JPH04155259A - アフィニティークロマトグラフィーの技術を応用した検体の定量方法と、それを実施する為に構成された定量キット - Google Patents
アフィニティークロマトグラフィーの技術を応用した検体の定量方法と、それを実施する為に構成された定量キットInfo
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- JPH04155259A JPH04155259A JP28105390A JP28105390A JPH04155259A JP H04155259 A JPH04155259 A JP H04155259A JP 28105390 A JP28105390 A JP 28105390A JP 28105390 A JP28105390 A JP 28105390A JP H04155259 A JPH04155259 A JP H04155259A
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明はアフィニティークロマトグラフィーの技術を応
用した検体の定量方法と、それをブ施する為に構成され
た検体の定量キットに関ブる。
用した検体の定量方法と、それをブ施する為に構成され
た検体の定量キットに関ブる。
即ち、実験器具に官能基を固定化し、更に、その官能基
にリガンドを結合させ、続いてそにリガンドに被検検体
を結合させた後、既知の方法により、検体を定量する方
法。更に、実験器ｙ 具ｔこ直接リガンドを結合さ
せ、そのリガンドにｊ 被検検体を結合させた後、既
知の方法により、ｊ 検体の定量をする方法。更に、
アフィニティークロマトグラフィー担体を用いて、被検
検体を′ 捕捉した後、既知の方法により、検体を定
量す° る方法に関する。
にリガンドを結合させ、続いてそにリガンドに被検検体
を結合させた後、既知の方法により、検体を定量する方
法。更に、実験器ｙ 具ｔこ直接リガンドを結合さ
せ、そのリガンドにｊ 被検検体を結合させた後、既
知の方法により、ｊ 検体の定量をする方法。更に、
アフィニティークロマトグラフィー担体を用いて、被検
検体を′ 捕捉した後、既知の方法により、検体を定
量す° る方法に関する。
［従来技術］
本発明は、殆どすべての検体の定量に応用出来るが、遊
離ヘモグロビンの定量方法を具体例として説明する。
離ヘモグロビンの定量方法を具体例として説明する。
ハプトグロビン（Ｈｐ）は、α２−グロブリンに属する
糖タンパクで、溶血により生ずる遊離へモー グロビ
ンと結合し、複合体を形成する。ヘモグ１ ロビンー
・・ブトグロビン複合体は、肝実質細胞゛ に運搬さ
れ、ヘモグロビンは、ビリルビンに代謝される。しかし
、遊離ハプトグロビン量よりも多量の遊離へモグロヒン
が、血中に生じた場） 合には、遊離ヘモグロビンの
一部は、糸球体をろ過し、尿細管上皮細胞に摂取され、
グロビンとヘムに分離される。ヘムは、細胞毒で、急性
細管壊死の発症原因となり得る。心臓血管外科の進歩と
共に、三弁置換術、補助人工心臓置換等の治療が施行さ
れる症例が増加しつつあり、これらの高度医療の施療の
際に併発する、高度溶血による溶血性腎障害を防止する
ことは、極めて重要なことである。それ故に、遊離ヘモ
グロビンの迅速定量法が求められている。
糖タンパクで、溶血により生ずる遊離へモー グロビ
ンと結合し、複合体を形成する。ヘモグ１ ロビンー
・・ブトグロビン複合体は、肝実質細胞゛ に運搬さ
れ、ヘモグロビンは、ビリルビンに代謝される。しかし
、遊離ハプトグロビン量よりも多量の遊離へモグロヒン
が、血中に生じた場） 合には、遊離ヘモグロビンの
一部は、糸球体をろ過し、尿細管上皮細胞に摂取され、
グロビンとヘムに分離される。ヘムは、細胞毒で、急性
細管壊死の発症原因となり得る。心臓血管外科の進歩と
共に、三弁置換術、補助人工心臓置換等の治療が施行さ
れる症例が増加しつつあり、これらの高度医療の施療の
際に併発する、高度溶血による溶血性腎障害を防止する
ことは、極めて重要なことである。それ故に、遊離ヘモ
グロビンの迅速定量法が求められている。
現在、遊離ヘモグロビン値を直接に分画定量する方法は
考案されていない。僅かに、（１）総ヘモグロビン値と
、総ハプトグロビン値から分別定量する方法。
考案されていない。僅かに、（１）総ヘモグロビン値と
、総ハプトグロビン値から分別定量する方法。
（２） ？離ハプトグロビン測定カラムを用いて半定量
する方法 の２通りの方法があるのみである。
