JPS62500452A - ヒト細胞形質転換に関連するレトロウイルスポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト細胞形質転換に関連するレトロウィルスポリペプチド血」Ｌ夏」Ｌ且 光ユ夏分… ヒト−リンパ球、特にＴ−細胞に感染することができ、こらをリンパ腫及び白血 病へ形質転換することができるレトロウィルスの最近の発見はこれらのタイプの 腫瘍の病因への洞察を提供する。はとんどの場合、ヒト以外の哺乳類動物に観察 される形質転換性レトロウィルス性のウィルスは２群、すなわち、ゲノムに組み 込まれ、そして細胞性遺伝子の活性化を伴って挿入変異誘発による形質転換を導 くと考えられる慢性形質転換性ウィルス、及び細胞性腫瘍遺伝子又はプロ）−腫 瘍遺伝子に関連する特定の形質転換配列（ウィルス性腫瘍遺伝子）を担持する急 性形質転換性レトロウィルスに分けられる（　Ｈａｙｗａｒｄ等、Ｎａｔｕｒｅ （１９８１）　２９０：４７５；Ｎｕｓｓｅ等、　Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３ ０７　：１３１；Ｐａｙｎｅ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８２）　２９５：２０９） 　、しかしながら、ＨＴ　Ｌ　Ｖとして知られる、ヒトＴ−リンホトロピックウ イルスの一層最近発見されたファミリーは特定の部位において組み込まれず、ま た正常な細胞性相同性を伴うウィルス性腫瘍遺伝子を有しないようである。従っ て、ＨＴＬＶファミリー中のウィルスによる形質転換の機作は他の既知のレトロ ウィルスとは異る様である。［ＩＴＬＶは若干の破壊的な疾患と関連しているの で、ＩＩＴＬＶファミリー中のウィルスの作用機作に興味が持たれる。特に、Ｉ ＩＴＬＶ−１は成人Ｔ−細胞白血病に関連しており、そしてＩＩＴＬＶ−１１は 毛状細胞白血病（ｈａｉｒｙ　ｃｅｌｌｌ、ｅｕｋｅｍｉａ）のＴ−細胞変異体 から単離されている。

診断、治療、及びＴ−細胞の制御された形質転換又は感染を可能にするインビト ロ適用を可能にするためにＨＴ　Ｌ　Ｖファミリー中のウィルスによる形質転換 又は感染の機作を理解することができるためには、ＨＴＬＶファミリー中のウィ ルスがＴ−細胞又は他の免疫細胞を形質転換又は感染する機作を決定し、そして 形質転換又は感染、並びにウィルスの増加又は増殖サイクルに関与する組成物を 特徴付けそして単離することに関心が寄せられる。

史米肢歪旦児双 ＋１ＴＬＶ−■及び−■のヌクレオチド配列はウィルスのｅｎｖ及び３°ＬＴＲ の間に位置する高度に保存された領域を示し、これはウシ白血病ウィルス中の相 同配列中にその単なる類似性を見出す（Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ等、５ｃｉｅｎｃｅ 　（１９８４）　２２５：４１９）　、　５ｅｉｋｉ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ（１９８３）８０：３６１８−３６２２は Ｉｔ　Ｔ　Ｌ　Ｖ−■のＸ配列中の４個のオープンリーディングフレームを報告 している。ｌ１ａｓｅｌＬｉｎｅ等、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８４）　２２５： ４１９、及びＳｈｉｍｏｔｏｈｎｏ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９８４）８１；１０７９−１０８３は、ＩＩＴＬＶ−１１ のＸ配列と称する領域に３個のオープンリーディングフレームが存在することを 報告する。これら２種類のウィルスからのＸ領域のヌクレオチド配列の比較はＩ Ｉ　Ｔ　Ｌ　Ｖｌ　（））　ｐＸ−ＩＶ領領域ＩＩＴＬＶ−ＩＩ　ノルＸ−ｃ領 域の間に有意な配列の相同性（約７５％）を示す。−Ｎ最近のデータは、ヌクレ オチドレベルでの相同性の量がＨＴＶＬ−Ｉ［［のゲノムと１１　Ｔ　Ｌ　Ｖシ リーズの他のウィルスのゲノムとの間で最少であることを示している。

溌ヲ几」し眉二翌 ポリペプチド及びそれに対する抗体が提供され、このポリペプチドはＨＴＬＶフ ァミリー中のウィルス、特にＩＩＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−ＩＩの免疫原部位を 含む発現生成物と関連する。ポリペプチド及びその断片はＨＴＬＶウィルスのＸ 　ｊＪ域の発現生成物に関連し、そして病原性部位に特異的な抗血清又はモノク ローナル抗体の製造のための免疫原として使用することができる。

ポリペプチド及び抗体は、診断において、ウィルスの増殖のために、Ｔ−細胞及 び他の免疫細胞の形質転換又は感染において、そしてこれらのレトロウィルスに よる細胞形質転換又は感染の病因の研究において、試薬として使用することがで きる。特に、ポリペプチドは、ＩＩＴＬＶへの暴露及び／又はそれによる感染と 関連することがここで示される抗−Ｘ−領域蛋白質抗体の検出において使用され る。

、λ体珀方」Ｉ［λ証戴 ＋１ＴＬＶフアミリー中のウィルスのＸ　？、ＩＴ域の発現生成物もしくはその 断片又はこのようなポリペプチドもしくは断片の融合生成物である新規なポリペ プチドが提供される。ポリペプチド及び抗原の両者はポリクローナル抗血清又は モノクローナル抗体の製造のだめの免疫原として役立つであろう。これらの物質 は診断測定、ＩＩ　Ｔ　Ｌ　Ｖの増殖の制御、Ｔ−細胞又は他の免疫細胞の形質 転換又は感染、及びＨＴ　Ｌ　Ｖウィルスによる細胞形質転換の病因の研凭にお いて役立つであろう。

