JPH04164097A - ペプチドおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明はペプチドおよびその用途に関する。

本発明によって提供されるペプチドは新規であり、　ヒ
トＴ細胞白血病つィルス■型（以下、これをＨＴＬＶ−
ＩＩと略称する）関連抗原に対する特異性を有する抗体
（以下、これを抗ＦＩＴＩ、Ｖ−ｆｆ抗体と略称する）
とのみ特異的に結合する能力を有する。

本発明のペプチドはヒトＴ細胞白血病つィルスＩ型（以
下、これをＨＴＬＶ−Ｉと略称する）関連抗原に対する
特異性を有する抗体（Ｊ５下、これを抗Ｈ丁ＬＶｉ抗体
と略称する）とは交叉反応を起こさないので、抗ＨＴＬ
Ｖ−ｆｆ抗体の特異的な測定に利用できる。

本発明によって提供される抗ｉ＋ｎ、ｖ−ｎ抗体の測定
試薬は、血清または血漿中の抗ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体を高
感度で検出する能力を有しており、抗ＨτＬＶ−Ｉ！抗
体の測定において有用である。

［従来の技術］ ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−ＩＩはヒトの悪性腫瘍の特殊
な形態と結びついている。　　ＨＴＬＶ−Ｉは成人Ｔ細
胞白血病として知られている悪性腫瘍、ＨＴＬＶ−Ｉ関
連を髄症または熱帯性痙性麻痺として知られる慢性骨髄
障害の病因ウィルスである［プロシーディングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オ
ブ・ザ・ユナイテッド・ステイッ・オブ・アメリカ（Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａ
ｌＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈ
ｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　ｏｆ＾ｍｅｒｉｃａ
）　、　　＄　７８巻、　第６４７６頁（１９８１年）
；　ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）　、　　＠　７巻、第
１０４〜１０５頁（１９８６年）；　ランセット、第２
巻、第４０７〜４１０頁（１９８５年）参照］、一方、
）ＩＴＬＶ−ＩＩは病原体としては毛状細胞白血病とい
われる異常なＴ細胞性悪性腫瘍を持つ稀な患者について
報告されているだけである［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）　、　　ＩＩ　２１８響、　　１１！　５７１〜５
７３頁（１９８２年）参照コ、シかし、ポリメラーゼ連
鎖核酸増幅法を用いて行われた疫学的研究によると、Ｈ
ＴＬＶ反応性抗体を持つ麻薬乱用者の大多数はＨＴＬＶ
−ＩよりもむしろＨＴＬＶ−Ｉｆに感染している［サイ
エンス、第２４４＃Ｊ、第４７１〜４７５頁（１９８９
年）参照］、この研究はＨＴＬＶ−１感染症の多発地域
のいくつかはＨＴＬＶ−１１感染症の多発地域であるか
も知れないということを示唆する。これらの疾病を明瞭
に区別する簡単な血清学的試験はそれらの感染経路の解
明と病理学的分類のために必須である。

しかし、ＨＴＬＶ−ＩＩの血清診断にとって主要な制約
ｔ！、　　）ＩＴＬＶ−ＩＩ　ａ！染ヲＨＴＬＶ−１６
染力ラ区別スルコトの困難性であり、この困難性はこれ
ら２つのウィルスのそれぞれのアミノ酸配列間の比較的
高い相同性に起因する本質的な交叉反応性のためである
［サイエンス、　第２２５巻、　第５７１〜５７３頁　
（１９８２年）参照］、全ウィルス溶解物を抗原として
用いる抗原抗体反応を利用した従来の血清診断法では。

ＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ−ＩＩとの間のアミノ酸配列の
よく保存された領域をもつ抗原に対する部分的な交叉反
応性のために、）ＩＴＬＶ−Ｉ感染からＨＴＬＶ−ＩＩ
感峻を明確に区別することができていない、すなわち。