する方法 の２通りの方法があるのみである。
［発明が解決しようとする問題点］
本発明の発明者らは、
（１）アフィニティークロマトグラフィー担体ｔこ、被
検検体を吸着、結合させた後、既知の方法（放射イムノ
アッセイ法、非放放射イムノアッセイ法等）により、被
検検体を定量する方法。
検検体を吸着、結合させた後、既知の方法（放射イムノ
アッセイ法、非放放射イムノアッセイ法等）により、被
検検体を定量する方法。
、（２）アフィニティークロマトグラフィー担体を固相
化した、試験管、ビーズ、マイクロタイタープレート、
磁性粒子、等の実験器具に被検検体を選択的に結合させ
、既知の方法（放射イムノアッセイ法、非放射イムノア
ッセイ法等）により、被検検体を定量する方法。
化した、試験管、ビーズ、マイクロタイタープレート、
磁性粒子、等の実験器具に被検検体を選択的に結合させ
、既知の方法（放射イムノアッセイ法、非放射イムノア
ッセイ法等）により、被検検体を定量する方法。
（３）アフィニティークロマトグラフィー担体を、ウェ
ルの側面（底面以外の部分）に固相化したマイクロタイ
タープレート。
ルの側面（底面以外の部分）に固相化したマイクロタイ
タープレート。
（４） −Ｎ＝Ｃ）Ｉ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｎ−、−
ＣＯＮＨ−等の官能基を固定化し、その官能基にリガン
ドを共有結合させた、試験管、ビーズ、マイクロタイタ
ープレート、磁性粒子等の実験器具。
ＣＯＮＨ−等の官能基を固定化し、その官能基にリガン
ドを共有結合させた、試験管、ビーズ、マイクロタイタ
ープレート、磁性粒子等の実験器具。
（５）アフィニティークロマトグラフィー担体ヲ固相化
した、試験管、ビーズ、マイクロタイタープレート、磁
性粒子、等の実験器具。
した、試験管、ビーズ、マイクロタイタープレート、磁
性粒子、等の実験器具。
（６）試験管、ビーズ、マイクロタイタープレート、磁
性粒子、等の実験器具をマトリクスとし、−Ｎ＝ＣＨ−
（ＣＨ２）−ＣＨ＝Ｎ−１−ＣＯＮＨ−等の官能基（官
能基とりガントが結合すれば官能基の種類に特に制限は
ない）をスペーサーとして結合させ、更に、プロティン
Ａ１ハプトグロビン等をリガンド（リガンドと被検検体
が結合すれば、リガンドの種類に特に制限はない）とし
て結合させ、引き続き、被検検体をリガンドに特異的に
結合させた後、既知の方法（放射イムノアッセイ法、非
放射イムノアッセイ法等）により、検体を定量する方法
。
性粒子、等の実験器具をマトリクスとし、−Ｎ＝ＣＨ−
（ＣＨ２）−ＣＨ＝Ｎ−１−ＣＯＮＨ−等の官能基（官
能基とりガントが結合すれば官能基の種類に特に制限は
ない）をスペーサーとして結合させ、更に、プロティン
Ａ１ハプトグロビン等をリガンド（リガンドと被検検体
が結合すれば、リガンドの種類に特に制限はない）とし
て結合させ、引き続き、被検検体をリガンドに特異的に
結合させた後、既知の方法（放射イムノアッセイ法、非
放射イムノアッセイ法等）により、検体を定量する方法
。
（７）試験管、ビーズ、マイクロタイタープレート、磁
性粒子、等の実験器具をマトリクスとし、プロティンＡ
１ハプトグロビン等をリガンド（リガンドと被検検体が
結合すれば、リガンドの種類に特に制限はない）として
結合させ、更に、被検検体をリガンドに特異的に結合さ
せた後、既知の方法（放射イムノアッセイ法、非放射イ
ムノアッセイ法等）ニより、検体を定量する方法。
性粒子、等の実験器具をマトリクスとし、プロティンＡ
１ハプトグロビン等をリガンド（リガンドと被検検体が
結合すれば、リガンドの種類に特に制限はない）として
結合させ、更に、被検検体をリガンドに特異的に結合さ
せた後、既知の方法（放射イムノアッセイ法、非放射イ
ムノアッセイ法等）ニより、検体を定量する方法。
（８）請求項（１）、請求項（２）、請求項（６）及び
請求項（７）の実施の為に構成された検体定量キット。
請求項（７）の実施の為に構成された検体定量キット。
、
が既知の方法、即ち、遊離ヘモグロビン測定カラムを用
いて半定量する方法および簡易分別定量法の改良、自動
化を可能にすることを見出した。
いて半定量する方法および簡易分別定量法の改良、自動
化を可能にすることを見出した。
［発明の効果コ
即ち、本発明を応用することにより、
（１）遊離ヘモグロビン測定カラムを用いた、遊離ヘモ
グロビン半定量法の煩雑な操作が簡略化でき、単位時間
当たりの処理検体数の、飛躍的な増大が期待できる。
