JPH04169193A - 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチド、該抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びそれらを用いた非ａ非ｂ型肝炎の診断方法 ４ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原に関する。より
詳しくは、本発明は非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清と特異的に
抗原抗体反応を示す抗原ボッペプチド並びに該抗原ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びそれらを
用いた非Ａ非Ｂ型肝炎の診断法に関する。

（従来の技術） 非Ａ非Ｂ型肝炎とは、（Ｅ　搬性のウィルスにより惹起
されると考えられているウィルス性肝炎の内、実体の明
らかにされている＾型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝
炎ウィルス（ＨＢＶ）、　　Ｄ型肝炎ウィルス（ＨＤＶ
）、　　あるいは肝細胞にも感染して症状を呈するサイ
トメガロウィルス（ＣＩ４Ｖ）、エプスタイン・バーウ
ィルス（ＥＢＶ）、　　アデノウィルス等をその病因と
する肝炎を、ウィルス学的・血清学的に除外したもので
ある。疫学的証拠によれば非Ａ非Ｂ型肝炎には次の３つ
の型があると示唆されている、即ち開発途上国で流行す
る水系伝染型５　輸血後（または注射針事故）型及び先
進国諸国でみられる散発性（集団獲得）型である。水系
伝染型は他の２つの型とは異なるウィルスに起因すると
考えられていたが、近年その主要な原因ウィルス（Ｅ型
肝炎ウィルス）の遺伝子断片が、ゲンラボ（Ｇｅｎｅｌ
ａｂｓ）社（米ＣＥＩ）と米［ＩＥＩ　ＣＤＣのグルー
プにより単離された［国際公開第８９／１２４６２．８
９／１２６４１号ツインフレット（１９９０）、　Ｒｅ
ｙｅｓ、Ｇ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ２４７
、１３３５（１９９０）］、　　本明細書においては特
に断わらない限り　”非＾非Ｂ型肝炎′°とはこの水系
伝染型は含めず残りの輸血後型および散発性型により生
じるものを意味する。

これまで輸血を受けた人の　１０〜２０％に輸血後肝炎
が発生することはよく知られているが、輸血後肝炎がＢ
型肝炎ウィルス以外によっても起きることが明らかにな
ったのはオールター［Ａｌｔｅｒ、　ＭＪ、、ｅｔ　ａ
ｌ、＾ｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ　７７．６９１（１９７２）　］、プリンス［
１”ｒｉｎｃｅ、Ａ、Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ
２．２４１（＋９７４）３　、ファインストーンＥ　Ｆ
ｅ１ｎｓｔｏｎｅ。

Ｓ、Ｍ、、ｅｔ　　ａｌ、　　Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎ
ｄ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２
９２、７６７　（１９７５）コの報告以来である。その
後Ａ型肝炎ウィルスの関与も否定され、　「非、べ非Ｂ
型肝炎」と診断されるようになった。この肝炎が感染性
の疾患であることは、輸血の他、血液製剤（凝固因子製
剤や免疫グロブリン製剤）によっても発症し、更にそれ
らの製荊ロントによって肝炎発生の見られるものと見ら
れないものがあるという疫学的な調査から推定されてい
た。濾過実験や、クロロホルム、ホルマリン処理後の忌
中実験、密度勾配遠心法による分画などにより、この感
染病原因子はエンベロープを持つ小型のＲＮＡウィルス
であり、おそらくトガウィルス（Ｔｏｇａｖｉｒｕｓ　
）の−程であろうと考えられていた。

ところで厚生省の推計（１？８８年）によれば輸血後思
惟肝炎の９割口上が、また散発性急性肝炎の約５割が非
＾非Ｂ型肝炎と推計されているが、こうして起こった肝
炎の、およそ半数が慢性肝炎に進み、１０〜２０　％は
肝硬変へと進行する。そして更には肝癌へと進んでいく
過程においてら、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの持続感染お
よび／またはそれ番二件なう慢性炎症が関係していると
考えられる。従って、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの予防及
び治療法を確立することは医療上の緊急の要請であろ力
Ｓ、り下に述べるように現在においてもなお、１００１
実な詐断法、予防法、治療法の確立には至ってし）゛　
　　ない６ 近年、輸血により起こる非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス特異的
抗原の遺伝子の単離が２つのグル−プにより報告された
。一つはカイロン社（米［１１＞のグルーフニよるもの
であり［Ｃｈｏｏ、　Ｑ−Ｌ、　、　ｅｔ　ａｌＳｃｉ
ｅｎｃｅ　２４４．３５’）（１９８９＞、　Ｋｕｏ、
Ｇ、、ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ２４４．３６２（
１９８９）、特表千　２−５００８８０号　公報、欧州
特許出願公開第３１８２１６号明細書（１９８９）　（
、もう一つは岡山大字（現鹿児島大学）の有馬らのグル
−プによるものである［Ａｒｉｍａ、Ｔ、、ｅｔ　ａｌ
、）ｌｅｐａｔｏｌｏｇｙ８、１２７５　（１９８８）
　、＾ｒｉ＋ｏａ、Ｔ、、ｅｔ　ａｌ、　Ｇａｓｔｒｏ
ｅｎｔｅｒｏ−１ｏｇｉａ　Ｊａｐｏｎｉｃａ　２４．
６８５（１９８９）、Ａｒｉｍａ、Ｔ、、ｅｔ　ａｌＧ
ａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏ３ｉａ　Ｊａｐｏｎｉｃａ
　２５．２１８（１９９０）、欧＋Ｉｊ特許出願公開第
３６３０２５号明細Ｍ　（１９９０）　３．　　両者の
抗原はともに多くの輸血後非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清
および一部の散発性非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清と特異
的に反応し、正常人血清、Ａ型急性肝炎およ、びＢ型慢
性肝炎唐者血漬とはほとんど反応しなかった。またこれ
らをコードする遺伝子は宿主細胞由来ではなく、これら
の抗原は非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子に由来するもの
と考えられた。カイロン社のグループはこの遺伝子を含
有するウィルスＥＣ型肝炎ウィルス（Ｈｃｖ）と命名し
た。その遺伝子構造からＨＣＶ：ａフラビウイルス〒４
に属するものと考えられている。１旦し、ｅ中性ウィル
ス粒子や感染性ウィルスゲノムの単離はなされておらず
、いまだ非＾非　Ｂ型肝炎ウィルスとしての病原性を証
明するには至っていない。

