JPH04169184A - リパーゼの活性発現を調節する遺伝子、ベクターおよびリパーゼの生産方法 - Google Patents
リパーゼの活性発現を調節する遺伝子、ベクターおよびリパーゼの生産方法Info
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- JPH04169184A JPH04169184A JP2294558A JP29455890A JPH04169184A JP H04169184 A JPH04169184 A JP H04169184A JP 2294558 A JP2294558 A JP 2294558A JP 29455890 A JP29455890 A JP 29455890A JP H04169184 A JPH04169184 A JP H04169184A
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- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はリパーゼの活性発現を調節する遺伝子、この遺
伝子を有するベクター、およびリパーゼを生産する方法
に関する。さらに詳しくは、耐熱性リパーゼ生産菌であ
るシュードモナスｓｐ、 ＫＷＩ−５６（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ、 ＫＷＩ−５６）菌株に由来する染
包体ＤＮＡより調製されたリパーゼの活性発現を調節す
る遺伝子、この遺伝子を有するベクター、およびこのベ
クターを保持する宿主によりリパーゼを生産する方法に
関する。
伝子を有するベクター、およびリパーゼを生産する方法
に関する。さらに詳しくは、耐熱性リパーゼ生産菌であ
るシュードモナスｓｐ、 ＫＷＩ−５６（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ、 ＫＷＩ−５６）菌株に由来する染
包体ＤＮＡより調製されたリパーゼの活性発現を調節す
る遺伝子、この遺伝子を有するベクター、およびこのベ
クターを保持する宿主によりリパーゼを生産する方法に
関する。
リパーゼはトリグリセリドを基質とし、これを脂肪酸と
グリセリンとに加水分解する酵素である。
グリセリンとに加水分解する酵素である。
この性質を利用して、油脂から脂肪酸を生産する場合、
エステルを合成する場合、あるいは洗浄剤等へ添加する
場合などに、リパーゼが工業的に利用されている。この
ためには、目的に応した酵素が安価に供給される必要が
ある。
エステルを合成する場合、あるいは洗浄剤等へ添加する
場合などに、リパーゼが工業的に利用されている。この
ためには、目的に応した酵素が安価に供給される必要が
ある。
ところで近年、酵素を大址に生産する際、遺伝子工学的
技術が応用されるようになった。この場合、まず目的と
する酵素をコートする遺伝子をクローニングし、これを
適当な発現ベクターに連結する。そしてこの酵素遺伝子
を含んだベクターを大腸菌等の宿主細胞に導入して形質
転換し、この形質転換体を酵素生産に最適な条件で培養
することによって、容易かつ大址に目的とする酵素を得
ることが可能となる。遺伝子工学的技術の応用はリパー
ゼについても試みられており、例えばスタフィロコッカ
ス（Ｓｔａｐｈｉｌｏｃｏｃｃｕｓ）ＪＪＩｃ、シュー
ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｏ＋ｏｎａｓ）属、バチルス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属。
技術が応用されるようになった。この場合、まず目的と
する酵素をコートする遺伝子をクローニングし、これを
適当な発現ベクターに連結する。そしてこの酵素遺伝子
を含んだベクターを大腸菌等の宿主細胞に導入して形質
転換し、この形質転換体を酵素生産に最適な条件で培養
することによって、容易かつ大址に目的とする酵素を得
ることが可能となる。遺伝子工学的技術の応用はリパー
ゼについても試みられており、例えばスタフィロコッカ
ス（Ｓｔａｐｈｉｌｏｃｏｃｃｕｓ）ＪＪＩｃ、シュー
ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｏ＋ｏｎａｓ）属、バチルス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属。
ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｊｃｈｕｍ）属等に属する多
数の微生物からリパーゼ構造遺伝子がクローニングされ
ている。
数の微生物からリパーゼ構造遺伝子がクローニングされ
ている。
しかしながらクローン化されたリパーゼ構造遺伝子を利
用してリパーゼを生産する場合、単にリパーゼ構造遺伝
子を有するベクターを宿主に導入して、これを培養して
も必ずしもリパーゼ活性の高い培養液を得ることはでき
ない。
用してリパーゼを生産する場合、単にリパーゼ構造遺伝
子を有するベクターを宿主に導入して、これを培養して
も必ずしもリパーゼ活性の高い培養液を得ることはでき
ない。
本発明の目的は、リパーゼ構造遺伝子を利用してリパー
ゼの生産を行う場合に、リパーゼの活性発現を調節する
遺伝子（以Ｆ、調節遺伝子という）、この遺伝子を有す
るベクター、およびこれらを利用してリパーゼ活性の高
い培養ことにより、リパーゼを生産する方法を とである。
ゼの生産を行う場合に、リパーゼの活性発現を調節する
遺伝子（以Ｆ、調節遺伝子という）、この遺伝子を有す
るベクター、およびこれらを利用してリパーゼ活性の高
い培養ことにより、リパーゼを生産する方法を とである。
本発明は次のリパーゼの活性発現を調節する遺伝子、ベ
クター、およびリパーゼの生産方法である。
クター、およびリパーゼの生産方法である。
（１）下記の塩基配列を有することを特徴とするリパー
ゼの活性発現を５１Ｂする遺伝子。
ゼの活性発現を５１Ｂする遺伝子。
ＧＴＧＣＣＧＧＣＡＡＧＣＡ（＝６６ＧＣＴＴＧＣＣＧ
ＣＣＧＴＣＡＣＴＣＧＣＣＩｉＧＣＴＣＣＡＧＣＧＣＧ
ＣＣＧＣＧＧＴＴＧＣＣＧＣＴＣＧＡＴＧＣＣＧＧＣ（
コＧＧＣＡＴＣＴＣＧ（ＩコＡＡＧＴＣＧＣＧＣＧＣＡ
ＧＴＧＣＧＧＧＡＴＴＴＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＴＧＣＣ
ＴＣＧＡＡＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＣｆコＧＣＣＧＡＣＧ
ＡＡＣ［ＪＣＧＣＣＧＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＴＣＧ
ＡＣＣＡＧＣＡＵ（、ｕ１ＧＣＧＧＣＧＡ ＴＣＧＡＣ
ＣＡＧＡ ＴＣＧＣＧＣＡ Ａ Ｔ ＴＧＣＡＧＡＡＧ
ＡＧＣＧＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣＧＡ ＴＧＣＧＡ Ｔ
ＧＣＧＣ６１０６２０６’３０ ６４０
６５０ ６６０ＧＣＡＣＡＡＣＴＧＡＣＧＣＡＧ