グロビン半定量法の煩雑な操作が簡略化でき、単位時間
当たりの処理検体数の、飛躍的な増大が期待できる。
（２）総ヘモグロビン値と総ハプトグロビン値を求めた
後、計算により遊離・・ブトグロビン値を算出する、簡
易分別定量法の操作の大幅な簡略化が可能となる。
後、計算により遊離・・ブトグロビン値を算出する、簡
易分別定量法の操作の大幅な簡略化が可能となる。
（３）高価なアフィニティークロマトグラフィー担体の
使用量を減少させることにより、安価な遊離ヘモグロビ
ン分画定量キットの提供が可能となる。
使用量を減少させることにより、安価な遊離ヘモグロビ
ン分画定量キットの提供が可能となる。
（４）検体が尿でその鮮度が落ち、ヘモグロビン力、還
元ヘモグロビン、メトヘモグロビン、ヘマチンに変化し
、色調が暗褐色ンこ変化した場合、ハプトグロビンを固
体化したアフィニティークロマトグラフィー担体に遊離
ヘモグロビンを選択的に結合させ、続いて、酵素免疫測
定法により定量する方法（実施例２）は、吸着されてい
る遊離ヘモグロビンが変性している為、正確な値が得ら
れない。これに対し、アフィニティークロマトグラフィ
ー担体またはリガンドに遊離ヘモグロビンを選択的に吸
着し、テトラメチルベンジジン法、または、フルオレイ
ン法により定量する方法（実施例１、実施例３）は、遊
離ヘモグロビンが変化しても、そのパーオキシダーゼ様
活性には、殆ど低下が認められない為、より正確な値が
得られる。
元ヘモグロビン、メトヘモグロビン、ヘマチンに変化し
、色調が暗褐色ンこ変化した場合、ハプトグロビンを固
体化したアフィニティークロマトグラフィー担体に遊離
ヘモグロビンを選択的に結合させ、続いて、酵素免疫測
定法により定量する方法（実施例２）は、吸着されてい
る遊離ヘモグロビンが変性している為、正確な値が得ら
れない。これに対し、アフィニティークロマトグラフィ
ー担体またはリガンドに遊離ヘモグロビンを選択的に吸
着し、テトラメチルベンジジン法、または、フルオレイ
ン法により定量する方法（実施例１、実施例３）は、遊
離ヘモグロビンが変化しても、そのパーオキシダーゼ様
活性には、殆ど低下が認められない為、より正確な値が
得られる。
（５）便潜血反応試験は、酵素免疫測定法により行なわ
なければ、便中のヘム様物質、パーオキシダーゼ様活性
を持つ物質による影響を除けないという問題があった。
なければ、便中のヘム様物質、パーオキシダーゼ様活性
を持つ物質による影響を除けないという問題があった。
しかし、アフィニティークロマトグラフィー担体、また
はりガントに遊離ヘモグロビンを選択的に吸着し、テト
ラメチルベンジジン法、または、フルオレイン法により
定量する方法（実施例１、実施例３）により、便潜血反
応試験を行なえば、これらの物質による影響を除去でき
、迅速に、安価な検査費用で、便潜血反応の実施が可能
となる。
はりガントに遊離ヘモグロビンを選択的に吸着し、テト
ラメチルベンジジン法、または、フルオレイン法により
定量する方法（実施例１、実施例３）により、便潜血反
応試験を行なえば、これらの物質による影響を除去でき
、迅速に、安価な検査費用で、便潜血反応の実施が可能
となる。
（６） （ａ）アフィニティークロマトグラフィー担
体に被検検体を結合させた後、既 知の方法により、被検検体の定量を 行なう方法。
体に被検検体を結合させた後、既 知の方法により、被検検体の定量を 行なう方法。
（ｂ）担体に官能基を介してリガンドを結合させ、その
リガンドに被検検体を 結合させた後、既知の方法により、 被検検体の定量を行なう方法。
リガンドに被検検体を 結合させた後、既知の方法により、 被検検体の定量を行なう方法。
は共に、従来法に比較し、検体の捕捉１が飛躍的に増大
することから、検量線ｔシグモイド曲線にはならず、直
線に近−く為、より正確な値が得られやすい。
することから、検量線ｔシグモイド曲線にはならず、直
線に近−く為、より正確な値が得られやすい。
という特長がある。
以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明する。
実施例１゜
Ａ、キット内容
（１）官能基−Ｎ＝ＣＨ−（ＣＨ２） ３−ＣＨ＝Ｎ−
ヲ結合すセ、更に、リガンドとしてハプトグロビンを共
有結合させたマイロタイタープレート。
ヲ結合すセ、更に、リガンドとしてハプトグロビンを共
有結合させたマイロタイタープレート。
Ｃ２） ３．３’ 、 ５．５’−テトラメチルベンジ
ジン水溶液（３）過酸化水素水溶液。
ジン水溶液（３）過酸化水素水溶液。