その後、複数の日本のグループにより非Ａ非Ｂ型肝炎患
者血清よりイムノスクリーニング法および逆転写−ポリ
メラーゼ　チエイン反応（ＲＴ−ＰＣＦり法を用いてＨ
ＣＶにホモロジー分有する遺伝子断片がクローニングさ
れた。これらはカイロン社のＨＣｖに比べて塩基配列レ
ベルで５χ〜３０％程度、アミノ酸レベルで５χ〜２０
　％程度の相違が認められ、ＨＣＶの日本型変異株に由
来するものと考えられている［Ｍａｅｎｏ、Ｍ、、ｅｔ
　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ１８、２６８５　（１９９０）、高田伸夫ら、肝臓
３１５ｕｐｐ１．２１７（１９９０）、金子周一ら、肝
［３１５ｕｐｐ１．２１３（１９９０）、加訃宣之ら、
肝Ｈ＆　３１５ｕｐｐ１．２１４（１９９０）］。

このように非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに関する知見が集積
しつつあるが−１）ＨＣＶの亜型の種類および分布状形
、２　）　１（ＣＶ以外にも輸血により同様の病態を惹
起する別のウィルスが存在するのか、３）先進諸国でみ
られる”散発性”非Ａ非Ｂ型肝炎も全て上述のＨＣＶ　
”ｒ惹起されるものかどうかなどについては十分研究は
なされていない、すなわち非Ａ非Ｂ型肝炎に対応した詳
細且つ有用な診断法及び治療用手段の開角に必要な抗原
の同定に関する研究は、いまだ十分には完成されていな
い。

たとえば、非Ａ非Ｂ型肝炎の診断については該ウィルス
抗体測定キットが既に市販されているものもあるが、輸
血後非Ａ　ＩＰＢ型肝炎、そ者血涜の約７割としか反応
しないこと′ＬＸｕｏ、　Ｇ、　、　ｅｔ　ａｌ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２４４．３６２（１９９，Ｏ）コ、慢
性用の非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清との反応率は高いが急性
期の非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清および散発性非Ａ非Ｂ型肝
炎患者血清との反応率は低いことＣＭｉｙａｍｕｒｉ、
　Ｔ、　、　ｅｔａｌ、　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、［Ｊ、Ｓ、＾　８７．９８３　（１９９
０）。

西岡久寿弥ら、内科６４．１０２７　＜１９８９＞　］
、また抗体陽転までに平均４ケ月を要すること［＾ｔｉ
ｅｒ、　ｆ（、Ｊ、　。

ｅｔ　ａｌ、　Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、３０．１４
９４　（１９８９）　ｉおよび該ウィルス抗体の存在が
必ずしもウィルス血症と一致しないこと［岡本宏明、肝
ＴＲ３１５ｕｐｐ１．４０（１９９０）。

古澤浩司、肝臓３１５ｕｐｐ１．４２（１９９０）１等
が知られており、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体の診断法
には未だ多くの解決すべき課題が残されている。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者らは、従来の該ウィルス抗原よりも有用な抗原
、即ち　ｌ）輸血後非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清への反応率
の高い抗原５２）散発性非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清への反
応率の高い抗原、３）ウィルス血症と相関性の強いウィ
ルス抗体を検出できる抗原を発見すべく鋭意研究した結
果、日本人ヒト血漿より新たな非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス
抗原の遺伝子を取得した。そしてその遺伝子の塩基配列
を決定したところ、従来報告されている塩基配列（特表
千２〜５００８８０号公報第４７図に示される塩基配列
の６０６０番目から６３１４番目）とホモロジーがある
が、異なる塩基配列であり、新規な非Ａ１１−Ｂ型肝炎
ウィルス抗原て′あることを知り本発明を完成した。

