JPS61280274A - 新規リパ−ゼ - Google Patents
新規リパ−ゼInfo
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- JPS61280274A JPS61280274A JP60120400A JP12040085A JPS61280274A JP S61280274 A JPS61280274 A JP S61280274A JP 60120400 A JP60120400 A JP 60120400A JP 12040085 A JP12040085 A JP 12040085A JP S61280274 A JPS61280274 A JP S61280274A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/38—Pseudomonas
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- Molecular Biology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は耐熱性を有し、高いアルカリ側に至適ｐＨをも
ち、低分子モノエステル及び水溶性エステルにもよく作
用する新規リパーゼに関する。
ち、低分子モノエステル及び水溶性エステルにもよく作
用する新規リパーゼに関する。
リパーゼは消化剤や血中脂質の測定用試薬などの医療用
として、また石鹸製造のための油脂の分解用や洗剤用酵
素として注目を集めている。
として、また石鹸製造のための油脂の分解用や洗剤用酵
素として注目を集めている。
本発明によって得られたアルカリリパーゼは安定、かつ
強力であり、耐熱性を有し、至適ｐＨも高いので洗剤等
に配合したり、高温下においての油脂の分解に使用する
など、巾広い利用面が考えられる。
強力であり、耐熱性を有し、至適ｐＨも高いので洗剤等
に配合したり、高温下においての油脂の分解に使用する
など、巾広い利用面が考えられる。
本出願人は、先にシュードモナス属の細菌シュードモナ
ス・フラボ（Ｐ ｓ 、 行立〔）を培養することによ
りアルカリリパーゼを採取する方法を提案した（特公昭
５６−２８５１７号）。そして、その後の研究の結果、
本酵素を電気泳動的に単一にしその性質を調べたところ
、次の化学的及び物理的な性質を有する新規リパーゼで
あることを見出し、本発明を完成した。
ス・フラボ（Ｐ ｓ 、 行立〔）を培養することによ
りアルカリリパーゼを採取する方法を提案した（特公昭
５６−２８５１７号）。そして、その後の研究の結果、
本酵素を電気泳動的に単一にしその性質を調べたところ
、次の化学的及び物理的な性質を有する新規リパーゼで
あることを見出し、本発明を完成した。
尚、本酵素の活性測定方法は特に記載しない限り、山田
らのＰＶＡ乳化法（日本農芸化学会誌、第３６巻第８６
０頁、１９６２年）を改変した方法により行い、１分間
に１マイクロ当量の脂肪酸を遊離せしむる酵素量を１ユ
ニツ） （Ｕ）とした（詳細は特公昭５６−２８５１７
号を参照）。
らのＰＶＡ乳化法（日本農芸化学会誌、第３６巻第８６
０頁、１９６２年）を改変した方法により行い、１分間
に１マイクロ当量の脂肪酸を遊離せしむる酵素量を１ユ
ニツ） （Ｕ）とした（詳細は特公昭５６−２８５１７
号を参照）。
ｆ８） 基質特異性
各種天然油脂及びトリオレイン、トリブチリン、トリア
セチン等をよく分解する。また、メチルオレアート、プ
チルオレアート等のモノエステル及びポリオキシエチレ
ンゾルビタン脂肪酸エステル（ツウィーン）等の水溶性
エステルもよく分解する。
セチン等をよく分解する。また、メチルオレアート、プ
チルオレアート等のモノエステル及びポリオキシエチレ
ンゾルビタン脂肪酸エステル（ツウィーン）等の水溶性
エステルもよく分解する。
（ｂ） 至適ｐＨ
基質としてオリーブ油エマルジョンを用いた場合、ｐＨ
９，０であり、アルカリの比較的高い側に至適ｐＨがあ
る。
９，０であり、アルカリの比較的高い側に至適ｐＨがあ
る。
（Ｃ） 至適温度
オリーブ油エマルジョンに対し６５〜７０℃である。
（ｄｌｐＨ安定性
４℃中、ｐ Ｈ４，０以上で安定、３０℃中、ｐ Ｈ６
，５以上で安定である。また、５０℃中でもｐＨ８，０
以上で安定である。
，５以上で安定である。また、５０℃中でもｐＨ８，０
以上で安定である。
ｆｅｌ 熱安定性
ｐＨ９で５１℃までは２４時間安定、５０℃以上では徐
々に失活する。
々に失活する。
（［１活性化及び失活化
金属イオンのうち、特にＺｎ”″、Ｆｅ”″。
