JPH0416193A - 植物における外来遺伝子発現方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は植物細胞でを用遺伝子を大量に発現させる物質
生産、植物体で有用遺伝子を大量に発現させるパイオフ
アーミング、又は植物体の形質を変えるような育種等の
分野に利用できる外来遺伝子発現方法に関する。

〔従来技術］ 従来、植物ＲＮＡウィルスを用いたベクター基は今まで
に２例の報告がある。一つはトバモウィルスの一つであ
る、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）ゲノムＲＮＡに
対するｃＤＮＡのコートタンパク質をコードする領域、
あるいはコートタンパク質および３０にタンパク質をコ
ードする領域を外来遺伝子（クロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ遺伝子）に置き換え、そのキメ
ラＤＮＡからＲＮＡを合成し、そのＲＮＡを植物体に接
種するかあるいは細胞に導入することにより：ウイルス
の複製様式を利用して外来遺伝子を発現させるようなベ
クター系である（Ｔａｋａｍａｔｓｕ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８７）ＥＭＢＯＪ、６３０７−３１１．、特開昭
６３−１４６９３、特開平１４２０２９０）。２つめは
、ブロモウィルスのブロモモザイクウィルス（以下ＢＭ
Ｖと称する）ゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡのコートタ
ンパク質をコードする領域に外来遺伝子を置き換え上記
と同様の方法により外来遺伝子を発現させるベクター系
である　（Ｆｒｅｎｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）
　５ｃｉｅｎｃｅ　２３Ｌ１２９４−１２９７）。

（発明が解決しようとする課題〕 これらの方法は、ウィルスの複製に不必要な領域、例え
ばコートタンパク質をコードする領域を外来遺伝子で置
き換えてそれを発現するような系である。しかし、ウィ
ルスゲノムの中で複製に不必要な領域はごく一部である
。また、例えばＴＭＶの場合、ウィルスゲノムの全長は
約６．４ｋｎｔであり、そこからコートタンパク質をコ
ードする領域を除いても約５．２ｋｎｔであり、その領
域に外来遺伝子を挿入するような遺伝子操作をする場合
、かなり複雑な手法を取らざるをえなかった。また、接
種あるいは導入したＲＮＡは、接種した葉、あるいは導
入した細胞でのみしか複製され発現されなかった。そこ
で、本発明者らは上記問題点を解決すべく鋭意研究を行
い本発明を完成した。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、ウィルスの複製に関与しているタンパク
質をコードしているゲノムの領域を植物染色体に組み込
むことにより、植物体の全ての細胞でそのタンパク質を
発現する植物体あるいは細胞を作成した。その植物体あ
るいは細胞に、ウィルスの複製に必要のない領域はもち
ろん、植物体の中で発現しているタンパク質によって補
い得るウィルスゲノムの領域に相当する部分、具体的に
は植物染色体に組み込んだ複製に関与するタンパク質を
コードしている領域の大部分を削除し、そこに外来遺伝
子を挿入したキメラ遺伝子を導入することにより、ウィ
ルスの複製様式を利用して外来遺伝子を大量に発現でき
るようにした。この方法によれば、導入するベクターは
、ウィルスゲノムの大部分を削除できるため非常に小さ
くなる。

そのため、上述の問題点として上げた外来遺伝子を挿入
するための遺伝子操作が非常に容易になった。

更に、先に述べたように、ヘルパーとして働くウィルス
の複製に関与するタンパク質をコードする遺伝子は植物
の染色体に組み込まれているため、全ての細胞で発現し
後代に遺伝する。よって、このベクター系の宿主として
この植物細胞、又は植物体を利用する場合は、該植物体
のどの部分を用いてもよく、更に世代を経過した植物体
をも利用できる。

また外来遺伝子を挿入した組換えベクターは、キメラＤ
ＮＡから合成したＲＮＡ０形で導入してもウィルスの複
製様式によって発現されるが、ＤＮＡあるいは、ｃＤＮ
Ａをさらに上記の植物染色体に組み込むことによっても
機能する。この場合は、植物の全ての細胞で外来遺伝子
は発現され、またその発現は後代に伝わる。