〈課題を解決するための手段） 本発明の実施においては、特に指示されない限り、当該
分野で公知である分子生物学、微生物学組換えＤ　Ｎ　
Ａ、　　および免疫学の従来の手法が採用される。この
ような手法は、以下の実験書を参照されたい。

実験書１：　　Ｓａ＋ｏｂｒｏｏｋ、Ｊ、、　Ｆｒ１ｔ
ｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、、およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、　　
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄ、
；　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　（１９８９
）実験書２：　　ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　１巻（Ｇｌ
ｏｖｅｒ、　Ｄ、Ｍ編）ｒＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　　（１
９８５）実験書３：　　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　３巻
（Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｄ、Ｍ、　＃４〉ＩＲＬ　　Ｐｒｅ
ｓｓ、　　（１９８７）実験書４：　　［（ａｎｄｂｏ
ｏｋ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｉｍｍｕｎｏ
−１ｏｇｙ、　４ｔｈ　ｅｄ、　１〜ＩＶ巻（Ｈｅｉｒ
、　Ｄ、Ｍ編）、ＢＩａｃｋ−ｗｅｌｌ　　（１９８６
） 夷験書５°　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉ
ｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ旧ｏｌｏｇｙ　（＾ｕｓｕｂｅ
１．Ｆ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｘ）　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌ
ｅｙ＆　　５ｏｎｓ　　（１９８ｇ） 実験書６：　　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ　１８５巻（Ｇｏｅｄｄ−ｅｌ、Ｄｌ、！　）Ａｃ
ａｄｅ＋ｎｉｃ　　Ｔ’ｒｅｓｓ　（１９９０）（１）
ウィルスＲＮ＾の調製 ・）患者血液からのＲＮＡの調製 Ｆ［Ｂｓ抗原陰性、ＨＢＶ−ＤＮＡ　ｊｌｊＨ性、高Ａ
ＬＴ（ＧＰＴ＞活性値（＞３５１ｔｌ／Ｉ）を示すヒト
血軌または非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清をプールし、ウィル
スＲＮＪＩ製のための出発材料とする。ウィルス粒子は
ポリエチレングリコール沈澱法により沈澱物として濃縮
　回収し、沈澱物からのＲＮＡの抽出はグアニジン・チ
オシアオート法等の方法［Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、　
Ｐ、　ａｎｄ　Ｓａｃｃｈｉ、Ｎ１．＾ｎａｌｙｔｉｃ
ａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ａｉｓｔｒｙ　１６２．　１５９
　（＋９８７）］により行なわれる。この際、ＲＮａｓ
ｅによる　ＲＮＡの分解を防ぐためＲＮａｓｅインヒビ
ターとして、例えばヘパリン、ポリビニルｙＭ、ジエチ
ルピロカーボネート　バナジウム複合体等を添加するこ
とも出来る。

また、ヒト血清の代わりに非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスを感
染させたチンパンジー血清を用いることもできるが、一
般にウィルスを異種動物で継代した場合にウィルス遺伝
子に変異が生じる場合もあるので、該抗原をクローニン
グする場合にはヒト血清を出発材料にするのが好ましい
。

ｂ）μ者肝Ｍｉ織からの］’ｌＮ＾の調製過去に非Ａ非
Ｂ型肝炎に感染したことがあると考えられる肝臓がん患
者より切除された肝組織より常法［実験書１．７章］に
よりＲＮＡを調製することができる。

（２）ｃＤＮＡライブラリーの楕築 得られたＲＮＡを鋳型とし５　ランダムヘキサマーをプ
ライマーとしてＧｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ法［Ｇｅ
ｎｅ、２５、２６３　（１９８３）１により二本鎖　ｃ
ＤＮＡを合成する。該ｃＤＮ＾はλｇｔｌｌファージベ
クターに挿入される。

＾ｇｔｌｌを用いたイムノスクリーニング法は特定の抗
体に対応する抗原の遺伝子を単離するために開発された
方法であり公知である［　Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，Ａ、　ａ
ｎｄＤａｖｉｓ、Ｒ，Ｗ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ！、＾
ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８０．１１９４（１９８３）
、実験書２　、ｐ４９−７８　］、　　またλｇｔｌＮ
Ｊ外にλＺＡＰ、λＺＡＰＩ１．　ｐＵｃ１９．　ｐＵ
ＥＸｌなどのベクターに挿入する事も出来る０組換え体
λｇｔｌｌは、宿主の大腸菌（例えばＹ１０９０株など
）に８染させるが、一定の条件下でバクテリオファージ
の増殖機構に従って増殖し、これに伴って、先に組み込
まれたｃＤＮＡも増幅される。増殖したバクテリオファ
ージは一定の条件下で、宿主大腸菌を溶菌し、肉眼的に
認識できるプラークを形成する。