Ｆｅ ｆｆ （により失活する。
セチルトリメチルアンモニウムブロマイド等の陽イオン
界面活性剤により失活する。
界面活性剤により失活する。
デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウ
ム、トリトンＸ−１００により多少活性化する。
ム、トリトンＸ−１００により多少活性化する。
（（イ）等電点
キャリ°？−アンフオライトを用いた等電点電気泳動に
より求めたところｐＩは７付近である。
より求めたところｐＩは７付近である。
（ｈ） 分子量
ウニバー及びオスポーンの方法に従い５ＤＳ−電気泳動
により求めたところ約３３０００であり、さらにセファ
デックスＧ−１００を用いたゲルろ過より求めたところ
３２５００である。
により求めたところ約３３０００であり、さらにセファ
デックスＧ−１００を用いたゲルろ過より求めたところ
３２５００である。
（１）来歴
シュードモナス・フラボ２２．３９Ｂ
（工業技術院微生物工業技術研究所受託番号１３３９号
） 本発明において使用する微生物はシュードモナス属に属
し、上記した性質を有するリパーゼの生産能力を有する
ものであればよく、具体的は前述のシュードモナス・フ
ラボ２２．３９Ｂがあげられる。
） 本発明において使用する微生物はシュードモナス属に属
し、上記した性質を有するリパーゼの生産能力を有する
ものであればよく、具体的は前述のシュードモナス・フ
ラボ２２．３９Ｂがあげられる。
また、本発明の新規リパーゼを生産する微生物の培養は
目的とするリパーゼの生産量が最大になるように選定す
ればよく、具体例としては特公昭５６−５８５１７号の
実施例に記載されている方法などがあげられる。
目的とするリパーゼの生産量が最大になるように選定す
ればよく、具体例としては特公昭５６−５８５１７号の
実施例に記載されている方法などがあげられる。
培養終了後、本リパーゼを精製するには既知の適当な方
法、例えばイオン交換やゲルろ過などのクロマトグラフ
ィー等により行うことができる。
法、例えばイオン交換やゲルろ過などのクロマトグラフ
ィー等により行うことができる。
このようにして得られる精製リパーゼの性質につき、そ
の詳細を記述する。
の詳細を記述する。
（１）酵素の化学的性状
■ 基質特異性
種々の基質に対する分解の様子は第１表−１，２に示し
たとおりである。要約すると、このリパーゼはトリグリ
セライドはもちろんよく分解するが、低分子モノエステ
ルも比較的よく分解し、エステラーゼの性質も兼備する
ものと推測される。また、ツイーンのような水溶性のポ
リオキシエチレンゾルビタン脂肪酸エステルのようなも
のもよく分解する。
たとおりである。要約すると、このリパーゼはトリグリ
セライドはもちろんよく分解するが、低分子モノエステ
ルも比較的よく分解し、エステラーゼの性質も兼備する
ものと推測される。また、ツイーンのような水溶性のポ
リオキシエチレンゾルビタン脂肪酸エステルのようなも
のもよく分解する。
このことからこのリパーゼは、グリセロール脂肪酸エス
テルのみならず、水溶性、非水溶性を問わず巾広く種々
のカルボキシリックエステル（カルボン酸エステル）を
分解するものであることが言える。
テルのみならず、水溶性、非水溶性を問わず巾広く種々
のカルボキシリックエステル（カルボン酸エステル）を
分解するものであることが言える。
天然動植物油脂に対する作用についても、本酵素は油脂
の種類によらずいずれにもよく作用する。
の種類によらずいずれにもよく作用する。
尚、ここで用いた測定法は前述のＰＶＡ乳化法ではなく
、振とう法により行った。その詳細は下記のとおりであ
る。
、振とう法により行った。その詳細は下記のとおりであ
る。
（イ）反応液の組成
基 質 ０．２ｇｏ、
２トリス−ＨＣ１緩衝液 ４ ｍ （１（ｐＨ９，０
） ６０ｍＭ ＣａＣ１ｚ溶液 １ ｍ ｌ酵素液
１ｍ１ （ロ）操 作 上記反応液を１００ｍｊ２用三角フラスコに入れて３７
℃の振とう恒温槽中、反応時間３０分間、９０回転１分
の速さで８の字振とうを行う。反応終了後、直ちにアセ
トン：エタノール（１： １）混液２Ｑ ｍ （ｌを加
え、一定時間内にこれをフェノールフタレインを指示薬
として０．０５Ｎ水酸化ナトリウムで滴定する。
２トリス−ＨＣ１緩衝液 ４ ｍ （１（ｐＨ９，０
） ６０ｍＭ ＣａＣ１ｚ溶液 １ ｍ ｌ酵素液
１ｍ１ （ロ）操 作 上記反応液を１００ｍｊ２用三角フラスコに入れて３７
℃の振とう恒温槽中、反応時間３０分間、９０回転１分
の速さで８の字振とうを行う。反応終了後、直ちにアセ
トン：エタノール（１： １）混液２Ｑ ｍ （ｌを加