ＨＴＬＶ−１はＨＴＬＶ−ＩＩと密接に関係しており、
）ＩＴＬＶ　−■プロウィルスのタンパクのコード領域
はヌクレオチドレベルにおいてＨＴＬＶ−Ｉのそれと約
６０％の相同性を示す［プロシーデインゲス・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・
ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ、　３１
８２巻、　ｊＩ　３１０１〜３１０５頁　（１９８５年
）参照コ。

ＨＴＬＶ−ＩＩのｇａｇ前駆体タンパクは１５−、　２
４−および９−にＤａのタンパクに開裂し、これらは相
当するＨＴＬＶ−Ｉのタンパクとそれぞれ５５％、８５
％および６８％の相同性を示す、またこの２つのレトロ
ウィルスのｅｎｖ前駆体タンパクのタンパク加水分解部
位から予測される表面糖タンパクと膜タンパクのアミノ
＊ｉｉ！列の相同性は６３％と７３％である。これらの
事実は、全ウィルス溶解物を抗原として用いる測定にお
いては）ＩＴＬＶ−１感染とＨＴＬＶ−ＩＦ感染の信頼
性ある区別が不可能であることを示唆している。

［発明が解決しようとするｓｇ］ 合成ペプチドは真性のウィルスタンパクに対していくら
かの潜在的優位性を持つ０合成ペプチドは生物的手法に
よることなく調製されるので、非特異的抗体吸着を起こ
しうる混入物質をよりわずかにしか含まない、従って、
発明者らはＨＴＬＶ−ＩＩのペプチドにおける高抗原性
を有する部位を選択し、この部位に相当するペプチドの
合成を試みた。

しかして、本発明の１つの目的は抗ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体
と特異的に結合する能力を有するペプチドを提供するこ
とにある。本発明の他の１つの目的は抗ＨＴＬＶ−ＩＩ
抗体の測定試薬を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明によれば、上記の目的は、 １、式 ％式％ で示されるペプチド。

２、式 ％式％ で示されるペプチド、および ３、上記のペプチドからなる抗ＨＴＬＶ−１１抗体の測
定試薬を提供することによって達成される。

本明細書においては各種アミノ酸残基を次の略号で記述
する。

Ａｌａ：　　Ｌ−アラニン残基 Ａｒｇ：　　Ｌ−アルギニン残基 ＾ｓｎ：　　Ｌ−アスパラギン残基 Ａｓｐ：　　Ｌ−アスパラギンｉ！［残基Ｃｙｓ：　　
Ｌ−システィン残基 Ｇｉｎ：　　Ｌ−グルタミン残基 Ｇｌｕ：　　Ｌ−グルタミン酸残基 Ｇｌｙ：　　グリシン残基 Ｈｉｓ：　　Ｌ−ヒスチジン残基 ＩＩｓ：　　Ｌ−イソロイシン残基 Ｌｅｕ：　　Ｌ−ロイシン残基 Ｌｙｓ：　　Ｌ−リシン残基 Ｎｅｔ：　　Ｌ−メチオニン残基 Ｐｈｅ：　　Ｌ−フェニルアラニン残基Ｐｒｏ：　　Ｌ
−プロリン残基 Ｓｅｒ：　　Ｌ−セリン残基 Ｔｈｒ：　　Ｌ−トレオニン残基 Ｔｒｐ：　　Ｌ−）リプトファン残基 Ｔｙｒ：　　Ｌ−チロシン残基 Ｖａｌ：　　Ｌ−バリン残基 また本明細書においては、常法に従ってアミノ酸配列を
Ｎ末端のアミノ酸残基が左側に位置し、Ｃ末端のアミノ
酸残基が右側に位置するよう番こ記Ｃ末端のアミノ酸残
基が右側に位置するように記述する。