（３）患者血清による　ｃＤＮ＾ＤＮＡラリーのイムノ
スクリーニング λｇｔｌｌファージベクターに挿入された　ｃＤＮＡは
、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）との融合ポリペ
プチドとして発現されるため、特定の抗原に対して生じ
た特異的な抗血清で多数の組換え体λｇｔｌ！３スクリ
ーニングすれば、特定の抗原ポリペプチドをコードする
ｃＤＮＡを免疫化学的方法によって同定することができ
る９本発明においては、上記（２）で作製したｃＤＮＡ
ライブラリーを、種々の非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清または
そのプール血清でスクリーニングする事が望ましい、具
体的には、プラークを形成している培養シャーレ等から
発現された融合抗原蛋白をニトロセルロース膜にトラン
スファーし、上述の患者血清を　１次抗体として反応さ
せ、これにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗（ヒト　ＩｇＧ
）　ＩｇＧ等を　２次抗体として反応させ、発色反応陽
性となるプラークを単離する。

（４）ｃＤＮＡ配列の決定 こうして得られた本発明の抗原遺伝子の塩基配列は、組
換え体λｇｔｌｌＤＮＡ上、およびサブクローニング後
のプラスミドベクターＤＮＡ上でサンガー法〔Ｓａｎｇ
ｅｒ、　Ｆ、　、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ、　、　７４
゜５４６３　（１９７７）、実験！１．ｌ　３章〕を応
用した市販のシークエンスキｌトと用いて決定すること
が出来る。

（５）抗原遺伝子の塩基配列を利用した患者血清中の該
ウィルスゲノムの検出法 本発明の非　Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスポリヌクレオチドの
塩基配列の開示部分を基本として、連続した８塩基Ｕ上
の部分を包含するポリヌクレオチドを、ホスホアミダイ
ト法Ｃｆ（ｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、　Ｍ、　ｅｔａｌ、
　Ｎａｔｕｒｅ　３１０．１０５−１１１（１９８４）
１等の合成法、或は市販のＤＮＡ合成機（例えば、アプ
ライｌ゛バイオシステムズ（、ＡＢＩ）、　３８すＡ型
　ＤＮＡ合成機な七′）を用いて合成する事が出来る。

このポリヌクレオチドは１本発明のウィルスゲノムとハ
イブリダイズし。

該ウィルスの同定、検出に用いるプローブ（またはプラ
イマー）として有用である。　　ｍＡボッヌクレオチド
を於断に利用する際に（シ　常法により、放射性１０−
ブ、ビオチン蛍光プローブ、及び化学発光プローブ等の
標識プローブとして用いることができるが、上述のハイ
ブリダイゼーション法、桿減法　およびシグナルの増幅
、検出方法（よいずれも公知であり、高橋豊三、ＤＮＡ
プローブ■、シーエムシー　（１９９０）を参照し実施
することができる。

これまで非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスは患者血清中に極微量
にしか存在しない事（Ｂ型肝炎ウィルスの場合の１／１
０’程度）が知られている。この様な場合には１本発明
の塩基配列の一部を利用した逆転写−ＰＣＲ法［Ｋａｗ
ａｓａｋｉ、　Ｅ、　Ｓ、　、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８５．５６９８（１９８８
）、岡本宏明、肝１ｔｉ３１、５ｕｐｐ１．４０　（１
９９０）　］などにより目的ウイｌレスゲノムを増幅後
、検出する事も出来る。

（６）非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ポリペプチド及び融
合抗原ポリペプチドの１ＩｉＩ製 λ）遺伝子組換え技術を用いた組換え抗原ポリペプチド
及び組換え融合抗原グリペプチドの発現：該抗原ポリペ
プチドは公知の発現ベクターを用いて発現できる１例え
ば、大腸菌での発現は案験書１の１７章、実験書３　、
　ｐ５９−８８、実験書６．ｐＨ−１２８などを、酵母
での発現は実験書３　、　ｐ１４１−１６１゜実験書６
　、　ｐ２３１−４８４．　　また、は乳動物細胞を宿
主とした場合の発現方法は実験ｉｌｌの１６章、実験書
　　　・３　、　ｐ１６３−２１２、実験書６．ｐ４δ
５−５９８などを参考に実施することが出来る０発現し
た組撓え抗原ポリペプチドは、溶解したｍ胞あるいは培
地から当該分野では公知の蛋白精製の手法（限外濾過、
遠心分離、透析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル
濾過、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、
ＨＰＬＣ等；たとえばＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏ−１ｏｇｙ　１８２巻　（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、　
Ｍ、　Ｐ、　ｖ４）　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（
１９９０）等を参照）を利用することにより精製するこ
とができる。また、融合抗原ポリペプチドの簡便な発現
方法としては、例えば本発明の組換え体λｇｔｌｌクロ
ーンＹ１が溶原化した大腸菌Ｙ１０８９株をＩＰＴＧ　
（１ｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｓ
　１ｄｅ）で発現誘導する方法である［実験書２　、ｐ
７ロー７７］、　　発現した融合抗原ポリペプチドは、
ゲルろ過および／またはβ−ｇａｌに対するマウスモノ
クローナル抗体（ベーリンガーマンハイム、　１０８３
１０４）を用いた免疫沈降法またはアフィニティークロ
マトグラフィーによりＭ製できる。また、β−ｇａ１１
．″ノ外を用いた８１合抗原ポリペプチドの発現は、実
験書６、ｐ１２９−１６５と参考にして行なうことが出
来る。