え、一定時間内にこれをフェノールフタレインを指示薬
として０．０５Ｎ水酸化ナトリウムで滴定する。
第１表−２
■ 至適ｐＨ
至適ｐＨの測定はオリーブ油エマルジョンを基質として
用いて行った。反応液のｐＨ調整のために用いた緩衝液
はクエン酸−クエン酸ナトリウム（ｐＨ５〜６）、イミ
ダゾール−塩酸（ＰＨ６〜８）、トリス−塩酸（ｐＨ８
〜１０）、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム（ｐ
Ｈ９，５〜１０．５）である。
用いて行った。反応液のｐＨ調整のために用いた緩衝液
はクエン酸−クエン酸ナトリウム（ｐＨ５〜６）、イミ
ダゾール−塩酸（ＰＨ６〜８）、トリス−塩酸（ｐＨ８
〜１０）、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム（ｐ
Ｈ９，５〜１０．５）である。
結果は第１図に示したとおりである。図示の如く、オリ
ーブ油エマルジョンを基質として用いたとき至適ｐＨは
９．０である。
ーブ油エマルジョンを基質として用いたとき至適ｐＨは
９．０である。
■ 至適温度
至適温度の測定はオリーブ油エマルジョンを基質として
用い、ｐＨ９，０条件下３５℃を下限に約５℃刻みで検
討した。結果を第２図に示した。図示の如く、オリーブ
油エマルジョンを基質として用いたときの分解活性は６
５〜７０℃が最高である。
用い、ｐＨ９，０条件下３５℃を下限に約５℃刻みで検
討した。結果を第２図に示した。図示の如く、オリーブ
油エマルジョンを基質として用いたときの分解活性は６
５〜７０℃が最高である。
■ ｐＨ安定性
ｐＨ安定性を調べるために用いた緩衝液はクエン酸−ク
エン酸ナトリウム（ｐ Ｈ３〜６）。
エン酸ナトリウム（ｐ Ｈ３〜６）。
イミダゾール−塩酸（ｐＨ６〜８）、トリス−塩酸（ｐ
Ｈ８〜１０．５）、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウ
ム（ｐＨ９〜１１）である。これらの緩衝液の中に２０
０Ｕ／ｍｆｆ（約１００μｇ／ｍｌになるように精製酵
素を入れ、４℃、３０℃及び５０℃中に１日放置した後
の残存活性を測定することにより行った。結果は第３図
に示したとおりである。
Ｈ８〜１０．５）、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウ
ム（ｐＨ９〜１１）である。これらの緩衝液の中に２０
０Ｕ／ｍｆｆ（約１００μｇ／ｍｌになるように精製酵
素を入れ、４℃、３０℃及び５０℃中に１日放置した後
の残存活性を測定することにより行った。結果は第３図
に示したとおりである。
図示の如く１、本酵素は低温中であればｐＨ４，０の酸
性から中性、アルカリ側にかけて安定である。また、比
較的高温でも中性付近からアルカリ側にかけて非常に安
定であるということがわかる。
性から中性、アルカリ側にかけて安定である。また、比
較的高温でも中性付近からアルカリ側にかけて非常に安
定であるということがわかる。
■ 熱安定性
温度による影響は本精製酵素を１０ｍＭＴＨＢに２００
Ｕ／ｍｊ！ （約１００μｇ／ｍｊ）になるように入
れ、３５〜７２℃中に最高３日間放置し、その時間帯内
に適宜残存活性を測定することにより検討した。結果を
第４図に示した。図示のとおり、本酵素は５１℃までは
２４時間安定であり、それ以降時間が経過するに従い徐
々に失活してゆく。５１℃、。
Ｕ／ｍｊ！ （約１００μｇ／ｍｊ）になるように入
れ、３５〜７２℃中に最高３日間放置し、その時間帯内
に適宜残存活性を測定することにより検討した。結果を
第４図に示した。図示のとおり、本酵素は５１℃までは
２４時間安定であり、それ以降時間が経過するに従い徐
々に失活してゆく。５１℃、。
３日間でも活性は半分近く残存している。また、本酵素
は５６℃を越えると、失活が比較的急であり、本酵素の
安定な上限温度は５０〜５５℃と認められる。
は５６℃を越えると、失活が比較的急であり、本酵素の
安定な上限温度は５０〜５５℃と認められる。
■ 活性化及び失活化
金属イオンの酵素活性に及ぼす影響は５Ｕ／ｍａｔの酵
素液と１０ｍＭ金属イオン溶液を９：１の割合で混ぜ、
２５℃で３０分間放置した後、その残存活性を測定する
ことにより調べた。その際、反応液中には塩化カルシウ
ムは加えておかない。結果を第２表に示す二この表より
Ｚｎ”、Ｆｅ”及びＦｅ”は本酵素を失活させる。
素液と１０ｍＭ金属イオン溶液を９：１の割合で混ぜ、
２５℃で３０分間放置した後、その残存活性を測定する
ことにより調べた。その際、反応液中には塩化カルシウ
