JPH04169176A - 細胞の培養方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は医学的な検査、薬品あるいは生化学物質の製造
工程における試験、その他に利用する。

〔概要〕

本発明は、培養液にマイクロキャリアを混濁させ、マイ
クロキャリアに細胞を付着させて培養を行う細胞の培養
方法およびその培養装置において、マイクロキャリアの
比重を培養液の比重よりわずかに大きくし、容器内で静
止状態を保って培養し、フィルタを通してマイクロキャ
リアから細胞を分離することにより、 長期に連続的に大量の細胞を培養できるようにしたもの
である。

〔従来の技術〕

神経細胞やＬ−細胞のような接着性細胞は培養液の中に
浮遊した状態では培養できず、必ずプラスチックやガラ
スなどの固体壁面に接着した状態でなければならない。

また、細胞は壁面に何層にも重なって培養することがで
きないために、多数の細胞を培養するときには広い接着
面積を必要とする。

従来、上述した接着性細胞を培養する方法として、カル
チャーフラスコを用いた方法、培養皿を用いた方法、あ
るいはこれらの方法に改良を加えたものとして培養ビン
を使用しマイクロキャリアにより培養する方法がある。

カルチャーフラスコによる培養法は、第４図に示すよう
に底面が広く高さの低い直方体の横に出し入れ口が設け
られたカルチャーフラスコ４１を用い、培養液をその高
さの約１７３になるように入れて、これに細胞を入れ培
養するものである。培養液および細胞の入ったカルチャ
ーフラスコ４１は恒温槽内で３７℃に保たれる。このよ
うな環境の中で細胞はカルチャーフラスコ４１の底面に
付着し、その底面に沿って増殖する。底面全域にわたっ
て増殖するとそれ以上の増殖は行われない。増殖した細
胞は先端に丸みを有するガラス棒、または先端部が耳か
き状の棒を用いて擦りながら掻き取るか、あるいは蛋白
分解酵素を作用させて回収する。

培養皿による培養法は、培養皿に培養液および細胞を入
れて蓋をし、恒温槽の中で培養するものである。培養皿
の大きさおよび個数は特に限定されたものはなく、例え
ば第５図に示すように直径約３５ル、深さ８闘の培養皿
５１を６個配置して用いられる。培養および培養後の処
理は前述したカルチャーフラスコによる培養と同様に行
われる。

上述した培養法に改良を加えたマイクロキャリアによる
培養法は、接着性細胞の培養を行うには細胞が付着する
面ができるだけ広い方がよいことから面を広くするため
に考案されたものである。

マイクロキャリアは、その直径が５０μｍないし３００
μｍの球形のデキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ）製のビー
ズで、このマイクロキャリアの表面に細胞を付着させて
培養する。

マイクロキャリアを培養液の中に懸濁させると、マイク
ロキャリアの面が立体的になるために、例えば、Ｃｙｔ
ｏｄｅｘｌ　ｌＢｍｌ　で６０００Ｃ１１？得られるよ
うに非常に広い培養面積を得ることができる。５０ｍ１
のカルチャーフラスコ１個に１０ｍ１の培養液を入れ培
養する場合の底面積に比べて、同じ１０ｍ１の培養液に
直径約１８０μｍのマイクロキャリアを１．９　Ｘｌ０
６個懸濁させたときの表面積は６８倍になる。

このようなマイクロキャリアを用いた培養法は、第６図
に示すように培養ビン６１内の培養液６２に細胞とマイ
クロキャリアを入れて栓６３および蓋６４により密封し
、静置培養して細胞がマイクロキャリアにある程度付着
したときに攪拌培養を行う。

攪拌は四ッド式攪拌棒６５を培養液６２の中に入れ、は
しｔは２Ｏｒｐｍ程度のゆっくりした回転速度で攪拌し
、数時間後には２Ｑｒｐｍ〜６０ｒｐｍ程度に攪拌速度
を上げ、さらに１日〜２日後には１１００ｒｐ”−１２
Ｏｒｐｍ程度に攪拌速度を高めて培養する。このような
回転速度の増加とともに新しい培養液６２を加え、１日
〜２日後には始めの量の４倍程度になシように　　゛す
る。

３日〜４日後に部分的に培養液６２の交換を行い、培養
したマイクロキャリアを少量取り出し、顕微鏡で観察し
てほぼ全域にわたって増殖していればマイクロキャリア
から細胞を剥がして回収する。