（４）ｔｉ準ヒトヘモグロビン。
（５）緩衝液。
（６）洗浄液。
（７）反応停止液。
Ｂ、測定操作
（１）検体を緩衝液で希釈し、キット（１）のマイｌ
クロタイタープレートの各人に２００ ）］づ
・−つ分取した。
クロタイタープレートの各人に２００ ）］づ
・−つ分取した。
ｓ （２） （１）の操作をしたマイクロタ
イタープレートｔこシールをし、室温で３０分インキユ
ベートシた。
イタープレートｔこシールをし、室温で３０分インキユ
ベートシた。
（３）マイクロタイタープレートの各人の内容液を捨て
、洗浄液３００ Ｊｌｌで３回洗浄した。
、洗浄液３００ Ｊｌｌで３回洗浄した。
（４） （３）の操作をしたマイクロタイタープレー
トの各人にキットの（２）と（３）の等量混合液２００
μｍを添加、混和し、３７度で１０分間インキュベート
した。
トの各人にキットの（２）と（３）の等量混合液２００
μｍを添加、混和し、３７度で１０分間インキュベート
した。
（５） （４）の操作をしたマイクロタイタープレー
トの各人に反応停止液１００ ｙＩを添加し、４５０
ｎｍの吸光度を測定した。
トの各人に反応停止液１００ ｙＩを添加し、４５０
ｎｍの吸光度を測定した。
（６）標準ヒトヘモグロビンを用いて同一操作をして描
いた検量線から、検体の遊離ヘモグロビン量を求めた。
いた検量線から、検体の遊離ヘモグロビン量を求めた。
実施例２゜
Ａ、キット内容
（１）官能基−Ｎ＝ＣＨ−（Ｃ）Ｉ２） 、−ＣＨ＝Ｎ
−を固定化し、その官能基に、・・ブトグロビンを共有
結合させた、マイクロタイタープレート （２）酵素標識抗ヒトヘモグロビン抗体。
−を固定化し、その官能基に、・・ブトグロビンを共有
結合させた、マイクロタイタープレート （２）酵素標識抗ヒトヘモグロビン抗体。
（３）酵素標識抗体溶解液。
（４）標準ヒトヘモグロビン。
（５） ３．３“７５．５°−テトラメチルベンジジン
水溶液。
水溶液。
（６）過酸化水素水溶液。
（７）緩衝液。
（８）洗浄液。
（９）反応停止液。
Ｂ、測定操作
（１）検体を緩衝液で希釈し、キットの（１）のマイク
ロタイタープレートの各人に２００ ）Ｊｉづつ分取し
た。
ロタイタープレートの各人に２００ ）Ｊｉづつ分取し
た。
（２） ＜１１のｈ？作をしたマイクロタイタープレ
ートにシールをし、室温で３０分インキュベートした。
ートにシールをし、室温で３０分インキュベートした。
（３）マイクロタイタープレートの各人の内容液を捨て
、洗浄液３００ ＪＩ！で３回洗浄した。
、洗浄液３００ ＪＩ！で３回洗浄した。
（４） ＜３）の操作をしたマイクロタイタープレー
トの各人Ｖこ酵素標識抗体２００νｉを添加し、３７度
で１時間インキュベートした。
トの各人Ｖこ酵素標識抗体２００νｉを添加し、３７度
で１時間インキュベートした。
（５）マイクロタイタープレートの各人の内容液を捨て
、各人を洗浄液３００ Ｊ４１で３回洗浄した。
、各人を洗浄液３００ Ｊ４１で３回洗浄した。
（６） （５）の操作をしたマイクロタイタープレー
トの各人にキットの（５）と（６）の等量混合液２００
ＪＪＩを添加、混和し、３７度で１０分間インキュベ
ートした。
トの各人にキットの（５）と（６）の等量混合液２００
ＪＪＩを添加、混和し、３７度で１０分間インキュベ
ートした。
ｊ７） （６）の操作をしたマイクロタープレートの
各人に反応停止液１００ ｐｌを添加し、４９２ ｎｍ
の吸光度を測定した。
各人に反応停止液１００ ｐｌを添加し、４９２ ｎｍ
の吸光度を測定した。
（８）標準ヒトへモグロヒノを用いて同一操作をして描
いた検量線から検体の遊離ヘモグロビン値を求めた。
いた検量線から検体の遊離ヘモグロビン値を求めた。
実施例３゜
Ａ、キット内容
（））官能基−ＣＯＮ）ｌ−を介して、ハブトグロビン
を共有結合させた試験管。
を共有結合させた試験管。
（２） ３．３’ 、 ５．５−テトラメチルベンジジ
ン水溶液。
ン水溶液。
（３）過酸化水素水溶液。
（４）ｆｆ準ヒトヘモグロビン。
（５）緩衝液。
（６）洗浄液
（７）反応停止液。
Ｂ、測定操作
（１）検体を緩衝液で希釈し、キットの（１）の試験管
に２ ｍｌづつ分取した。
に２ ｍｌづつ分取した。
（２） （１）の操作をした試験管を室温で３０分間
インキュベートした。
インキュベートした。
（３） （２）の操作をした試験管の内容液を捨て、
洗浄液２ｍｌで３回洗浄した。
洗浄液２ｍｌで３回洗浄した。
（４） （３）の操作をした各試験管にキットの（２
）と（３）の等量混液２ ｍｌを添加、混和し、３７度