この明細書及び請求の範囲において使用する場合、ＩＩＴＬＶは、ヒトＴ−細胞 及び他の免疫細胞に感染することができ、ＩＩＴＬＶ−■又は−■と実質的な相 同性（≧４０％）を有し、そしてウィルスゲノム中に構造遺伝子工土且、Ｌ土工 及びｅｎｖ、並びに５°−及び３’−ＬＴＲ及びＸ配列を有し、好ましくはｅｎ ｖ及び３’−ＬＴＩ？の間にＸｎＭ域又はウィルスにより発現される蛋白質をコ ードする配列を有するし１−ロウイルスを暗示する。

＋１　Ｔ　Ｌ　ＶのＸ領域により発現される蛋白質は典型的には、特定のウィル ス及び感染される生物又は使用されるセルラインに依存して、約３５ｋｄ〜約４ ２ｋｄの範囲の分子量を有する。さらに一般には、ＩＩＴＬＶのＸ領域によりコ ードされる蛋白質は分子量において約３７ｋｄ〜約４０ｋｄの範囲でる。特にＨ ＴＬＶ−１のＸ配列中のｐＸ−ＩＶとして記載される領域中、及びＨＴＬＶ−Ｉ ＩのＸ配列中ｐＸ−ｃとして記載される領域中にコードされるポリペプチドは、 それぞれ約４０ｋｄ及び約３７ｋｄであるとして特徴付けられる。便宜上、これ らはそれぞれｐ４ＱＸＩ及びｐ３７Ｘｌ＋と称されよう。

これらのポリペプチドはさらに、下記の配列１〜４のいずれか内に含まれる１２ アミノ酸から成る少なくとも１つの配列を有し、好ましくはこれらの配列内に含 まれる少なくとも１４個以上のアミノ酸を有し、そしてさらに好ましくは２又は それより多くの配列の少なくとも部分を有することにより特徴付けられる（ここ で、大きい番号の配列はどＮ−末端に近い）。

配列（１）：　ＣＰＥＨ口（ａａ）　ＡＴＷＤＰ　ｒＤＧＲ配列（２）：　ＩＰ ＲＬＰＳＦＰ’ｒＱＲＴＳ（ａａ）”ＴＬＫ配列（３）：　Ｋ（ａａ）”Ｂ（ａ ａ）”ｐ（ａａ）”ＲＮＧ（ａａ）”５（ａａ）ＡｓＥＰＴＬＧ（ａａ）ＡｃＡ ″′（ａａ）Ａ１″′ＬＰ（ａａ）ＡＩ″Ｌ（ａａ）ＡＡ’ＦＰ（ａａ）ＡｃＰ ＧＬＲＰＱＮ（ａａ）ＡＹＴ（ａａ）　ＡＡ’ＷＧ　（ａａ）　ＡＢ（ａａ）　 ”ＶＶＣ（ａａ）”ＹＬＹＱＬＳＰＰ（ａａ）”ＴＷＰＬ（ａａ）ＡＰｔｌＶＩ ＦＣＨＰ（ａａ）”Ｑ配列（４）：　Ｖ（ａａ）ＡＱＳＳ（ａａ）ＡＡｈ（ａａ ）ＡＡ’ＩＦ（ａａ）”’！ＫＦ　（ａａ）　””ＴＫＡ　（ａａ）　”１１Ｐ Ｓ　（ａａ）　”ＬＬＳｔｌ　（ａａ）　ＡＡＩＩＬＩＱＹＳＳＦＩＩ（ａａ） ＡｈＡＩＩＬ）ＩＬＬＦ（ａａ）ＡＣＥＹＴＮ　ＩＰ　（ａａ）　ＡＳ　（ａａ ）　ＡＬＦＮ（ａａ）　”１ｌ（ａａ）＾”ＥＡＤＤＮ（ａａ）　ＡＡｃ（ａａ ）　ＡｃＢＥＰＱＩＳＰＧＧＬＥＰＰＳＥＫｔｌＲＥＴＥＶ 上記の配列において、 （ａａ）ＸＹは、蛋白質中の２０の天然アミノ酸から選択されるアミノ酸である 。肩記号ｘ、ｙはアミノ酸上の好ましい側鎖の種類を示し、ここで、 Ａは脂肪族側鎖であり、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイ シンを包含し： Ａｃは、酸性側鎖であり、アスパラギン酸及びグルタミン酸を包含し； Ａ、　ｈは、脂肪族−ヒドロキシル側鎖であり、セリン及びスルオニンを包含し ； Ａｍは、アミド含有側鎖であり、アスパラギン及びグルタミンを包含し； ／’１１　ｒは、芳香族側鎖であり、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン 、及びトリプトファンを包含し；Ｂば、塩基性側鎖であり、リジン、アルギニン 、及びヒスチジンを包含し；そして、 Ｓは、硫黄含有側鎖であり、システィン及びメチオニンを包含する。

１個より多くの上記配列を含有する注目のポリペプチドにおいて、アミノ酸配列 １及び２は少な（とも５個のアミノ酸であって、通常１２個以下のアミノ酸によ り、典型的には９個のアミノ酸により分離される。配列２及び３は少なくとも１ ０個のアミノ酸であって、通常３０個より少いアミノ酸、典型的には２２個のア ミノ酸により分離される。配列３及び４は少なくとも２０個のアミノ酸により分 離され、そして２００個又はそれより多数のアミノ酸により分離されていてもよ く、典型的には９１個のアミノ酸により分離される。

これらの配列は一緒に連結されて、それぞれｐ３７”　’　（５Ａ）及びｐ４０ Ｘ’　（５Ｂ）に対応する次の配列のいずれかを有する一層大きなポリペプチド を構成することができる。

の　ρ この発明に従うＩＩ　Ｔ　Ｌ　ＶのＸ領域の発現において抗原エピトープ部位を 代表する好ましいポリペプチド（オリゴペプチド及び一層大きな蛋白′ｆｒ、質 断片）は、次のものを含む。