この細胞の回収は、トリプシン、コラゲナーゼのような
蛋白分解酵素を加えて細胞をバラバラに分離し、１００
μｍ程度のフィルタで濾過して回収する。

〔発明が解決しようとする課題〕

前述した従来の培養ビンを用いた方法では、１、培養を
行う際、すべてのマイクロキャリアに細胞を付着させな
ければならない。

２、　攪拌中マイクロキャリアが撹拌棒に接触して細胞
を剥離させ死滅させることがあり、したがって攪拌に細
心の注意を必要とする。

３、細胞を回収する際にマイクロキャリアを培養ビンか
ら別の容器に移さなければならない。

４、マイクロキャリアから細胞を剥がした後連続して培
養することは困難である。

５、シたがって長期連続的に大量の細胞の培養を行うこ
とができない。

などの問題がある。

本発明はこのような問題を解決するもので、特殊な容器
および特別な注意を要することなく、連続的、かつ大量
に細胞を培養することができる培養方法および装置を提
供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、培養液にマイクロキャリアを混濁させ、その
マイクロキャリアに細胞を付着させて培養を行う細胞の
培養方法であって、前記マイクロキャリアの比重を前記
培養液の比重よりわずかに大きくなるように調整し、混
濁させた培養液およびマイクロキャリアを筒状の容器に
投入して静止状態に保ち前記マイクロキャリアを前記培
養液の中で沈澱させた状態で加温し、培養完了後に、前
記マイクロキャリアを阻止し細胞および培養液を通過さ
せるフィルタを用いて、培養により生じた物質および細
胞を前記マイクロキャリアから分離することを特徴とす
る。

本発明の第二は、これを実現するための装置であって、
容器と、この容器内に培養液に懸濁して投入されるマイ
クロキャリアとを備えた細胞の培養装置において、前記
マイクロキャリアの比重が前記培養液の比重よりわずか
に大きく、静置状態でそのマイクロキャリアがその培養
液の中で沈澱するように調整され、前記容器には、縦形
の筒状部と、その筒状部の底に配置され前記マイクロキ
ャリアを阻止し培養液および細胞を通過させるフィルタ
と、このフィルタを通過した培養液の通路に設けられた
開閉栓とを備えたことを特徴とする。

前記マイクロキャリアは、デキストランを主成分とする
ビーズ形状であり、前記マイクロキャリアは、その直径
が５０μｍないし３００μｍのビーズ形状であり、前記
容器を恒温槽内に静止鼾垂する構造を備えることが望ま
しい。

〔作用〕

培養液に混濁させるマイクロキャリアの比重を培養液の
比重よりわずかに大きくなるように調整し、混濁させた
培養液およびマイクロキャリアを筒状の容器に投入して
静止状態に保ち、マイクロキャリアを培養液の中で沈澱
させた状態で加温する。このような環境の中で培養を行
った後に、培゛養液およびマイクロキャリアの混濁液を
フィルタに通し、培養により生じた物質および細胞をマ
イクロキャリアから分離して筒状の容器の底部から回収
する。

これにより、培養日数の経過に伴って長期にわたって連
続的に大量の細胞を培養することができ、また、細胞の
回収にあたっては別の容器に−たん移し取る模作が不要
となり、マイクロキャリアからは細胞が自動的に分離す
るために連続して次の培養に用いることが可能となり、
さらに攪拌動作がなくなるためにマイクロキャリアから
の剥がれによる細胞の死滅をなくすことがてきる。

培養液とマイクロキャリアの比重を接近させるように培
養液の比重を調整すると、培養中に液を静置状態とした
場合にもマイクロキャリアが相互に接触することなくマ
イクロキャリアが培養液と接触する面積を大きく維持で
きる。

〔実施例〕

次に、本発明実施例を図面に基づいて説明する。

第１図は本発明実施例の構成を示す図である。

本発明実施例は、容器１と、この容器１内に培養液２に
懸濁して投入されるマイクロキャリア３とを備え、さら
に、本発明の特徴として、マイクロキャリア３の比重が
培養液２の比重よりわずかに大きく、静置状態でそのマ
イクロキャリア３がその培養液２の中で沈澱するように
調整され、容器１には、縦形の筒状部１ａと、その筒状
部１ａの底に配置されマイクロキャリア３を阻止し培養
液２および細胞を通過させる１００μｍ程度のメツシュ
のフィルタ４と、このフィルタ４を通過した培養液２の
通路に設けられた開閉栓５とを備え、マイクロキャリア
３は、デキストランを主成分とするビーズ形状であり、
マイクロキャリア３は、その直径が５０μｍないし３０
０μｍのビーズ形状であり、容器１を図外の恒温槽内に
静止懸垂する吊り下げ棒６および蓋７を備える。