ムは加えておかない。結果を第２表に示す二この表より
Ｚｎ”、Ｆｅ”及びＦｅ”は本酵素を失活させる。
第 ２ 表
界面活性剤の酵素活性に及ぼす影響は、１０ Ｕ／ｍβ
の酵素液と４％の界面活性剤溶液を９：１の割合で混ぜ
、２５℃で３０分間放置した後、その残存活性を測定す
ることにより調べた。結果は第３表に示した。この表よ
り明らかなように、陽イオン性界面活性剤は本酵素を失
活させる。また、非イオン性及び陰イオン性界面活性剤
には活性化させるものと失活させるものがある。
の酵素液と４％の界面活性剤溶液を９：１の割合で混ぜ
、２５℃で３０分間放置した後、その残存活性を測定す
ることにより調べた。結果は第３表に示した。この表よ
り明らかなように、陽イオン性界面活性剤は本酵素を失
活させる。また、非イオン性及び陰イオン性界面活性剤
には活性化させるものと失活させるものがある。
（２）酵素の物理的性状
■ 等電点（ｐｉ）
１旦体としてｐＨ３，５〜１０のアンフオライトを用い
た等電点電気泳動法により本酵素の等電点を測定した。
た等電点電気泳動法により本酵素の等電点を測定した。
１００ｖ定電圧で２時間、次に２００Ｖ定電圧で５時間
泳動を行った結果、ｐｌ＝６．９の値が得られた。結果
を第５図に示す。
泳動を行った結果、ｐｌ＝６．９の値が得られた。結果
を第５図に示す。
■ 分子量
つ＆−及びオニボーア、）方法４．従い、ＳＤＳ電気泳
動により求めた。結果を第６図に示す。これより分子量
は約３３，０００という値が得られた。この際分子量マ
ーカーとして、リゾチーム（分子量１４，４００）、大
豆・トリプシンインヒビター（分子量２Ｌ ５００）。
動により求めた。結果を第６図に示す。これより分子量
は約３３，０００という値が得られた。この際分子量マ
ーカーとして、リゾチーム（分子量１４，４００）、大
豆・トリプシンインヒビター（分子量２Ｌ ５００）。
カルボニックアンヒドラーゼ（分子量
’ ３１，０００）、卵アルブミン（分子量４５．
０００）、生血端アルブミン（分子量６６．２００）及
びフォスフォリラーゼＢ（分子量９２，５００）を用い
た。本酵素はカルボニックアンヒドラーゼと卵アルブミ
ンの間に染色バンドとして現われ、その対分子量移動度
直線の勾配から上記の値が得られた。
０００）、生血端アルブミン（分子量６６．２００）及
びフォスフォリラーゼＢ（分子量９２，５００）を用い
た。本酵素はカルボニックアンヒドラーゼと卵アルブミ
ンの間に染色バンドとして現われ、その対分子量移動度
直線の勾配から上記の値が得られた。
また、セファデックスＧ−１００を用いたゲルろ過によ
っても分子量を測定した。用いたカラムのサイズは直径
１．８ｃｍ、長さ９０（Ｊのものである。上記カラムは
０．２Ｍ ＮａＣ１を含む１０ｍＭ ＴＨＢで充分
平衡化しておく。結果を第７図に示す。これより分子量
は約３２，５００という値が得られた。ゲルろ過の際に
分子量マーカーとして、リボヌクレアーゼＡ（分子量１
３，７００）、キモトリプシノーゲンＡ（分子量２５．
０００）、卵アルブミン（分子量４３，０００＞及び牛
血清アルブミン（分子１ｔ６７．０００）を用いた。本
酵素はキモトリプシノーゲンＡと卵アルブミンの間に溶
出し、その対分子量溶出量直線の勾配から上記の値が得
られた。これら２つの結果より本酵素の分子量は約３３
，０００と推定した。
っても分子量を測定した。用いたカラムのサイズは直径
１．８ｃｍ、長さ９０（Ｊのものである。上記カラムは
０．２Ｍ ＮａＣ１を含む１０ｍＭ ＴＨＢで充分
平衡化しておく。結果を第７図に示す。これより分子量
は約３２，５００という値が得られた。ゲルろ過の際に
分子量マーカーとして、リボヌクレアーゼＡ（分子量１
３，７００）、キモトリプシノーゲンＡ（分子量２５．
０００）、卵アルブミン（分子量４３，０００＞及び牛
血清アルブミン（分子１ｔ６７．０００）を用いた。本
酵素はキモトリプシノーゲンＡと卵アルブミンの間に溶
出し、その対分子量溶出量直線の勾配から上記の値が得
られた。これら２つの結果より本酵素の分子量は約３３
，０００と推定した。
以上詳述した如く、本酵素はエステラーゼの性質を兼備
し、６５〜７０°Ｃと高い所に至適温度を有し、熱安定
性もよく、中性からアルカリ側にかけて非常に安定であ
り、至適ｐＨも高いアルカリリパーゼである。また、比
活性も高（、粉末状態はもちろん溶液状態での安定性も
すぐれており、臨床検査用、油脂分解用、洗剤用等様々
な分野での利用が期待できる。
し、６５〜７０°Ｃと高い所に至適温度を有し、熱安定
性もよく、中性からアルカリ側にかけて非常に安定であ
