JPH04169192A - 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原ポリペプチド、該抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びそれらを用いた非ａ非ｂ型肝炎の診断方法 ３ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野）− 本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原に関する。より
詳しくは、本発明は非Ａ１１＝　Ｂ型肝炎患者血清と特
異的に抗原抗体反応を示す抗原ポリペプチド並びに該抗
原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びそ
れらを用いた非Ａ非Ｂ型肝炎の診断法に関する。

（従来の技術〉 非Ａ非Ｂ型肝炎とは、伝搬性のウィルスにより惹起され
ると考えられているウィルス性肝炎の内、実体の明らか
にされている　＾型肝炎ウィルス（ＨＡＹ＞、Ｂ！！！
肝炎ウイ７つ、ス（ＨＢＶ）、Ｄ型肝炎ウィルス（）Ｉ
ＤＶ）、あるいは肝細胞にも感染して症状を呈するサイ
トメガロウィルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウィ
ルス（ＥＢＶ）、アデノウィルス等をその病因とする肝
炎を、ウィルス学的・血清学的に除外したものである。

疫学的証拠によれば非Ａ非Ｂ型肝炎には次の３つの型が
あると示唆されている、即ち開発途上国で流行する水系
伝染型、輸血後（または注射針事故）型及び先進国諸国
でみられる散発性（集団獲得）型である。水系伝染型は
他の２つの型とは異なるウィルスに起因すると考えられ
ていたが、近年その主要な原因ウィルス（Ｅ型肝炎ウィ
ルス）の遺伝子断片が、ゲンラボ（Ｇｅｎｅ！ａｂｓ）
社（米国）と米ｒ５ＣＤＣのグループにより単離された
［国際公開第８９／１２４６２．８９／１２６４１号パ
ンフレット（１９９０）、　Ｒｅｙｅｓ、Ｇ、Ｒ，、ｅ
ｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ２４７、１３３５　（１９９
０）１３本明細書においては特に断わらない限り　”非
Ａ非Ｂ型肝炎”とはこの水系伝染型は含めず残りの輸血
後型および散発性型により生じるものを意味する。

これまで輸血を受けた人の１０〜２０　％に輸血後肝炎
が発生することはよく知られているが、輸血後肝炎がＢ
型肝炎ウィルス以外によっても起きることが明らかにな
ったのはオールター〔＾１ｔｅｒＪＪ６．ｅｔ　ａｌ、
　Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃ
ｉｎｅ　７７．６９１（１９７２）　］、プリンス［Ｐ
ｒ１ｎｃｅ、＾、Ｍ、、ｅｔ　ａｌ、Ｌａｎｃｅｔ２、
２４１　（１９７４）コ、ファインストーン［Ｆｅ１ｎ
ｓｔｏｎｅ。

Ｓ、Ｍ　　、ｅｔ　　ａｌ、　　Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａ
ｎｄ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
２９２、７６７　（１９７５）　］の報告以来である。

その後Ａ型肝炎ウィルスの関与も否定され、　「非Ａ非
Ｂ型肝炎」と診断されるようになった。この肝炎が感染
性の疾患であることは、輸血の他、血液製剤（凝固因子
製剤や免疫グロブリン製剤）によっても発症し、更にそ
れらの製剤ロフトによって肝炎発生の見られるものと見
られないものがあるという疫学的な調査から推定されて
いた。濾過実験や、クロロホルム、ホルマリン処理後の
感染実験、密度勾配遠心法による分画などにより、この
Ｓ染病原因子はエンベロープを持つ小型のＲＮＡウィル
スであり、おそらくトガウィルス（Ｔｏｇａｖｉｒｕｓ
）の−種であろうと考えられていた。

ところで厚生省の推計（１９８８年）によれば輸血後急
性肝炎の９割以上が、また散発性急性肝炎の約５割が非
Ａ非Ｂ型肝炎と推計されているが、こうして起こった肝
炎の、およそ半数が慢性肝炎に進み、１０〜２０　Ｋは
肝硬変へと進行する。そして更には肝癌へと進んでいく
過程においても、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの持続８染お
よび／またはそれに件なう慢性炎症が関係していると考
えられる。従って、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの予防及び
治療法を確立することは医療上の緊急の要請であるが、
以下に述べるように現在においてもなお、１０ｏｚ確実
な診断法、予防法、治療法の確立には至っていない。