即ち、本発明は、 ピ）植物ウィルスの複製に関与するタンパク質をコード
する遺伝子を植物細胞又は植物体の染色体に組み込み、
上記タンパク質を発現できる植物細胞または植物体を作
成し、 呻）上記タンパク質の認識部位を有し、該タンパク質に
より複製されるベクターに所望の外来遺伝子を挿入して
組換えベクターを作成し、次いで（ハ）上記（Ｉｌｆｆ
）で作成した組換えベクターを上記（イ）で作成した植
物細胞又は植物体に導入することを特徴とする植物細胞
又は植物体における外来遺伝子の発現方法に関する。

そして、上記ベクターとしては、植物ウィルスのゲノム
の一部を含むものが挙げられる。

以下に本発明を具体的に説明する。

１）本発明における植物ウィルス 本発明で利用し得るウィルスは、植物細胞中で増殖可能
なものであれば、どのようなものをも用いることができ
る。植物ウィルスの大部分はＲＮＡウィルスであるから
ここではＲＮＡウィルスを例に挙げて説明するが、ＲＮ
Ａウィルスの代わりにＤＮＡウィルスを用いても全く同
じ技術で行われる。よく知られた代表的なウィルスを例
示すれば、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）　、ジャ
ガイモウィルスＸ　（ＰＶＸ）　、ササゲモザイクウイ
ルス（ＣＰＭＶ）、キュウリモザイクウィルス（ＣＭＶ
）　、ブロムモザイクウィルス（ＢＭＶ）等をあげるこ
とができる。これらのウィルスは種々の保存機関、例え
ばＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）から入手することができ
る。

２）植物染色体に組み込むウィルスの複製に関与するタ
ンパク質をコードするｃ　ＤＮＡすべでのウィルスは、
ゲノムの複製に関与しているタンパク質をコードしてお
り、そのタンパク質と、宿主のなんらかの因子がウィル
スゲノムを認識し複製させることによって増殖している
。ウィルスゲノムにおけるこれらのタンパク質をコード
する領域に対応するすべてのｃＤＮＡが、本発明の植物
ウィルスの複製に関与するタンパク質をコードする遺伝
子として利用し得る。例示するならば、ＴＭＶの１３０
にタンパク質と１８０にタンパク質（Ｉｓｈｉｋａｉｖ
ａ　ｅｔ　ａｌ、（１９８６）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄ　Ｒｅｓ。

１４、８２９１−８３０５）、ＢＭＶの１ａタンパク質
と２ａタンパク質（Ｆｒｅｎｃｈ　ｅｔ　ａｌ、（１９
８６）　５ｃｉｅｎｃｅ　２３１１２９４−１２９７　
）等をコードするｃＤＮＡが挙げられる。これらのｃＤ
ＮＡを植物染色体に組み込みＲＮＡに転写させるために
は、このｃＤＮＡを植物細胞中で活性を持つプロモータ
ー（以下植物プロモーターという）の下流に連結するこ
とが必要である。

植物プロモーターとしては、どのようなプロモーターで
も用いることができる。例示するならば、カリフラワー
モザイクウィルスの３５３プロモータ、ツバリン合成酵
素のプロモーター等が挙げられる。一方、該ｃＤＮＡの
３゛末端にはなんらかの転写終結シグナル、例えば、ポ
リＡシグナル配列を結合してもよいが、必ずしも必須の
ものではない。

ウィルスゲノムの全長に対するｃＤＮＡから、ウィルス
の複製に必要のない領域を削除したｃＤＮＡから合成し
たＲＮＡも、細胞中で複製能を有することが知られてい
る。たとえば削除し得る領域として、ＴＭＶのコートタ
ンパク質をコードする領域、あるいは３０にタンパク質
をコードする領域（Ｔａｋａｍａｔｓｕ　ｅｔ　ａｌ、
（１９８７）　ＥＭＢＯＪ、　６３０７−３１１．。

Ｍｅｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）　ＥＭＢＯＪ、
　６２５５７−２５６３．）、さらには、ＢＭＶのＲＮ
Ａ３にコードされている領域（Ｆｒｅｎｃｈ　ａｎｄ　
Ａｈｌｑｕｉｓｔ　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、（１９８７）　６
１１４５７−１４６５．）などがあげられる。このよう
なｃＤＮＡから合成されたＲＮＡは、ウィルスの複製様
式によって複製し、その過程で複製に必要なタンパク質
をも増産し得るので、植物染色体に導入し発現させる際
も、単に植物プロモーターに連結するよりもはるかに該
タンパク質を多量に発現することができる。（具体例と
しては、ＴＭＶゲノムＲＮＡのコートタンパク質をコー
ドする領域を削除したＲＮＡに対するｃＤＮＡを挙げる
ことができる。）　ウィルスの複製のためには、転写さ
れたＲＮＡの５゛末端の構造が、本来のウィルスのもの
となるべく同じであることが必要である（Ａｈｌｑｕｉ
ｓｔａｎｄ　Ｊａｎｄａ　（１９８４）　Ｍｏ１．Ｃｅ
１１．Ｂｉｏｌ、　４２８７６−２８８２）。