ＡＣＧＣＴＣＧＧＣＣＣＣＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣ
ＧＣＧ 丁ＣＧＣＧＣＡＧ、ＡＴＧＣＡＧＣＡＧ６７０
．６８０ ６９０ ７００
７＋、０ ７２０ＧＡＣＧＡＣＧＣＡ ＴＣＧＴ
ＧＧＣＡＧＡＧＣＣＧＣＴＡＣＧＣＧＧＡＣＴＡ ＴＧ
ＣＧＧＣＧＣＡＧＣＧＣＡＣＧＣＡＧＡ ＴＣＧＡＡＴ
ＣＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＴＣＧＣＣＧＣＡＧＧＡ ＴＣ
ＧＣＧＡ ＣＧＣＧＣＡＧ Ａ ＴＣＧＣＣＧＣＧＣＴ
ＧＣＧＧＣＡＧＣＧＣＧＴＧＧＧ （２）上記（１）記載の遺伝子を有するベクター。
ＣＣＧＴＣＡＣＴＣＧＣＣＩｉＧＣＴＣＣＡＧＣＧＣＧ
ＣＣＧＣＧＧＴＴＧＣＣＧＣＴＣＧＡＴＧＣＣＧＧＣ（
コＧＧＣＡＴＣＴＣＧ（ＩコＡＡＧＴＣＧＣＧＣＧＣＡ
ＧＴＧＣＧＧＧＡＴＴＴＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＴＧＣＣ
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ＧＣＧＡ ＣＧＣＧＣＡＧ Ａ ＴＣＧＣＣＧＣＧＣＴ
ＧＣＧＧＣＡＧＣＧＣＧＴＧＧＧ （２）上記（１）記載の遺伝子を有するベクター。
（３）−１−記（２）記載のベクターとリパーゼ構造遺
伝子とを保持する？ｄ王を培養して、リパーゼを生産す
ることを特徴とするリパーゼの生産方法。
伝子とを保持する？ｄ王を培養して、リパーゼを生産す
ることを特徴とするリパーゼの生産方法。
本発明の調節遺伝子は、前記耐熱性リパーゼ生産菌シュ
ードモナスｓｐ、 ＫＩＩｌｆ−５６菌株がらクローニ
ングされたものである。シュードモナスＳＰ。
ードモナスｓｐ、 ＫＩＩｌｆ−５６菌株がらクローニ
ングされたものである。シュードモナスＳＰ。
ＫＷＩ−５６菌株は、通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所に、微工研菌寄第９６５９号（ＦＥＲＭ Ｐ
−９６５９）の微生物受託番号で寄託されており、その
菌学的性質等については特開平１−１１２．９７９号に
記載されている。このシュードモナスｓｐ、 ＫＷＩ−
５６菌株は耐熱性リパーゼ生産菌として、耐熱性リパー
ゼをコートするリガーゼ構造遺伝子を有することが明ら
かになっている（特願平１−１８２３０１号）。
技術研究所に、微工研菌寄第９６５９号（ＦＥＲＭ Ｐ
−９６５９）の微生物受託番号で寄託されており、その
菌学的性質等については特開平１−１１２．９７９号に
記載されている。このシュードモナスｓｐ、 ＫＷＩ−
５６菌株は耐熱性リパーゼ生産菌として、耐熱性リパー
ゼをコートするリガーゼ構造遺伝子を有することが明ら
かになっている（特願平１−１８２３０１号）。
本発明の調節遺伝子は、シュードモナスＳＰ。
ＫＩｉｌＩ−５６菌株の耐熱性リパーゼ構造遺伝子の下
流に存在し、リパーゼの活性発現を調節する遺伝子とし
てコートされている。この調節遺伝子はシュードモナス
ｓｐ、 ＫＷＩ−５６菌株よりクローニングすることに
より得られる。
流に存在し、リパーゼの活性発現を調節する遺伝子とし
てコートされている。この調節遺伝子はシュードモナス
ｓｐ、 ＫＷＩ−５６菌株よりクローニングすることに
より得られる。
調節遺伝子のクローニングを行うための好ましい方法に
ついて説明すると、まず調Ｂ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ
をシュードモナスＳＰ、 ＫＷＩ−５６菌株より単離す
る。調節遺伝子を含むＤＮＡの単離は常法、例えばＭａ
ｒｍｕｒの方法（Ｍａｒｍｕｒ、 Ｊ、＋ Ｊ、 Ｍｏ
１． Ｂｉｏｌ。
ついて説明すると、まず調Ｂ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ
をシュードモナスＳＰ、 ＫＷＩ−５６菌株より単離す
る。調節遺伝子を含むＤＮＡの単離は常法、例えばＭａ
ｒｍｕｒの方法（Ｍａｒｍｕｒ、 Ｊ、＋ Ｊ、 Ｍｏ
１． Ｂｉｏｌ。
３、２０８（１９６１））、Ｓｍ１ｔｈらの方法（Ｓｍ
」、ｔｈ、 Ｍ−Ｉ Ｇ、１“Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” 、 Ａｃａｄｅｍｉｃ
ｐｒｅｓｓ。
」、ｔｈ、 Ｍ−Ｉ Ｇ、１“Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” 、 Ａｃａｄｅｍｉｃ
ｐｒｅｓｓ。
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 １２． ｐａｒｔ Ａ、 Ｐ５４
５（１９６７））等により行うことができる。
５（１９６７））等により行うことができる。
こうして単離された染色体ＤＮＡおよびベクターＤＮＡ
を制限酵素で切断したのち、両者を混合し、ＤＮＡリガ
ーゼで処理することにより、染色体ＤＮＡのベクターＤ
Ｎ、Ａへの組込みを行う。制限酵素としては鼾＋ｍＨＩ
＋凪遼ＲＩ、均銭■、虱Ｉ、ジ用３ＡＩ等があげられ
る。ベクターＤＮＡにはｐＬｌｃ１８． ｐｕｃ１９、
ｐＢＲ３２２等の公知のプラスミドベクターや、Ｍ１３
１１１ρ１８、λｇｔｌｏ等公知のファージベクターな
どを利用できる。こうして得られた組換ベクターを大腸
菌、枯草菌、酵母等の宿主細胞に導入して形質転換し、
形質転換体を形成する。形質転換は塩化カルシウム法等
の公知の方法によることができる。
を制限酵素で切断したのち、両者を混合し、ＤＮＡリガ
ーゼで処理することにより、染色体ＤＮＡのベクターＤ
Ｎ、Ａへの組込みを行う。制限酵素としては鼾＋ｍＨＩ
＋凪遼ＲＩ、均銭■、虱Ｉ、ジ用３ＡＩ等があげられ
る。ベクターＤＮＡにはｐＬｌｃ１８． ｐｕｃ１９、
ｐＢＲ３２２等の公知のプラスミドベクターや、Ｍ１３
１１１ρ１８、λｇｔｌｏ等公知のファージベクターな
どを利用できる。こうして得られた組換ベクターを大腸
菌、枯草菌、酵母等の宿主細胞に導入して形質転換し、
形質転換体を形成する。形質転換は塩化カルシウム法等
の公知の方法によることができる。
次に、上記の方法により得られた形質転換体の中から、
調節遺伝子を保持する株をスクリーニングする。スクリ
ーニングは例えばＫｕｇｉｍｉｙａらの方法（Ｋｕｇｉ
ｍｉｙａ、 Ｓ、＋ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ
、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、。
調節遺伝子を保持する株をスクリーニングする。スクリ
ーニングは例えばＫｕｇｉｍｉｙａらの方法（Ｋｕｇｉ
ｍｉｙａ、 Ｓ、＋ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ
、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、。
１’４］、、 １８５（＋９８６））により、トリブチ
リン寒天培地上で、トリブチリンの加水分解に伴うクリ
アゾーンを形成する菌株を分離することによって行うこ