本発明のペプチドはＨＴＬＶ−ｎウィルスのｅｎｖ遺伝
子またはｔａｇ遺伝子にコードされるペプチドに相当す
る。これらのペプチドの合成は、ペプチドの合成におい
て通常用いられる方法、例えば、固相合成法または段階
的伸長法、フラグメント縮合法のような液相合成法によ
り行われるが、固相合成法により行うのが操作上簡便で
ある［例えば、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケ
ミカル・ソサエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　
Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｃｈｅ＋ｎ１ｃａｌＳｏｃｉｅｔ
ｙ）、　第８５巻、　第２１４９−２１５４頁（１９６
３年）；日本生化学会ｖａ［生化学実験講座エタンノ々
り質の化学■　化学修飾とペプチド合成」　（昭和５２
年１１月１５日　株式会社東京化学同人発行）、第２０
７〜４９５頁；　日本生化学全編［続生化学実験講座２
タンパク質の化学（下）」（昭和６２年５月２０日株式
会社東京化学同人発行）、第６４１〜６９４頁など参照
コ。

本発明のペプチドの固相合成法による製造は、例えば、
スチレン−ジビニルベンゼン共重合体などの反応溶媒に
不溶性である重合体に目的とするペプチドのＣ末端に対
応するアミノ酸またはそのアミドをそれらが有するα−
ＣＯＯＨ基またはα−ＣＯＮＨ２基からそれぞれ水素原
子を除いて得られるα−Ｃ０〇−基またはα−ＣＯＮＨ
−基を介して結合させ、次いで該アミノ酸またはそのア
ミドに目的とするペプチドのＮ末端の方向に向って、対
応するアミノ酸またはペプチド断片を該アミノ酸または
ペプチド断片が有するα−ＣＯＯＨ基以外のα−アミノ
基などの官能基を保護したうえで縮合させて結合させる
操作と、該結合したアミノ酸またはペプチド断片におけ
るα−アミノ基などのペプチド結合を形成するアミノ基
が有する保護基を除去する操作を順次繰返すことによっ
て、ペプチド鎖を伸長させ、目的とするペプチドに対応
するペプチド鎖を形成し、次いで該ペプチド鎖を重合体
から脱離させ、かつ保護されている官能基から保護基を
除去することにより目的とするペプチドを得、次いでこ
れを精製することによって実施される。ここで、ペプチ
ド鎖の重合体からの脱離および保護基の除去は、フン化
水素を用いて同時に行うのが副反応を抑制する観点から
好ましい、また、得られたペプチドの精製は逆相液体ク
ロマトグラフィーで行うのが効果的である。

本発明のペプチドは抗ＨＴＬＶ−１抗体とは反応せず、
特異的に抗）ＩＴＬＶ−ＩＩｎ抗体結合する能力を有す
るので、ＨＴＬＶ−ＩＩ　Ｆ５染者のみを特異的に検出
することができ、ＨＴＬＶ−１１染とＦＩＴＬＶ−ｆｆ
感染トヲ区別するための測定試薬として用いることがで
きる。

本発明のペプチドを利用した抗１（ＴＬＶ−ｎ抗体の測
定は、蛍光免疫測定法（以下、これをＩＰ法と略称する
）、ゼラチン粒子凝集法（以下、これをＰＡ法と略称す
る）、放射免疫測定法、酵素免疫測定法（以下、これを
ＥＬＩＳＡと略称する）のいずれかを利用することによ
って行われる。これらの方法はいずれも公知であるが、
例えばＥＬＩＳＡを利用する場合について以下に説明す
る。

測定系全体の構成要素は担体、測定試薬としての本発明
のペプチド、ブロッキング剤、被検試料、標識用抗体、
酵素および発色剤からなる。担体に本発明のペプチドを
コーティングし、次いでペプチドコーティング担体にブ
ロッキング剤を作用させて担体上の非特異的なタンパク
結合部位をブロックし、ペプチドコーティング担体に被
検試料を加えてインキュベートし、続いて酵素標識抗体
を接触させてインキュベートし、次にこのように処理し
た担体に発色剤を加えてインキュベートし、酵素と発色
剤との反応の反応産物の生成量を吸光度計を用いて測定
する。担体としてはエンザイムイムノアッセイ用カップ
、またはガラスもしくは樹ｆｉｌ製のビーズを用いるの
が好ましい。測定に先立ち、本発明のペプチドを０．０
１Ｍ炭酸１１衝液に溶解し、その溶液を例えばポリスチ
レン製エンザイムイムノアッセイ用カップに加えたのち
、４℃で一夜または室温で３時間静置することにより、
担体表面は本発明のペプチドによってコートされる。