Ａ：ＣＰｉミＩＩＱＩＴＷＤＰＩＤＧＲＢ　：　ｌＰＩ？ＬＰｓＦｌ）ＴＱＲＴ ！ＶＴＬＫＣ：　ＶＬＱＳＳＳＦＩＦＧ　ＫＦＱＴＫＡＹＩＩＰＳ　ＦＬｌ、５ ＩＩＧＬＩＱＹ　５ＳＦｌｌＳＬｌｌＬ１．ＦＥＩＥＹＴＮＩＰＩＳＩ、Ｌ　Ｆ 　Ｎ　ＩＥに１ミＡｌ）ｌ）Ｎ　Ｉ）ＩｌｉｉＰ旧Ｓ　Ｐ　Ｇ　Ｇ　Ｌ　Ｅ　Ｐ 　Ｐ　Ｓ　Ｅ　Ｋ　Ｉｔ　e　Ｒ ＥＴＩミＶ Ｄ　：　Ｓ　Ｓ　Ｆ　ｔｌ　Ｓ　Ｌｉｔ　１．　Ｌ　Ｆ　Ｅ　Ｅ　Ｓ　Ｓ　Ｆ　 Ｉｆ　Ｓ　Ｌ、　ｌ！　Ｉ、Ｉ、ＦＥＥＹＴＮＩＰＩ　ＳＬk［’ＮｌミＫＥ酎 〕 耐ＮＤＩＩＥＰＱ＋ＳＰ　ＧＧＩ、Ｉ’：ＰＰ５ＥＫＨＦＲＩＥＴＥＶＴＥＶ前 記のポリペプチド、及びその部分は、ＩＩＴＬＶ−Ｘ及び−■のｐＸ発現生成物 中のエピトープ部位に特異的な抗血清又はモノクローナル抗体の製造のための免 疫原として、及びＩＩ　Ｔ　Ｌ　ＶのＸの領域蛋白質に対する抗体を検出するた めの試薬（ラベルされているか、又は未ラベルである）としで、有利に使用する こ止ができる。

この発明の検出方法において有用であるためには、この発明のポリペプチドは実 質上純粋な形で、すなわち典型的には約５０讐八χ又はこれより高い純度で、妨 害蛋白質及び汚染物を実質」二含有しない形で得るのが適当である。好ましくは 、これらのポリペプチドは、少なくとも約８０讐八χの純度、さらに好ましくは 少なくとも約９５イム２純度で、ヒトからの他の蛋白質、ウィルス性蛋白質又は 他の汚染物を実質上含有しない形で単離又は合成される。常用の蛋白質精製技法 を用いて、少なくとも９９匈／−χの均一なポリペプチドを得ることができ、そ してこれらの均一なポリペプチドはこの発明の方法において最も好都合に使用さ れる。さらに、この発明の蛋白質は、イムノツルバントアフィニティークロマト グラフィーにおいて記載される抗体の使用により実質上純粋な形で得ることがで きる。このイムノツルバントアフィニティークロマｌ−グラフィーは、まず抗体 を固体担体に連結し、そして次に連結された抗体をＩＩ　Ｔ　Ｌ　Ｖウィルスの １つに感染した細胞の溶解物と接触せめしることにより行われる。こうして得ら れる蛋白質もこの発明の範囲内であり、そしてＩＩ　Ｔ　Ｌ　Ｖ又はその生成物 の存在を検出するためのこの発明の方法において使用することができる。

約３０アミノ酸より大きな、特に約５０アミノ酸より大きなペプチドは免疫原と して役立つことができ、あるいは約１、Ｏｋｄより小さく、特に約６０ｋｄより 小さい場合には、免疫原として使用される融合した又は共有結合したポリペプチ ドとして、他の物質、特にポリペプチドに連結され得る。この発明のポリペプチ ドは種々の免疫原、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アル ブミン、破傷風毒素等に融合又は共有結合され得る。例えばＭｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏ■、　ＨｏｅｂｅｒＭｅｄｉｃａｌ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｈａｒｐｅｒ及び Ｒｏｗｅ＋　１９６９；　Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ。

Ｓ　ｅｃｉｆｉｃｉｔ　ｏｆ　５ｅｒｏｌｏ　１ｃａｌ　ｌ１ｅａｃＬｉｏｎｓ ＋　ドーバーバプリケーションズ、ニューヨーク、１９６２；及びＷｉｌｌｉａ ｍｓ等、Ｍｅ　ｔｈｏｄｓｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒ　、　Ｖｏｌ、１、アカデミツクプレス、ニューヨーク、　１９６ ７　（ポリクローナル抗血清の調製の記載について）を参照のこと。多くの場合 、モノクローナル抗体を調製することが望ましく、この場合モノクローナル抗体 は種々の咄乳類宿主、例えばマウス、１歯動物、霊長類、ヒト等に由来すること ができる。モノクローナル抗体を調製するための技法の記載はＢａ５ｉｃ　ａｎ 虹廻ユｎ１ｃａｌ−見譚四工幻ひ−。

Ｓ　ｔ　ｉ　ｔｅｓ等編、第四板、ランジメディカルバブリケーションズ、ロス ・アルトス、カリホルニア、及びこれに引用されている参考文献中に見出される 。

これらの抗体は、それらがポリクローナルであるかモノクローナルであるかに依 存して種々の方法で使用することができる。ポリクローナル抗体は、ＩＩ　Ｔ　 Ｌ　ＶウィルスのＸ領域により発現されるポリペプチド又は蛋白質と関連するエ ピトープ部位を有するポリペプチドを検出するために使用することがで−きる。

従ってこれらは、この発明のポリペプチドの１又は複数のエピトープ部位を共有 するすべてのポリペプチドの存在を検出することができる。これに対して、モノ クローナル抗体は特定の部位を検出することができ、又は２個の特定のエピトー プ部位の存在を証明するために組み合わせて使用することができる。従って、モ ノクローナル抗体は、同一の又は異るポリペプチド上に存在する特定の１個又は 複数のエピトープ部位について一層大きな特異性を有する。

この発明のポリペプチド、それらの融合生成物、及び該ポリペプチドに対して特 異的な抗体は、ＩＩ　Ｔ　Ｌ　Ｖウィルス又はこれらのウィルスの個々のタイプ の存在を検出するための種々の診断において使用される。これは、細胞溶解物を 用い、細胞を固定し、そして免疫蛍光を用い、血清中の関連抗体又は抗原の存在 を検出する等により行うことができる。

ポリペプチド及び／又は抗体は修飾することなく使用され、又は種々の方法で、 例えばラベル化により修飾される。ラベル化とは、検出可能なシグナルを直接的 又は間接的に提供する成分を共有的に又は非共有的に結合することを意味する。