近年、輸血により起こる非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス特異的
抗原の遺伝子のａＸが２つのグループにより報告された
。一つはカイロン社（米Ｅ＞のグループによるものであ
り［Ｃｈｏｏ、Ｑ−Ｌ、、ｅｔ　ａｔ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２４４．３５９＜１９８９）、　Ｋｕ
ｏ、Ｇ、、ｅｔ　ａｔ、　５ｃｉｅｎｃｅ２４４、３６
２　（１９８９）、特表千２−５００８８０号　公報、
欧州特許出願公開第３１８２１６号明細書（１９８９）
コ、もう一つは岡山大学（現鹿児島大学）の有馬らのグ
ループによるものである［＾ｒｉｍａ、Ｔ、、ｅｔ　ａ
ｌ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ８．１２７５（１９８８）、
　Ａｒｉｍａ、Ｔ、、ｅｔ　ａｌ、　Ｇａｓｔｒｏｅｎ
ｔｅｒｏ−１ｏｇｉａ　Ｊａｐｏｎｉｃａ　２４．６８
５（１９８９）、Ａｒｉｍａ、Ｔ、、ｅｔ　ａｌＧａｓ
ｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉａ　Ｊａｐｏｎｉｃａ　２
５．２１８（１９９０）、欧州特許出願公開第３６３０
２５号明Ｍ３１　＜１９９０）コ１両者の抗原はともに
多くの輸血後非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清および一部の
散発性非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者血清と特異的に反応し、
正常人血清、Ａ型急性肝炎およびＢ型慢性肝炎患者血清
とはほとんど反応しなかった。またこれらをコードする
遺伝子は宿主細胞由来ではなく、これらの抗原は非Ａ非
Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子に由来するものと考えられた。

カイロン社のグループはこの遺伝子を含有するウィルス
をＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）と命名した。その遺伝子
構造からＨＣＶはフラビウィルス科に属するものと考え
られている。但し、感染性ウィルス粒子や感染性ウィル
スゲノムの単離はなされておらず、いまだ非Ａ非Ｂ型肝
炎ウィルスとしての病原性を証明するには至っていない
。

その後、複数の日本のグループにより非＾非Ｂ型肝炎患
者血清よりイムノスクリーニング法および逆転写−ポリ
メラーゼ・チエイン反応ＣＲＴ−ＰＣＲ）法を用いて　
ＨＣＶにホモロジーを有する遺伝子断片がクローニング
された。これらはカイロン社のＨＣＶに比べて塩基配列
レベルで５χ〜３０％程度、アミノ酸レベルで５ｘ〜２
０χ程度の相違が認められ、ＨＣＶの日本型変異株に一
由来するものと考えられて１）る［　Ｍａｅｎｏ、Ｍ、
、ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ１Ｂ、　２６ｓ５　（１９９０）、高田伸夫
ら、肝臓３１５ｕｐｐ１．２１７（１９９０）、金子周
一ら、肝Ｉｔ３１５ｕｐｐ１．２１３（１９９０）、加
藤宣之ら、肝臓３１５ｕｐｐ１．２１４＜１９９０）］
。

このように非非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルに関する知見が気積
しつつあるが、１　）　Ｉ’ｌＣＶの亜型のＮ類および
分布状態、２　）　ＨＣＶ以外にも輸血により同様の病
態を惹起する別のウィルスが存在するのか、３）先進諸
国でみちれる”散発性”非Ａ非Ｂ型肝炎も全て上述のＨ
ＣＶで惹起されるものかどうかなどについては十分研究
はなされていない、すなわち非Ａ非Ｂ型肝炎に対応した
詳細且つ有用な診断法及び治療用羊膜の開発に必要な抗
原の同定に関する研究は、いまだ十分には完成されてし
１ない。

たとえば、非Ａ非Ｂ型肝炎の於断については該ウィルス
抗体測定キットが既に市販されているものもあるが、輸
血後非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清の約７割としか反応しない
こと［Ｋｕｏ、　Ｇ、　、　ｅｔ　ａｌＳｃｉｅｎｃｅ
　２４４．３６２（１９９ｐ）コ、慢性期の非Ａ非Ｂ型
肝炎患者血清との反応率は高いが急性期の非Ａ非Ｂ型肝
炎患者血清および散発性非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清との反
応率は低いこと［Ｍｉｙａ＠ｕｒａ、　Ｔ、　、　ｅｔ
ａｌ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、
Ｓ、Ａ、　８７．９８３（１９９０）。

西岡久寿弥ら、内科６４．１０２７　（１９８９）コ、
また抗体陽転までに平均４ケ月を要すること［Ａｔ１ｅ
ｒ、　Ｈ，Ｊ、　。

ｅｔ　ｉｌ、　Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、３０，１４
９４（１９８９）］および該ウつルス抗体の存在が必ず
しもウィルス血症と一致しないこと［岡本宏明、肝１ｉ
　３１５ｕｐｐ１．４０（１９９０）。

古澤浩司、肝１ｉａ　３１５ｕｐｐ１．４２（１９９０
）］等が知られており、非Ａ１１−Ｂ型肝炎ウィルス抗
体の診断法には未だ多くの解決すべき課題が残されてい
る。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者らは、従来の該ウィルス抗原よりも有用な抗原
、即ちｌ）輸血後非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清への反応率の
高い抗原、２）散発性非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清への反応
率の高い抗原、３〉急性期非Ａ１１−Ｂ型肝炎の患者血
清にも反応できる抗原（より感染早期に出現するウィル
ス抗体を検出できる抗原）、４）ウィルス血膨と相関性
の強し）ウィルス抗体を検出できる抗原を発見すべく鋭
意研究した結果、日本人ヒト血漿より新たな非Ａ非Ｂ型
肝炎ウィルス抗原の遺伝子を取得した。そしてその遺伝
子の塩基配列を決定したところ、従来報告されている塩
基配列（特表千２−５００８８０号公報第４７図に示さ
れる塩基配列の５４９３番目から５６２７番目）とホモ
ロジーがあるが、異なる塩基配列であり、新規な非Ａ非
Ｂ型肝炎ウィルス抗原であった。しかも、この抗原は慢
性期のみならず急性期に出現するウィルス抗体をも検出
できる抗原であることと知り本発明を完成した。