担体上の非特異的なタンパク結合部位をブロックするた
めのブロッキング剤としては、例えば、牛血清アルブミ
ン、カゼイン、脱脂粉乳、ａｌ識用抗体である抗ヒト１
．Ｇ抗体または抗ヒトエにに抗体を得るための免疫原動
物の血清、ゼラチンなどが用いられる。標識用抗体とし
ては例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体など
が用いられる。また酵素としては例えば、アルカリフォ
スファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、ベータガラクトシダーゼなどが挙げられる。測定
に先立ち、ゲルタールアルデヒドなどの２個以上の官能
基を有する化合物を用いて、標識用抗体に酵素を結合せ
しめてコンジュゲートとし、測定系全体の構成要素の一
部として予め準備しておくことが好ましい。発色剤は選
択した酵素に応じて適宜使用すればよい。例えば、酵素
としてペルオキシダーゼを選択した場合には０−フェニ
レンジアミンなどを使用することが好ましい。

［実施例］ 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが１本発
明はこれらの実施例により限定されるものではない。

実施例１ 式 ％式％ で示される）ＩＴＬＶ−ＩＩ関連ペプチドをペプチド自
動合成装置〔米国アプライド・バイオシステムズ（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製、モデル４３
１Ａ（Ｍｏｄｅｌ　４３１＾）コを用いて固相合成法に
より合成した。

すなわち、４−［Ｎ−α−（ｔ−ブトキシカルボニル）
−り一ロイシルオキシメチル］フェニルアセトアミドメ
チル基 （ＣＨ３）　２ Ｍ ＣＨ２ を０．７２ミリモル／ｇ（樹ｎ）の割合で有するスチレ
ン−ジビニルベンゼン共重合体［スチレンとジビニルベ
ンゼンの構成モル比：９９対１］からなる粒状樹脂［米
国アプライド・パイオシステふズ社製、ＰＡＭロイシン
（Ｌｅｕｃｉｎｅ）、１Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕコを６９４
ｍ　ｇ用い、これに第１表に示す一連の操作に従って目
的とするペプチドのＮ末端の方向に向って対応するＬ−
アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、し−グルタミン酸２
Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ
−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−
トレオニン、Ｌ−バリンを順次結合させた。縮合反応に
おいて、上記のアミノ酸はそれぞれＮ−（ｔ−ブトキシ
カルボニル）−Ｌ−アスパラギン酸−β−ベンジルエス
テル、Ｎ−α−（１−ブトキシカルボニル）−Ｌ−グル
タミン、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−グルタ
ミン酸−γ−ベンジルエステル、Ｎ−α−（し−ブトキ
シカルボニル）　−Ｎ−ｉｓ−ジニトロフェニル−Ｌ−
ヒスチジン、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−イ
ソロイシン、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−り一ロ
イシン、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−フェニ
ルアラニン、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−プ
ロリン、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｏ−ベンジ
ル−し−セリン、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−〇
−ベンジルーＬ−）レオニン、Ｎ−（ｔ−ブトキシカル
ボニル）−Ｌ−バリンとして用い、それらの使用量は基
質に対して約４倍モル量とした。縮合反応は室温下で行
った６　反応時間は１００〜１１０分間の範囲内であっ
た。全てのアミノ酸についての反応操作が終了したのち
、得られた樹脂をグラスフィルター上でジエチルエーテ
ル、ジクロロメタンおよびメタノールを用いて順次洗浄
し、次いで真空乾燥することによって２．０５ｇの乾燥
樹脂を得た。

ガラス製のフラスコ中で乾燥樹Ｊ］！１．０ｇをチオフ
ェノール２ｍ　ｌおよびＮ、　　Ｎ−ジメチルホルムア
ミド４８ｍ　ｌと混合し、室温で３０分間スターラーに
より攪拌した。上滑を除去し、再び同じ操作を３回繰り
返した＃　残液をジクロロメタンとメタノールで洗浄し
たのち、減圧下に乾燥し、　　１．０ｇの樹脂を得た。