このような目的を達成するための植物プロモータ、ある
いは、プロモーターとｃＤＮＡを連結する方法は、すで
に発表されており　（Ｙａｍａｙａ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８Ｂ）　Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　　Ｇｅｎｅｔ　２１１
５２０−５２５゜、特開平０１８０２８１号）、このよ
うな方法で、上記のｃ　ＤＮＡを植物染色体に導入し、
該タンパク質を発現し得る。

３）本発明における植物体および植物細胞本発明におけ
る植物細胞および植物体は、外来遺伝子を含むベクター
を導入するための宿主となるものであり、具体的には、
ウィルスの複製に関与するタンパク質をコードしている
ゲノム領域に対するｃＤＮＡを、染色体に組み込むこと
により該タンパク質が発現しているものである。その際
、ウィルスの複製様式を利用して、該タンパク質が増産
するようにした方が、効果が大きいことは上記２）で述
べたとおりである。

本発明で使用するベクターはウィルスの複製機構を利用
し増幅させる系であるため、本発明において用いる植物
体および植物細胞は用いるウィルスの宿主範囲を考慮す
る必要がある。即ち、本発明で用いる植物が用いるウィ
ルスの宿主となっている必要がある。しかし、従来ウィ
ルスの感染しない、非宿主とされている植物でも、その
原因が−次感染細胞から周囲の細胞へのウィルスの転移
の阻害によるものであって、個々の細胞中では、該ウィ
ルスは増殖できるものが知られている（Ｐｒｏｚ　ａｎ
ｄ　Ｂｒｕｅｎｉｎｇ　（１９８６）　　Ａｎｎ、　Ｒ
ｅｖ、　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ。

２４、３５５−３８１）。このような場合、非宿主植物
においても本発明方法を適用することが可能である。

なぜなら、本発明では、ウィルスの複製に関与するタン
パク質をコードする遺伝子が植物の染色体に組み込まれ
ているため、全ての細胞で発現しており、全ての細胞で
ウィルスの複製能力を持っているためである。

４）ｃＤＮＡの植物染色体への導入および再分化２）で
述べたような植物プロモーターを連結したｃＤＮＡを、
植物染色体に組み込むためには、すでによ（知られた種
々の方法を採ることができる。たとえば、アグロバクテ
リウム・ツメファシェンスのＴｉプラスミドを利用する
ことができる。

これは、該ｃＤＮＡを、中間ベクターと呼ばれるプラス
ミドに組み込んで、Ｔｉプラスミドベクターを持つアグ
ロバクテリウムに導入し、ついでこのアグロバクテリウ
ムを感染させることにより、該ｃＤＮＡを植物染色体に
組み込む方法（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉｅｔ　ａｌ、（１９
８４）ｉｎ″Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｉｅｅｒｉｎ
ｇ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｉｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｖｏｌｕｍｅ　６　（Ｓｅｔｌｏｗ　ａｎｄ　Ｈｏ１ｌ
ａｅｎｄｅｒ　ｅｄｓ、）”、ｐｐ、２５３−２７８．
　Ｐｌｅｎｕｍ、特開昭５９−１４０８８５号）である
。アグロバクテリウムを植物に感染させる方法について
は、種々の方法を採用することができるがｃＤＮＡを組
み込んだ植物体を再生させようとする場合に比較的容易
な方法として、植物の葉片をアグロバクテリウムの菌液
に浸す方法（Ｈｏｒｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５
）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３６３７６４２、
）をあげることができる。菌液に浸した葉片を、不定芽
発生を誘導するようにホルモン濃度を調製した培地上に
置床して、カルス形成と不定芽発生を行わせる。得られ
た不定芽を切取り、ホルモンを含まない培地上に移して
、発根させることにより、形質転換植物を得ることがで
きる。植物体を再生する必要のない場合は、アグロバク
テリウム・ツメファシェンスの菌液に浸した葉片をその
ホルモン組成をカルス誘導条件に調整した培地に置床す
ることにより形質転換したカルスを得ることができる。