種々のラベルが科学文献及び特許文献の両者中に知られておりそして広範に使用 されている。これらのラベルには放射性核種、酵素、基質、コファクター、阻害 剤、蛍光剤、化学発光剤、粒子、磁性粒子等が含まれる。特許の例には隘３，８ １７，８３７．３，８５０，７５２．３，９３９，３５０．３，９９６，３４５ ．４．２７７．４３７．４，２７５．１４９、及び４，３６６．２４１が含まれ 、これらは利用可能な種々の技法の単なる例示である。

ポリペプチドを種々のラベルに連結する方法は文献中に広く報告されており、そ してここで広範に説明する必要はない。

技法の多くは、カルボジイミド又は活性エステルを用いることにより、活性化さ れたカルボキシル基を使用することによるペプチド結合の形成；メルカプト基と 活性化されたハロゲン、例えば、クロロアセチル、又は活性化されたオレフィン 、例えばマレイミドとの反応によるチオエーテルの形成、等を含む。

測定は均質法（遊離試薬及びリセプターーリガンド複合体の間の分離を伴わない ）又は不均一法＜ｍ離試薬及びリセプターーリガンド複合体の間の分離を伴う） でよい。種々の商業的測定法、例えばラジオイムノアツセイ　（ＲＩＡ）、ＥＬ ＩＳ八、ＥＩＡ　、、聞ＩＴ、　５ＬＩＦＡ等が存在する。

ラベルされており、目的ポリペプチドに対する抗体を認識する第２抗体を使用す ることにより、ラベルされていなし）抗体を使用することができる。これらの測 定法についても、文献中に広範な例が見出される。

ペプチドｐ　４０ｘ　Ｉ又はｐ３７ＸＩ＋に対する抗体は、共通のエピトープ部 位を有するＨ　Ｔ　Ｌ　Ｖのポリペプチドを検出するために使用することができ る。さらに、分子量の識別を可能にする技法、例えば免疫沈澱及びそれに続＜　 ＳＤＳページを用いることにより、ポリペプチド、そしてそれ故にファージの性 質をさらに特徴付けることができる。

しばしば、測定の感度を最適にするために試薬がキ・ノドとして提供される。こ の発明のためには、測定の種類に依存してプロトコール、ラベル、ラベルしであ るかもしくはラベルしてない抗体、又はラベルしたポリペプチドが、通常は他の 付属物、例えば緩衝剤、安定剤、シグナルの生成に必要な材料、例えば、酵素の ための基質等と組合わせて提供される。

好ましくは、試薬は乾燥分束として提供され、この場合この試薬は測定を行うた めに適当な濃度を有するように水性媒体中に再調製される。

抗体はまた、ＩＩＴＬＶ−ｒもしくは−Ｈにより生産されたポリペプチド又は類 似のポリペプチドの単離におけるアフィニティークロマトグラフィーのためにも 使用することができる。

カラムを調製することができ、この場合抗体を固体支持体、例えば粒子、例えば アガロース、セファデックス等に連結し、細胞溶解物をカラムに通し、カラムを 洗浄し、次に増加する濃度の穏和な変性剤、例えば尿素により処理し、こうする ことによって精製された蛋白質が遊離される。

この発明の試薬は、Ｉｔ　Ｔ　Ｌ　Ｖに暴露されそして／又は）ＩＴＬＶ関連疾 患に罹患していることが疑われる患者においてＸ領域蛋白質に対する抗体を検出 するために使用することができる。血清中での抗−Ｘ　ＴＪ域抗体の存在が、抗 −ｇａｇ及び抗−ｅｎｖ抗体の存在に比べて、幾つかのケースにおいてＩＩＴＬ Ｖ暴露及び疾患との高い相関を示すことが本発明者等により見出され、これらの 結果を実験の部において詳細に示す。

抗−Ｘｊｆｆ域抗体を検出するために、通常、ラベルされているか又はラベルさ れていないｐ４０ＸＩＸｐ３７”’％又はこれらの断片を用いる広範囲の種類の プロトコールを用いることができる。例えば、競争的ラジオイムノアッセイを行 うことができ、この場合、ラベルされた抗−ｐ　４　Ｑ　Ｘ　Ｉ又は抗−ｐ３７ ＸＩ＋が固相抗原への結合について血清抗体と競争する。前記の他のよ（知られ たイムノアッセイもまた血清中の抗−Ｘ領域抗体の検出のために適用することが できるであろう。他の実験室分析、例えば、ウェスタンプロットも抗体を検出す ることができるが、しかし一般に診断スクリーニングのためにはイムノアッセイ 技法に比べて非常に不便である。

ｘ　ｊｌ域抗体のスクリーニングを他の）ＩＴＬＶ−関連抗体、特に抗−ｇａｇ 及び抗−ｅｎｖ抗体のスクリーニングと組合わせることができる。後で実験の部 において示すように、１１　Ｔ　Ｌ　Ｖ−関連疾患に罹患しているか又はＩＩＴ ＬＶに暴露された患者が抗−ｇａｇ及び／又は抗−ｅｎｖ抗体を有するがしかし 抗−Ｘ領域抗体については陰性である幾つかの場合が存在する。従って、３種類 の抗体すべてについての組合わされたスクリーニングは最高の信頼度を提供する ことができる。

尖−駄 次の例は限定的でなく例示的に与えられる。

常用の合成法により次のアミノ酸配列を調製した。

配列（１）：　ＣＰＥＨＱＩＴＷＤＰＩＤＧＲ配列（２）：　Ｉ　ＰＲＬＰＳＦ ＰＴＱＲＴＳＫＴＬＫ傘配列（３’）：　ＰＤＰＧＬＲＰＱＮ＊配列（３゛）は ｐ４０ＸＩの配列（３）上に位置する。配列（３）の全配列は前に示されている 。

上記の各オリゴペプチドを個別にキーホールリンペントヘモシアニンに連結しＣ Ｌｅｒｎｅｒ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　（１９８１）　７８：３４０３　、これを引用によりこの明細書に組み 入れる〕、そして生成する免疫原をオリゴペプチドに対して特異的な抗血清の製 造のためにラビットに注射した。生成する抗血清を常法に従って単離し、そして 次の研究において使用した。