ポリトリフルオロモノクロロエチレン製ノ反応容器（株
式会社ペプチド研究所製、）ＩＦ−反応装置１！［）中
で、得られた乾燥樹ｎ１．ｏｇをアニソール１．５ｍ　
ｌおよびエチルメチルスルフィド０．２５ｍ　ｌと混合
し、この混合物に・２０　”Ｃの温度でフン化水素１０
ｍ１を加え、同温度で３０分間、次いで０℃の温度で３
０分間攪拌した。得られた反応混合物からフン化水素、
アニソールおよびエチルメチルスルフィドを減圧下に除
去し、残留物をグラスフィルター上でジエチルエーテル
を用いて充分洗浄した。得られたその残留物を２規定の
酢酸水溶液で抽出し、抽出液を凍結乾燥することにより
ペプチドの粗製物を７８０ｍ　ｇ得た。得られた粗製物
を分取用逆相高速液体クロマトグラフィー［カラム：　
オクタデシル化シリカゲル（粒径：１５μｍ）充填カラ
ム（内径：５０ｍｍ、長さ：　　３００ｍｍ）、日本ウ
ォーターズ社製、　　ｐ　ＢＯＮＤＡＳＰＨＥＲＥ　　
ＩｓμＣ１ｇ−１００Ａ；　　移動相：　トリフルオロ
酢酸を０．０５容量％含有するアセトニトリルと水との
混合溶媒（アセトニトリルの濃度は３０分間で２０容量
％から４ｏ容愈％になるように漸次変化させた）コで精
製することによって、目的とするペプチドのｗ製物を５
４０ｍ　ｇ得た。得られた８１１物を分析用逆相高速液
体クロマトグラフィー［カラム：　オクタデシル化シリ
カゲル（粒径：　５μｍ）充填カラム（内径：４ｍｍ、
長さ：　　１５０ｍ　ｍ　）、東ソー株式会社製、ＴＳ
に−ｇｅｌ　　ＯＤＳ４０ＴＭ　　；　　移動相：　ト
リフルオロ酢酸を０．０５容量％含有するアセトニトリ
ルと水との混合溶媒（アセトニトリルの濃度は３０分間
で５容量％から５０容量％になるように漸次変化させた
）；流速：１ｍｌ／分：　検出法：　波長２１０ｎｍに
おける吸光度］に付したところ、２０．６分に単一の鋭
いピークが示さ九た。高速原子衝撃法（以下、これをＰ
ＡＢ法と略称する）マススペクトルにより求めた精製物
の分子量は２８５３であった（理論値＝２８５３．０３
）　。

以下余白 ｇＪ１表 ２　洗浄　　　　　　ジ−クロロメタン　　　　　　　
　　　　　　　３５ビμリトーン ４　洗浄　　　　　　Ｎ−メチル七°ロリトーン　　　
　　　　　　　５６チルヒ゛ロリトーン ７　洗浄　　　　　　シークロロメクン　　　　　　　
　　　　　　　４６実施例２ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式１式％ で示されるＨＴＬＶ−１１開連ペプチドを得た。得られ
たペプチドを分析用逆相高速液体クロマトグラフィー（
前記と同じ）に付したところ、１７．１分に単一の鋭い
ピークが示された。　　ＦＡＢ法マススペクトルにより
求めたペプチドの分子量は１２８６であった（理論値：
　　１２ｇ６．３９）。

参考例１ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式１式％ で示されるＨＴＬＶ−ｎ関連ペプチドを得た。得られた
ペプチドを分析用逆相高速液体クロマトグラフィー（前
記と同じ）に付したところ、１８．６分に単一の鋭いピ
ークが示された。　　ＦＡＲ法マススペクトルニより求
めたペプチドの分子量は２７４９であった（理論（１１
！：　　２７４８．９６）。