このｃＤＮＡを植物細胞の染色体に組み込むための別の
方法としては、植物細胞をプロトプラスト化した後、化
学的あるいは物理的な処理を施して、直接、該ｃＤＮＡ
をプロトプラストに導入する方法があげられる。そのよ
うな処理を例示するならば、リン酸カルシュウムとポリ
エチレングリコールで処理する方法（Ｋｒｅｎｚｕ　ｅ
ｔ　ａｌ、　（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ　２９６７２−
７４゜Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、（２９８４
）ＥＭＢＯＪ、　３２７１７−２７２２．）、電気パル
スを与える方法（エレクトロポレーション）（Ｌａｎｇ
ｒｉｄｇｅ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８６）　ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　Ｒｅｐ、　４３５
５−３５９．．０ｋａｄａ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８６）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ
、　２７６１９−６２６．）などをあげることができる
。

なお、植物細胞を植物体に再分化させる技術は、一般に
知られている。この技術は、植物を適当な培地で培養す
ることからなるが、具体的な条件は、植物によって異な
るので、それぞれの植物に応じて適した条件を設定する
ことになる。

５）ベクターの構成 本発明に用いるベクターは、３）で述べた植物細胞、又
は植物体に導入したとき細胞内で発現している植物ウィ
ルスの複製に関与するタンパク質によって認識され、か
つウィルスの複製様式によって複製され、その結果増幅
されるような構成を有するものである必要がある。その
ために、基本的にはウィルスゲノムの構造を有するｃＤ
ＮＡから転写されたＲＮＡであることが望ましい。しか
し、ウィルスゲノムの中でイ）ウィルスの複製に必要の
ない領域や、口）ウィルスの複製に必要な領域であって
も３）で述べた植物体あるいは細胞中で発現しているタ
ンパク質により、補充できるような領域は削除できる。

具体的には、上記イ）に相当する領域はさきに述べた通
りであり、例えば、ＴＭＶのコートタンパク質をコード
する領域、あるいは３０にタンパク質をコードする領域
、ＢＭ■のＲＮＡ３にコードされている領域などであり
、上記口）に相当する領域は、植物染色体に組み込んだ
ｃＤＮＡの領域の全部、あるいは大部分の領域である。

一方、ウィルスゲノムの５°非翻訳領域や、３゛非翻訳
領域の中にも、ウィルスの複製に不可欠な領域があるこ
とが知られている。例えば、ＴＭＶの５′末端の２５番
目の塩基から、翻訳開始コドンの直前までの４７塩基を
欠失させると、複製能は失われてしまうことが知られて
いる（第１１回日本分子生物学会年会講演集、ｐ２９６
　）。また、ＴＭＶの５′非翻訳領域の中に存在するｐ
ｓｅｕｄｏｋｎｏｔ構造を完全に失うと増殖能を失うが
、少なくとも３”末端側の１つのｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ
構造と、その下流に存在するｔＲＮＡ様の構造が存在す
ればウィルスは増殖することができる（第１０回日本分
子生物学会年会講演集、ｐ１２４）。少なくとも上記し
た領域はベクターの中に残しておく必要がある。

本発明におけるベクターにおいては、ウィルスの複製様
式によって外来遺伝子が発現されるため、外来遺伝子を
挿入する場所は、従来知られているコートタンパク質等
のサブゲノムＲＮＡをコードしている領域と置換しても
充分に機能するが（Ｔａｋ−ａｍａｔｓｕ　ｅｔ　ａｌ
、　（１９８７）　ＥＭＢＯＪ、　６３０７−３１１）
　、ゲノムのＲＮＡに相当する領域の大部分が削除し得
るため、直接ゲノムのＲＮＡから翻訳させるような構造
にすることもできる。直接ゲノムのＲＮＡから翻訳させ
る際には、所望の外来遺伝子の翻訳開始コドンの上流に
翻訳開始コドンが存在しないことが少な（とも必要であ
る。以上のような構成は、実際にはウィルスゲノムに対
するｃＤＮＡを用いて操作され、上記のような外来遺伝
子を挿入したキメラＤＮＡ　（以後キメラＤＮＡ）から
転写されたＲＮＡが、本発明の組換えベクターに相当す
る。