（課題を解決するための手段） 本発明の実施においては、特に指示されない限り、当該
分野で公知である分子生物学、微生物学組換えＤＮＡ、
および免疫学の従来の手法が採用される。このような手
法は、以下の実験書を参照されたい。

実験書１：　　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、、Ｆｒ１ｔｓｃ
ｈ、Ｅ、Ｆ、、およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、　　Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　２ｎｄ　　Ｅｄ
、；　　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　（
１９８９）実験書２：　　ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　１
巻（Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｄ、Ｍ、　１ｉ）ＩＲＬ　　Ｐｒ
ｅｓｓ、　　（１９８５）実験書３：　　ＤＮＡ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ　３巻（Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｄ、Ｍ、編）ＩＲ
Ｌ　　Ｐｒｅｓｓ、　　（１９８７）実験書４：　　Ｈ
ａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｉ
ａ＋＊ｕｎｏ−１ｏｇｙ、　４ｔｈ　ｅｄ、　ｌ〜ＩＶ
巻（Ｗｅｉｒ、　Ｄ、Ｍ編）、Ｂｌａｃｋ−ｗｅｌｌ　
　（１９８６） 実験書５：　　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　
ｉｎ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　　（＾ｕｓ
ｕｂｅｌ、Ｆ、Ｍ、　　ｅｔ　　ａｌ、、１ｉ）Ｊｏｈ
ｎ　　Ｗｉｌｅｙ＆　　５ｏｎｓ　　（１９８８） 実験書６：　　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ　１８５巻（Ｇｏｅｄｄ−ｅ　Ｉ、　Ｄ、　Ｖ、編
）＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９０）（１）
ウィルスＲＮ＾の調製 ａ）患者血液からのＲＮＡの調製 ＨＢｓ抗原陰性、　　ＨＢｖ−ＤＮＡ陰性、高ＡＬＴ（
ＧＰＴ）活性値（＞３５１ｔｌ／１）を示すヒト血漿ま
たは非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清をプールし、ウィルスＲＮ
Ａ１Ｆｌ製のための出発材料とする。ウィルス粒子はポ
リエチレングリコール沈澱法により沈澱物として濃縮・
回収し、沈澱物からのＲＮＡの抽出はグアニジン・チオ
シアネート法等の方法［Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、　Ｐ
、　ａｎｄ　５ａｃｃｈｉ、Ｎ、：　Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ＋１ｉｓｔｒｙ　１６２．１５９　
（１９８７）］により行なわれる。この際、ＲＮａｓｅ
によるＲＮＡの分解を防ぐためＲＮａｓｅインヒビター
として、例えばヘパリン、ポリビニル硫酸、ジエチルピ
ロカーボネート、バナジウム複合体等を添加することも
出来る。

また、ヒト血清の代わりに非＾非Ｂ型肝炎ウィルスを感
染させたチンパンジー血清を用いることもできるが、一
般にウィルスを異種動物で継代した場合にウィルス遺伝
子に変異が生じる場合もあるので、該抗原をクローニン
グする場合にはヒト血清を出発材料にするのが好ましい
。

ｂ）患者肝組織からのＲＮＡの調製 過去に非＾非Ｂ型肝炎に感染したことがあると考えられ
る肝臓がん患者より切除された肝組織より常法［実験書
１．７章］によりＲＮＡを調製することができる。

（２）ｃＤＮＡライブラリーの構築 得られたＲＮＡを鋳型とし、ランダムヘキサマーをブラ
イマーとしてＧｕｂｌｅｒ−）１ｏｆｆ＋＋ａｎ法［Ｇ
ｅｎｅ、　２５、２６３　（１９８３）］により二本鎖
ｃＤＮ＾を合成する。該ｃＤＮＡはλｇｔｌｌファージ
ベクターに挿入される。

λｇｔｌｌを用いたイムノスクリーニング法は特定の抗
体に対応する抗原の遺伝子を単離するために開発された
方法であり公知である［　Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，＾、λｎ
ｄＤａｖｉｓ、Ｒ，Ｗ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃ
ａｄ、ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０．１１９４（１９８３）、
実験書２．ｐ４９−７８　］、　　またλｇｔｌｌ以外
にＡ　ＺＡＰ、λＺＡＰＩＩ、　ｐＵｃ１９．　ｐＵＥ
Ｘｌなどのベクターに挿入する事も出来る０組換え体λ
ｇｔｔｔは、宿主の大腸ｇＡ（例えばＹ１０９０株など
）に感染させるが、一定の条件下でバクテリオファージ
の増殖機構に従って増殖し、これに伴って、先に組み込
まれたｃＤＮＡも増幅される。増殖したバクテリオファ
ージは一定の条件下で、宿主大腸菌を溶菌し、肉眼的に
認識できるプラークを形成する。