ｂ）ペプチド合成による該抗原ポリペプチドの調製： 該抗原ポリペプチドは、本発明で決定したアミノ酸配列
をもとに化学合成によっても供給されうる。この場合、
全配列を合成が比較的容易な長さの断片（１０〜５０Ｔ
Ａ基）に、しかも隣り合う断片同士が５〜１０残基程度
重複するよう分割して合成するのが好ましい、抗ウイル
ス抗体の検出のためには、これらの分割合成したペプチ
ド断片のすべてを混合して使用するが、エビトープマノ
ピングにより抗原性領域が特定されれば、抗原性領域を
含む断片のみを単独または数種混合して使用することが
できる。

該抗原ポリペプチドのアミノ酸配列を含む各種ポリペプ
チドは液相法あるいは固相法 により手動で、または自動合成装置（例えばＡＢＩ社の
４３０Ａ型ペプチド合成機）により化学合成することが
できる。　　ｔ、−Ｂｏｃ法又はＦｔｒｒｏｃ法に従い
固相法により合成したポリペプチドは樹脂よりトリフル
オロメタンスルホン酸、フッ化水素、またはトリフルオ
ロ酢酸などを用いて切り出される。これらの合成ペプチ
ドは、さらに精製度を高めるために、分取用逆相高性能
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製する
ことも可能である。

（７）イムノアッセイによる患者血清中のウィルス抗体
の検出法 本発明によって得られた非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ポ
リペプチド、またはその一部のエピトープからなる抗原
ポリペプチドは、イムノアッセイを用いて、例えば、血
液、血顯、血清、髄液などの体液試料およびヒト免疫グ
ロブリン製剤などを含む生物学的試料に於ける非Ａ非Ｂ
型肝炎ウィルス抗体の存在を検出す条ために使用するこ
とができる。このイムノアッセイにおいては上記抗原ポ
リペプチドと試料中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体との
間で免疫学的結合体く抗原抗体結合物）を形成し得る条
件下で該抗原ポリペプチドを試料と接触させるのが）、
！ましい、抗原抗体結合物がたとえわずかでも形成され
るのであれば、試料中に非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体が
存在することが分かり、適当な手段によって検出・測定
できる。

このような方法として、免疫沈澱法、凝集法、ラジオイ
ムノアッセイ（Ｒ１，八）、　ＥＩＡ、　ＥＬＩＳＡ、
ウエスタンブロットアゾセイあるいはパインディングイ
ムノアッセイなどがある。さらに該抗原ポリペプチドを
用いるアッセイプロトコールは競合的または非競合的結
合方法によってもできる。

該抗原ポリペプチドはアッセイ方法に応じて標識物でラ
ベルしてもよい、ポリペプチドに結合するラベルは公知
の物を用いる事ができ、例えば、蛍光分子、発光色素分
子、放射性分子、酵素、コファクター、ビオチン・アビ
ジン、金コロイド、磁性粒子などがある。又、本発明の
抗原ポリペプチドを化学修飾すれば、公知手段によって
、キャリアタンパクやキャリアポリペプチドあるいは公
知の支持体に結合することができる。この様な支持体と
しては、例えばポリスチレンやポリビニル製のマイクロ
タイタープレートやビーズ、ガラス管やガラスピーズ、
また紙、セルロース、セルロース誘導体やシリカのよう
なりロマトグラフィー用支持体も用いることができる。

これらアッセイ法のうち、特に悪者血清や血液あるいは
血液製剤などを大規模スクリーニングするには、ＥＬＴ
ＳＡ、環気法またはウェスタンプロットアッセイなどが
好適である。

最も簡便な方法としては、例えば本発明により得られた
抗原を例えば　β−ｇａｌとの融合蛋白として発現させ
、ニトロセルロース膜にプロットしたものを固相に固定
した抗原とし、ＥＬＩＳＡ法によつ非Ａ非Ｂ型肝炎ウィ
ルス抗体を検出する方法（イムノプラークアッセイ、ウ
ェスタンプロ・ｌトアノセイなど）である（実施例４）
。

（発明の効果） 本発明の抗原ポリペプチドは、従来の抗原を利用した検
査法では検出不可能な非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体の検
出に有用である。また、本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィル
スポリヌクレオチド配列を利用すれば、従来の検圧法を
用いた検出５度では測定不可能なウィルス粒子（ゲノム
）の検出が可能である。また、該抗原ポリペプチドを用
いて。

該ウィルス抗原の検出及び非＾非Ｂ型肝炎の治療に利用
し得るポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を作
成することが出来る。また、該抗原ポリペプチドはウィ
ルスの６染予防及び８染を麦の治療のためのワクチンの
製造に利用できる。