で１０分間インキュベートした。
）と（３）の等量混液２ ｍｌを添加、混和し、３７度
で１０分間インキュベートした。
（５） （４）の操作をした各試験管に反応停止液Ｉ
ｍｌを添加、混和し、４５０ ｎｍの吸光度を測定し
た。
ｍｌを添加、混和し、４５０ ｎｍの吸光度を測定し
た。
（６）標準ヒトヘモグロビンを用いて同一操作をして描
いた検量線から検体の遊離ヘモグロビン値を求めた。
いた検量線から検体の遊離ヘモグロビン値を求めた。
実施例４゜
Ａ、キット内容
（１）ハプトグロビンを固定化したアフィニティークロ
マトグラフィー担体を固相化した試験管。
マトグラフィー担体を固相化した試験管。
（２）酵素標識抗ヒトヘモグロビン抗体。
（３）酵素標識抗体溶解液。
（４）［４ヒトヘモグロビン。
（５）酵素基質。
（６）緩衝液。
（７）洗浄液。
（８）反応停止液。
Ｂ、測定操作
（１）検体を緩衝液で希釈し、キットの（１）の試験管
に２ ｍｌづつ分取した。
に２ ｍｌづつ分取した。
（２） （１）の操作をした試験管を室温で３０分間
インキュベートした。
インキュベートした。
（３） （２＞の操作をした試験管の内容液を捨て、
洗浄液２ ｍｌで３回洗浄した。
洗浄液２ ｍｌで３回洗浄した。
（４） （３）の操作をした各試験管に酵素標識抗体
２ ｍｌを添加し、３７度で１時間インキュベートした
。
２ ｍｌを添加し、３７度で１時間インキュベートした
。
（５３＜４）の操作をした各試験管の内容を捨て、各試
験管を洗浄液２ ｍｌ で洗浄した。
験管を洗浄液２ ｍｌ で洗浄した。
（６） （５）の操作をした各試験管に、酵素基質液
２ ｍｌを添加、混和し、３７度で１時間インキュベー
トした。
２ ｍｌを添加、混和し、３７度で１時間インキュベー
トした。
（７） ：６）の操作をした各試験管に、反応停止液
１ ｍｌを添加し、４９２ ｎｍの吸光度を測定した。
１ ｍｌを添加し、４９２ ｎｍの吸光度を測定した。
（８）標準ヒトへモグロヒンを用いて同一操作をして描
いた検量線から検体の遊離ヘモグロビン値を求めた。
いた検量線から検体の遊離ヘモグロビン値を求めた。
実施例５゜
Ａ、キット内容
（１）ハプトグロビンを固定化したアフィニティークロ
マトグラフィー担体Ｅ濁１）。
マトグラフィー担体Ｅ濁１）。
（２） ３．３°、 ５．５’−テトラメチルベンジジ
ン水溶液。
ン水溶液。
（３）過酸化水素水溶液。
（４）標準ヒト遊離ヘモグロビン。
（５）緩衝液。
（６）洗浄液
（７）反応停止液。
Ｂ、測定操作
（１）検体を緩衝液で希釈し、その５０ＪＪＩを試験管
に秤取し、更に、キットの（１）の担体懸濁液５０ Ｊ
ＪＩ を秤取、混和した。
に秤取し、更に、キットの（１）の担体懸濁液５０ Ｊ
ＪＩ を秤取、混和した。
（２）（１）の操作をした試験管を室温で３０分間イン
キュベートした。
キュベートした。
＜３） （２）の操作をした試験管中の担体を洗浄液
２ ｍｌで３回洗浄した。
２ ｍｌで３回洗浄した。
（４） ＜３）の操作をした各試験管にキットの（２
）と（３）の等量混液２ ｍｌを添加、混和し、３７度
で１０分間インキュベートした（混和後、３分後、８分
後に、更に、混和した）。
）と（３）の等量混液２ ｍｌを添加、混和し、３７度
で１０分間インキュベートした（混和後、３分後、８分
後に、更に、混和した）。
（５） （４）の操作をした各試験管に反応停止杯ｌ
ｍｌを添加、混和し、３．００Ｏｒｐｍで、分間遠心
分離した後、その上清の４５０ｎｍの吸光度を測定した
。
ｍｌを添加、混和し、３．００Ｏｒｐｍで、分間遠心
分離した後、その上清の４５０ｎｍの吸光度を測定した
。
（６）標準ヒトヘモグロビンを用いて同−操伯をして描
いた検量線から検体の遊離ヘモグロビン値を求めた。
いた検量線から検体の遊離ヘモグロビン値を求めた。
実施例６゜
Ａ、キット内容
（１）官能基−ＣＯＮ）Ｉ−を介して、ハプトグロビン
を共有結合させたビーズ。
を共有結合させたビーズ。
（２） ３．３’ 、 ５．５−テトラメチルベンジジ
ン水溶液。
ン水溶液。
（３）過酸化水素水溶液。
（４）［準ヒトヘモグロビン。
（５）緩衝液。
（６）洗浄液。
（７）反応停止液。
Ｂ、測定操作
（１）検体を緩衝液で希釈し、その２ ｍｌを試ビ
験管に秤取し、更に、キットの（１）のビー１０
ズ１個を秤取、混和した。
験管に秤取し、更に、キットの（１）のビー１０
ズ１個を秤取、混和した。
（２） （１）の操作をした試験管に蓋をし、室温で
３０分インキュベートした。
３０分インキュベートした。