り、至適ｐＨも高いアルカリリパーゼである。また、比
活性も高（、粉末状態はもちろん溶液状態での安定性も
すぐれており、臨床検査用、油脂分解用、洗剤用等様々
な分野での利用が期待できる。
因みにシュードモナス属の菌株から報告されたリパーゼ
のうちシュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓ、 ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・メフィティカ
・バラエティ・リボリティ力（Ｐｓ、 ｍｅｆｉｔｉｃ
ａ ｖａｒ、 Ｉｉ ｏｌｙｔｉｃａ）、 シュード
モナス・アエルギノサ（Ｐｓ、 ａｅｒｕ １ｎｏｓａ
）。
のうちシュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓ、 ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・メフィティカ
・バラエティ・リボリティ力（Ｐｓ、 ｍｅｆｉｔｉｃ
ａ ｖａｒ、 Ｉｉ ｏｌｙｔｉｃａ）、 シュード
モナス・アエルギノサ（Ｐｓ、 ａｅｒｕ １ｎｏｓａ
）。
シュードモナス・フラボ（Ｐ ｓ 、 ｈ且１）ＮＲＲ
Ｌ Ｂ−２５のリパーゼと本酵素との性質の対比を第
４表に示すが、これから明らかなように、これらの酵素
は本発明に係る酵素と著しく異っている。
Ｌ Ｂ−２５のリパーゼと本酵素との性質の対比を第
４表に示すが、これから明らかなように、これらの酵素
は本発明に係る酵素と著しく異っている。
次に、本発明を実施例により説明する。
（１）菌の培養及び濾液の調製
本発明の酵素はシュードモナス属に属するバクテリア、
シュードモナス・フラボ２２・３９Ｂ（ＦＥＲＭ Ｐ
−１，３３９）を牛脂１％、大豆粉２％、コーンステイ
ープリカー１％、ペプトン０．４％、硫安０．１％、硫
酸マグネシウム０．０５％、炭酸カルシウム０．５％及
びリン酸２カリウムＯ川％の成分より成る培地（ｐＨは
７．０に調整）を入れた１５０１用ジヤーで２７℃、２
日間通気攪拌培養した。
シュードモナス・フラボ２２・３９Ｂ（ＦＥＲＭ Ｐ
−１，３３９）を牛脂１％、大豆粉２％、コーンステイ
ープリカー１％、ペプトン０．４％、硫安０．１％、硫
酸マグネシウム０．０５％、炭酸カルシウム０．５％及
びリン酸２カリウムＯ川％の成分より成る培地（ｐＨは
７．０に調整）を入れた１５０１用ジヤーで２７℃、２
日間通気攪拌培養した。
培養終了後、培養液を５ｏｏｏ回転／分、２０分間の遠
心を行いその上清を集めた。
心を行いその上清を集めた。
（２）酵素の精製
■ 上記の上清に塩酸を加え、そのｐＨを４゜Ｏに調整
しリパーゼを沈澱させた。その沈澱を８０００回転／分
、２０分間の遠心により回収した。この操作を４℃の低
温下で行った。
しリパーゼを沈澱させた。その沈澱を８０００回転／分
、２０分間の遠心により回収した。この操作を４℃の低
温下で行った。
■ 上の沈澱を用いた培養上清の１／１０量の１０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９，０、以下、ＴＨＥと略１
．）に溶解させ硫安分画操作を行った。まず、溶解液に
２０％飽和になるように硫安を加え、溶液中のリパーゼ
以外の物質の１部を沈澱させ、その沈澱を１ｏｏｏ。
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９，０、以下、ＴＨＥと略１
．）に溶解させ硫安分画操作を行った。まず、溶解液に
２０％飽和になるように硫安を加え、溶液中のリパーゼ
以外の物質の１部を沈澱させ、その沈澱を１ｏｏｏ。
回転７分、２０分間の遠心により集め、溶液から除いた
。次に、その溶液からリパーゼを回収するために、硫安
を４０％飽和になるように加えてリパーゼを沈澱させた
。その沈澱を１００００回転／分、２０分間の遠心によ
り集めた。得られた沈澱は次に少量の１０ｍＭ ＴＨ
Ｂに溶解させて粗酵素液とし、これを透析チューブに入
れ、１０ｍＭ ＴＨＢに対して充分透析を行った。
。次に、その溶液からリパーゼを回収するために、硫安
を４０％飽和になるように加えてリパーゼを沈澱させた
。その沈澱を１００００回転／分、２０分間の遠心によ
り集めた。得られた沈澱は次に少量の１０ｍＭ ＴＨ
Ｂに溶解させて粗酵素液とし、これを透析チューブに入
れ、１０ｍＭ ＴＨＢに対して充分透析を行った。
■ 透析終了後、粗酵素液を１０ｍＭ ＴＨＢで充分
平衡化させたＤＥＡＥ−１−コパール６５０Ｍゲルの入
ったカラムに負荷した。１０ｍＭ ＴＨＢで充分に非