とができる。この場合大腸菌、枯草菌、酵母等はリガー
ゼを生産しないため、培地上でクリアゾーンを形成しな
いが、リパーゼ構造遺伝子を導入した大腸菌は小さいク
リアゾーンを形成する。さらにリパーゼ構造遺伝子と調
節遺伝子の両方を導入した大腸菌は高いリパーゼ活性を
示すため、大きなりリアゾーンを形成する。
リン寒天培地上で、トリブチリンの加水分解に伴うクリ
アゾーンを形成する菌株を分離することによって行うこ
とができる。この場合大腸菌、枯草菌、酵母等はリガー
ゼを生産しないため、培地上でクリアゾーンを形成しな
いが、リパーゼ構造遺伝子を導入した大腸菌は小さいク
リアゾーンを形成する。さらにリパーゼ構造遺伝子と調
節遺伝子の両方を導入した大腸菌は高いリパーゼ活性を
示すため、大きなりリアゾーンを形成する。
従って大きなりリアゾーンを形成するコロニーを選んで
増殖させれば、リパーゼ構造遺伝子と調節遺伝子を有す
る形質転換体が得られる。
増殖させれば、リパーゼ構造遺伝子と調節遺伝子を有す
る形質転換体が得られる。
こうして得られた形質転換体よりアルカリ−５Ｏ５（ソ
ジウムジサルフエート）法等の公知の方法を用いて組換
ベクターを分離し、制限酵素を用いて、調節遺伝子が存
在する領域を切断し、精製することにより、本発明の調
節遺伝子が得られる。この場合、調節遺伝子が存在する
領域は、上記組換ベクターを各種制限酵素を用いて切断
し、その切断によって得られた遺伝子領域とリパーゼ構
造遺伝子とを導入した形質転換体について前記と同様に
して、トリブチリン寒天培地でのクリアゾーン形成能の
大小を調べることにより決定できる。
ジウムジサルフエート）法等の公知の方法を用いて組換
ベクターを分離し、制限酵素を用いて、調節遺伝子が存
在する領域を切断し、精製することにより、本発明の調
節遺伝子が得られる。この場合、調節遺伝子が存在する
領域は、上記組換ベクターを各種制限酵素を用いて切断
し、その切断によって得られた遺伝子領域とリパーゼ構
造遺伝子とを導入した形質転換体について前記と同様に
して、トリブチリン寒天培地でのクリアゾーン形成能の
大小を調べることにより決定できる。
こうして得られる調節遺伝子は前記の塩基配列を有して
いる。調節遺伝子の塩基配列は例えばジデオキシ法（Ｓ
ａｎｇｅｒ、 Ｆ、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ。
いる。調節遺伝子の塩基配列は例えばジデオキシ法（Ｓ
ａｎｇｅｒ、 Ｆ、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ。
し、Ｓ、Ａ、、 ７４．５４６３（１９７７））等の公
知の方法により決定することができる。
知の方法により決定することができる。
本発明の調節遺伝子を有するベクターは、上記のような
調節遺伝子をプラスミドベクターやファージベクター等
の発現ベクターに組込んだものである。この場合調ＢＪ
Ｊ！仏子はリパーゼ構造遺伝子とともに、同しベクター
に組込むのが好ましいが、調節遺伝子のみを組込んでも
よい。このような調節遺伝子を４１′するベクターは、
大腸菌、枯α菌、酵母、ツユ−トモナス等の宿主細胞に
導入することにより、形質転換体を１１トることができ
る。
調節遺伝子をプラスミドベクターやファージベクター等
の発現ベクターに組込んだものである。この場合調ＢＪ
Ｊ！仏子はリパーゼ構造遺伝子とともに、同しベクター
に組込むのが好ましいが、調節遺伝子のみを組込んでも
よい。このような調節遺伝子を４１′するベクターは、
大腸菌、枯α菌、酵母、ツユ−トモナス等の宿主細胞に
導入することにより、形質転換体を１１トることができ
る。
本発明のリパーゼの生産方法は、ｍｊ記調節遺伝子を利
用してリパーゼを生産する方法であり、リガーゼ構造遺
伝子と調節遺伝子を有するベクターとを保持する宿主を
培養してリパーゼを生産する。
用してリパーゼを生産する方法であり、リガーゼ構造遺
伝子と調節遺伝子を有するベクターとを保持する宿主を
培養してリパーゼを生産する。
この場合リパーゼ構造遺伝子と調節遺伝子とを一個のベ
クター上に連結して宿主に導入するか、もしくは別個の
ベクターにそれぞれを連結して同時に宿主に導入すれば
よい。使用する宿主微生物としては、大腸菌、シュード
モナス属細菌、枯草菌等が利用できる。また使用するベ
クターとしては。
クター上に連結して宿主に導入するか、もしくは別個の
ベクターにそれぞれを連結して同時に宿主に導入すれば
よい。使用する宿主微生物としては、大腸菌、シュード
モナス属細菌、枯草菌等が利用できる。また使用するベ
クターとしては。
用いる宿主内で安定かつ自律的に複製が可能であり、組
込まれた遺伝子の発現が可能なものであればよく、例え
ば宿主微生物が大腸菌の場合は、ｐＵｃ１８、ｐＨ３Ｇ
２９９． ｐＢＲ３２２、Ｍ１３ｍｐ１８、λｇｔｌｏ
等が使用でき、宿主微生物がシュードモナス属細菌の場
合は、ｐＫＴ２４０． ｐｓＵＰ１０４、ＰＶＫＩＯＩ
等が使用でき、宿主微生物が枯草菌の場合は、ｐＵＢｌ
ｌｏ、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が使用できる。また、細胞
へのプラスミドの導入法としては、カルシウム処理によ
る方法、エレクトロポーションによる方法、接合伝達に
よる方法など、公知の手法を利用できる。また、調節遺
伝子とともに用いるリパーゼ構造遺伝子としては、シュ
ードモナス属、アルカリ土類金属、クロモバクテリウム
属、バチルス属、リゾプス属、キャンディダ属、ゲオト
リクム属等の公知のリパーゼ生産菌より分離されたリパ
ーゼ構造遺伝子を用いることもできる。耐熱性のリパー
ゼ生産のためにはシュードモナスｓｐ、、 ＫＶＩ−５
６菌株より分離されたリパーゼ構造遺伝子を用いること
が望ましい。
込まれた遺伝子の発現が可能なものであればよく、例え
ば宿主微生物が大腸菌の場合は、ｐＵｃ１８、ｐＨ３Ｇ
２９９． ｐＢＲ３２２、Ｍ１３ｍｐ１８、λｇｔｌｏ
等が使用でき、宿主微生物がシュードモナス属細菌の場
合は、ｐＫＴ２４０． ｐｓＵＰ１０４、ＰＶＫＩＯＩ
等が使用でき、宿主微生物が枯草菌の場合は、ｐＵＢｌ
ｌｏ、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が使用できる。また、細胞
へのプラスミドの導入法としては、カルシウム処理によ
る方法、エレクトロポーションによる方法、接合伝達に
よる方法など、公知の手法を利用できる。また、調節遺
伝子とともに用いるリパーゼ構造遺伝子としては、シュ
ードモナス属、アルカリ土類金属、クロモバクテリウム
属、バチルス属、リゾプス属、キャンディダ属、ゲオト
リクム属等の公知のリパーゼ生産菌より分離されたリパ
ーゼ構造遺伝子を用いることもできる。耐熱性のリパー
ゼ生産のためにはシュードモナスｓｐ、、 ＫＶＩ−５
６菌株より分離されたリパーゼ構造遺伝子を用いること
が望ましい。
このようにして得られた形質転換体を、酵素生産に最適
の条件下で培養し、培養上清あるいは破砕菌体よりリパ
ーゼを得ることができる。このようにリパーゼ構造遺伝
子と調節遺伝子の両方を組込んだ形質転換体により生産
