣＡＵＵ ＧＡＧ ＡＣＣＣＡＣＵＡ
Ｕ ＧＣＡ ＧＣＣＵＡＣＡＵＧ ＣＬＪＣＡＡ、Ｇ
ＵＡＬＩＡｓｎ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｔ
ｙｒ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｌｙｓ ＴｙｒＧＡＣＵＣＣＵ
ＣＣＣＡＣＧＧＵ ＣＵＣＵＵＣＡＡＧ ＧＧＣＧＡＣ
ＡＵＣＵＣＣＣＵＧ ＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡｓｐ Ｓｅ
ｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｙ ５ｅｒＧＡＣＣＵＧ ＵＣＣＧＵＧ ＡＡＣ
ＧＧＣＡＡＧ ＡＡＧ ＧＵＣＡＡＧ ＵＵＣＵＡＣＡ
ＣｌＪ ＧＡＧ ＣＧＣＧＡＣＡｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅ
ｒ Ｖａｔ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｖａ
ｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ
ＡｓｐＧＧＣＧＣＣＧＡＧ ＵＡＣＡＵＣＡＵＣＧ
ＡＧＧｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｉｌｅ ｒ
ｌｅ ＧｌｕＡＡＧ ＧＣＣＡＡＧ ＧＣＣＣＡ
ＣＣｕＵ ＡＡＵＬｙｓ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｈｉｓ Ｌｅｕ ＡｓｎＧＣＵ ＣＣＣＵＣＣＧ
ＣＣＧＡＵ ＧＣＣＣＣＣＧｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｓｅ
ｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｌ
ａ Ｐｒ。 つづきあり 第 図 ＡＵＧ ＵＡＣＧＵＧ ＡＵＧ ＧＧＣＧｔ、ＩＣＡＡ
ＣＧＡＧ ＡＡＣＡＣＣＵＡＣＧＡＵ ＧＧＣＡＡＧ
ＧＣＣＧＡＵＭｅｔ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｔｙｒ
Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ−ＧＬＩＣ
ＡＵＣＵＣＣＡＡＣＧＣＵ ＵＣＵ ＵＧＣＡＣＣ
ＡＣＣＶａｌ Ｌｉｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ ＴｈｒＡＵＧ ＵＡＣＧＵＧ
ＡＵＧ ＧＧＣＧＵＣＡＡＣＧＡＧ ＡＡＣＭｅｔ Ｔ
ｙｒ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｓｎ
Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌ
ｙｓ Ａｌａ ＡｓｐＡＡＣＵＧＣＣＵＧ ＧＣＵ
ＣＣＣＣＬＪＧ ＧＣＣＡｓｎ Ｃｙｓ Ｌｅ
ｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ ＡｌａＧＵＣＧＡＧ
ＧＧＵ ＣＵＣＡＵＧ ＡＣＣＡＣＣＶａｌ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｔｈ
ｒＡＣＣＧＵＣＧＡＵ ＧＧＡ ＣＣＵ ＩＪＣＣ
ＧＣＣＴｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ
Ｓｅｒ ＡｌａＧＣＣＣＡＧ ＡＡＣＡＵＣＡＵ
Ｕ ＣＣＣＡＧＣＡｌａ Ｇｉｎ Ａｓｎ Ｉｌ
ｅ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒｅｒ Ｔｈｒ １ｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ つづきあり 第 図 ＧＧＣＡＡＧ ＣＵＣＡＣＬＩ ＧＧＣＡＵＧ ＵＣＣ
ＡＵＧ ＣＧＣＧＵＧ ＣＣＣＡＣＵ ＧＣＣＡＡＣＧ
ＵＣＵＣＣＧｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｌ ５ｅｒＧＵＣＧＵ
Ｕ ＧＡＣＣＬＯＧ ＡＣＣＧＣＣＣＧＣＣＵＣＡＡＣ
ＡＡＧ ＧＧＡ ＧＣＣＡＡＣＵＡＣＧＡＧ ＣＡＧＶ
ａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｇｌｕ ＧｌｎＡＵＣＡＡＧ ＧＣＵ
ＧＣＣＡＬＩＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＣＣＧＣ
Ｕ ＧＣＣＧＧＵ ＣＣＣＣＵＵ ＡＡＧ ＧＧ
ＣＡＵＵｌｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｍｅｔ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ ｌ１ｅＣＬ
ＩＣＧＡＣＬＩＡＣＡＣＣＧＡＧ ＧＡＣＧＡＧ
ＧＵＵ ＧＬＩＣＵＣＣＡＣＣＧＡＣＣＵＧ ＡＡ
ＣＧＧＣＡＡＣＬｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌ
ｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔ
ｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ ＡｓｎＡＧＣ
ＣＡＣＩＪＣＣＩＪＣＣＡＬＩＣＵＬＩＣＧＡＣＧＣＣ
ＡＡＧ ＧＣＣＧＧＵ ＡＵＣＬＩＣＣＣＵＣＡＡ
ＣＧＡＣ９ｅｒ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌ
ｅ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ ＡＳ
ｐＡＡＣＵＵＣＧＬＩＣＡＡＧ ＧＵＡ ＧＬｊＣ
ＧＣＣＬＩＧＧ ＵＡＣＧＡＣＡＡＣＧＡＧ ＵＧ
Ｇ ＧＧＣＵＡＣＵＣＣＡｓｎ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌ
ｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｙｒ
Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｔｙｒ ５
ｅｒＧＧＬＩ ＣＧＵ ＧｔＪＣＣＵＣＧＡＣＣＵ
Ｄ ＧｔＪＣＵＣＣＵＡＣＡＵＣＵＣＣＡＡＧ Ｇ
ＵＣＧＡＵ ＧＣＣＧＧＣＧｌｙ ＡｒｇＶａｌ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｙｒ
Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌ
ａ Ｇｌ）’ＡＡＡ ＵＡＡ Ｌ１２ ＊＊＊ ■ 固 Ｈｉｎｄｍ 日ａｍＨｌ フ −−−−□−− Ｃ駄 第 図 ５゛ −ＡＴＧＧＧＴＴＣＣＧＴＴＣＣＡＧＴｍａ ｒ） 聚 ■
５ａｕ３Ａ１部位から開始コドンを含み、目的とする遺
伝子の開始コドンの下流に位置する適当な制限酵素部位
までの合成二本鎖ＤＮＡの一般的な構造を、第２図は実
施例１−２）で得られたＤＮＡオリゴマーを、第３図は
実施例１−５）で得られたプラスミドｐＧＬＤ１９の制
限酵素切断地図を、第４図は実施例２−４）で得られた
プラスミドｐＧＬ１３の制限酵素切断地図を、第５図は
実施例３で決定されたプラスミドｐＧＬ１３のＰｓＬｌ
−Ｘｈｏｌ断片のＤＮＡ塩基配列を、第６図は実施例３
において予想されたアクレモニウム・クリソゲナム由来
のＧＬＤのアミノ酸配列を、第７図は実施例４で得られ
たプラスミドｐＣＨＩの制限第１Ｏ図はプラスミドｐＧ
Ｈ２の調製法を、第１１図はプラスミドｐＣＨ２２の制
限酵素切断地図を、第１２図は実施例６で得られたＤＮ
Ａオリゴマーを、第１３図は実施例６−２）で得られた
プラスミドｐｌＰｓ６の制限酵素切断地図を、第１４図
はプラスミドｐＧＩ２の調製法を、第１５図は実施例６
−４）で得られたプラスミドｐＧＨ２１の制限酵素切断
地図を、第１６図はプラスミドｐＧＨ１２２の制限酵素
切断地図を、第１７図はプラスミドｐｌＧＨ２の調製法
を、第１８図はプラスミドｐＧＧ２の調製法を、第１９
図はプラスミドｐＧＨＧ２２の調製法を、第２０図はプ
ラスミドｐＧＩの調製法を、第２１図はプラスミドｐＧ
ＨＩＧ２の調製法をそれぞれ示す。 第１ 図 代理人 弁理士 岩 １） 弘（ほか４名）開始コド
ン ａｕ３ＡＩ 丁τＴでＡ Ａ Ｔ ＣＡ Ａ Ａ Ａ下でＸＸＸ・・
・ＸＸＴＴＡＧＴＴＴＴＡＣＸＸＸ・・・ｘｘｘｘｘｘ
ＸＸＸ ：目的とする遺伝子 第 図 ５° −ＡＴＧＧＴＴＡＧＡＧＴＴＧＣＴＡＴ（１７ｍ
ｅｒ） 第 図 ＡＵＧ ＧＣＣＡＵＣＡＡＧ ＧＬＩＣＧＧＣＡＵＣＡ