（３）患者血清による　ｃＤＮＡライブラリーのイムノ
スクリーニング λｇｔｌｌ　ファージベクターに挿入された　ｃＤＮＡ
は、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）との融合ポリ
ペプチドとして発現されるため、特定の抗原に対して生
じた特異的な抗血清で多数の組換え体λｇｔｌｌをスク
リーニングすれば、特定の抗原ポリペプチドをコードす
るｃＤＮＡを免疫化学的方法によって同定することがで
きる６本発明においては、上記（２）で作製した　ＣＤ
ＩＮ＾ライブラリーを１種々の非＾非Ｂ型肝炎手１者血
清またはそのプール血清でスクリーニングする事が望ま
しい、具体的には、プラークを形成している培養シャー
レ等から発現された融合抗原蛋白をニトロセルロース膜
にトランスファーし、上述の患者血清を　１次抗体とし
て反応させ、これにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗（ヒト
　ＩｇＧ）　ＩｇＧ等を　２次抗体として反応させ、発
色反応陽性となるプラークを単離する。

（４）　ｃＤＮ＾ＤＮＡ決定 こうして得られた本発明の抗原遺伝子の塩基配列は、組
換え体λｇｔｌｌＤＮＡ上、およびサブクローニング後
のプラスミドベクターＤＮＡ上でサンガー法［Ｓａｎｇ
ｅｒ、Ｆ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃ
ａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ、　、　７４゜５４６３　
（１９７７）、実験書１．１３章］を応用した市販のシ
ークエンスキットを用いて決定することが出来る。

（５）抗原遺伝子の塩基配列を利用した患者血清中の該
ウィルスゲノムの検出法 本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスポリヌクレオチドの塩
基配列の開示部分を基本として、連続した８塩基以上の
部分を包含するポリヌクレオチドを、ホスホアミダイト
法［Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、　Ｍ、　ｅｔａｔ、　Ｎ
ａｔｕｒｅ　３１０，１０５−１１１（１９８４）１等
の合成法、或は市販のＤＮＡ合成機（例えば、アプライ
ドバイオシステムズ（ＡＢＩ）、　３８ＯＡ型、ＤＮＡ
合ｔｃＰＩなど）を用いて合成する事が出来る。このポ
リヌクレオチドは、本発明のウィルスゲノムとハイブリ
ダイズし、該ウィルスの同定、検出に用いるプローブ〈
またはプライマー）として有用である。該ポリヌクレオ
チドを診断に利用する際には、常法により、放耐性プロ
ーブ、ビオチン蛍光プローブ、及び化学発光プローブ等
の標識プローブとして用いることができるが、上述のハ
イブリダイゼーシミン法、標識法５　およびシグナルの
増幅、検出方法はいず゛　　れも公知であり、高橋豊三
、ＤＮＡ７０−ブ■、シーエムシー　（１９９０）を参
照し実施することができる。

これまで非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスは患者血清中に極微量
にしか存在しない事（Ｂ型肝炎ウィルスの場合の１／１
０’ｌｉ度）が知られている。この様な場合には１本発
明の塩基配列の一部を利用した逆転写−ＰＣＲ法［Ｋａ
ｗａｓａｋｉ、　Ｅ、　Ｓ、　、　ｅｔ　ａｌ、　、　
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ８５．５６９８　（１９
８８）、岡本宏明、肝臓３１、５ｕｐｐ１．４０　（１
９９０）　］などにより目的ウイｌレスゲノムを増幅後
、検出する事も出港る。

（６）非＾非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ポリペプチド及び融
合抗原ポリペプチドの調製 ａ）遺伝子組換え技術を用いた組換え抗原ポリペプチド
及び組換え融合抗原ポリペプチドの発現：該抗原ポリペ
プチドは公知の発現ベクターを用いて発現できる０例え
ば、大腸菌での発現は実験書１の１７章、実験１３　、
　ｐ５９−８８、実験書６．ｐＨ−１２８などを、酵母
での発現は実験書３　、　ｐ１４１−１６１゜実験書６
　、Ｐ２３１−４８４、また、は乳動物ｍ胞を宿主とし
た場合の発現方法は実験書１の１６章、実験書３　、ｐ
１６３−２１２、実験書６　、ｐ４８５−５９８などを
費考に実施することが出来る６発現した組換え抗原ポリ
ペプチドは、溶解した細胞あるいは培地から当該分野で
は公知の蛋白精製の手法（＠外濾過、遠心分離、透析、
イオン交換クロマトグラフィー、ゲルｒ過、電気泳動、
アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等；たと
えば　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｒ＋ｚｙｍｏ−１ｏｇ
７１８２巻　（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、　Ｍ、　Ｐ、　＠
　）　Ａｃａｄｅ＋ｗｊｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９０）等
を参照）を利用することにより精製することができる。