（３）各試験管の内容液を捨て、洗浄液２ ｍｌで３回
洗浄した。
洗浄した。
（４）新しく準備した各試験管にキットの（２）と（３
）の等量混液２ ｍｌを添加、混和し、（３）の操作を
したピースを入れ、３７度で！０分間インキュベートし
た。
）の等量混液２ ｍｌを添加、混和し、（３）の操作を
したピースを入れ、３７度で！０分間インキュベートし
た。
ｌ ｍｌを添加し、４５０ ｎｍの吸光度を測定した。
（６）標準ヒトヘモグロビンを用いて同一操作をして描
いた検量線から検体の遊離ヘモグロビン値を求めた。
いた検量線から検体の遊離ヘモグロビン値を求めた。
実施例７゜
Ａ、キット内容
（１）官能基−Ｎ二ＣＨ−（ＣＨ２）ａ−ＣＨ＝Ｎ−を
介して、ハプトグロビンを共有結合させたビーズ。
介して、ハプトグロビンを共有結合させたビーズ。
（２）酵素標識抗ヒトヘモグロビン抗体。
（３）酵素標識抗体溶解液。
（４）標準ヒトヘモグロビン。
（５）酵素基質。
（６）緩衝液。
（７）洗浄液。
（８）反応停止液。
Ｂ、測定操作
全自動分析装置を用いて、以下のフローチ。
−トに従い、遊離ヘモグロビンの定量を行なった。
レローチャート】
（１）スタート
（２）検体サンプリング
（３）緩衝液分注
（４）ビーズ投入
（５）攪拌
（６）インキュベーション
（７）ビーズ洗浄
（８）酵素標識抗体分注
（９）攪拌
（１０）インキュベーション
（印ビーズ洗浄
（）２）ビーズトランス
（１３）酵素基質分注
（１４）攪拌
（Ｉ５）インキュベーション
（１６）反応停止液分注
？ （１７）測光、データ処理実施例８゜
Ａ、キット内容
（り官能基−Ｎ−ＣＨ−’、ＣＨ２Ｊ ３ＣＨ”Ｎ−ヲ
結合すセ、更に、リガンドとしてハプトグロビンを共ｙ
Ｕｓ合させたマイロタイタープレート。
結合すセ、更に、リガンドとしてハプトグロビンを共ｙ
Ｕｓ合させたマイロタイタープレート。
（２）フルオレイノ水溶液。
（３）過酸化水素水溶液。
（４）標準ヒトへモグロヒン
（５）緩衝液。
（６）洗浄液。
（７）反応停止液。
Ｂ、測定操作
（１）検体を緩衝液で希釈し、キラ） （１）のマイク
ロタイタープレートの各人に２００ ｐｌづつ分取した
。
ロタイタープレートの各人に２００ ｐｌづつ分取した
。
（２） （１）の操作をしたマイクロタイタープレー
トにシールをし、室温で３０分インキュベートした。
トにシールをし、室温で３０分インキュベートした。
（３）マイクロタイタープレートの各人の内容液を捨て
、洗浄液３００屡で３回洗浄した。
、洗浄液３００屡で３回洗浄した。
（４） （３）の操作をしたマイクロタイタープレ
−一トの各人にキットの（２）と（３）の等景況合液２
００ ＪＪＩを添加、混和し、３７度で１０分間インキ
ュベートした。
−一トの各人にキットの（２）と（３）の等景況合液２
００ ＪＪＩを添加、混和し、３７度で１０分間インキ
ュベートした。
（５） （４）の操作をしたマイクロタイタープレー
トの各人に反応停止液１００ ＪＪＩを添加し、４５０
ｎｍの吸光度を測定し、た。
トの各人に反応停止液１００ ＪＪＩを添加し、４５０
ｎｍの吸光度を測定し、た。
（６）標準ヒトヘモグロビンを用いて同一操作をして描
いた検量線から、検体の遊離ヘモグロビン量を求めた。
いた検量線から、検体の遊離ヘモグロビン量を求めた。
実施例９゜
Ａ、キット内容
（１）官能基−Ｎ＝ＣＨ−（Ｃ）１２） ３−ＣＨ＝Ｎ
−を固定化し、その官能基に、プロティンＡを共有結合
させた、マイクロタイタープレート （２）官能基−Ｎ＝ＣＨ−＜ＣＨ２） ３ＣＨ＝Ｎ−を
固定化し、その官能基に、プロティンＧを共有結合させ
た、マイクロタイタープレート （３）酵素標識抗ヒトＩｇＧ３抗体。
−を固定化し、その官能基に、プロティンＡを共有結合
させた、マイクロタイタープレート （２）官能基−Ｎ＝ＣＨ−＜ＣＨ２） ３ＣＨ＝Ｎ−を
固定化し、その官能基に、プロティンＧを共有結合させ
た、マイクロタイタープレート （３）酵素標識抗ヒトＩｇＧ３抗体。
（４）酵素標識抗体溶解液。
（５）標準ヒトＩｇＧ３゜
（６）酵素基質。
（７）緩衝液。
（８）洗浄液。
（９）反応停止液。
Ｂ、測定操作
（１）検体を緩衝液で希釈し、キットの（１）のマイク
ロタイタープレートの各人に２００ ｐＩづつ分取した
。
ロタイタープレートの各人に２００ ｐＩづつ分取した
。
Ｃ２） （１Ｇの操作をしたマイクロタイタープレー
トにシールをし、室温で３０分インキュベートした。
トにシールをし、室温で３０分インキュベートした。