ＡＣＧＧＣＬＩＵＣＧＧＵ ＣＧＬＩ ＡＵＵ ＧＧＡ
ＣＧＵ ＡＵＣＭｅｔ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖ
ａｌ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌ
ｙ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ ｌ１ｅＧＵＣＬ
ＪＵＣＣＧＣＡＡＣＧＣＣＡＵＣＧＡＧ ＣＡＣＡＧＣ
ＧＡＣＧＵＣＧＡＧ ＧＵＣＧＵＵ ＧＣＵ ＧＵＣ
Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ
’／ａＩ ’／ａＩ Ａｌａ ＶａｔＡＡＣＧＡ
ＣＣＣＣＵｔＪＣＡＵＵ ＧＡＧ ＡＣＣＣＡＣＵＡ
Ｕ ＧＣＡ ＧＣＣＵＡＣＡＵＧ ＣＬＪＣＡＡ、Ｇ
ＵＡＬＩＡｓｎ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｔ
ｙｒ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｌｙｓ ＴｙｒＧＡＣＵＣＣＵ
ＣＣＣＡＣＧＧＵ ＣＵＣＵＵＣＡＡＧ ＧＧＣＧＡＣ
ＡＵＣＵＣＣＣＵＧ ＧＡＣＧＧＣＡＧＣＡｓｐ Ｓｅ
ｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｙ ５ｅｒＧＡＣＣＵＧ ＵＣＣＧＵＧ ＡＡＣ
ＧＧＣＡＡＧ ＡＡＧ ＧＵＣＡＡＧ ＵＵＣＵＡＣＡ
ＣｌＪ ＧＡＧ ＣＧＣＧＡＣＡｓｐ Ｌｅｕ Ｓｅ
ｒ Ｖａｔ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｖａ
ｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ
ＡｓｐＧＧＣＧＣＣＧＡＧ ＵＡＣＡＵＣＡＵＣＧ
ＡＧＧｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｉｌｅ ｒ
ｌｅ ＧｌｕＡＡＧ ＧＣＣＡＡＧ ＧＣＣＣＡ
ＣＣｕＵ ＡＡＵＬｙｓ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｈｉｓ Ｌｅｕ ＡｓｎＧＣＵ ＣＣＣＵＣＣＧ
ＣＣＧＡＵ ＧＣＣＣＣＣＧｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｓｅ
ｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｌ
ａ Ｐｒ。 つづきあり 第 図 ＡＵＧ ＵＡＣＧＵＧ ＡＵＧ ＧＧＣＧｔ、ＩＣＡＡ
ＣＧＡＧ ＡＡＣＡＣＣＵＡＣＧＡＵ ＧＧＣＡＡＧ
ＧＣＣＧＡＵＭｅｔ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｔｙｒ
Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ−ＧＬＩＣ
ＡＵＣＵＣＣＡＡＣＧＣＵ ＵＣＵ ＵＧＣＡＣＣ
ＡＣＣＶａｌ Ｌｉｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓ
ｅｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ ＴｈｒＡＵＧ ＵＡＣＧＵＧ
ＡＵＧ ＧＧＣＧＵＣＡＡＣＧＡＧ ＡＡＣＭｅｔ Ｔ
ｙｒ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｓｎ
Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌ
ｙｓ Ａｌａ ＡｓｐＡＡＣＵＧＣＣＵＧ ＧＣＵ
ＣＣＣＣＬＪＧ ＧＣＣＡｓｎ Ｃｙｓ Ｌｅ
ｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ ＡｌａＧＵＣＧＡＧ
ＧＧＵ ＣＵＣＡＵＧ ＡＣＣＡＣＣＶａｌ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｔｈ
ｒＡＣＣＧＵＣＧＡＵ ＧＧＡ ＣＣＵ ＩＪＣＣ
ＧＣＣＴｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ
Ｓｅｒ ＡｌａＧＣＣＣＡＧ ＡＡＣＡＵＣＡＵ
Ｕ ＣＣＣＡＧＣＡｌａ Ｇｉｎ Ａｓｎ Ｉｌ