されたリパーゼの活性は、リパーゼ構造遺伝子のみを組
込んだ形質転換体により生産されたリパーゼの活性に比
へると。
の条件下で培養し、培養上清あるいは破砕菌体よりリパ
ーゼを得ることができる。このようにリパーゼ構造遺伝
子と調節遺伝子の両方を組込んだ形質転換体により生産
されたリパーゼの活性は、リパーゼ構造遺伝子のみを組
込んだ形質転換体により生産されたリパーゼの活性に比
へると。
培養液単位容量あたり、酵素活性が２０〜３００倍であ
る。
る。
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明する。各
例中、％は特に指示しない限り重量％である。
例中、％は特に指示しない限り重量％である。
実施例１ 調節遺伝子のクローニング
シュードモナスｓｐ、 ＫＶＩ−５６菌株の一白金耳を
２００ｍ１２のＮＢ培地（肉エキス１％、ペプトン１％
、ＮａＣＱ ０．５％、ｐ）ｉ７．０）に植菌し、３０
℃で２４時間振とう培養した。菌体を集菌して洗浄した
後、１２ｍΩの０、ＩＭｌ−リスー塩酸緩Ｎ Ｆ＆Ｃｐ
Ｈ８，０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁し、１ｍｇのリ
ゾチームを加えて３７℃で１０分間放置した。次に６０
０ｄの１０％ＳＤＳを加え、３７℃で３０分間放置して
溶菌を行った。さらに６００４の３Ｍ ＮａＣＱを加え
たのち、フェノール抽出を３回繰返し、エーテル洗浄お
よびエタノール沈殿を行った。得られた沈Ｒ物は乾燥後
１０ｍＱのＳＳＣ溶液に溶解し、リボヌクレアーゼＡ
０．５ＩＩ１ｇを加えて３７℃で３０分間放置した。再
度フェノール抽出を３回行い、エーテル洗／？後、エタ
ノール沈殿でＤ〜、Ａを回収し、乾燥後ＳＳＣ溶液に溶
解した。その結果、３．５ｍｇの染色体１〕Ｎ４へを得
た。
２００ｍ１２のＮＢ培地（肉エキス１％、ペプトン１％
、ＮａＣＱ ０．５％、ｐ）ｉ７．０）に植菌し、３０
℃で２４時間振とう培養した。菌体を集菌して洗浄した
後、１２ｍΩの０、ＩＭｌ−リスー塩酸緩Ｎ Ｆ＆Ｃｐ
Ｈ８，０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁し、１ｍｇのリ
ゾチームを加えて３７℃で１０分間放置した。次に６０
０ｄの１０％ＳＤＳを加え、３７℃で３０分間放置して
溶菌を行った。さらに６００４の３Ｍ ＮａＣＱを加え
たのち、フェノール抽出を３回繰返し、エーテル洗浄お
よびエタノール沈殿を行った。得られた沈Ｒ物は乾燥後
１０ｍＱのＳＳＣ溶液に溶解し、リボヌクレアーゼＡ
０．５ＩＩ１ｇを加えて３７℃で３０分間放置した。再
度フェノール抽出を３回行い、エーテル洗／？後、エタ
ノール沈殿でＤ〜、Ａを回収し、乾燥後ＳＳＣ溶液に溶
解した。その結果、３．５ｍｇの染色体１〕Ｎ４へを得
た。
得られた染色体１）ＮＡを制限＃索勾品３ＡＩにより。
得られるＤＮＡ断片の鎖長がほぼ４〜１０ｋｂの範囲と
なるような条件下で部分分解した。一方ベクターＤＮＡ
としてプラスミドρＬＩＣ１９を用い、これを制限酵素
ト）１夏で切断し、アルカリホスファターゼで処理した
。そして前記部分分解したシュードモナスｓｐ、 ＫＷ
Ｉ−５６菌株染色体ＤＮＡとＢａｍｔ（Ｉで切断しアル
カリホスファターゼ処理したプラスミドｐｔｌｃ１９と
を２：１の割合で混合したのち、宝酒造（株）製ＤＮＡ
ライゲーションキットにより、 １６℃で３０分間反応
させ連結させた。
なるような条件下で部分分解した。一方ベクターＤＮＡ
としてプラスミドρＬＩＣ１９を用い、これを制限酵素
ト）１夏で切断し、アルカリホスファターゼで処理した
。そして前記部分分解したシュードモナスｓｐ、 ＫＷ
Ｉ−５６菌株染色体ＤＮＡとＢａｍｔ（Ｉで切断しアル
カリホスファターゼ処理したプラスミドｐｔｌｃ１９と
を２：１の割合で混合したのち、宝酒造（株）製ＤＮＡ
ライゲーションキットにより、 １６℃で３０分間反応
させ連結させた。
次に大腸菌８８１０１株を）Ｉａｎａｈａｎの方法（Ｈ
ａｎａｈａｎ。
ａｎａｈａｎ。
Ｄ、、 Ｇｅｎｅ、 １０．６３（１９８０））に基づ
き、カルシウム処理を施すことによって形質転換細胞と
して調製し、上記組換プラスミドを形質転換した。
き、カルシウム処理を施すことによって形質転換細胞と
して調製し、上記組換プラスミドを形質転換した。
上記形質転換体を、５０１ｔｇ／ＩＩＩＱのアンピシリ
ン、１％のトリブチリンを含むＬＢ甲板培地にブレーテ
ィングした。３７℃で４８時間培養したのち、約１６．
４００個の形質転換体より１４個のコロニー周辺にクリ
アゾーンを形成する株を得た。そしてこの１４個のクリ
アゾーン形成株を５０ｇ／ｍＱのアンピシリンを含む５
ｍＱのＬＢ液体培地により３７℃で２４時間振どう培養
した。培養液は菌体を破砕する目的で超音波処理し、そ
のリパーゼ活性をポリ定した。
ン、１％のトリブチリンを含むＬＢ甲板培地にブレーテ
ィングした。３７℃で４８時間培養したのち、約１６．
４００個の形質転換体より１４個のコロニー周辺にクリ
アゾーンを形成する株を得た。そしてこの１４個のクリ
アゾーン形成株を５０ｇ／ｍＱのアンピシリンを含む５
ｍＱのＬＢ液体培地により３７℃で２４時間振どう培養
した。培養液は菌体を破砕する目的で超音波処理し、そ
のリパーゼ活性をポリ定した。
リパーゼ活性の測定は回転攪拌法により行った。
すなわち反応容器に５ｎＱの１／２０Ｍリン酸緩衝液（
ｐｉ（７，０）、１＋＋＋２のオリーブ油および１ｍＱ
の酵素液を加え、３７℃で６０分間、スターラー回転５
００ｒρｍで反応を行った。エタノール２０ｍΩを加え
て反応を停止したのち、生成した遊離脂肪酸を１／２Ｏ
ＮのＫＯＨで滴定した。酵素活性は１分間に１マイクロ
モルの脂肪酸を遊離させる酵素量を１ユニツト（ＩＵ）
とした。
ｐｉ（７，０）、１＋＋＋２のオリーブ油および１ｍＱ
の酵素液を加え、３７℃で６０分間、スターラー回転５
００ｒρｍで反応を行った。エタノール２０ｍΩを加え
て反応を停止したのち、生成した遊離脂肪酸を１／２Ｏ
ＮのＫＯＨで滴定した。酵素活性は１分間に１マイクロ
モルの脂肪酸を遊離させる酵素量を１ユニツト（ＩＵ）
とした。
その結果、１４個のクリアゾーン形成株の中から。
０．０２５Ｕ／ｎ＋Ｑのリパーゼ活性を示す一株を単離
した。
した。
本形質転換体を５Ａ−３株と命名した。
そしてこの５Ａ−３株を５０ Ｘ ／ ｍ Ｑのアンピ
シリンを含む５ｍＱのｌ−Ｂ液体培地により３７°Ｃで
２４時時間上う培養し、アルカリ−３ＤＳ法によりプラ
スミドを抽出した。このプラスミドは１１．５ｋｂの外
来［）ＮＡ断片を保持していた。本プラスミドをｐＬＰ
６と命名した。
シリンを含む５ｍＱのｌ−Ｂ液体培地により３７°Ｃで
２４時時間上う培養し、アルカリ−３ＤＳ法によりプラ
スミドを抽出した。このプラスミドは１１．５ｋｂの外
来［）ＮＡ断片を保持していた。本プラスミドをｐＬＰ
６と命名した。
次にこのプラスミドｐＬＰ６を各種制限酵素により断片
化し、サブクローニングした。組換プラスミドを保持す
る大腸菌１１ Ｂ １０１株のトリブチリン−Ｌ８平板
上でのクリアゾーン形成の有無および形成されたクリア