５ＬＢ−１セルラインを、ＨＴＬＶ−１によりインビトロ形質転換されたヒト成 人抹消血細胞から導いた（　Ｋｏｆｆｌｅｒ等、Ｂｌｏｏｄ（１９８４）６４： ４８２；　Ｇａ５５ｏｎ等、Ｎｏｒｍａｌ　ａｎｄ　Ｎｅｏ　１ａｓｔｉｃ　ｔ ｌｅｍａｔｏ−ルＩ至ａシー、Ｇｏｌｄｅ、ＭａｒｋｓｔＱ、Ａｌａｎ　Ｌｉ５ ｓｓ　１９８３．１２９頁〕。

細胞からの溶解物を下記のようにして免疫沈澱せしめた。標準マーカーは２００ ｋｄ、９２．６ｋｄ、　６８ｋｄ、４２ｋｄ及び２５．７ｋｄのＩＣ−ラベル蛋 白質であった。ゲルのレーンは（ａ）ＳＬＢ−Ｉ細胞溶解物及び免疫前血清ｉ　 （ｂ）ＳＬＢ−１細胞溶解物及び抗配列１血清；　（ｃ）ＳＬＢ−１細胞溶解物 及び抗配列１血清（配列Ｉペプチドの１＋＋ｖ／ｍβ溶液１０μｌと４℃におい て３０分間、前インキュベートしたもの）　；　（ｄ）標準マーカー；　（ｅ） ＳＬＢ−１細胞溶解物及び免疫前血清ｉ　（ｆ）ＳＬＢ−Ｉ溶解物及び抗配列２ 血清、（ｇ）ＳＬＢ−１細胞溶解物及び抗配列２血清（前記のように配列２ペプ チドと前インキュベートしたもの）　；　（ｈ）ＭＯＬＴ−４細胞溶解物及び抗 配列１血清；　（ｉ）ＩＩＬ　６０細胞溶解物及び抗配列１血清；　（ｊ）ＭＯ ＬＴ−４細胞溶解物及び抗配列２血清；（ｋ）　ＨＬ　−６０細胞溶解物及び配 列２血清、　（１）ＳＬＢ−１細胞熔解物及び正常ヒト血清；（ｍ）成人Ｔ−細 胞リンパ腫（ＩＩＴＬＶ−１関連）を有する患者からのヒト血清中５Ｌ１３−　 Ｉ細胞溶解物であった。

メチオニン不含Ｅａｒｌｅの改変最少必須培地（フロララボラトリーズ、マクレ アン、ＶＡ）に２％グルタミン、１０％透析したウシ胎児血清、１００μＣｉ／ ｍｊ？の（ｆｆ５ｓ）−メチオニン（＞６００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ　、アメルシャ ム、アーリントンハイツ、ＩＬ）を補充したものの中でＩ　Ｘ　１０６細胞／ｍ ｅの濃度にて、３７℃にて４〜５時間細胞を培養することにり、全細胞性蛋白質 を（＋５３）−メチオニンにより代謝的にラベルした。次に、細胞を２回冷（４ ℃）リン酸緩衝化塩溶液（ｐａｌ　７．４　）中で洗浄し、そしてＲＩＰＡ緩衝 液（５０ｍＭ　ＮａＣ１，１％デオキシコール酸ナトリウム、１％トリトンＸ− １００，０，１％ＳＤＳ、１０ｍＭＴｒｉｓ−１１ｃＩ　（ｐＨ７，２）及び１ ｍＦＩ　フ、ｚ−ルメチルスルホニルフルオリド）中で４Ｘ１０６細胞／ｍｌの 濃度において細胞溶解した。細胞抽出物を１００ｋｇにて４℃で６０分間遠心分 離することにより透明にした。

免疫沈澱反応混合物は、２ｍｇ／ｍβＢＳＡ及び０．０７％ｓｎｓを含有する最 終容量２５０μｌのＲＩＰＡＩ衝液中１０μβの示された血清及び８　Ｘ　１０ ６ｃｐｍの透明にされた細胞溶解物から成った。

パンソルビン（カルビオヶムーヘーリング、う・ジョラ、ＣＡ）の１０％懸濁液 ６ｏμｌを添加することにより４℃にて３０分間免疫沈澱物を集めた。次に、サ ンプルをＲＩＰＡＩ衝液中で４回洗浄し、そしてＬａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ （１９７０）　２２７：　６８０により記載されたようにして７，５％５Ｏ５− ポリアクリルアミドゲル上で分析した。次に、ゲルをフルオログラフィーにかけ た。

４０ｋｄの蛋白質が、配列１又は配列２ペプチドのいずれかに向けられた抗血清 により、これらの細胞から一貫して免疫沈澱した。この蛋白質は免疫前血清によ っては沈澱せず、そしてこの蛋白質の免疫沈澱は、特異的抗原−抗体反応を示す 関連するペプチドと完全に競合した。この蛋白質は、ＩＩＴＬνにより感染され ていない形質転換されたＴ−細胞系、すなわちＭＯＬＴ−４を包含する対照造血 系細胞系においては見出されず、Ｉｌｌ、−６０についても観察されなかった。

Ｊｌ、Ｂ−１セルラインは、ＳＬＢ司セルラインを樹立するために使用されたの と同じ正常ドナーに由来する、）ＩＴＬＶ−ｎで形質転換されたＴ−細胞系であ る。これらの細胞中には、上記と同じ抗血清を用い、同じ方法及び対照を用いて 、３７ｋｄの蛋白質が見出された。約３０ｋｄの一層低い分子量を有する第２の 蛋白質も抗配列２血清を用いてＪＬＢ−１セルライン中に同定された。この蛋白 質は抗配列１血清によって認識されなかった。

次の研究において、ＩＩＴＬＶ−ｎに感染したＢ−細胞を使用した（Ｃｈｅｎ等 、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）　３０９：２７６）　、感染されていない、及びＩ ＩＴＬＶ−１１に感染されたＢ細胞からの免疫沈澱を研究した。