実施例 以下に実施例をあげて、本発明を更に具体的に説明する
が、これらは本発明の範囲を制限するものではない。

実施例１：　　ｃＤＮＡ作成のための血漿ＲＮＡの抽出
ＡＬＴ活性値が異常高値　（＞７０１０／Ｉ）でＨＢｓ
抗原および！（ＩＩＩＶ−ＤＮＡが陰性を示す凍結血漿
２０００　ｍｌを室温で融解したのち、５０００ｒｐ票
（日立、　ＲＰＲ９−２０−ター）、２０分、４°Ｃで
遠心しフィブリンを除去した。上清に８０　ｇのポリエ
チレングリコール４０００を加え溶解した。３０分間氷
冷したのち同し条件で遠心し、沈澱物を回収した。沈澱
相力・らのＲＮＡの抽出は、グアニジン　チオシアネー
トを用いたＡＧＰＣ法［Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、　Ｐ
、　および５ａｃｃｈｉ、Ｎ＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｌｉ２．１５６（１９８７）
］に準じた。すなわち沈澱物を２倍量（沈澱物１ｇを　
ｌ　ｉ＋１と換算）の溶液６Ｄ（６Ｍグアニジン　チオ
シアネート、　　２５＋Ｉ１Ｍクエン酸ナトリウム、　
　ｐＨ７，０、０弥サルコシール、０．１Ｍ２−メルカ
プトエタノール）に溶解後、０１容量の２Ｍ酢酩酊ナト
リウム　（ｐＨ４，０）を加え１次に等容量のフェノー
ル、０２容量のクロロホルム、　イソアミルアルコール
ｒＭ　？ｌ’！　　（４９：　Ｉ　）で抽出を行った。

１５分間水冷後、遠心し上層を分取し２等量の２−プロ
パツールを加え、ＲＮＡｔ！−沈澱させた。遠心後、沈
澱物を０５ｍＱ　　の１ｇ１ｉ　４Ｄ　（４％グアニジ
ン・チオシアネート２５　ｍ　Ｍクエン酸ナトリウム　
ｐＩ（７，０＋　０．５％サルコシール、　Ｏ，Ｉ＠２
−メルカプトエタノール）で溶解後、２倍容量のエタノ
ールを添加し、再度Ｒ１１Ａを沈澱させた。遠心後洗を
物を　７５％エタノールで洗浄し、乾燥さぜな、沈澱物
は、　５０μ９の滅菌蒸留水に溶解し、ＲＮ　、４溶液
とした。

実施例２：　　ｃＤＮＡライブラリーの作成１０μｍの
ＲＮ＾溶液を出発材料にｃＤＮＡ合成を行った。　　Ｒ
ＮＡから　２本ｆｉ　ｃＤＮＡの作成は、市販のｃ　Ｄ
ＮＡ合成システム・プラス（アマジャム、　ＲＰＮ−１
２５６７）を用いて行った。　　ＲＮＡから１木鎖ｃＤ
ＮＡの変換率は約２％、１木鎖ｃＤＮＡから２木鎖ｃＤ
ＮＡへの変ｔｃｉ率は、約１００χであった。

合成した２本ｇ　ｃＤＮＡは、エタノール沈澱を行った
のち　１００μＱ　　のＴＥ　ｉ８液　（１０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＣＲ。

ｐＨ８，ｏ　］ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解した０次に市販
のｃＤＮ＾合成キ合成キットルマシアＩＪＢ、　２７−
９２６０−０１）と用いて以下の反応を行った。　　ｃ
ＤＮＡ溶液をキットに付属している５ｅｐｈａｃｒｙｌ
　Ｓ−３００スパンカラムを通すことにより、　　ＩＸ
Ｔ４　リガーゼ溶液にバッファー交換を行った０次に、
説明書に準じＥｃｏＲＩアダプターのｆす加反応と　Ｔ
４キナーゼ反応を行った。

ｃＤＮＡに結合しなかったアダプターは、５ｅｐｈａｃ
ｒｙｌＳ−３００スパンカラム含用いて除去した。溶出
液中のｃＤＮＡは、５μｇのキャリアー　ｔＲＮＡとと
もにエタノール沈澱を行った。沈澱物は７５％エタノー
ルで洗浄したのち風乾した。

次に市販のｃＤＮＡクローニングシステムλｇ　ｔｘ　
ｔ・アダプター法（アマジャム、　ＲＰＮ　１２８０）
を用いて以下の反応を行った。沈澱物に５μ９　の滅菌
蒸留水、４μＱ　　（２μｇ）の　λｇ？、１１　Ｅｃ
ｏＲＩアーム、１μΩ　のＬ７にバッファーを加えて溶
解したのち、１μＱ　　（２，５Ｕ）のＴ４リガーゼを
加え、１′５’Ｃで−晩装置した。　次に、ＧＩＧＡＰ
ＡＣＫＩＩ　　Ｇｏｌｄ　λＤシＡパッケージングキッ
ト（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　２００２１６）を用いて
上記反応物（組み換え　λｇｔｌｌ　ＤＮＡが含まれる
）の　ｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージング反応を行い、ｃ
ＤＮＡライブラリー　（Ｌｏｔ、Ｂ）　　を作成した。