導入する外来遺伝子については特に制限はないが、例示
するならば、甘味料、医薬物質等の有用物質をコードし
ている遺伝子や、耐冷性、耐暑性、多収性、除草剤耐性
などの植物の形質を改善させるような遺伝子等があげら
れる。

上記のキメラＤＮＡを、上記３）で述べた植物細胞、又
は植物体で発現させるためには、該キメラＤＮＡから合
成したＲＮＡを導入する方法と、該キメラＤＮＡを植物
染色体に組み込み、植物内で転写させる方法が用いられ
る。合成ＲＮＡを導入する方法においては、該キメラＤ
ＮＡをＲＮＡ転写ベクターに挿入することが必要である
。このＲＮＡ転写ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼによ
るＲＮＡ合成を行うためのプロモーターを持ち、プロモ
ーターの転写開始点の直後にＤＮＡの挿入部位があり、
挿入されたＤＮＡのすぐ下流に制限酵素切断部位（例え
ば、Ｍｌｕ　Ｉ　）が位置するような構造を有すること
が望ましい。なぜなら、先に述べたように、転写された
ＲＮＡの５゛末端と３゛末端が、キメラＤＮＡのものと
、なるべく同じになるような構成になることが必要であ
り、そのようなＲＮＡは、上記のベクターを３゛末端に
ある制限酵素切断部位で切断し線状化した後、ＲＮＡの
合成を行うことにより実施できる。このようなベクター
は、公知のものである　（特開昭６１−５７７９号。

Ａｈｌｑｕｉｓｔ　ａｎｄ　Ｊａｎｄａ　（１９８４）
　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　４２８７６−２８８
２．）。また、上記該キメラＤＮＡを植物染色体に組み
込む方法においては、上記２）で述べたような、植物プ
ロモーターを必要とする。

６）組み換えベクターの植物体または植物細胞への導入
法 上記キメラＤＮＡから合成した組み換えＲＮＡベクター
は、上記４）で述べた化学的あるいは物理的処理を施し
て上記３）で述べた細胞より調整した、プロトプラスト
に導入することができる。

また、上記３）で述べた植物体に直接接種することによ
っても目的を達成することができる。上記５）で述べた
該キメラＤＮＡを植物染色体に組み込むような構成のベ
クターは、上記４）で述べた方法で植物の染色体へ組み
込むことによって目的を達成することができる。さらに
、上記４）で述べた方法で、染色体に組み込んだ植物体
と、上記３）で述べた植物体を交配し、その次世代の植
物体あるいは植物細胞を取ることによっても、目的を達
成することができる。

〔実施例〕

以下の実施例において本発明をさらに詳細に説明するが
、本発明はこの実施例に限定されるものではない。

以下の実施例では、ウィルスとしてＴＭＶを、また植物
としてはタバコを用いたものである。

また、ＴＭＶｃＤＮＡは、常法（Ｏｈｎｏ　ｅｔ　ａｌ
、（１９８４）　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９６．１９
１５−１９２３）にしたがって作成したトマト系ＴＭＶ
の野生型ＴＭＶ−り株のＲＮＡに対するもの（以下、Ｔ
ＭＶ　−ＬｃＤＮＡと記す）を用いている。

実施例Ｉ ＴＭＶの複製に関与するタンパク質（１３０Ｋ及び１８
０にタンパク質）の、タバコでの発現。

１）ｐＯＫＬＤｃの作成 第１図で示すように、カリフラワーモザイクウィルス３
５Ｓプロモーター（図中Ｃａで示す）に、転写開始点が
ウィルス本来のものと一致するようにＴＭＶ−ＬｃＤＮ
Ａが連結され、かつアグロバクテリウムツメファシェン
スによる植物染色体への遺伝子組み込みのための、中間
ベクターとして機能する既知のプラスミド、ｐ　ＯＫ　
Ｌ　４　（Ｙａｍａｙａ　ｅｔａｌ、（１９８８）　Ｍ
ｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　２１１，５２０−５２５）
と、ＴＭＶ−ＬｃＤＮＡのコートタンパク質領域を削除
したプラスミド、ｐ　Ｌ　Ｄ　Ｃ３２９（Ｔａｋａｍａ
ｔｓｕ　ｅｔａｌ、　ＥＭＢＯＪ、（１９８７）　６，
３０７−１１）を、制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造■製）と
Ｍｌｕｌ（宝酒造■製）で完全消化し、ｐＯＫＬ４から
は、植物プロモーターとＴＭＶ−ＬｃＤＮＡの５゛領域
を含む１２ｋｂｐの断片と、ｐＬＤｃｓ２９からは、コ
ートタンパク質の削除された、ＴＭＶ−ＬｃＤＮＡの３
゛領域を含む約１．５ｋｐｂの断片を電気泳動により分
離し抽出した。