ゾーンの大小を指標として、リパーゼ構造遺伝子および
調節遺伝子がコートされる最小ＤＮＡ断片を明らかにし
た。
化し、サブクローニングした。組換プラスミドを保持す
る大腸菌１１ Ｂ １０１株のトリブチリン−Ｌ８平板
上でのクリアゾーン形成の有無および形成されたクリア
ゾーンの大小を指標として、リパーゼ構造遺伝子および
調節遺伝子がコートされる最小ＤＮＡ断片を明らかにし
た。
まず２．９ｋｂの斃伊ＩＩ −ＥｃｏＲＩ断片を、リパ
ーゼ構造遺伝子および調節遺伝子がコートされる最小Ｄ
ＮＡ断片とし、この断片を、…Ｈ１およびＥｃｏＲ１で
消化したアンピシリン耐性の遺伝子マーカーを有するプ
ラスミドｐｌＪｃ１．９に結合した。得られたプラスミ
ドをｐＬＰ６４と命名した。一方、２．１ｋｂのＢｇＱ
ｌｌ−Ｂ２υＨ１断片をリパーゼ構造遺伝子がコード
される最小ＤＮＡ断片とし、この断片を、ｔ３ａｍｔｉ
ｌおよびＥｃｏＲＩで消化したアンピシリン耐性の遺伝
子マーカーを有するプラスミドｐＵｃ１９に結合した。
ーゼ構造遺伝子および調節遺伝子がコートされる最小Ｄ
ＮＡ断片とし、この断片を、…Ｈ１およびＥｃｏＲ１で
消化したアンピシリン耐性の遺伝子マーカーを有するプ
ラスミドｐｌＪｃ１．９に結合した。得られたプラスミ
ドをｐＬＰ６４と命名した。一方、２．１ｋｂのＢｇＱ
ｌｌ−Ｂ２υＨ１断片をリパーゼ構造遺伝子がコード
される最小ＤＮＡ断片とし、この断片を、ｔ３ａｍｔｉ
ｌおよびＥｃｏＲＩで消化したアンピシリン耐性の遺伝
子マーカーを有するプラスミドｐＵｃ１９に結合した。
得られたプラスミドをｐＬＰ６５と命名した。
また１、９ｋｂのＰｓｔ Ｉ −ＥｃｏＲＩ断片を、カ
ナマイシン耐性の遺伝子マーカーを持つベクタープラス
ミドｐＨ５Ｇ２９９（宝酒造（株）製）にし、ｐ １１
５ Ｇ ＋−６８を１１＋た。
ナマイシン耐性の遺伝子マーカーを持つベクタープラス
ミドｐＨ５Ｇ２９９（宝酒造（株）製）にし、ｐ １１
５ Ｇ ＋−６８を１１＋た。
第１図はプラスミドρＬ １１６４、ｐＬＰ６５、ｐ
１１５ Ｇ ｌ、６８の制限酵素地図であり、図中、黒
細線はシュードモナスＳＰ、 ＫＷＩ−５６菌株染色体
ＤＮＡ由来の遺伝子を、黒太線はベクターＤＮＡ由来の
遺伝子を示す。また白太線はリパーゼ構造遺伝子の位置
を、Ａｍρはアンピシリン耐性遺伝子の位置を、Ｋｍは
カナマイシン耐性遺伝子の位置を示し、矢印はベクター
上の］、ａｃプロモーターの方向を示す。
１１５ Ｇ ｌ、６８の制限酵素地図であり、図中、黒
細線はシュードモナスＳＰ、 ＫＷＩ−５６菌株染色体
ＤＮＡ由来の遺伝子を、黒太線はベクターＤＮＡ由来の
遺伝子を示す。また白太線はリパーゼ構造遺伝子の位置
を、Ａｍρはアンピシリン耐性遺伝子の位置を、Ｋｍは
カナマイシン耐性遺伝子の位置を示し、矢印はベクター
上の］、ａｃプロモーターの方向を示す。
各プラスミドを保持した大腸菌１１ＢＩＯＩ株をトリブ
チリン−ＬＢ平板培地上で培養した時のクリアゾーン形
成の有無を第１図の右端に示す。すなわちｐ Ｌ Ｐ
５４を保持する大腸菌）１８１０１株は、５０Ａｔｇ／
ＩｎＱアンピシリン、】％トリブチリンを含むＬＢ平板
培地上にて、３７℃で２日間培養した時、大きな（半径
１．０〜１．２ｃｍ）クリアゾーンを形成した。一方、
ｐＬＰ６５を保持する１１８１０１株は、同様の条件
で小さな（半径０．３ ０．４ｃｍ）クリアゾーンを形
成した。またｐＨ５ＧＬ６８を屯独で保持する１１０１
株は５０ ｐｇ ／ ｔｓ Ｑカナマイシンを含むトリ
ブチリン−ＬＢ平板培地上でクリアゾーンを形成しなか
ったか、ＰＨ５ＧＬ６８とρＬＰ６５の双方を保持する
１１０１株は、５０ ｐｙ、 ／ ｍ Ｑアンピシリン
および５０１ｔｇ／ｍＱカナマイシンを含むトリブチリ
ン−ＬＢ平板培地上で大きなりリアゾーンを形成した。
チリン−ＬＢ平板培地上で培養した時のクリアゾーン形
成の有無を第１図の右端に示す。すなわちｐ Ｌ Ｐ
５４を保持する大腸菌）１８１０１株は、５０Ａｔｇ／
ＩｎＱアンピシリン、】％トリブチリンを含むＬＢ平板
培地上にて、３７℃で２日間培養した時、大きな（半径
１．０〜１．２ｃｍ）クリアゾーンを形成した。一方、
ｐＬＰ６５を保持する１１８１０１株は、同様の条件
で小さな（半径０．３ ０．４ｃｍ）クリアゾーンを形
成した。またｐＨ５ＧＬ６８を屯独で保持する１１０１
株は５０ ｐｇ ／ ｔｓ Ｑカナマイシンを含むトリ
ブチリン−ＬＢ平板培地上でクリアゾーンを形成しなか
ったか、ＰＨ５ＧＬ６８とρＬＰ６５の双方を保持する
１１０１株は、５０ ｐｙ、 ／ ｍ Ｑアンピシリン
および５０１ｔｇ／ｍＱカナマイシンを含むトリブチリ
ン−ＬＢ平板培地上で大きなりリアゾーンを形成した。
以上の結果よりプラスミドｐＬＰ６４のリパーゼ構造遺
伝子より下流に、リパーゼの活性発現を調節する調節遺
伝子が存在することがうかがえる。
伝子より下流に、リパーゼの活性発現を調節する調節遺
伝子が存在することがうかがえる。
次にｐＨ５ＧＬ６８より各種制限酵素を用いて欠失プラ
スミドを作製した。第２図はプラスミドｐＬＰ６４とｐ
Ｈ５ＧＬ６８由来の欠失体の制限酵素地図である。
スミドを作製した。第２図はプラスミドｐＬＰ６４とｐ
Ｈ５ＧＬ６８由来の欠失体の制限酵素地図である。
図中、黒細線はシュードモナスｓｐ、 ＫＷＩ−５６菌
株染色体ＤＮＡ由来の遺伝子を、黒太線はベクターＤＮ
Ａ由来の遺伝子を示す。また白太線はリパーゼ構造遺伝
子の位置を、斜太線は調節遺伝子の位置を示し、矢印は
ベクター上の１４シ９プロモーターの方向を示す。
株染色体ＤＮＡ由来の遺伝子を、黒太線はベクターＤＮ
Ａ由来の遺伝子を示す。また白太線はリパーゼ構造遺伝
子の位置を、斜太線は調節遺伝子の位置を示し、矢印は
ベクター上の１４シ９プロモーターの方向を示す。
プラスミ１〜ｐ Ｌ Ｐ ６５ と上記欠失プラスミド
の双方を大腸菌８８１０１株に導入して形質転換し、１
）１ｊ記と同様にトリブチリン−Ｌｌい１１扱培地にで
培養した時のクリアゾーン形成の有無を第２回の右端に
示す。
の双方を大腸菌８８１０１株に導入して形質転換し、１
）１ｊ記と同様にトリブチリン−Ｌｌい１１扱培地にで
培養した時のクリアゾーン形成の有無を第２回の右端に
示す。
第２図から明らかなように、Ｂ−ｓｔ−Ｅｌｌ認識部位
より上流領域を欠失したｐＨ５ｔ＞ＬＤ８Ｂ、およびＥ
ｃ−ｑ丁２２１認識部位より下流領ＦｔＸ、を欠失した
ｐ ＨＳ Ｇ ｌ−６８１Ｅでは、大きなりリアゾーン
形成能を相補できるのに対し、Ｍｌｕ Ｉ認識部位より
上流領域を欠失したｐＨ５ＧＬ６８Ｍ 。
より上流領域を欠失したｐＨ５ｔ＞ＬＤ８Ｂ、およびＥ
ｃ−ｑ丁２２１認識部位より下流領ＦｔＸ、を欠失した
ｐ ＨＳ Ｇ ｌ−６８１Ｅでは、大きなりリアゾーン
形成能を相補できるのに対し、Ｍｌｕ Ｉ認識部位より
上流領域を欠失したｐＨ５ＧＬ６８Ｍ 。
ＫｐｎＩ認識部位より一ヒ流領域を欠失したｐＨ５Ｇ１
６８に、およびＮｏｔ Ｉ認識部位より下流領域を欠失
したＰｕ５ＧＬ６８Ｎでは相補性が認められなかった。
６８に、およびＮｏｔ Ｉ認識部位より下流領域を欠失
したＰｕ５ＧＬ６８Ｎでは相補性が認められなかった。
したがって調節遺伝子は１．Ｏｋｂのは匹ＥＩＩ認識部