ｅ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒｅｒ Ｔｈｒ １ｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ つづきあり 第 図 ＧＧＣＡＡＧ ＣＵＣＡＣＬＩ ＧＧＣＡＵＧ ＵＣＣ
ＡＵＧ ＣＧＣＧＵＧ ＣＣＣＡＣＵ ＧＣＣＡＡＣＧ
ＵＣＵＣＣＧｌｙ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｌ ５ｅｒＧＵＣＧＵ
Ｕ ＧＡＣＣＬＯＧ ＡＣＣＧＣＣＣＧＣＣＵＣＡＡＣ
ＡＡＧ ＧＧＡ ＧＣＣＡＡＣＵＡＣＧＡＧ ＣＡＧＶ
ａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｇｌｕ ＧｌｎＡＵＣＡＡＧ ＧＣＵ
ＧＣＣＡＬＩＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＣＣＧＣ
Ｕ ＧＣＣＧＧＵ ＣＣＣＣＵＵ ＡＡＧ ＧＧ
ＣＡＵＵｌｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｍｅｔ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ ｌ１ｅＣＬ
ＩＣＧＡＣＬＩＡＣＡＣＣＧＡＧ ＧＡＣＧＡＧ
ＧＵＵ ＧＬＩＣＵＣＣＡＣＣＧＡＣＣＵＧ ＡＡ
ＣＧＧＣＡＡＣＬｅｕ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌ
ｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔ
ｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ ＡｓｎＡＧＣ
ＣＡＣＩＪＣＣＩＪＣＣＡＬＩＣＵＬＩＣＧＡＣＧＣＣ
ＡＡＧ ＧＣＣＧＧＵ ＡＵＣＬＩＣＣＣＵＣＡＡ
ＣＧＡＣ９ｅｒ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌ
ｅ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ ＡＳ
ｐＡＡＣＵＵＣＧＬＩＣＡＡＧ ＧＵＡ ＧＬｊＣ
ＧＣＣＬＩＧＧ ＵＡＣＧＡＣＡＡＣＧＡＧ ＵＧ
Ｇ ＧＧＣＵＡＣＵＣＣＡｓｎ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌ
ｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｙｒ
Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｔｙｒ ５
ｅｒＧＧＬＩ ＣＧＵ ＧｔＪＣＣＵＣＧＡＣＣＵ
Ｄ ＧｔＪＣＵＣＣＵＡＣＡＵＣＵＣＣＡＡＧ Ｇ
ＵＣＧＡＵ ＧＣＣＧＧＣＧｌｙ ＡｒｇＶａｌ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｙｒ
Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌ
ａ Ｇｌ）’ＡＡＡ ＵＡＡ Ｌ１２ ＊＊＊ ■ 固 Ｈｉｎｄｍ 日ａｍＨｌ フ −−−−□−− Ｃ駄 第 図 ５゛ −ＡＴＧＧＧＴＴＣＣＧＴＴＣＣＡＧＴｍａ ｒ） 聚 ■
Claims (7)
- （１）アクレモニウム・クリソゲナムのグリセロアルデ
ヒド３燐酸脱水素酵素遺伝子プロモーター活性部分を有
するＤＮＡフラグメント。 - （２）アクレモニウム・クリソゲナムのグリセロアルデ
ヒド３燐酸脱水素酵素遺伝子プロモーターを組み込んだ
プラスミド。 - （３）アクレモニウム・クリソゲナムのグリセロアルデ
ヒド３燐酸脱水素酵素遺伝子プロモーター部位の下流に
グリセロアルデヒド３燐酸脱水素酵素遺伝子翻訳開始部
位を組み込んだプラスミド。 - （４）プロモーターまたは翻訳開始部位の下流に構造遺
伝子を組み込んだ請求項２または３のプラスミド。 - （５）請求項４のプラスミドで形質転換したアクレモニ
ウム・クリソゲナム。 - （６）セフアロスポリン類合成能を有する請求項５の形
質転換体。 - （７）請求項６の形質転換体を培地に培養して、培養物
中にセファロスポリン類を生成蓄積させることを特徴と
するセファロスポリン類の製造法。
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