この両断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し
、これを大腸菌ＨＢＩＯＩ（宝酒造■製）に形質転換す
ることにより、中間ベクターｐＯＫＬＤＣを得た。

２）タバコ細胞への導入および再分化 Ｖａｎ　Ｈａｕｔｅ　ｅｔ　ａｌ、　（ＥＭＢＯ−Ｊ、
２，４１１−４１７．（１９８３）］の方法により、ｐ
ＯＫＬＤｃを、接合によりアグロバクテリウムに移し、
ＴｉプラスミドベクターとｐＯＫＬＤｃのコインテグレ
ートをつくらせた。

すなわち、ｐＯＫＬＤｃを持つ大腸菌ＨＢＩＯＩと、ヘ
ルパープラスミドをもつ大腸菌ＧＪ２３株との培養液を
等量ずつ抗生物質の入っていない培地上に加え、３７°
Ｃ２時間保ったのち、アンピシリンとテトラサイクリン
の入った培地上にまき、ｐＯＫＬＤＣとヘルパープラス
ミドの双方をもつ大腸菌を選抜した。次に、この大腸菌
の培養液と、改変Ｔｉプラスミドベクター１）　Ｇ　Ｖ
３８５０（Ｚａｍｂｒｙｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８３）　ＥＭＢＯＪ、　２２１４３−２１５０）
を持つアグロバクテリウム・ツメファシェンスＣ５８Ｃ
Ｉ　Ｐｒ１ｆ’株の培養液とを、等量ずつ混合し、抗生
物質の人っていない培地に加え、３７°Ｃ２時間、つい
で２８°Ｃに一夜保った後、リファンピシンとカナマイ
シンを含む培地上にまき、ｐＧＶ３８５０とｐＯＫＬＤ
ｃのコインテグレートを持つアグロバクテリウムを選抜
した。

タバコへの導入には、リーフディスク法（ｌｌｏｕｓｃ
ｈｅｔ　ａｌ、（１９８５）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ　３．６３７−６４２）　）を用いた。タバコ　
（サムスン）の葉を直径８薗の円形に打ち抜き、これを
ｐＧＶ３８５０とｐ　０ＫＬＤＣのコインテグレートを
持つアグロバクテリウム・ツメファシェンスの培養液に
浸した。数分後に弓き上げ、抗生物質を含まないＭＳ培
地（フローラボラトリー社製）上に４８時間置いた後、
カナマイシンを含むＭＳ培地（フローラボラトリー社製
）上に置いて２５°Ｃに保った。カナマイシンの添加は
、形質転換植物細胞を選抜するためである。３−４週間
後、葉片の周辺部にカルスが形成され、不定芽が誘導さ
れた。この不定芽を切取り、ホルモンを含まないＭＳ培
地に移して、上記と同じ条件に保った。約２週間後に発
根した植物体を、形質転換植物体とした。

３）ＬＤＣ−ＲＮＡのタバコ細胞中の複製上記の形質転
換植物の葉から、常法によりトータルＲＮＡを抽出した
。このＲＮＡ　１μｇを、グリオキサールで変性させた
のち、１％アガロースで電気泳動し、ナイロンフィルタ
ーに移した後、ＴＭＶ−ＬｃＤＮＡをプローブとしてノ
ーザンプロット分析を行った。その結果を第２図に示し
た。

レーン１−３は、夫々独立の形質転換体より抽出したＲ
ＮＡであることを示している。またレーン４は、普通の
タバコより抽出したＲＮＡを、また、レーン５は、精製
したＴＭ　Ｖ　−ＲＮＡｌｏｐｇを泳動したものである
。第２図に示したように、染色体に組み込んだＬＤＣに
由来するＲＮＡが生成されている。ＬＤＣ−ＲＮＡの発
現量が、単に３５３プロモーターから転写されるＲＮＡ
と比較して非常に多いことは、転写されたＬＤＣ−ＲＮ
Ａが、細胞中で複製されていることを裏づけでいる。