次に、このように構成された本発明実施例の培養方法に
ついて説明する。

−まず、マイクロキャリア３の比重を培養液２の比重よ
りわずかに太き（なるように調整し、混濁させた培養液
２およびマイクロキャリア３を筒状の容器１に投入して
静止状態に保ちマイクロキャリア３を培養液２の中で沈
澱させた状態で図外の恒温槽に入れ加温し、培養完了後
に、マイクロキャリア３を阻止し細胞および培養液２を
通過させるフィルタ４を用いて、培養により生じた物質
および細胞をマイクロキャリア３から分離する。

容器１内の培養液２は、マイクロキャリア３の高さの２
倍程度まで入れ、マイクロキャリア３は底に沈んだ状態
で培養を行う。マイクロキャリア３の比重は１．０３〜
１．０４であり、培養液２の比重に対しわずかに大きい
程度であるので、マイクロキャリア３が何層に重なって
も、マイクロキャリア３の表面相互間には隙間が存在し
、下層のマイクロキャリア３の表面まで細胞が十分に付
着する。

培養液２の交換は、容器１の下部に備えられた開閉栓５
を開放して培養液２の液面がマイクロキャリア３の上端
面近くに下るまで排出する。次いで、開閉栓５を間約で
新しい培養液２を蓋７をはずして追加し、再度開閉栓５
を開放して培養液２の液面がマイクロキャリア３の上端
面近くになるまで排出する。このような操作を必要に応
じて数回繰り返す。

増殖した細胞の回収は、トリブンンまたはコラゲナーゼ
のような蛋白分解酵素を加えて細胞をマイクロキャリア
３から剥がしバラバラにして、上から新しい培養液２を
加えながら、下部の排出口８から細胞を流し出し回収す
る。

このとき、トリプシンまたはコラゲナーゼは細胞と細胞
との間、および細胞とマイクロキャリア３との間を繋い
でいる蛋白質を分解する役目をはたす。また、マイクロ
キャリア３は１００μｍのフィルタ４を通過せずに、細
胞だけが通過して下に流れ回収される。

回収の方法をさらに具体的に説明する。

１、まず、開閉栓５を開放して培養液２をマイクロキャ
リア３の上端面まで流した後、開閉栓５を閉じ牛胎児血
清（以下ＦＣ３と呼ぶ）を含まない培養液２を加える。

２、　この培養液２をマイクロキャリア３の上端面まで
流した後、トリプシン０．１２５％およびエチレンジア
ミン４酢酸０．０５％を含む燐酸緩衝液を加えて１５分
間３７℃に保って反応させる。

３、前記燐酸緩衝液を開閉栓５を開放して流し出し図外
の別の容器に集める。

４、次に、ＦＣ３を含まない培養液同量を加えて流し同
じ容器に集める。このような操作をもう一度繰り返す。

５、ＦＣ３を含む培養液２を倍量前えながら下から流し
出して同じ容器に集める。容器に集められた液にはバラ
バラになった細胞が含まれているので、遠心分離により
洗浄分離する。容器１に残ったマイクロキャリア３には
新しい培養液２と細胞を加えることにより培養を続ける
ことができる。

細胞そのものではなく、細胞が産出する物質を利用する
場合はトリブンン処理を行わずに培養液交換の要領で培
養済の液を集めればよい。

第２図は本発明実施例装置の自動回収システムの構成を
示すブロック図である。

このシステムは、新しい培養液が格納された培養液容器
１１と、この培養液容器１１から細胞の培養を行う容器
１に新しい培養液を供給する送液ポンプ１２と、容器１
から培養液２を電気的に排出する電磁バルブ１３と、排
出された培養液２のＰＨ（ペーハー）を検出するＰＨ検
出器１４と、排出された培養液２を受ける排液容器１５
と、送液ポンプ１２、電磁バルブ１３、およびＰＨ検出
器１４を制御する制御回路１６とを備える。制御回路１
６にはタイマが含まれる。

このようなシステムによる培養液２の交換は、あらかじ
め定められた培養時間が経過したときに、制御回路１６
がタイマの出力により起動し、電磁バルブ１３を開放状
態にして容器１内部の培養液２を排出する。ＰＨ検出器
１４は培養液２の通過時にＰＨの検出を行い制御回路１
６に検出値を出力する。