吸着分を除いた後、０．５Ｍの塩化ナトリウムの入った
１０ｍＭＴＨＢを流して溶出を行った。次に、溶出液を
集め、１０ｍＭ ＴＨＢに対し充分透析を行った。
平衡化させたＤＥＡＥ−１−コパール６５０Ｍゲルの入
ったカラムに負荷した。１０ｍＭ ＴＨＢで充分に非
吸着分を除いた後、０．５Ｍの塩化ナトリウムの入った
１０ｍＭＴＨＢを流して溶出を行った。次に、溶出液を
集め、１０ｍＭ ＴＨＢに対し充分透析を行った。
■ 透析終了後、上記の粗酵素液を１％トリトンｘ−ｉ
ｏｏを含む１０ｍＭ ＴＨＢ （ＴＨＢＴＸｌ、ＯＯ
と略す。）で充分平衡化させたＤＥＡＥ−セファロース
ＣＬ−６Ｂゲルの入ったカラム（サイズ：φ３．６ｃｍ
ｘ ｌ ６ｃｍ）に負荷した。１０ｍＭＴＨＢ−ＴＸ
１００で充分に非吸着分を除いた後、同緩衝液と０．２
５Ｍの塩化ナトリウムの入った同緩衝液を用い、カラム
に塩化ナトリウムの濃度勾配をかけることにより溶出を
行った（１分画溶量１０ｍＣ流速３０ｍ１／時間）。こ
の操作で得られたクロマトグラムを第８図に示す。
ｏｏを含む１０ｍＭ ＴＨＢ （ＴＨＢＴＸｌ、ＯＯ
と略す。）で充分平衡化させたＤＥＡＥ−セファロース
ＣＬ−６Ｂゲルの入ったカラム（サイズ：φ３．６ｃｍ
ｘ ｌ ６ｃｍ）に負荷した。１０ｍＭＴＨＢ−ＴＸ
１００で充分に非吸着分を除いた後、同緩衝液と０．２
５Ｍの塩化ナトリウムの入った同緩衝液を用い、カラム
に塩化ナトリウムの濃度勾配をかけることにより溶出を
行った（１分画溶量１０ｍＣ流速３０ｍ１／時間）。こ
の操作で得られたクロマトグラムを第８図に示す。
以上の精製操作により得られた最終製品を７％アクリル
アミドゲル（ｐＨ９，５泳動）を用い、ディスク電気泳
動に付したものと、７．５％アクリルアミドゲルを用い
、ＳＤＳ・電気泳動に付したものを第９図に示す。また
、各工程における収得物の活性（Ｕ）、比活性（Ｕ ／
ｍｇタン白）及び収率を第５表に示す。
アミドゲル（ｐＨ９，５泳動）を用い、ディスク電気泳
動に付したものと、７．５％アクリルアミドゲルを用い
、ＳＤＳ・電気泳動に付したものを第９図に示す。また
、各工程における収得物の活性（Ｕ）、比活性（Ｕ ／
ｍｇタン白）及び収率を第５表に示す。
第１図は本発明の酵素の活性とｐＨとの関係を、第２図
は該酵素の活性と温度との関係を、第３図ａ、ｂ、ｃは
該酵素のｐＨ安定性を、第４図は該酵素の熱安定性をそ
れぞれ示すグラフである。第５図は本酵素の等電点を示
すグラフ、第６図はＳＤＳ電気泳動法による本酵素の分
子量測定図、第７図はゲルろ適法による本酵素の分子量
測定図、。 第８図は本酵素の精製操作で得たクロマトグラム、第９
図は本酵素の電気泳動図である。 特許出願人 サッポロビール株式会社第６図 一４ヤＯ贋 第７図 １ｑ濫’、ｔ（（、＝ｌ） ネ目プ↑；ｆ３１μｍ （ｚ） ↓ 濱 諌 シ 相ず寸シ古オ生 （％） ｌ 灯 シ１舌ｊノド生 （％） 残存シ古・１亡主−（’／、）
は該酵素の活性と温度との関係を、第３図ａ、ｂ、ｃは
該酵素のｐＨ安定性を、第４図は該酵素の熱安定性をそ
れぞれ示すグラフである。第５図は本酵素の等電点を示
すグラフ、第６図はＳＤＳ電気泳動法による本酵素の分
子量測定図、第７図はゲルろ適法による本酵素の分子量
測定図、。 第８図は本酵素の精製操作で得たクロマトグラム、第９
図は本酵素の電気泳動図である。 特許出願人 サッポロビール株式会社第６図 一４ヤＯ贋 第７図 １ｑ濫’、ｔ（（、＝ｌ） ネ目プ↑；ｆ３１μｍ （ｚ） ↓ 濱 諌 シ 相ず寸シ古オ生 （％） ｌ 灯 シ１舌ｊノド生 （％） 残存シ古・１亡主−（’／、）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 下記の特徴を有する新規リパーゼ （ａ）基質特異性 トリグリセライド、低分子モノエステルを 分解する。また、ポリオキシエチレンゾルビタン脂肪酸
エステル等の水溶性エステルや天然油脂を分解する。 （ｂ）至適ｐＨ 基質としてオリーブ油エマルジョンを用い た場合、ｐＨ９．０である。 （ｃ）至適温度 オリーブ油エマルジョンに対し６５〜７０ ℃である。 （ｄ）熱安定性 ｐＨ９で５１℃までは２４時間安定、５１ ℃以上では徐々に失活する。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60120400A JPS61280274A (ja) | 1985-06-05 | 1985-06-05 | 新規リパ−ゼ |