４）１３０Ｋ及び１８０にタンパク質の発現上記の形質
転換植物の葉から、常法により全タンパク質を抽出し、
その２０μｇをポリアクリルアミド電気泳動し、ニトロ
セルロースフィルターに移した後、抗１３０にタンパク
質抗体を用いてウェスタンプロット分析を行ったその結
果を、第３図に示す。レーン１．２は、各々独立の形質
転換体、またレーン３は、普通のタバコより抽出したタ
ンパク質を泳動したことを示している。この図は、ＬＤ
Ｃ−ｃＤＮＡを組み込んだタバコで、１３０にタンパク
質が、発現していることを示している。

又、１８０にタンパク質は、１３０にタンパク質のり一
ドスルー産物であり、１３０にタンパク質が発現された
ことから、１８０にタンパク質も発現されていると考え
られる。

実施例２ ベクターの構築と上記形質転換クハコ細胞中での複製と
発現 １）ｐＬＦＬＤＲシリーズの作成。

作成の一連の過程と、その構成を、第４図に示した。

ア）ｐＬＦＬＤＲ２１の作成。（「第４図（ａ）参照」
）既に知られている、ＲＮＡ合成用のベクターにＴＭＶ
の全長に対するｃ　ＤＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼによ
り、ＲＮＡ合成を行うためのプロモーター（図中Ｐｒｒ
ｌで示す。）の下流に、５゛末端がＴＭＶのものと同じ
くなるように連結し、かつ３゛末端に制限酵素Ｍｌｕｌ
の切断部位をもつような構造で組み込んだＴＭＶ−ＲＮ
Ａ合成用のベクターｐＬ　Ｆ　Ｗ　３　（Ｍｅｓｈｉ　
ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、（［ＩＳＡ、　８３５０４３−５０４７．）５
μｇを、制限酵素Ｓｔｕ　Ｉ　（宝酒造株製）で完全消
化し、プロモーターＴＭＶ−ＬｃＤＮＡの５°領域さら
に３゛領域を含む約４．７ｋｂｐの断片を抽出し、Ｔ４
リガーゼ（全酒造■製）により連結し、大腸菌ＨＢＩＯ
Ｉ（全酒造■製）に形質転換し、プラスミドｐＬＦＬＤ
Ｒ２１を作成した。

イ）ｐＬＦＬＤＲ２２の作成。（「第４図（ｂ）参照Ｊ
）上記のｐＬＦＷ３　　（５μｇ）を制限酵素Ｓｔｕ　
ＩとＭｌｕ　Ｉで完全消化して得たプロモーターとベク
ターの部分を含む約３．７ｋｂｐの断片と、ｐＬＦＷ３
をＫｐｎ　ＩとＭｌｕ　Ｉで完全消化して得たＴＭＶ−
ＬｃＤＮＡの３゛領域を含む断片とを、それぞれ電気泳
動にかけて分離し抽出した。また、ｐＵｃ１９をＨｉｎ
ｄｌｌｌ　（全酒造■製）で切断し得られる断片をＤＮ
Ａポリメラーゼのクレノーフラグメント（全酒造■製）
により平滑末端にした後、Ｋｐｎ　Ｉで完全消化し、電
気泳動にかけてリンカ−サイトの部分を分離し抽出した
。これら３つのフラグメントを混合し、Ｔ４リガーゼに
より結合させ、大腸菌ＨＢ　１０１に形質転換すること
によってプラスミドＰＬＦＬＤＲ２２を作成した。

つ）ｐＬＦＬＤＲ２３の作成。（「第４図（ａ）参照」
）上記のｐＬＦＷ３（５μｇ）を、制限酵素Ｂｇｌで完
全消化した後、電気泳動により、プロモーターＴＭＶ−
ＬｃＤＮＡの５′領域さらに３゛領域を含む約７．８ｋ
ｂρの断片を抽出しＴ４リガーゼにより連結し、大腸菌
ＨＢＩＯＩに形質転換することによりプラスミドｐＬＦ
ＬＤＲ２３を作成した。

２）ｐＬＦＬＤＲシリーズのＲＮＡの合成ｐＬＦＬＤＲ
のプラスミド（ｐＬＦＬＤＲ２１，２２，又は２３）　
１０μｇを、制限酵素旧ｕｌで完全消化した後、既知の
方法（Ｍｅｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、（１９８８）Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