ＰＨ検出器１４を！！ｉ過した培養液２は排液容器に排
出される。

一方、制御回路１６の制御により送液ポンプ１２が起動
し、培養液容器１１から新しい培養液を容器１に供給す
る。このような培養液の回収および供給動作は、あらか
じめプログラミングしておくことによって人手を要せず
に完全自動化することが可能である。なお、新しい培養
液を供給する送液ポンプに代えて圧縮空気による送液手
段を用いてもよい。

第３図は本発明実施例装置による細胞培養の培養日数と
細胞数との関係を示す図、第７図は従来例装置による細
胞培養の培養日数と細胞数との関係を示す図である。

これは、５ｍｌの容器に２．５＋１１１　のマイクロキ
ャリア（商品名Ｃｙｔｏｄｅｘ　１、サイズ１３１μｍ
〜２２０μｍ）を５０μｍ〜１００μｍのナイロンメツ
シュをフィルタとして備え、初期細噌数１．７Ｘ　１０
５個の神経細胞を容器内で培養した結果を示したもので
ある。

この培養結果によると、本発明実施例装置を用いた場合
には、培養期間１６日間で細胞数は３．５×１０７個と
対数的に増加する。これに対し従来装置による細胞の増
加は、５日目までは急激に増加し約２．５×１０６個の
細胞数になるが、それ以後は飽和状態となり増加が完全
に停止する。したがって１６８開の培養の結果では本発
明実施例装置は従来例装置と比較して約２００倍の細胞
を培養することができる。

〔発明の効果〕

以上説明したように本発明によれば、攪拌により生じる
細胞のダメージをなくすことができ、細胞が分裂して浮
遊状態になっても再びマイクロキャリアに付着して培養
が継続される。また、培養開始時に細胞濃度が低くても
培養が可能であり、廿イクロキヤリアを移動することな
く培養密度の高い細胞を容易に回収することができ、長
期間連続的に大量の細胞を培養することができる効果が
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明実施例の構成を示す図。 第２図は本発明実施例装置を用いた自動回収システムの
構成を示すブロック図。 第３図は本発明実施例装置による細胞培養の培養日数と
細胞数との関係を示す図。 第４図は従来例におけるカルチア−フラスコの外観を示
す図。 第５図は従来例における６穴形培養皿の配列を示す平面
図。 第６図は従来例における培養ビンの構成を示す図。 第７図は従来例培養ビンによる細胞培養の培養日数と細
胞数との関係を示す図。 １・・・容器、１ａ・・・筒状部、２．６２・・・培養
液、３・・・マイクロキャリア、４・・フィルタ、５・
・・開閉栓、６・・・吊り下げ棒、７．６４・・・蓋、
８・・・排出口、１１・・・培養液容器、１２・・送液
ポンプ、１３・電磁バルブ、１４・・・ＰＨ検出器、１
５・・・排液容器、１６・・・制御回路、４１・・・カ
ルチャーフラスコ、５１・・・培養皿、６１・・・培養
ビン、６３・・・栓、６５・・・ロッド式攪拌棒。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、容器と、この容器内に培養液に懸濁して投入される
   マイクロキャリアとを備えた細胞の培養装置において、 前記マイクロキャリアの比重が前記培養液の比重よりわ
   ずかに大きく、静置状態でそのマイクロキャリアがその
   培養液の中で沈澱するように調整され、 前記容器には、縦形の筒状部と、 その筒状部の底に配置され前記マイクロキャリアを阻止
   し培養液および細胞を通過させるフィルタと、 このフィルタを通過した培養液の通路に設けられた開閉
   栓と を備えたことを特徴とする細胞の培養装置。 ２、前記マイクロキャリアは、デキストランを主成分と
   するビーズ形状である請求項１記載の細胞の培養装置。 ３、前記マイクロキャリアは、その直径が５０ないし３
   ００μｍのビーズ形状である請求項１記載の細胞の培養
   装置。 ４、前記容器を恒温槽内に静止懸垂する構造を備えた請
   求項１記載の細胞の培養装置。 ５、培養液にマイクロキャリアを混濁させ、そのマイク
   ロキャリアに細胞を付着させて培養を行う細胞の培養方
   法において、 前記マイクロキャリアの比重を前記培養液の比重よりわ
   ずかに大きくなるように調整し、混濁させた培養液およ
   びマイクロキャリアを筒状の容器に投入して静止状態に
   保ち前記マイクロキャリアを前記培養液の中で沈澱させ
   た状態で加温し、 培養完了後に、前記マイクロキャリアを阻止し細胞およ
   び培養液を通過させるフィルタを用いて、培養により生
   じた物質および細胞を前記マイクロキャリアから分離す
   る ことを特徴とする細胞の培養方法。