| EP86107417A EP0204284A3 (en) | 1985-06-05 | 1986-06-02 | A novel lipase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60120400A JPS61280274A (ja) | 1985-06-05 | 1985-06-05 | 新規リパ−ゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61280274A true JPS61280274A (ja) | 1986-12-10 |
Family
ID=14785273
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60120400A Pending JPS61280274A (ja) | 1985-06-05 | 1985-06-05 | 新規リパ−ゼ |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0204284A3 (ja) |
| JP (1) | JPS61280274A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01112979A (ja) * | 1987-10-26 | 1989-05-01 | Kurita Water Ind Ltd | シェードモナスｋｗｉ−５６菌株 |
| JPH01225481A (ja) * | 1988-03-07 | 1989-09-08 | Kurita Water Ind Ltd | 新規リパーゼおよびその製法 |
| US5454971A (en) * | 1992-05-27 | 1995-10-03 | Showa Denko K.K. | Alkaline lipase, method for producing the same, microorganism producing the same and detergent composition containing alkaline lipase |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5273898A (en) * | 1986-10-17 | 1993-12-28 | Noro Nordisk A/S | Thermally stable and positionally non-specific lipase isolated from Candida |
| JP2628667B2 (ja) * | 1986-10-17 | 1997-07-09 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 位置非特異性リパーゼ |
| JP3079276B2 (ja) * | 1988-02-28 | 2000-08-21 | 天野製薬株式会社 | 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法 |
| US5292448A (en) * | 1988-05-10 | 1994-03-08 | Lever Brothers Company, Division Of Conopco, Inc. | Enzymatic detergent composition |
| US5223169A (en) * | 1989-05-15 | 1993-06-29 | The Clorox Company | Hydrolase surfactant systems and their use in laundering |
| JPH074256B2 (ja) * | 1990-10-31 | 1995-01-25 | 栗田工業株式会社 | リパーゼの活性発現を調節する遺伝子、ベクターおよびリパーゼの生産方法 |
| DK39593D0 (da) * | 1993-04-02 | 1993-04-02 | Novo Nordisk As | Enzym |
| DE4329463A1 (de) * | 1993-09-01 | 1995-03-02 | Cognis Bio Umwelt | Mehrenzymgranulate |
| DE4422433A1 (de) * | 1994-06-28 | 1996-01-04 | Cognis Bio Umwelt | Mehrenzymgranulat |
| BE1008998A3 (fr) * | 1994-10-14 | 1996-10-01 | Solvay | Lipase, microorganisme la produisant, procede de preparation de cette lipase et utilisations de celle-ci. |