実施例３：　非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原遺伝子のイム
ノスクリーニングによるクローニングｃＤＮＡライブラ
リー　（Ｌｏｔ、　Ｂ）中のプラークと１次抗体および
２次抗体との反応は、市販のスーパースクリーン・イム
ノスクリーニングシステム（アマジャム、　ＲＰＮ　１
２８１７）の方法に準じて行った。スクリーニングに使
用した１次抗体は、非Ａ非Ｂ型肝炎患者のプール血清（
５名の急性肝炎回復期と５名の慢性肝炎）を、大腸菌ラ
イゼート（バイオラット、　１．７−３２０５）で吸収
　（２ｍｇライゼート／■ｇ　　血清）したものを溶液
Ａ　（１０ＩＩ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｃｇ、　ｐＨ７，５１
５０ｍＭ　ＮａＣＲ、２％　（Ｗ／Ｖ）　ＢＳ＾）で２
０倍希釈して使用した。２次抗体には、パーオキンダー
ゼ標識したヤギ抗（ヒト　ＩｇＧ＞　ＩｇＧ　（カッベ
ル、　３２０１−００８１）を５００倍希釈して使用し
た０発色反応は市販のラムダ　リフト検出キ／ト　ＧＡ
Ｒ−ＨＲＰ　（バイオラッド、１７−３５５６）を用い
て行った。

約５００．０００個のプラークより１０ケの陽性プラー
クにトロセルロースフィルター上で青紫色に発色）を単
離した。その中の１クローンをＹｌと命名し、以下の解
析を続けた。

実施例４：　クローンＹ１の抗原特異性試験ａ）イムノ
プラークア・／セイ Ｙ１クローンと陰性クローンを　２：８の割合で混合し
たものをプじ一ティングし、上述のイムノスクリーニン
グの方法を用いて、非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者（輸血歴有
）血清（５名）、非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者（輸血歴無）
血清（５名）、正常人コントロール血清（５名）、Ｂ型
慢性肝炎患者血清（５名）、Ａ型急性肝炎磨者血清（１
名）との反応性を調べた。その結果、クローンＹｌは、
非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清とのみ特異的に反応することが
示された（表１）。

非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者有　　５　　　３　／’　５非
Ａ非Ｂ型慢性肝炎幹血無　　５　　２１５Ａ型　　　２
性肝炎　　　　　１　　　０／′ＩＢ型　　　慢性肝炎
　　　　　５　　　０　、／　５τ　　　コ゛　ロート
　　　　　　　　　　５すなわち、クローンＹ】は非Ａ
非Ｂ型肝炎患者由来の血清により免疫学的に認識される
抗原（エピトープ）をコー）シていることが確認された
。

ｂ）ウェスタンプロットアッセイ λｇｔ、ｌ１（親株）溶原菌及び組換え体λｇｔｌｌＹ
ｌ溶Ｗ、菌のＪＡ製、上記溶原閏の培養及びβ−ｇ、１
１およびβ−ｇａｌ融合抗原ポリペプチドの発現誘導は
実験書３．ｐ７６の方法に準じて行った０発現誘導ｆＬ
　　培養液を超音波破砕し蛋白濃度をＢｉｏ−Ｒａｄ法
（バイオラッド、　５００−０００１　）で測定した。

各破砕液より５μｇ相当の蛋白量を５ＤＳ−ＰＡＧＥに
かけ、泳動後セミドライエレクトロプロッター　（Ｉｎ
ｔｅｇａｔｅｄ　５ｅｐａｒａｔｉ。

ｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）をもちいてウェスタンプロットを
おこなった。１次抗体には、表１記載の各種血清を使用
し、実施例３）記載のイムノスクリーニングの方法を用
いてβ−ｇａｌ、β−ｇａｌ融合抗原に対する各種血清
の反応性をしらべた。その結果５　β−ｇａｌ融合抗原
ポリペプチド（約］００ｋｄ）と非Ａ非Ｂ型肝炎患者血
清との組合せにおいてのみ呈色反応が認められ（陽性率
は表１の結果と同じ）該抗原ポリペプチドの抗原特異性
が確認された。

実施例５：　クローンＹ１由来のｃＤＮＡの塩基配列お
よび該配列内にコードされる抗原ポリペプチド配列の決
定 クローンＹ１を実験書１の２１１８記載のプレートライ
ゼー）−法により増殖させたのちファージＤＮＡを調製
した。５μｇのファージＤＮＡ　ｔ！−ＥｃｏＲＩ消化
した後、フェノール抽出およびエタノール沈澱によ、り
精製した。