ＵＳＡ、７，８３．５０４３−５０４７）により、ｍ　
７　ＧｐｐｐＧの存在下で大腸菌由来のＲＮＡポリメラ
ーゼ（ファルマシア社製）で処理してＲＮＡの５゛末端
にキャンプ構造を持つＲＮＡ約０．３μｇを合成した。

３）合成したＲＮＡの植物細胞への導入上記の１３０Ｋ
及び１８０にタンパク質が発現している形質転換植物の
葉を、セルラーゼオノズヵＲ１０１，４％　マセロザイ
ムＲ−１００，４％０．４Ｍ　シュークｏ−ス（ｐＨ５
，５）の液中で、２５°Ｃ−晩保温することにより、プ
ロトプラストを調製した。このプロトプラストを、Ｃａ
Ｃ１ｚ　２．７５％ＭＥＳ　０．０５％で洗浄後、０．
５Ｍマンニトール５ｍＭ　ＭＢ２７０ｍＭにＣ１に懸濁
した。このプロトプラス）　５　ＸＩＯ’個に、上記２
）で合成したＲＮＡを混合して、既成のエレクトロポレ
ーションの方法（Ｏｋａｄａ　ｅｔ　ａｌ、（１９８６
）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　２７，６
１９−６２６）により、ＲＮＡを細胞中に導入した。Ｒ
ＮＡを導入した細胞は、ＮＴ培地に懸濁し、２５°Ｃで
、−日培養した。

４）導入したＲＮＡの複製 ＲＮＡを導入し、−日培養した上記の細胞より、常法に
より全タンパク質を抽出し、アクリルアミド電気泳動後
、ニトロセルロースフィルターに移し、抗コートタンパ
ク質抗体によってウェスタンプロット分析を行った。結
果を第５図に示す。

第５図においてレーン１は、ＲＮＡを導入していない形
質転換細胞より、またレーン２．３．４は、それぞれＬ
ＤＲ２３，ＬＤＲ２１１ＬＤＲ２２のＲＮＡを上記の細
胞に導入し、その細胞より抽出したタンパク質であるこ
とを示している。また、レーン５は、上記のｐＬＦＷ３
より合成したＲＮＡを、普通の細胞に導入し、その細胞
より抽出したタンパク質であることを示している。

１３０Ｋ及び１８０にタンパク質の欠如したｐＬＦＬＤ
ＲシリーズのＲＮＡを、形質転換植物細胞中に導入した
細胞からサブゲノムのＲＮＡより発現されるコートタン
パク質が発現された。このことは、とりもなおさず、こ
の導入したＬＤＲシリーズのＲＮＡが、形質転換細胞中
で発現している１３０Ｋ及び１８０にタンパク質の働き
によって、ウィルスの複製様式によって増幅されたこと
を示すものである。

〔発明の効果〕

本発明において簡単な遺伝子操作により、植物体または
植物細胞により大量の有用物質を発現、第１図はベクタ
ーｐＯＫＬＤｃ構築の図、第２図はＬＤＣ形質形質転換
コバ３葉抽出したＲＮＡのノーザンプロット分析の結果
を示す図、第３図はＬＤＣ形質形質転換コバ３葉抽出し
たタンパク質の抗１３０にタンパク質抗体によるウェス
タンプロット分析の結果を示す図、第４図はヘクターＰ
ＬＦＬＤＲシリーズ作成の一連の過程とその構成を示す
図、第５図はＬＤＣプロトプラストにＬＤＲシリーズＲ
ＮＡを導入した細胞より抽出したタンパク質の抗コート
タンパク質抗体によるウェスタンプロット分析の結果を
示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、イ）植物ウィルスの複製に関与するタンパク質をコ
   ードする遺伝子を植物細胞または植物体の染色体に組み
   込み、上記タンパク質を発現できる植物細胞または植物
   体を作成し、 ロ）上記タンパク質の認識部位を有し、該タンパク質に
   より複製されるベクターに、所望の外来遺伝子を挿入し
   、組換えベクターを作成し、 ハ）上記組換えベクターを、上記イ）で作成した植物体
   及び細胞に導入することを特徴とする植物細胞または植
   物体における外来遺伝子の発現方法。 ２、組換えベクターが植物ウィルスのゲノムの一部を含
   むことを特徴とする請求項１記載の外来遺伝子の発現方
   法。