レーンは、（ａ）非感染細胞溶解物及び抗配列１血清；　（ｂ）ＩＩＴＬＶ−■ 感染細胞溶解物及び抗配列１血清；　（Ｃ）ＩＩＴＬＶ〜■感染細胞溶解物、及 び配列１ペプチドと前インキュベートされた抗配列１血清；　（ｄ）ＩＩＴＬＶ −ｎ感染細胞溶解物及び免疫前血清；（ｅ）非感染細胞溶解物及び抗配列２血清 ；　（ｆ））ＩＴＬＶ−ＩＩＩ胞溶解物及び抗配列２血清；　（ｇ））ＩＴＬＶ −ＩＩＩ染細胞溶解物、及び配列２ペプチドと共に前インキュベートされた抗配 列２血清；並びに（ｈ）　ＨＴＬＶ−ＩＩＩ染細胞溶解物及び免疫前血清を含ん だ。３６ｋｄの蛋白質が感染Ｂ−細胞溶解物中に見られ、そして非感染細胞中に は見られなかった。ＨＴＬＶ−ＩＩ感感染−細胞中に見出された３６ｋｄ蛋白質 の免疫沈澱は、対応する合成ペプチドと抗血清との前インキュベーションにより 競合され、そして免疫前血清はこの蛋白質を認識しなかった。

配列３″に対して向けられた抗血清は）［ＴＬＶ−ｉ又は−■中のユニーク蛋白 質をなんら認識しなかった。これはペプチドが小サイズである観点から結論的で はない。

＋１ＴＬＶ−ＴのＸ領域から制限断片をクローニングし、そしてＥ、コリ　（Ｅ 、ｃｏｌｉ）中で融合蛋白質として発現せしめ、そして得られる発現生成物を用 いてラビットを免疫感作し、そして抗血清を得た。使用した３つの制限断片及び 対応するポリペプチドは次の通りであった。

（１，）　Ｍｓｔ　Ｉ　−Ａｖａ　Ｔがコードする、前記のＩＩＴＬシー■配列 （５）上のアミノ酸１１５−１８２　、以後６８ｍａｒペプチドと称する；（２ ）’５ｃａｌ−且１ｎｃｌｌがコードする、前記ＨＴＬＶ−１配列（５）上のア ミン１１２７４−３５７　、以後８４ｍｅｒペプチドと称する；及び、 （３）　Ｓｃａ　Ｔ　−Ｈｉｎｃ　ＩＩがコードする、前記ＨＴＬＶ−１配列（ ５）上のアミノ酸３０４−３５７　、以後５４ｍｅｒペプチドと称する。

各ペプチド断片から生産された抗体はｐ４ｏ″′蛋白質及びｐ３７ＸＩ＋蛋白質 の両者と反応性であることが見出された。

＋１ＴＬＶ−１誘導疾患に罹患していることが疑われる患者からの血清及び正常 の個体からの血・清を、ｐ４０Ｘ　＋蛋白質に対する抗体の存在についてスクリ ーニングした。このスクリーニングは、高パーセンテージの成人Ｔ−細胞白血病 （ＡＴＬ）患者、慢性ＡＴＬ患者、前−ＡＴＬ患者、及び成人ニー細胞リンパ腫 （ＴＬ）患者、並びにこれらの患者の見かけ上病気に罹っていない家族員がそれ らの血清中にｐ４ＱＸＩに対する抗体を好することを示した。

次のグループからの血清を試験した。

（ａ）急性ＡＴＬ　：上昇したＷＢＣ、拡散リンパ腺腫、肝牌腫、皮膚病変、及 びしばしば過カルシウム症により特徴付けられる。これらの患者は通常有意な免 疫抑制を有し、そして１８ケ月以内にそれらの病気で死ぬ。

（ｂ）ＴＩ、：上記のような臨床経過をたどる。但しＷｉ環する悪性細胞が存在 しない。ずなわち正常〜低ＷＢＣである。

（ｃ）慢性ＡＴＬ　：上昇したーＢＣ、穏和なリンパ腺腫及び穏和〜中程度の免 疫抑制、及び病気の一層急性の経過により特徴付けられる。

（ｄ）前〜ＡＴＬ　：正常な全日Ｃ及び異状な循環細胞により特徴付けられる。

（ｅ）患者の家族員、配偶者、兄弟姉妹、及び子供を含む。

血清の試験は液相免疫沈澱により行った。要約すれば、１１ＴＬＶ−１感染細胞 を３５３−メチオニンと共にインキュベートし、そして細胞溶解した。次に、ラ ベルされたＸ％ｇａｇ及びｅｎｖ蛋白質を包含する細胞溶解物を上記の患者グル ープがらの血清と、及び陽性対照として実験室で調製した抗−ｐ　４　Ｑ　Ｘ　 Ｉと混合した。−夜インキユベートした後、形成された抗体−抗原複合体をスタ フィロコッカス・アウレウス−４成立す−ａｕｒｅｕｓ）と共に沈澱せしめ、そ して生ずるペレットを洗浄して非特異的に結果した物質を除去した。残ったペレ ットをメルカプトエタノール−ドデシル硫酸ナトリウム溶液中で煮沸することに より解離せしめ、そして遠心分離して細菌細胞を除去した。次に、解離した抗体 及び抗原を含有する上清をポリアクリルアミドゲル上で泳動せしめた。ここで、 ラベルされた抗原のみがオートラジオグラフィーにより検出可能であった。Ｘ、 ｇａｇ、及びｅｎｖ蛋白質がサイズに基いて識別された。結果を次の第工表に示 す。

メー」−一表 艮　１　（’−） ？、　ｒ−＜−） 総体的に、液相免疫沈澱測定法で決定した場合、ＩＩＴＬＶ−１関連疾患を有す る５３患者の内４１（７７％）がｐ　４　Ｑ　Ｘ　ｌ蛋白質に対する検出可能な レベルの抗体を存していた。３０の潜在的キャリヤー中２４（８０％）がｐ４Ｑ ＸＩに対する検出可能な抗体を有していた。患者及び家族員の両者について、観 察されるレベルの抗−ｐ４ＱＸＩ抗体頻度は抗−ｇａｇ及び抗−ｅｎｖ抗体のレ ベルを超えた。測定における抗原の量が律速ではないと仮定すれば、抗体の観察 されるレベル（ゲル上で観察されるバンドの強度）は血清サンプル中の担体の量 及び親和性／結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）に依存するであろう。データの要約は 次の通りである。