３μｇのＥｃｏＲ１消化物をアルカリホスファターゼ処
理した後、Ｔ４キナーゼと　γ３２　ｐ−＾ＴＰを用い
て５′末端ラベルを行った。フェノール抽出とエタノー
ル沈澱により　ＤＮＡ断片を精製した後、５．０％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行いオー１−ラジオグラ
フィーにより　ＥｃｏＲＩ消化により切り出されたｃＤ
ＮＡの長さを調べた。その結果ｃＤＮＡのサイズは約２
８０塩基対であることが判った。

次に前述のＥｃｏＲ］消化物と　ＥｃｏＦ！ｌ消化後脱
リ消化化脱リン酸化１９　（ファルマシアＩＪ８．２７
−４９８６−０１）とでＴ４リガーゼ反応を行った１反
応液をＪ）！１０９　（宝酒造、　９０５２）にトラン
スフェクションし、約２８０塩基のインサートをもつプ
ラスミドを羊離した　（ｐＴＺ１９−Ｙｌと命名）。

ｐＴＺ１９−Ｙｌに組み込まれた　ｃＤＮＡの塩基配列
は、ＤｙｅＤｅｏｘｙ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｔａｑ
　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｗｉｔ　（ＡＢＩ。

４０１０７０）を用いてシーフェンス反応を行い、Ｄｈ
Ａンークエンサー（八Ｂｌ、　３７３Ａ型）で泳動して
決定した。

決定にはＭ１３ブライマー１＋１４　（宝酒造ｊ８３２
）、Ｍ１３プライマーＲＶ　（宝酒造、　３ｇ３０）を
用いて両方鎖を読み、決定した。

また、決定した配列のいずれの鎖が組換えλｇｔｌｌ上
で　β−ｇａｌ蛋白と融合蛋白を形成するのに関与して
いたかを確認するため　λｇｔｌｌ　ＥｃｏＲ１部位プ
ライマー正向、逆向（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ
ｌａｂｓ、　＋２］８、１２２２）を用いてファージＤ
ＮＡを直接鋳型に用いて塩基配列決定を行った。これら
の結果に基づき、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清に特異的に反
応する抗原をコードする塩基配列を第１図に示すように
　また抗原のアミノ酸配列を第２図に示す櫟に決定した
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ポリペ
プチドをコードする塩基配列を示す。 第２図は、本発明の非Ａ　ＩＰＢ型肝炎ウィルス抗原ポ
リペプチドのアミノ酸配列を示す。 仏　１１￥１ ５’　　ＡＡＡＡＡＧＧＴＣＡ　　ＣＣＴＴＴＧＡＣＡ
Ｇ　　ＡＣＴＧＣＡＡＧＴＣ４０５０・　　　　　６０ ＣＴＧＧＡＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＧＧＧＡ　　ＣＧＴ
ＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＧ　　ＣＧＡＡＧＧ
ＣＧＴＣＣＡＣＡＧＴＴＡＡＧｌｏｏ　　　　　　　　
１１０　　　　　　　１２０ＧＣＴＡＡＡＣＴＴＣＴＡ
ＴＣＣＧＴＡＧＡ　　ＡＧＡＡＧＣＣＴＧＣＡＡＧＣＴ
ＧＡＣＧＣＣＣＣＣＡＣＡＴＴＣＧＧＣＣＡＡＡＴＣＣ
、１６０１７０１８０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記アミノ酸配列で示される非Ａ非Ｂ型肝炎ウィ
   ルス抗原ポリペプチド 【遺伝子配列があります。】 （２）化学合成された請求項（１）記載の抗原ポリペプ
   チドまたはそのアミノ酸配列を含むポリペプチド断片群 （３）請求項（１）のアミノ酸配列を有する融合抗原ポ
   リペプチド （４）抗原ポリペプチドがβ−ガラクトシダーゼ（β−
   ｇａｌ）と融合されたものである請求項（３）記載の融
   合抗原ポリペプチド （５）請求項（４）記載の抗原ポリペプチドを発現する
   組換え体λｇｔｌｌクローンＹ１（６）請求項（１）、
   （３）または（４）のいずれかの項に記載の抗原ポリペ
   プチドをコードするポリヌクレオチド （７）下記塩基配列で示される非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス
   ポリヌクレオチド 【遺伝子配列があります。】 （８）非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに由来するポリヌクレオ
   チドを検出するためのポリヌクレオチドであつて、請求
   項（７）記載の連続した８塩基、またはそれ以上の長さ
   からなるポリヌクレオチドプローブ （９）請求項（１）、（３）または（４）のいずれかの
   項に記載の抗原ポリペプチドを生産するように組換え体
   発現ベクターで形質転換された宿主細胞を該ポリペプチ
   ドを発現する条件下で培養することを特徴とする抗原ポ
   リペプチドの生産方法 （１０）請求項（１）、（２）、（３）または（４）記
   載の抗原ポリペプチドと生物学的試料中に存在する非Ａ
   非Ｂ型肝炎ウィルス抗体との反応で形成される免疫学的
   結合物を測定して生物学的試料中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィ
   ルス抗体の存在を確認する非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体
   の検出方法