| DE19515072A1 (de) * | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Cognis Bio Umwelt | Cellulasehaltiges Waschmittel |
| WO2003035712A1 (de) | 2001-10-22 | 2003-05-01 | Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien | Baumwollaktive schmutzablösevermögende polymere auf urethan-basis |
| EP1572851B1 (de) | 2002-12-20 | 2007-03-21 | Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien | Bleichmittelhaltige wasch- oder reinigungsmittel |
| DE10351325A1 (de) | 2003-02-10 | 2004-08-26 | Henkel Kgaa | Wasch- oder Reinigungsmittel mit wasserlöslichem Buildersystem und schmutzablösevermögendem Cellulosederivat |
| ES2285421T3 (es) | 2003-02-10 | 2007-11-16 | Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien | Agente de lavado o de limpieza, que continen un agente de blanqueo, con sistema adyuvante, soluble en agua, y un derivado de la celulosa con capacidad para el desprendimiento de la suciedad. |
| DE102005026522B4 (de) | 2005-06-08 | 2007-04-05 | Henkel Kgaa | Verstärkung der Reinigungsleistung von Waschmitteln durch Polymer |
| DE102005026544A1 (de) | 2005-06-08 | 2006-12-14 | Henkel Kgaa | Verstärkung der Reinigungsleistung von Waschmitteln durch Polymer |
-
1985
- 1985-06-05 JP JP60120400A patent/JPS61280274A/ja active Pending
-
1986
- 1986-06-02 EP EP86107417A patent/EP0204284A3/en not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01112979A (ja) * | 1987-10-26 | 1989-05-01 | Kurita Water Ind Ltd | シェードモナスｋｗｉ−５６菌株 |
| JPH01225481A (ja) * | 1988-03-07 | 1989-09-08 | Kurita Water Ind Ltd | 新規リパーゼおよびその製法 |
| US5454971A (en) * | 1992-05-27 | 1995-10-03 | Showa Denko K.K. | Alkaline lipase, method for producing the same, microorganism producing the same and detergent composition containing alkaline lipase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0204284A2 (en) | 1986-12-10 |
| EP0204284A3 (en) | 1988-08-10 |
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