（３＞ （２）の操作をしたマイクロタイタープレー
トの各人の内容液１９０ ｐｉをキットの（２）のマイ
クロタイタープレートに移し、シールをし、室温で３０
分インキュベートした。
トの各人の内容液１９０ ｐｉをキットの（２）のマイ
クロタイタープレートに移し、シールをし、室温で３０
分インキュベートした。
（４）マイクロタイタープレートの各人の内容液を捨て
、洗浄液３００ ）＋１で３回洗浄した。
、洗浄液３００ ）＋１で３回洗浄した。
（５） （４＋の操作をしたマイクロタイタープレー
トの各人に酵素標識ヒ）ＩｇＧ３抗体２００ＪＪＩを添
加し、３７度で１時間インキユベートシた。
トの各人に酵素標識ヒ）ＩｇＧ３抗体２００ＪＪＩを添
加し、３７度で１時間インキユベートシた。
（６）マイクロタ、イタ−プレートの各人の内容液を捨
て、各人を洗浄液３００ ）Ｉで３回洗浄した。
て、各人を洗浄液３００ ）Ｉで３回洗浄した。
（７） Ｃ６）の操作をしたマイクロタイタープレー
トの各人に、酵素基質液２００ ＪＪＩを添加、混和し
、３７度で１時間インキュベートした。
トの各人に、酵素基質液２００ ＪＪＩを添加、混和し
、３７度で１時間インキュベートした。
（８） （７）のｉ作をしたマイクロタープレートの
各人に反応停止液＋００ ）１１を添加し、４９２ ｎ
ｍの吸光度を測定した。
各人に反応停止液＋００ ）１１を添加し、４９２ ｎ
ｍの吸光度を測定した。
（９）標準とＦ１ｇＧ３を用いて同一操作をして描いた
検量線から検体の１ｇＧ３値を求めた。
検量線から検体の１ｇＧ３値を求めた。
実施例１０゜
Ａ、キット内容
ｆｌ）官能基−ＣＯＮＨ−を固定化したマイクロタイタ
ープレート （２）酵素標識抗トロンボキサンＢ２抗体。
ープレート （２）酵素標識抗トロンボキサンＢ２抗体。
（３）酵素標識抗体溶解液。
（４）標準トロンボキサンＢ２゜
・：５）酵素基質。
（６）緩衝液。
（７）洗浄液。
（８）反応停止液。
Ｂ、測定操作
（１） Ｐｏｗｅｌｌの方法により抽出した粗抽出液を
、キットの（１）のマイクロタイタープレートの各人に
２００ ｐｌづつ分取した。
、キットの（１）のマイクロタイタープレートの各人に
２００ ｐｌづつ分取した。
（２） （１）の操作をしたマイクロタイタープレー
トにシールをし、室温で３０分インキュベートした。
トにシールをし、室温で３０分インキュベートした。
（３）マイクロタイタープレートの各人の内容液を捨て
、洗浄液３００ ＪＪＩで３回洗浄した。
、洗浄液３００ ＪＪＩで３回洗浄した。
（４） （３）の操作をしたマイクロタイタープレー
トの各人に酵素標識抗トロンボキサンＢ２抗体２００
ＪＪｌを添加し、３７度で１時間インキュベートした。
トの各人に酵素標識抗トロンボキサンＢ２抗体２００
ＪＪｌを添加し、３７度で１時間インキュベートした。
（５）マイクロタイタープレートの各人の内容液を捨て
、各人を洗浄液３００ ｐｌで３回洗浄した。
、各人を洗浄液３００ ｐｌで３回洗浄した。
（６） （５）の操作をしたマイクロタイタープレー
トの各人に、酵素基質液２００Ｊ１１を添加、混和し、
３７度で１時間インキュベートした。
トの各人に、酵素基質液２００Ｊ１１を添加、混和し、
３７度で１時間インキュベートした。
（７） （８）のｉ作をしたマイクロタープレートの
各人に反応停止液１００ ｐｉを添加し、４９２ ｎｍ
の吸光度を測定した。
各人に反応停止液１００ ｐｉを添加し、４９２ ｎｍ
の吸光度を測定した。
（８）標準ｌ・ロンホキサンＢ２を用いて同一操作をし
て描いた検量線から検体のトロンボキサンＢ２値を求め
た。
て描いた検量線から検体のトロンボキサンＢ２値を求め
た。
以下余白。
Claims (8)
- （１）アフィニティークロマトグラフィー担体に、被検
検体を吸着、結合させた後、既知の方法（放射イムノア
ッセイ法、非放放射イムノアッセイ法等）により、被検
検体を定量する方法。 - （２）アフィニティークロマトグラフィー担体を固相化
した、試験管、ビーズ、マイクロタイタープレート、磁
性粒子等の実験器具に被検検体を選択的に結合させ、既
知の方法 （放射イムノアッセイ法、非放射イムノアッセイ法等）
により、被検検体を定量する方法。 - （３）アフィニティークロマトグラフィー担体を、ウェ
ルの側面（底面以外の部分）に固相化したマイクロタイ
タープレート。 - （４）−Ｎ＝ＣＨ−（ＣＨ＿２）＿ｎ−ＣＨ＝Ｎ−、−
ＣＯＮＨ−等の官能基を固定化し、その官能基にリガン
ドを共有結合させた、試験管、ビーズ、マイクロタイタ