位−も遼丁２２■認識部位間に存在することが明らかと
なった。
位−も遼丁２２■認識部位間に存在することが明らかと
なった。
ジデオキシ法により本断片の全塩基配列を決定した結果
、 ＢｓｔＥＩＩ認識部位−Ｍｌｕ Ｉ認識部位間に開
始コドンを持ち、Ｎｏｔ Ｉ認識部位−４遼Ｔ２２１認
識部位間に終止コドンを持つオープンリーディングフレ
ームを認めた。第３図はこうして確認された調節遺伝子
のオープンリーディングフレームの塩基およびアミノ酸
配列図であり、上段は塩基配列を。
、 ＢｓｔＥＩＩ認識部位−Ｍｌｕ Ｉ認識部位間に開
始コドンを持ち、Ｎｏｔ Ｉ認識部位−４遼Ｔ２２１認
識部位間に終止コドンを持つオープンリーディングフレ
ームを認めた。第３図はこうして確認された調節遺伝子
のオープンリーディングフレームの塩基およびアミノ酸
配列図であり、上段は塩基配列を。
下段はそれから決定されるアミノ酸配列を示す。
実施例２ 大腸菌によるリパーゼの生産５００ｍＱ坂ロ
フラスコに、５０ Ｘ ／ ｍ Ｑのアンピシリンと５
０ ｔｔｇ ／ ｍ Ｑのカナマイシンを添加したＬＢ
培地５０ｍＱを分注し、プラスミドｐＬＰ６５とＰＨ５
Ｇ２９９を保持した大腸菌１（８１０１株、およびプラ
スミドｐＬＰ６５とｐＨ５ＧＬ６８を保持した８８１０
１株の前培養液をそれぞれ１％の植苗量で接種し、３７
℃で２４時間振どう培養を行った。菌体を集菌して洗浄
したのち、５０ｍＭの２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）に懸濁した。懸濁液は超音波処理によって菌
体を破砕し、残存菌体を取除くために遠心分離を行った
。遠心分離上清のリパーゼ活性を前記回転攪拌法によっ
て測定したとコロ、８８１０１（ｐＬＰ６５＋ｐＨ５Ｇ
２９９）ｔ’ ０．３ＬＩ／ｍ１２． ＨＢＩＯＩ（ｐ
ＬＰ６５ ＋ｐＨ５ＧＬ６８）で１６．５Ｌｌ／＋＊Ｑ
のリパーゼ活性を示した。
フラスコに、５０ Ｘ ／ ｍ Ｑのアンピシリンと５
０ ｔｔｇ ／ ｍ Ｑのカナマイシンを添加したＬＢ
培地５０ｍＱを分注し、プラスミドｐＬＰ６５とＰＨ５
Ｇ２９９を保持した大腸菌１（８１０１株、およびプラ
スミドｐＬＰ６５とｐＨ５ＧＬ６８を保持した８８１０
１株の前培養液をそれぞれ１％の植苗量で接種し、３７
℃で２４時間振どう培養を行った。菌体を集菌して洗浄
したのち、５０ｍＭの２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）に懸濁した。懸濁液は超音波処理によって菌
体を破砕し、残存菌体を取除くために遠心分離を行った
。遠心分離上清のリパーゼ活性を前記回転攪拌法によっ
て測定したとコロ、８８１０１（ｐＬＰ６５＋ｐＨ５Ｇ
２９９）ｔ’ ０．３ＬＩ／ｍ１２． ＨＢＩＯＩ（ｐ
ＬＰ６５ ＋ｐＨ５ＧＬ６８）で１６．５Ｌｌ／＋＊Ｑ
のリパーゼ活性を示した。
実施例３ シュードモナス用ベクターの構築プラスミド
ｐＬＰ６４およびｐＬＰ６５よリシュートモナス用ベク
ターを構築した。第４図はベクターの構築工程図である
。図中、黒太線はシュードモナスｓｐ、 ＫＩＩＩＩ−
５６菌株の染色体ＤＮＡ由来の遺伝子を、Ａｍｐはアン
ピシリン耐性遺伝子を、 Ｃ＋ｉはクロラムフェニコー
ル耐性遺伝子を、Ｔｃはテトラサイクリン耐性遺伝子を
示す。またＢ、Ｂｇ、Ｅ、Ｈはそれぞれ制限酵素、壜馴
Ｈ１，顯ｌっＩＩ 、 ＥＣｏＲＩ 、 ＨｉｎｄＩ［
Ｉ 認識部位を示す。
ｐＬＰ６４およびｐＬＰ６５よリシュートモナス用ベク
ターを構築した。第４図はベクターの構築工程図である
。図中、黒太線はシュードモナスｓｐ、 ＫＩＩＩＩ−
５６菌株の染色体ＤＮＡ由来の遺伝子を、Ａｍｐはアン
ピシリン耐性遺伝子を、 Ｃ＋ｉはクロラムフェニコー
ル耐性遺伝子を、Ｔｃはテトラサイクリン耐性遺伝子を
示す。またＢ、Ｂｇ、Ｅ、Ｈはそれぞれ制限酵素、壜馴
Ｈ１，顯ｌっＩＩ 、 ＥＣｏＲＩ 、 ＨｉｎｄＩ［
Ｉ 認識部位を示す。
まずＥＣｏＲＩテ消化したプラスミドｐＬＰ６４．０．
５ＪｔｇをＴ４ポリメラーゼを用いて末端を平滑末端と
した。そしてこの断片をアルカリホスファターゼ処理し
たのち、０．２／、ｔｇのリン酸化ＢｇＲＩＩリンカ−
（Ｃ：２仝ＨｃＨ２，東洋紡（株）製）と混合し、宝酒
造（株）製ＤＮＡライゲーションキットを用いて、１２
℃で１時間反応させリンカ−ライゲーションを行った。
５ＪｔｇをＴ４ポリメラーゼを用いて末端を平滑末端と
した。そしてこの断片をアルカリホスファターゼ処理し
たのち、０．２／、ｔｇのリン酸化ＢｇＲＩＩリンカ−
（Ｃ：２仝ＨｃＨ２，東洋紡（株）製）と混合し、宝酒
造（株）製ＤＮＡライゲーションキットを用いて、１２
℃で１時間反応させリンカ−ライゲーションを行った。
上記プラスミドを大腸菌８８１０１株形質転換細胞に導
入して形質転換し、アルカリ−３Ｄｓ法によりプラスミ
ドρＬＰ６４−ＢＧＬを得た。そしてこのｐＬＰ６４−
ＢＧＬより得たリパーゼ構造遺伝子と調節遺伝子を含む
２．９ｋｂのＨｉｎｄ ｌｌ−８６名■断片を、肛せ■
および埠すＨＩで消化した広宿主域プラスミドベクター
ｐｓＵＰ１０４（Ｓｉｍｏｎ、 Ｒ，、”Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅＢａｃｔｅｒ
ｉａ−Ｐｌａｎｔ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ” Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌａｇＢｅｒｌｉｎ ）Ｉｅｉｄｅ
ｌｂｅｒｇ、 ｐ９８（１９８３））に連結し、シュー
ドモナス用ベクタープラスミドＰＳＵＰ−１ｉｐ６４を
得た。
入して形質転換し、アルカリ−３Ｄｓ法によりプラスミ
ドρＬＰ６４−ＢＧＬを得た。そしてこのｐＬＰ６４−
ＢＧＬより得たリパーゼ構造遺伝子と調節遺伝子を含む
２．９ｋｂのＨｉｎｄ ｌｌ−８６名■断片を、肛せ■
および埠すＨＩで消化した広宿主域プラスミドベクター
ｐｓＵＰ１０４（Ｓｉｍｏｎ、 Ｒ，、”Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅＢａｃｔｅｒ
ｉａ−Ｐｌａｎｔ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ” Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−ＶｅｒｌａｇＢｅｒｌｉｎ ）Ｉｅｉｄｅ
ｌｂｅｒｇ、 ｐ９８（１９８３））に連結し、シュー
ドモナス用ベクタープラスミドＰＳＵＰ−１ｉｐ６４を
得た。
また、前述のρＬ Ｐ ６５より得たリパーゼ構造遺伝
子のみを含む２．１ｋｂ ＨｉｎｄｌＩＩ−Ｂａｏ＋Ｈ
Ｉ断片を、前記と同様にしてプラスミドベクターＰＳＵ
Ｐ１０４ に連結し、シュードモナス用ベクタープラス
ミドｐｓＵＰ−１ｉｐ６５を得た。
子のみを含む２．１ｋｂ ＨｉｎｄｌＩＩ−Ｂａｏ＋Ｈ
Ｉ断片を、前記と同様にしてプラスミドベクターＰＳＵ
Ｐ１０４ に連結し、シュードモナス用ベクタープラス
ミドｐｓＵＰ−１ｉｐ６５を得た。
実施例４ シュードモナス・エルギノサによるリパーゼ