参考例２ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより１式％式％ で示されるＨＴＬＶ−１関連ペプチドを得た。得られた
ペプチドを分析用逆相高速液体クロマトグラフィー（前
記と同じ）に付したところ、１９．３分に単一の鋭いピ
ークが示された。ＦＡＢ法マススペクトルにより求めた
精製物の分子量は３２７１であった（理論値：　　３２
７０．５４）。

参考例３−５ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、参考例２で得られたＨＴＬ
Ｖ−１関連ペプチド（１−３１）の部分ペプチド（１−
１３）、部分ペプチド（１１−２２）、部分ペプチド（
２０−３１）をそれぞれ得た。得られたペプチドを分析
用逆相高速液体クロマトグラフィー（前記と同じ）に付
したところ、それぞれ１９．７分、１８．２分、１７．
５分に単一の鋭いピークが示された。　　ＰＡＢ法マス
スペクトルにより求めたペプチドの分子量はそれぞれ１
３４０．１３　Ｚ３．　１３１１であった（各理論（Ｉ
ｔ　：　　１３４０　、３３．　１３２３　、３４．１
３１０．４５）　。

参考例６ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、式１式％ で示されるＨＴＬＶ−ｎ関連ペプチドを得た。得られた
ペプチドを分析用逆相高速液体クロマトグラフィー（前
記と同じ）に付したところ、１８．５分に単一の鋭いピ
ークが示された。　　ＦＡＲ法マススペクトルにより求
めたペプチドの分子量は３２６４であった（理論値：　
　３２６３．５４）。

参考例７−８ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、参考例６で得られたＨＴＬ
Ｖ−Ｉｎ関連ペプチド（１−３１）の部分ペプチド（１
−１２）、　　部分ペプチド（２０−３１）をそれぞれ
得た。得られペプチドを分析用逆相高速液体クロマトグ
ラフィー（前記と同じ）に付したところ、それぞれ１７
．４分および１７．９分に単一の鋭い・ピークが示され
た。ＦＡＢ法マススペクトルにより求めたペプチドの分
子量はそれぞれ１２０１および１３６３であった（各理
論値：　　１２０１．３４．１３６３．４６）　。

実施例３ １１里１ ＨＴＬＶ−Ｉキャリア血清　：１５検体Ｈ丁ＬＶ−ｎキ
ャリア血清　＝　　９検体正常ヒト血清　　　　＝９６
検体 しＩｓ＾こ 各血清検体について、下記のＥＬＩＳ＾により吸光度を
測定し、抗ＨＴＬＶ−Ｉ抗体および抗ＨＴＬＶ−ＩＩ抗
体の有無を検定した。

すなわち、実施例１および２で得られたベブチドまたは
参考例１〜８で得られたペプチドをそれぞれ０．０１Ｍ
炭酸緩衝液（ＰＨ９，５）に溶解し、得られたペプチド
溶液をポリスチレン製エンザイムイムノアッセイ用カッ
プ（ダイナチック社製）に各１００μｌずつ加えたのち
、４℃で一夜静置することにより、ペプチドによるコー
ティングを行った。

次いで、得られたアッセイ用カップに含まれるペプチド
溶液を除去したのち、それらのカップに２０容量％の正
常ヤギ血清を含む０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（以
下、これをＰＢＳと略称する）２００μｌを加えて室温
で３時間静置し、非特異的なタンパク結合部位をブロッ
クした。続いて、各アッセイ用カップに含まれる２０容
量％の正常ヤギ血清を含むＰＢＳを除去したのち、それ
らのカップを減圧下に乾燥した。

血清希釈用溶液として１０容量％の正常ヤギ血清を含む
ＰＢＳを上記の各アッセイ用カップに１００μｌずつ加
えたのち、各被検血清（ＨＴＬＶ−Ｉキャリア血清１５
検体、１ｌＴＬＶ−Ｕキャリア血清９検体および正常ヒ
ト血清９６検体）を血清希釈用溶液と被検血清との割合
が２０：１（容量比）となるように加えた。

３７℃で１時間インキュベーション後、それらのカップ
を０．０５容量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回
洗浄した。