ＡＴＬを有する３０人の患者の内、２６（８７％）がｐ　４９　Ｘ　１に対する 検出可能な抗体を存していた。１４患者（４７％）中、抗−Ｘ抗体のレベルは抗 −ｇａｇ及び抗−ｅｎν両抗体のレベルを超えた。１９患者（６３％）において 、抗−Ｘ抗体のレベルが抗−ｇａｇ抗体又は抗−ｅｎｖ抗体のいずれかのレベル を超えた。

５患者（１７％）において、抗−Ｘ抗体が検出された唯一の抗体であった。５患 者（１７％）においてのみ、抗−Ｘ抗体のレベルを抗−ｇａｇ抗体又は抗−ｅｎ ｖ抗体のいずれかのレベルが超えた。４患者（１３％）においてのみ、抗−Ｘ抗 体が検出されなかった。ＴＬを有する３患者の内、すべて（１００％）が検出し 得るレベルの抗−Ｘ抗体を有しており、そして１患者において抗−Ｘ抗体のレベ ルが抗−ｇａｇ抗体のレベルより高かった。前−Ａ几を有する１６患者の内、９ 　（５６％）が検出可能なレベルの抗−Ｘ抗体を有していた。慢性ＡＴＬを有す る４患者の内、３　（７５％）が検出可能なレベルの抗−Ｘ抗体を有していた。

２患者において、抗体のレベルが抗−ｇａｇ及び抗−ｅｎν両抗体のそれより高 かった。疾患の明白な証拠を有しないがキャリヤーである疑がある３０人の家族 具の内、２４（８０％）がｐ　４　Ｑ　Ｘ　Ｉ蛋白質に対する検出可能な抗体を 有していた。１７患者（５６％）において、抗−Ｘ抗体のレベルが抗−ｇａｇ又 は抗−ｅｎν抗体のレベルを超えた。

これらのデータは、ＩＩＴＬＶ−１に感染した患者、及びＨＴＬＶ　−■の疑い のあるキャリヤーがｐ４ＱＸＩ遺伝子産物に対する抗体を生血すること、及びこ れらの抗体の検出がＨＴＬＶ−１への暴露についての可能性ある診断試験として 役立つであろうことを示している。特に、このデータは、時には抗−Ｘ抗体の検 出が抗−ｇａｇ抗体又は抗−ｅｎｖ抗体のいずれかの検出に比べて、＋１ＴＬＶ −［感染と一層確実に関連することを示している。ＡＴＬに罹患している患者に おいては、試験されｊこ４血清のみが抗−Ｘに対して陰性であり、他方試験され た１６血清が抗−ｇａｇに対して陰性であり、そして試験した血清が抗−ｅｎｖ に対して陰性であった。これに対して、１人のＡＴＬ患者のみが抗−ｇａｇ及び 抗−ｅｎｖに対して陽性であり、抗−Ｘに対して陰性であり、そして２人のＡＴ Ｌ患者のみが抗−ｇａｇ又は抗−ｅｎｖに対して陽性でありそして抗−Ｘに対し て陰性であった。最大の確実性のためには、ＩＩＴＬＶ−Ｉ疾患についての臨床 測定において３種類すべての抗体について測定するのが最善であろう。

上記の結果から、ＨＴＬＶ−１及びＩＩＴＬＶ−１１に特異的な蛋白質が各ウィ ルスのＸ領域中に存在する配列により発現されることが明らかである。この発明 に従って調製された抗体は、このような配列の検出、並びにＩＩ　Ｔ　Ｌ　Ｖウ ィルスの存在、及びどのウィルスが存在するかの決定をもたらす。さらに、抗体 、ポリペプチド及び認識された蛋白質は、個々のウィルスの検出並びに感染の性 質及び腫瘍形成の病因の決定のための試験として使用することができる。

理解を明確にするために説明及び例により前記の発明を幾分詳細に記載したが、 添付された請求の範囲の範囲内において幾つかの変化及び変法を行うことができ ることか明らかであろう。