また、融合基原ポリペプチドの簡便な発現方法としては
１例えば本発明の組換え体λｇｔｌｌクローンＹ１５が
溶原化した大腸菌Ｙ１０８９株をｒＰＴＧ　（１ｓｏｐ
ｒｏｐｙＨｈｉｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）で発
現誘導する方法である［実験書２　、ｐ７ロー７７］０
発現した融合抗原ポリペプチドは、ゲルろ過および／ま
たはβ−ｇａｌに対するマウスモノクローナル抗体（ベ
ーリンガーマンハイム、１０８３１０４）を用いた免疫
沈降法またはアフィニティークロマトグラフィーにより
精製できる。′ｉた、β−ｇａＪ以外を用いた融合抗原
ポリペプチドの発現は、実験書６、Ｐ１２９−１６５を
参考にして行なうことが出来る。

ｂ〉ペプチド合成による該抗原ポリペプチドの調製： 該抗原ポリペプチドは２本発明で決定したアミノ酸配列
をもとに化学合成によっても供給されうる。この場合、
全配列を合成が比較的容易な長さぐ の断片（１０〜稠残基）に、しかも隣り合う断片同士が
５〜１０残基程度重複するよう分割して合成するのが好
ましい、抗ウイルス抗体の検出のためには、これらの分
割合成したペプチド断片のすべてを混合して使用するが
、エピトープマツピングにより抗原性領域が特定されれ
ば、抗原性領域を含む断片のみを単独または数種混合し
て使用することができ　る。

該抗原ポリペプチドのアミノ酸配列を含む各種ポリペプ
チドは液相法あるいは固相法 により手動で、また呻自動合成装置（例えばＡＢＩ社の
４３０Ａ型ペプチド合成機）により化学合成することが
できる。　　ｔ−Ｂｏｃ法又はＦｍｏｃ法に従い固相法
により合成したポリペプチドは樹脂よりトリフルオロメ
タンスルホン酸、フッ化水素、またはトリフルオロ酢酸
などを用いて切り出される。これらの合成ペプチドは、
さらに精製度を高めるために。

分取用逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
によって精製することも可能である。

（７）イムノアッセイによる患者血清中のウィルス抗体
の検出法 本発明によって得られた非へ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ポ
リペプチド、またはその一部のエピトープからなる抗原
ポリペプチドは、イムノアッセイを用いて、例えば、血
液、血漿、血清、髄液などの体液試料およびヒト免疫グ
ロブリン製剤などを含む生物学的試料に於ける非Ａ非Ｂ
型肝炎ウィルス抗体の存在を検出するために使用するこ
とができる。このイムノアッセイにおいては上記抗原ポ
リペプチドと試料中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体との
間で免疫学的結合体（抗原抗体結合物）を形成し得る条
件下で該抗原ポリペプチドを試料と接触させるのが望ま
しい、抗原抗体結合物がたとえわずかでも形成されるの
であれば、試料中に非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体が存在
することが分かり、適当な手段によって検出・測定でき
る。

このような方法として、免疫沈澱法、凝集法、ラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）、　ＥＩＡ、　ＥＬＩＳＡ、ウ
ェスタンプロットアッセイあるいはパインディングイム
ノアッセイなどがある。さらに該抗原ポリペプチドを用
いるアッセイプロトコールは競合的または非競合的結合
方法によってもできる。

該抗原ポリペプチドはアッセイ方法に応じて標識物でラ
ベルしてもよい、ポリペプチドに結合するラベルは公知
の物を用いる事ができ、例えば、蛍光分子、発光色素分
子、放射性分子、酵素、コファクター、ビオチン・アビ
ジン、金コロイド、磁性粒子などがある。又、本発明の
抗原ポリペプチドを化学修飾すれば、公知手段によって
、キャリアタンパクやキャリアポリペプチドあるいは公
知の支持体に結合することができる。この様な支持体と
しては、例えばポリスチレンやポリビニル製のマイクロ
タイタープレートやビーズ、ガラス管やガラスピーズ、
また紙、セルロース、セルロース誘導体やシリカのよう
なりロマトグラフイー用支持体も用いることができる。

これらアッセイ法のうち、特に患者血清や血液あるいは
血液製剤などを大規模スクリーニングするに’ｉｊ、　
　Ｅ　Ｌ　Ｉ　ＳＡ、環系法またはウェスタンプロット
アッセイなどが好適である。

最も簡便な方法としては、例えば本発明により得られた
抗原を例えば　β−ｇａｌとの融合蛋白として発現させ
、ニトロセルロース膜にプロットしたものを固相に固定
した抗原とし、ＥＬＩＳＡ法により非Ａ非Ｂ型肝炎ウィ
ルス抗体を検出する方法（イムノプラークアッセイ、ウ
ェスタンプロットアッセイなと）である（実施例４）。