ープレート、磁性粒子等の実験器具。 - （５）アフィニティークロマトグラフィー担体を固相化
した、試験管、ビーズ、マイクロタイタープレート、磁
性粒子等の実験器具。 - （６）試験管、ビーズ、マイクロタイタープレート、磁
性粒子等の実験器具をマトリクスとし、−Ｎ＝ＣＨ−（
ＣＨ＿２）−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＯＮＨ−等の官能基（官
能基とリガンドが結合すれば官能基の種類に特に制限は
ない）をスペーサーとして結合させ、更に、プロテイン
Ａ、ハプトグロビン等をリガンド（リガンドと被検検体
が結合すれば、リガンドの種類に特に制限はない）とし
て結合させ、引き続き、被検検体をリガンドに特異的に
結合させた後、既知の方法（放射イムノアッセイ法、非
放射イムノアッセイ法等）により、検体を定量する方法
。 - （７）試験管、ビーズ、マイクロタイタープレート、磁
性粒子等の実験器具をマトリクスとし、プロテインＡ、
ハプトグロビン等をリガンド（リガンドと被検検体が結
合すれば、リガンドの種類に特に制限はない）として結
合させ、更に、被検検体をリガンドに特異的に結合させ
た後、既知の方法（放射イムノアッセイ法、非放射イム
ノアッセイ法等）により、検体を定量する方法。 - （８）請求項（１）、請求項（２）、請求項（６）及び
請求項（７）の実施の為に構成された検体定量キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28105390A JPH04155259A (ja) | 1990-10-18 | 1990-10-18 | アフィニティークロマトグラフィーの技術を応用した検体の定量方法と、それを実施する為に構成された定量キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28105390A JPH04155259A (ja) | 1990-10-18 | 1990-10-18 | アフィニティークロマトグラフィーの技術を応用した検体の定量方法と、それを実施する為に構成された定量キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04155259A true JPH04155259A (ja) | 1992-05-28 |
Family
ID=17633653
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28105390A Pending JPH04155259A (ja) | 1990-10-18 | 1990-10-18 | アフィニティークロマトグラフィーの技術を応用した検体の定量方法と、それを実施する為に構成された定量キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04155259A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004040305A1 (ja) * | 2002-10-31 | 2004-05-13 | Reverse Proteomics Research Institute Co., Ltd. | 化合物の固相担体への固定化方法 |
-
1990
- 1990-10-18 JP JP28105390A patent/JPH04155259A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004040305A1 (ja) * | 2002-10-31 | 2004-05-13 | Reverse Proteomics Research Institute Co., Ltd. | 化合物の固相担体への固定化方法 |
| JPWO2004040305A1 (ja) * | 2002-10-31 | 2006-03-02 | 株式会社リバース・プロテオミクス研究所 | 化合物の固相担体への固定化方法 |
| US7645614B2 (en) | 2002-10-31 | 2010-01-12 | Reverse Proteomics Research Institute Co., Ltd. | Method of immobilizing compound on solid phase support |
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