得られた各アッセイ用カップに、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体
−ペルオキシダーゼコンジュゲート（１０容量％の正常
ヤギ血清を含むＰＢＳで至適濃度に希釈したもの）１０
０μｍを加えた。３７℃で３０分間インキュベーション
後、それらのカップを０．０５容量％のＴｗｅｅｎ２０
を含むＰＢＳで３回洗浄した。続いて、得られた各アッ
セイ用カップに発色剤（Ｏ−）ユニレンジアミンを０．
３重量％となるように０．０２容量％の過酸化水素を含
む０．１Ｍクエン酸−リン酸ｓ！回液（Ｐｌ（５，６）
に溶解したもの）１００μｍを加えた。

室温で１５分間静置したのち、２Ｎ硫酸１００μｌを加
えて反応を停止し、反応液の４９２ｎｍの吸光度０Ｄ４
９２値を測定した。

１遠 測定結果を第２表に示す、正常ヒト血清９６検体の０Ｄ
ｔｅ２４１１よりカットオフ値を設定し、被検血清の各
ペプチドに対する抗ペプチド抗体陽性または陰性の判定
を行った。カットオフ値は、（（正常ヒト血清のＯＤＪ
　９２僅の平均値）＋２　）の計算式により求めた。ま
た、上式により求められたカットオフ値により陽性と判
定された各被検血清のＯＤｉ　ｅ　を値の大きさにした
がって、抗体価をそれぞれカットオフ値以上０．２５以
下：　（÷）、０．２５−０．５：　　２　（＋）、０
．５−０．７５：　　３　（＋）、０．７５−１．０：
　　４（＋）、１．０以上：５（＋）とした、その結果
、実施例１で得られたＩＩＴＬＶ−ＩＩ関連ペプチドを
用いたＥＬＩＳＡでは、ＨＴＬＶ−Ｉｎキャリアのすべ
ての被検血清が厘応し、陽性と判定された（　９／　９
）が、ＨＴＬＶ−■キャリアの血清は反応しなかった（
　０／　１５）　。

それに対し、参考例２によって得られたＨＴＬＶ−１関
連ペプチドを用いたＥＬＩＳＡでは、１（ＴＬＶ−ｎキ
ャリアのすべての被検血清が強く反応し、陽性と判定さ
レタ（１５／１５）が、　　ＨＴＬＶ−ｎキャリアノ血
清とは反応しなかった（　１／　９）　、　　すなわち
、実施例１で得られたペプチドを用いたＥＬＩＳＡでは
抗ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体のみが高度に特異的に検出され、
　　）ＩＴＬＶ−ＩＪ８染とＨＴＬＶ−Ｉｒ感染の血清
学的区別が可能となることが明らかとなった。また、実
施例２で得られたＨＴＬＶ−ＩＩ関連ペプチドを用いた
Ｅｔ、ＩＳＡでも同様にＨＴＬＶ−ｎキャリアの血清の
みが反応することが判明した。

以下余白 第２表 すなわち、本発明による合成ペプチドを用いたＥＬＩＳ
Ａを行うことによって、ＰＡ法および全ウィルス溶解物
を抗原として用いたＥＬＩＳＡでは排除することができ
なかった）ＩＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ−ＩＩとの交差反応
を排除できることを示している。

以上の結果、本発明のペプチドを用いることによってこ
れまで判別が不可能であったＦＩＴＬＶ−１ｇ染とＨＴ
ＬＶ−］１感染が明瞭に区別できることが明らかとなっ
た。

〔発明の効果］ 本発明によれば、抗ＨＴＬＶ−ｎ抗体と特異的に結合す
る能力を有するペプチドが提供される。

このペプチドにより抗ＨＴＬＶ−ｎ抗体の測定試薬を提
供することが可能となった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 Ｈ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ
   −Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−
   Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａ
   ｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｖａ
   ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨで示されるペプチド。 ２、式 Ｈ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ
   −Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−
   ＯＨ で示されるペプチド。 ３、請求項１または請求項２記載のペプチドからなるヒ
   トＴ細胞白血病ウィルスII型関連抗原に対する特異性を
   有する抗体の測定試薬。