（発明の効果） 本発明の抗原ポリペプチドは、従来の抗原を利用した検
査法では検出不可能な非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体の検
出に有用である。また、本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィル
スポリヌクレオチド配列を利用すれば、従来の検出法を
用いた検出感度では測定不可能なウィルス粒子（ゲノム
）の検出が可能である。また、該抗原ポリペプチドを用
いて、該ウィルス抗原の検出及び非＾非Ｂ型肝炎の治療
に利用し得るポリクローナル抗体及びモノクローナル抗
体を作成することが出来る。また、該抗原ポリペプチド
はウィルスの感染予防及び感染後の治療のためのワクチ
ンの製造に利用できる。

実施例 以下に実施例をあげて、本発明を更に具体的に説明する
が、これらは本発明の範囲を制限するものではない。

実施例１：　　ｃＤＮＤＮＡのための血漿ＲＮ＾の抽出
＾ＬＴ活性値が異常高値　（＞７０１Ｕ／ｌ＞でＨＢｓ
抗原およびＨＢＶ−ＤＮＡが陰性を示す凍結血漿２００
０　ｍｌを室温で融解したのち、５０００ｒｐｍ（日立
、　ｌ’１ＰＲ９−２０−ター）、２０分、４°Ｃで遠
心しフィブリンを除去した。上清に８０　ｇのポリエチ
レングリコール４０００を加え溶解した。　　３０分間
氷冷したのち同じ条件で遠心し、沈澱物を回収した。沈
澱物からのＲＮＡの抽出は、グアニジン・チオシアネー
トを用いたＡＧＰＣ法［Ｃｈｏｍｃｚｙｒ＋Ｓｋｉ、　
Ｐ、　および５ａｃｃｈｉ、　Ｎ、　：＾ｎａｌｙｔｉ
ｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｌＪｄ、　１５
６（１９８７）　］に準じた。すなわち沈澱物を２倍量
（沈澱物１ｇを　１１と換Ｘ）の溶液６Ｄ　（６）４グ
アニジン・チオシアネート、　　２５ｍＭクエン酸ナト
リウム　　ｐＨ７，０、０，５％サルコシール、　０．
１Ｍ　２−メルカプトエタノール）に溶解後、０．１容
量の２Ｍ酢酸ナトリウム　（ｐｉ（４’、Ｏ）を加え、
次に等容量のフェノール、０．２容量のクロロホルム：
　イソアミルアルコール混Ｍ　（４９：ｌ）で抽出を行
った。　　１５分間水冷後、遠心し上層を分取し、等量
の２−プロパツールを加え、ＲＮＡを沈澱させた。遠心
後、沈ｉ！ｉ物を　０５宵９　の溶？！！　４Ｔ）　（
４＠グアニジン・チオシアネート、　　２５＋ｍＭクエ
ン酸ナトリウム　ｐＨ７，０；　０．５％サルコシール
、０．１Ｍ２−メルカプトエタノール）でで溶解後、２
倍容量のエタノールを添加し、再度ＲＮＡを沈澱させた
。遠心後注澱物を７５％エタノールで洗浄し、乾燥させ
た。沈澱物は、　５０μ９の滅菌蒸留水に溶解し、ＲＮ
Ａ溶液と、　　　した。

実施例２：　　ｃＤＮＡライブラリーの作成ｌＯμｌの
ＲＮＡ溶液を出発材料にｃＤＮ＾合成を行った。　　Ｒ
ＮＡから　２重鎖ｃＤＮＡの作成は、市販のｃＤＮＡ合
成システム・プラス（アマジャム、　ＲＰＮ−１２５６
Ｚ）を用いて行った。　　ＲＮＡから１重鎖ｃＤＮＡの
変換率は約２％、１重鎖ｃＤＮＡから２重鎖ｃＤＮＡへ
の変換率は、約１００篤であった。

合成した２重鎖ｃＤＮＡは、エタノール沈澱を行ったの
ち１００．ｕ　ＩＩ　　のＴＥ溶液　（１０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−Ｃｆｆ　。

ｐＨ８，０１腸１４　ＥＤＴＡ）に溶解した０次に市販
のｃＤＮ＾合成キット（ファルマシアＩＪＢ、　２７−
９２６０−０１＞を用いて以下の反応を行った。　　ｃ
ＤＮＡ溶液をキットに付属している５ｅｐｈａｃｒｙｌ
　Ｓ−３００スパンカラムを通すことにより、！×Ｔ４
リガーゼ溶液にバッファー交換を行った０次に、説明書
に準じＥｃｏＲＩアダプターの付加反応と　Ｔ４−キナ
ーゼ反応を行った。

ｃＤＮＡに結合しなかったアダプターは、５ｅｐｈａｃ
ｒｙｌＳ−３００スパンカラムを用いて除去しな、溶出
液中のｃＤＮＡは、５μｇのキャリアー　ｔＲＮ＾とと
もにエタノール沈澱を行った。沈澱物は７５％エタノー
ルで洗浄したのち風乾した。