国ＦｆＡＵ４介報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．約３５ｋｄ〜約４２ｋｄの分子量を有し、そして次の配列：配列（１）：【 配列があります】 配列（２）：【配列があります】 配列（３）：【配列があります】 配列（４）：【配列があります】 （式中、（ａａ）Ａ及び（ａａ）Ａｃ、（ａａ）Ａｈ、（ａａ）Ａｍ、（ａａ） Ａｒ、（ａａ）Ｂ、及び（ａａ）ｓは同一であるか又は異り、そして蛋白質中に 存在する天然アミノ酸のいずれか１つから選ばれる）の少なくとも１つを有し、 ＨＴＬＶにより発現されるポリペプチドと質的に同じアミノ酸配列を有するエピ トープ部位を前記配列が定義しているポリペプチド。 ２．肩記号Ａが脂肪族アミノ酸を指定し、Ａｃが酸性アミノ酸を指定し、Ａｈが 脂肪族一ヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸を指定し、Ａｍがアミノ含有側鎖を有 するアミノ酸を指定し、Ａｒが芳香族アミノ酸を指定し、Ｂが塩基性アミノ酸を 指定し、そしてＳが硫黄含有側鎖を有するアミノ酸を指定する請求の範囲第１項 に記載のポリペプチド。 ３．前記ＨＴＬＶがＨＴＬＶ−Ｉである請求の範囲第１項に記載のポリペプチド 。 ４．前記ＨＴＬＶがＨＴＬＶ−ＩＩである請求の範囲第１項に記載のポリペプチ ド。 ５．約４２ｋｄ以下の分子量を有し、そして次のポリペプチド配列の少なくとも １つ中に存在する少なくとも１２個のアミノ酸のアミノ酸配列を有する： 配列（１）：【配列があります】 配列（２）：【配列があります】 配列（３）：【配列があります】配列（４）：【配列があります】〔式中、（ａ ａ）Ａ、（ａａ）Ａｃ、（ａａ）Ａｈ、（ａａ）Ａｍ、（ａａ）Ａｒ、（ａａ） Ｂ、及び（ａａ）ｓは同一であるか又は異り、そして蛋白質中に存在する２０個 の天然アミノ酸のいずれか１つから選択され、そして前記配列は抗体認識のため の免疫原部位を定義しそしてＨＴＬＶのＸ領域中に少なくとも部分的に存在する 遺伝子により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列と実質上同一である〕ペプ チド。 ６．肩記号Ａが脂肪族アミノ酸を指定し、Ａｃが酸性アミノ酸を指定し、Ａｈが 脂肪族一ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸を指定し、Ａｍがアミン含有側鎖を 有するアミノ酸を指定し、Ａｒが芳香族アミノ酸を指定し、Ｂが塩基性アミノ酸 を指定し、そしてＳが硫黄含有側鎖を有するアミノ酸を指定する請求の範囲第５ 項に記載のポリペプチド。 ７．少なくとも２０ｋｄの請求の範囲第６項に記載のポリペプチド。 ８．少なくとも１０ｋｄの請求の範囲第７項に記載のポリペプチド。 ９．検出可能なシグナルを直接的又は間接的に提供するラベルを有する請求の範 囲第６項に記載のポリペプチド。 １０．前記ラベルが放射性核種である請求の範囲第９項に記載のポリペプチド。 １１．請求の範囲第７項に記載のポリペプチドに対して調製され、そして該ポリ ペプチド及びＨＴＬＶのＸ領域の発現生成物の少なくとも部分と相同な配列を有 するポリペプチドに結合することができ、他の血液蛋白質を実質上含有しない抗 体。 １２．ポリクローナル抗体である請求の範囲第１１項に記載の抗体。 １３．モノクローナル抗体である請求の範囲第１１項に記載の抗体。 １４．配列【配列があります】を有するポリペプチド。 １５．免疫原に連結された請求の範囲第１４項のポリペプチドに対して調製され 、該ポリペプチド及びＨＴＬＶのＸ領域の発現生成物の少なくとも部分と相同の 配列を有するポリペプチドと結合することができる抗体。 １６．配列【配列があります】を有するポリペプチド。 １７．免疫原に連結された請求の範囲第１６項に記載のポリペプチドに対して調 製され、該ポリペプチド及びＨＴＬＶのＸ領域の発現生成物の少なくとも部分と 同相な配列を有するポリペプチドと結合することができる抗体。 １８．次の配列：【配列があります】 を有するポリペプチド。 １９．請求の範囲第１８項に記載のポリペプチドに対して調製され、該ポリペプ チド及びＨＴＬＶのＸ領域の発現生成物の少なくとも部分と相同な配列を有する ポリペプチドと結合することができる抗体。 ２０．配列【配列があります】２１．請求の範囲第２０項に記載のポリペプチド に対して調製され、該ポリペプチド及びＨＴＬＶのＸ領域の発現生成物の少なく とも部分と相同の配列を有するポリペプチドと結合することができる抗体。 ２２．次の配列：【配列があります】 を有するポリペプチド。 ２３．請求の範囲第２２項に記載のポリペプチドに対して調製され、該ポリペプ チド及びＨＴＬＶのＸ領域の発現生成物の少なくとも部分と相同な配列を有する ポリペプチドと結合することができる抗体。 ２４．ＨＴＬＶウイルスの存在を検出する方法であって、ＨＴＬＶに感染してい ると疑われる細胞の細胞部分を請求の範囲第１３項に記載の抗体と混合し、そし てＨＴＬＶの存在を示すものとしての該抗体との複合体形成の存在を決定するこ とを含んで成る方法。 ２５．前記抗体に結合するポリペプチドの分子量を、ＨＴＬＶ−ＩとＨＴＬＶ− ＩＩを識別することにより決定する請求の範囲第２４項に記載の方法。 ２６．前記ＨＴＬＶがＨＴＬＶ−Ｉである請求の範囲第２４項に記載の方法。 ２７．前記ＨＴＬＶがＨＴＬＶ−ＩＩである請求の範囲第２４項に記載の方法。 ２８．ＨＴＬＶウイルスの存在を検出する方法でっあて、ヒト由来の体液を請求 の範囲第１１項、第１５項、第１７項、第１９項、第２１項、及び第２３項のい ずれかの抗体と接触せしめ、そしてＨＴＬＶの存在を示すものとして、該体液中 の細胞又は細胞性生成物への前記抗体の結合のレベルを決定することを含んで成 る方法。 ２９．前記ＨＴＬＶがＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩから選ばれる請求の範囲 第２８項に記載の方法。 ３０．前記ＨＴＬＶがＨＴＬＶ−Ｉである請求の範囲第２９項に記載の方法。 ３１．前記ＨＴＬＶがＨＴＬＶ−ＩＩである請求の範囲第２９項に記載の方法。 ３２．前記体液が血清、唾液及び精液から選ばれる請求の範囲第３０項に記載の 方法。 ３３．配列５Ａ及び５Ｂから選ばれたアミノ酸配列を含む約４５ｋｄより小さい ポリペプチド。 ３４．ポリペプチドが少なくとも９５ｗ／ｗ％の純度を有する請求の範囲第２８ 項に記載のポリペプチド。 ３５．ＨＴＬＶウイルスの存在を検出する方法であって、ＨＴＬＶに対する抗体 を含むヒト宿主からの体液を請求の範囲第１項、第７項、第１４項又は第１６項 のいずれかの抗原ポリペプチドと接触せしめ、そしてＨＴＬＶの存在を示すもの としての前記抗原ポリペプチドヘの前記抗体のレベルを決定することを含んで成 る方法。 ３６．前記ＨＴＬＶがＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩから選択される請求の範 囲第３５項に記載の方法。 ３７．患者がＨＴＬＶウイルスに暴露されているか否かを決定する方法であって 、患者からの血清サンプル中の、ＨＴＬＶウイルスのＸ領域から発現された蛋白 質に対する抗体の存在を検出することを含んで成る方法。 ３８．前記蛋白質がＰ４０ｘ１又はＰ３７ｘ１１である請求の範囲第３７項に記 載の方法。 ３９．血清サンプル中の抗−ｇａｇ抗体又は抗−ｅｎｖ抗体の検出をさらに含ん で成る請求の範囲第３７項に記載の方法。