の生産 実施例３で得たプラスミドｐｓＵＰ−１ｉｐ６５． ｐ
ＳＬＪＰ−１ｉｐ５４およびプラスミドベクターｐＳＵ
Ｐ１０４を、塩化カルシウム法によりあらかじめ形質転
換細胞として調整したシュードモナス・エルギノサＰＡ
Ｏ１株（Ｈｏｌｌｏ讐ａｙ、 Ｂ、す、、 Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、 Ｒｅｖ、、 ４３．７３（１９７９））に
導入して形質転換した。そして上記形質転換体の前培養
液を１％の植菌量で、１ｏｏｐｇ／ｌ１ＩＱのクロラム
フェニコールを含む５０ｍ１２ＬＢ培地に植菌し、３７
℃で２４時間振どう培養を行った。菌体を集菌して洗浄
したのち、５ｍ１２の２０１トリス−塩酸緩衝液（ｐｌ
＋７．５）に懸濁した。懸濁液は超音波処理によって菌
体を破砕し、残存菌体を取り除くために遠心分離を行っ
た。各遠心分離上清のリパーゼ活性を前記の回転攪拌法
によって測定したところ、ＰＡＯＩ （ｐｓＵＰ１０４
） テＯＵ／ｍ（１，ＰＡＯＥ （ｐｓＵＰ−１ｉｐ６
４） テロ、Ｏ１ｌ／ｍＱ、 ＰＡＯＩ （ｐｓＵＰ−
１ｉｐ６５） テｏ、０２Ｕ／ｍ１ｌ（７） ’Ｊパー
ゼ活性を認めた。
の生産 実施例３で得たプラスミドｐｓＵＰ−１ｉｐ６５． ｐ
ＳＬＪＰ−１ｉｐ５４およびプラスミドベクターｐＳＵ
Ｐ１０４を、塩化カルシウム法によりあらかじめ形質転
換細胞として調整したシュードモナス・エルギノサＰＡ
Ｏ１株（Ｈｏｌｌｏ讐ａｙ、 Ｂ、す、、 Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、 Ｒｅｖ、、 ４３．７３（１９７９））に
導入して形質転換した。そして上記形質転換体の前培養
液を１％の植菌量で、１ｏｏｐｇ／ｌ１ＩＱのクロラム
フェニコールを含む５０ｍ１２ＬＢ培地に植菌し、３７
℃で２４時間振どう培養を行った。菌体を集菌して洗浄
したのち、５ｍ１２の２０１トリス−塩酸緩衝液（ｐｌ
＋７．５）に懸濁した。懸濁液は超音波処理によって菌
体を破砕し、残存菌体を取り除くために遠心分離を行っ
た。各遠心分離上清のリパーゼ活性を前記の回転攪拌法
によって測定したところ、ＰＡＯＩ （ｐｓＵＰ１０４
） テＯＵ／ｍ（１，ＰＡＯＥ （ｐｓＵＰ−１ｉｐ６
４） テロ、Ｏ１ｌ／ｍＱ、 ＰＡＯＩ （ｐｓＵＰ−
１ｉｐ６５） テｏ、０２Ｕ／ｍ１ｌ（７） ’Ｊパー
ゼ活性を認めた。
実施例５ シュードモナスｓｐ、 ＫｗＩ−５６菌株に
ょるリパーゼの生産 大腸菌５１７−１株（Ｓｉｍｏｎ、 Ｒ，、ＢＩＯ／Ｔ
ＥＣ）ＩＮＯＬＯＧＹ、 ｌ。
ょるリパーゼの生産 大腸菌５１７−１株（Ｓｉｍｏｎ、 Ｒ，、ＢＩＯ／Ｔ
ＥＣ）ＩＮＯＬＯＧＹ、 ｌ。
７８４ （１９８３））からＨａｎａｈａｎの方法によ
り形質転換細胞を調整し、これに前述のプラスミドＰＳ
ＬＩＰ１０４、ｐＳＬＩＰ−Ｌｉｐ６４、ＰＳＩＪＰ−
１ｊ ｐ６５をそれぞれ導入して形質転換した。５ｍ１
２のＬＢ培地中で００６Ｇｏ＝０．１０まで増殖させた
形質転換体と、同じく５社のＬＢ培地中でＯＤＧ、。：
０．２７まで増殖させたシュードモナスＳρ６ＫＩｊＩ
−５６菌株をツレぞし５Ｘｌｏ７、ｌＸｌＯ７の細胞数
となるように混合し、ＬＢ平板培地上に滴下した。
り形質転換細胞を調整し、これに前述のプラスミドＰＳ
ＬＩＰ１０４、ｐＳＬＩＰ−Ｌｉｐ６４、ＰＳＩＪＰ−
１ｊ ｐ６５をそれぞれ導入して形質転換した。５ｍ１
２のＬＢ培地中で００６Ｇｏ＝０．１０まで増殖させた
形質転換体と、同じく５社のＬＢ培地中でＯＤＧ、。：
０．２７まで増殖させたシュードモナスＳρ６ＫＩｊＩ
−５６菌株をツレぞし５Ｘｌｏ７、ｌＸｌＯ７の細胞数
となるように混合し、ＬＢ平板培地上に滴下した。
３０℃で一夜培養ののち、混合菌体−白金耳を。
１０Ｑ塊／ｍＱのクロラムフェニコールと５Ｊ１ｇ／ｍ
Ｑのアンピシリンを含むＬ８平板培地上に広げた。さら
に３０℃で２日間培養ののち、上記プラスミドの伝達が
認められたクロラムフェニコール耐性のシュー１〜モナ
スｓｐ、 ＫＷＩ−５６菌株を得た。
Ｑのアンピシリンを含むＬ８平板培地上に広げた。さら
に３０℃で２日間培養ののち、上記プラスミドの伝達が
認められたクロラムフェニコール耐性のシュー１〜モナ
スｓｐ、 ＫＷＩ−５６菌株を得た。
これらの形質転換体を１００ ｐｚ ／ ｍ Ｑのクロ
ラムフェニコールを含む５＋ａＱＰＹ培地（１％ペプト
ン、０．１％酵母エキス、０．１％に８２ＰＯい０．０
５％ｌ’１．ｓ０４、ｐＨ７，０）で前培養したのち、
その１％を、 ］ ＯＯｐｇ ／ ｏ Ｑのクロラムフ
ェニコールと２％のオリーブ油を添加した１００＠Ｑ
ＰＹ培地に植菌し、坂ロフラスコ中、２８℃で９８時間
振どう培養した。培養後、遠心分離によって菌体を除去
し、上澄液のリパーゼ活性を回転攪拌法により求めた。
ラムフェニコールを含む５＋ａＱＰＹ培地（１％ペプト
ン、０．１％酵母エキス、０．１％に８２ＰＯい０．０
５％ｌ’１．ｓ０４、ｐＨ７，０）で前培養したのち、
その１％を、 ］ ＯＯｐｇ ／ ｏ Ｑのクロラムフ
ェニコールと２％のオリーブ油を添加した１００＠Ｑ
ＰＹ培地に植菌し、坂ロフラスコ中、２８℃で９８時間
振どう培養した。培養後、遠心分離によって菌体を除去
し、上澄液のリパーゼ活性を回転攪拌法により求めた。
その結果、に―ニー５６ （ｐｓＬＩＰ １０４ ）で
５８００／ｍＱ、 ＫＩｉＩ−５６（ｐｓｌｊＰ−１ｉ
ｐ６４）で１１．０ＯＯＵ／ｍ１２． ＫＷＩ−５６（
ｐｓＵＰ−１ｉｐ６５）で５４０Ｕ／ＩＩＱの活性を示
した。
５８００／ｍＱ、 ＫＩｉＩ−５６（ｐｓｌｊＰ−１ｉ
ｐ６４）で１１．０ＯＯＵ／ｍ１２． ＫＷＩ−５６（
ｐｓＵＰ−１ｉｐ６５）で５４０Ｕ／ＩＩＱの活性を示
した。
本発明によれば、リパーゼの活性発現を調節する調節遺
伝子が得られ、これを利用してリパーゼを効率よく生産
することができ、リパーゼ構造遺伝子を単独で組込んだ
場合の２０〜３００倍の酵素活性が得られる。
伝子が得られ、これを利用してリパーゼを効率よく生産
することができ、リパーゼ構造遺伝子を単独で組込んだ
場合の２０〜３００倍の酵素活性が得られる。
第１図はプラスミドｐＬＰ６４、ρＬＰ６５． ｐＨ５
ＧＬ６８の制限酵素地図、第２図はプラスミドｐＬＰ６
４とｐＨ３ＧＬ６８由来の欠失体の制限酵素地図、第３
図は調節遺伝子のオープンリーディングフレームの塩基
およびアミノ酸配列図、第４図はベクターの構築工程図
である。 代理人 弁理士 柳 原 成
ＧＬ６８の制限酵素地図、第２図はプラスミドｐＬＰ６
４とｐＨ３ＧＬ６８由来の欠失体の制限酵素地図、第３
図は調節遺伝子のオープンリーディングフレームの塩基
およびアミノ酸配列図、第４図はベクターの構築工程図
である。 代理人 弁理士 柳 原 成
Claims (3)
- （１）下記の塩基配列を有することを特徴とするリパー
ゼの活性発現を調節する遺伝子。【遺伝子配列がありま
す。】 - （２）請求項（１）記載の遺伝子を有するベクター。
- （３）請求項（２）記載のベクターとリパーゼ構造遺伝
子とを保持する宿主を培養して、リパーゼを生産するこ