次に市販のｃＤＮＡクローニングシステムλｇｔｌ　ｌ
・アダプター法（アマジャム＋、　ＲＰＮ　１２８０）
を用いて以下の反応を行った。沈澱物に５μ９　の滅菌
蒸留水、４μ９（２μｇ）のλｇｔｌｌ　ＥｃｏＲ１ア
ーム、１μ９　のＬ／Ｘバッファーを加えてン容解した
のち、ｌμＱ　　（２，５０）のＴ４リガーゼを加え、
１５℃で一晩放置した０次に、ＧＩＧＡＰＡＣＫ　ｎ　
　ＧｏｌｄλＤＮＡパッケージングキット（Ｓｔｒ４ｔ
ａｇｅｎｅ、　２００２１６）を用いて上記反応物（組
み換え　λｇｔｌｌ　ＤＮＡが含まれる）の　ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏパッケージング反応を行い、ｃＤＮＡライブラ
リー　（Ｌｏｔ、Ｂ）を作成した。

実施例３：　非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原遺伝子のイム
ノスクリーニングによるクローニングｃＤＮＡライブラ
リー　（Ｌｏｔ、　Ｂ）中のプラークと１次抗体および
２次抗体との反応は、市販のスーパースクリーン・イム
ノスクリーニングシステム（アマジャム、　ＲＰＮ　１
２８１Ｚ）の方法に準じて行った。スクリーニングに使
用した１次抗体は、非Ａ非Ｂ型肝炎患者のプール血清（
５名の急性肝炎回復期と５名の慢性肝炎）を、大腸菌ラ
イゼート（バイオ・ラット、　１７−３２（１５）で吸
収　（２１ｇライゼート／１９　　血清）したものを溶
液Ａ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＱ、　ｐＨ７，５１５
０ｍＭ　ＮＡＣｌ　、　２％　（Ｗ／Ｖ）　ＢＳＡ）で
２０倍希釈して使用した。２次抗体には、パーオキシダ
ーゼ標識したヤギ抗（ヒト　ＩｇＧ）　ＩｇＧ　（カッ
ペル、　３２０１−００８１）を５００倍希釈して使用
した０発色反応は市販のラムダ・リフト検出キットＧＡ
Ｒ−ＨＲＰ　（バイオ・ラット、　　１７−３５５６）
を用い、て行った。

約５００．０００個のプラークより１０ケの陽性プラー
ク（ニトロセルロースフィルター上で青紫色に発色）を
単離した。その中の１クローンをＹ１５と命名し、以下
の解析を続けた。

実施例４：　クローンＹ１５の抗原特異性試験ａ）イム
ノプラークアッセイ Ｙ１５クローンと陰性クローンを　２＝８の割合で混合
したものをブレーティングし、上述のイムノスクリーニ
ングの方法を用いて、非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者（輸血歴
有）血清（５名）、非Ａ非Ｂ型急性肝炎患者（輸血！！
！無）血清（６名）、非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者（輸血歴
然）血清（５名）、正常人゛コントロール血清（５名＞
、Ｂ型慢性肝炎患者血清（５名）、Ａ型急性肝炎患者血
漬（１名）との反応性を調べた。その結果、クローンＹ
１５は、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清とのみ詩興的に反応す
ることが示された（表１）。

非Ａ非Ｂ型急性肝炎患者有　　５　　３１５非Ａ非Ｂ！
！２急性肝炎輸血無　　６　　２／６非Ａ非Ｂ型慢性肝
炎輸血無　　５　　４１５Ａ型　　　急性肝炎　　　　
　１　　０／ＩＢ型　　　慢性肝炎　　　　　５　　０
１５コン　ロー１　　　　　　　　．１５ すなわち、クローンＹ１５は非Ａ非Ｂ型肝炎患者由来の
血清により免疫学的に認識される抗原（エピトープ）を
コードしていることがＶ＆認された。また、この抗原は
急性期の非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清とも反応することが判
明した。

ｂ）ウェスタンプロットアッセイ λｇｌｌ　（親株）溶源菌及び組換え体λｇｔｌｌＹ１
５溶原菌の調製、上記溶源菌の培養及びβ−ｇｉｌおよ
びβ−ｇａｌ融合抗原ポリペプチドの発現誘導は実験書
３、ｐ７６の方法に準じて行った６発現誘導後、培養液
を超音波破砕し蛋白濃度をＢｉｏ−Ｒａｄ法（バイオ・
ラット、　５００−０００１　）で測定した。各破砕液
より５μｇ相当の蛋白量を５ＤＳ−Ｆ’ＡＧＨにかけ、
泳動後セミドライエレクトロプロッター　（Ｉｎｔｅｇ
ａｔｅｄ　５ｅｐａｒａｔｉ。

ｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）をもちいてウニ各タンプロットを
おこなった。１次抗体には、表１記載の各種血清を使用
し、実施例３）記載のイムノスクリーニングの方法を用
いてβ−ｇａｌ、β−ｇａｌ＠合抗原に対する各種血清
の反応性をしらべた。その結果、β−ｇａｌ融合抗原ポ
リペプチド（約１００ｋｄ＞と非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清
との組合せにおいてのみ呈色反応が認められ（陽性率は
表１の結果と同じ）該抗原ポリペプチドの抗原特異性が
確認された。

実施例５：　クローンＹ１５由来のｃＤＮＡの塩基配列
および該配列内にコードされる抗原ポリペプチド配列の
決定 クローンＹ１５を実験書１の２．１１８記載のプレート
ライゼート法により増殖させたのちファージＤＮＡを調
製した。５μｇのファージＤＮＡを　ＥｃｏＲｒ消化し
た後、フェノール抽出およびエタノール沈澱により精製
した。

３μｇのＥｃｏＲＩ消化物をアルカリホスファターゼ処
理した後、　　Ｔ４キナーゼと　γ）２　Ｐ−ＡＴＰを
用いて５′末端ラベルを行った。フェノール抽出とエタ
ノール沈澱により　ＤＮＡ断片、を精製した後、５．Ｏ
ｘポリアクリルアミドゲル電気泳動を行いオートラジオ
グラフィーにより　ＥｃｏＲＩ消化により切り出された
ｃＤＮＡの長さを調べた。その結果ｃＤＮ＾のサイズは
約１３０塩基対であることが判った。

次に前述のＥｃｏＲＩ消化物と　ＥｃｏＲＩ消化後脱消
化後止リン酸化Ｚ１９　（７ｙ　ル？　シフ　ＬＫＢ、
　２７−４９８６−０１）とでＴ４リガーゼ反応を行っ
た１反応液をＪＭ１０９　（宝酒造、　９０５２）にト
ランスフェクションし、約１３０塩基のインサートＰも
っプラスミドを単離した　（ｐＴＺ１９−Ｙ１５と命名
）。

ｐＴＺ１９−Ｙ１５に組み込まれた　ｃＤＮＡの塩基配
列は、ＤｙｅＤｅｏｘｙ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｔａ
ｑ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｘｉｔ　（＾Ｂｌ。

４０１０７０）を用いてシーフェンス反応を行い、　　
ＤＮＡシークエンサー（八Ｂｌ、　３７３＾型）で泳動
して決定した。

決定には）４１３プライ７−Ｍ４（宝酒造、３８３２）
、１４１３ブライマーＲＶ　（宝酒造、　３８３０）を
用いて両方鎖を読み、決定した。

また、決定した配列のいずれの鎖が組換えλｇｔｌｌ上
でβ−ｇａｌ蛋白と融合蛋白を形成するのに関与してい
たかを確認するため　λｇｔｌｌ　ＥｃｏＲ１部位プラ
イマー正向、逆向（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ
ａｂｓ、　１２１８．１２２２）を用いてファージＤＮ
Ａを直接鋳型に用いて塩基配列決定を行った。これらの
結果に基づき、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清に特異的に反応
する抗原をコードする塩基配列を第１図に示すように、
また抗原のアミノ酸配列を第２区に示す様に決定した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ポリペ
プチドをコードする塩基配列を示す。 第２図は５本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ポリペ
プチドのアミノ酸配列を示す。 特許出願人　山之内製薬株式会社 有　　馬　　　　暉　　勝

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記アミノ酸配列で示される非Ａ非Ｂ型肝炎ウィ
   ルス抗原ポリペプチド 【遺伝子配列があります。】
2. （２）化学合成された請求項（１）記載の抗原ポリペプ
   チドまたはそのアミノ酸配列を含むポリペプチド断片群
3. （３）請求項（１）のアミノ酸配列を有する融合抗原ポ
   リペプチド
4. （４）抗原ポリペプチドがβ−ガラクトシダーゼ（β−
   ｇａｌ）と融合されたものである請求項（３）記載の融
   合抗原ポリペプチド
5. （５）請求項（４）記載の抗原ポリペプチドを発現する
   組換え体λｇｔｌｌクローンＹ１５
6. （６）請求項（１）、（３）または（４）のいずれかの
   項に記載の抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
   チド
7. （７）下記塩基配列で示される非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス
   ポリヌクレオチド 【遺伝子配列があります。】
8. （８）非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに由来するポリヌクレオ
   チドを検出するためのポリヌクレオチドであって、請求
   項（７）記載の連続した８塩基、またはそれ以上の長さ
   からなるポリヌクレオチドプローブ
9. （９）請求項（１）、（３）または（４）のいずれかの
   項に記載の抗原ポリペプチドを生産するように組換え体
   発現ベクターで形質転換された宿主細胞を該ポリペプチ
   ドを発現する条件下で培養することを特徴とする抗原ポ
   リペプチドの生産方法
10. （１０）請求項　（１）、（２）、（３）または（４）
    記載の抗原ポリペプチドと生物学的試料中に存在する非
    Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体との反応で形成される免疫学
    的結合物を測定して生物学的試料中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
    ィルス抗体の存在を確認する非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗
    体の検出方法