とを特徴とするリパーゼの生産方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2294558A JPH074256B2 (ja) | 1990-10-31 | 1990-10-31 | リパーゼの活性発現を調節する遺伝子、ベクターおよびリパーゼの生産方法 |
| US07/639,330 US5306636A (en) | 1990-10-31 | 1991-01-10 | Gene, vector and transformant for thermostable lipase and preparation of them and thermostable lipase |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2294558A JPH074256B2 (ja) | 1990-10-31 | 1990-10-31 | リパーゼの活性発現を調節する遺伝子、ベクターおよびリパーゼの生産方法 |
| US07/639,330 US5306636A (en) | 1990-10-31 | 1991-01-10 | Gene, vector and transformant for thermostable lipase and preparation of them and thermostable lipase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04169184A true JPH04169184A (ja) | 1992-06-17 |
| JPH074256B2 JPH074256B2 (ja) | 1995-01-25 |
Family
ID=26559883
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2294558A Expired - Fee Related JPH074256B2 (ja) | 1990-10-31 | 1990-10-31 | リパーゼの活性発現を調節する遺伝子、ベクターおよびリパーゼの生産方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5306636A (ja) |
| JP (1) | JPH074256B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0657535A3 (en) * | 1993-11-19 | 1996-07-31 | Chisso Corp | Gene encoding a pseudomonas lipase. |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE9501939D0 (sv) * | 1995-05-24 | 1995-05-24 | Astra Ab | DNA molecules for expression of polypeptides |
| US7288400B2 (en) | 1996-02-16 | 2007-10-30 | Verenium Corporation | Nucleic acids encoding esterases and methods of making and using them |
| US5942430A (en) * | 1996-02-16 | 1999-08-24 | Diversa Corporation | Esterases |
| US6472189B1 (en) | 1996-11-28 | 2002-10-29 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Esterase gene and its use |
| JP3855329B2 (ja) * | 1996-11-28 | 2006-12-06 | 住友化学株式会社 | エステラーゼ遺伝子及びその利用 |
| CA2230738A1 (en) | 1997-03-03 | 1998-09-03 | Hiromichi Ohta | Production of optically active sphingoid compound |
| MXPA04007886A (es) * | 2002-02-13 | 2004-10-15 | Dow Global Technologies Inc | Sobre-expresion de genes de extremozimo en pseudomonadas y bacterias estrechamente relacionadas. |
| EP1668124A2 (en) * | 2003-09-30 | 2006-06-14 | Goldschmidt GmbH | Thermostable hydrolase |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61280274A (ja) * | 1985-06-05 | 1986-12-10 | Sapporo Breweries Ltd | 新規リパ−ゼ |
| JP3079276B2 (ja) * | 1988-02-28 | 2000-08-21 | 天野製薬株式会社 | 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法 |
| JP2639677B2 (ja) * | 1988-03-14 | 1997-08-13 | 旭化成工業株式会社 | リパーゼの遺伝情報を有するｄｎａ |
| JPH02190188A (ja) * | 1989-01-18 | 1990-07-26 | Sapporo Breweries Ltd | リパーゼをコードするｄｎａ配列，該ｄｎａ配列を有するプラスミド，該プラスミドを有する形質転換体および該形質転換体を用いてリパーゼを製造する方法 |
-
1990
- 1990-10-31 JP JP2294558A patent/JPH074256B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-01-10 US US07/639,330 patent/US5306636A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0657535A3 (en) * | 1993-11-19 | 1996-07-31 | Chisso Corp | Gene encoding a pseudomonas lipase. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH074256B2 (ja) | 1995-01-25 |
| US5306636A (en) | 1994-04-26 |
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|---|---|---|---|
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