JPH04187698A - ペプチド含有ポリエチレングリコール誘導体とその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野］ 本発明は、グルタミン酸−イソロイシンーロイソンーア
スパラギン酸−ハリン−プロリン−セリン−トレオニン
のオクタペプチド単位を有する、ポリエチレングリコー
ル誘導体またはその塩およびこれを有効成分とする動物
細胞の接着阻害剤ならひに血小板凝集・粘着抑制剤に関
する。

［従来の技術二 フィブロネクチンは細胞−細胞外基質の接着に関与する
タンパク質であり、血小板凝集やガン転移にも関与して
いると考えられている。これらの相互作用は一連の細胞
表面のレセプターにより仲介され、フィブロネクチンは
分子量約２５万の巨大分子であるにもかかわらず、これ
らのレセプターかそのアルキニン−グリノン−アスパラ
キン酸（以下、Ａｒｇ−Ｇａｙ−Ａｓｐと略す）配列を
特異的に認識することか明らかにされ、レセプターとの
相互作用に重要なものであることが報告されている（ネ
イチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、第３０９巻、３０頁、１
９８４年）ｅ以来、Ａｒｇ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｓｐ配列を
有するオリゴあるいはポリペプチドを用いる研究が進め
られている。

例えは、Ａｒｇ−Ｇｌ〜□−Ａｓｐ配列を有する種々の
鎖状および環状のオクタペプチドを用いて血小板凝集を
阻害する方法（高分子学会予稿集（ＰｏｌｙｍｅｒＰｒ
ｅｐｒｉｎｔｓ　、　Ｊａｐａｎ　）　、第３８巻、３
１４９頁、１９８９年、特開平２−１７４７９７号）　
、Ａｒｇ−［１＋Ｉｙ−Ａｓｐ配列を有するペプチドを
細胞移動抑制剤として用いる方法（特開平２−４７１６
号）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを固定化したＰＭＭＡ膜
を細胞接着膜として用いる方法（高分子学会予稿集（Ｐ
ｏｌｙｍｅｒＰｒｅｐｒｉｎｔｓ　、　Ｊａｐａｎ　）
　、第３７巻、７０５頁、１９８８年）が報告されてい
る。さらに、ポリマーにＡｒｇ−Ｇａｙ−Ａｓｐを必須
構成単位とするペプチドを共有結合させ動物細胞培養基
体、生体複合人工臓器用基体として用いる方法（特開平
１３０９６８２号、特開平１−３０５９６０号）　、Ａ
ｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−３ｅｒ配列を有するポリペプチ
ドを体外血液用血小板保護剤として用いる方法か開示さ
れている（特開昭６４−６２１７号）。また、Ａｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を有するオリゴペプチドあるいはそ
の繰り返し構造を有するポリペプチドを用いて、ガン転
移を抑制する方法か知られている（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｂ
ｉｏｌ。

Ｍａｃｒｏｍｏｌ、　）、第１１巻、２３頁、１９８９
年、同誌、第１１巻、２２６頁、１９８９年、（Ｊｐｎ
、　Ｊ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　）第６０巻、７２２頁、１９
８９年）。

一方、最近フィブロネクチン分子内にはＡｒｇ−Ｇｌｙ
−Ａｓｐ配列以外の細胞接着配列が存在することも明ら
かにされ、そのひとつとしてｌｌＩＣ３（ｔｙｐｅｌｌ
ｌｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ　ｓｅｇｍ
ｅｎｔ）領域内に存在するＣ３Ｉペプチド（グルタミン
酸−イソロインンーロイシンーアスパラギン酸−バリン
−プロリン−セリン−トレオニン配列を含む）か注目さ
れている（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　　２６２巻
、６８８６頁、１９８７年）。このペプチドは、Ａｒｇ
−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチドと同様にフィブロネクチンレ
セプターに認識され、フィブロネタチンの接着特異性に
寄与していると考えられている。現在では、その接着活
性の最小単位かグルタミン酸−イソロインンーロイシン
ーアスパラギン酸−バリン−プロリン−セリン−トレオ
ニン（以下、ＥＩＬＤＶＰＳＴと略す）配列を有するオ
クタペプチドであることが明らかにされている（Ｊ、　
Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　　１０７巻、２１８９頁、１
９８８年）。

一方、ポリエチレンクリコールは、疎水性および親水性
の両親媒性を兼ねそなえた合成高分子である。このポリ
エチレングリコールを用いて酵素の性質を改変する方法
が報告されており（Ｔｒｅｎｄｓｉｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈ
、、第４巻、６８頁、１９８６年）、ポリエチレングリ
コール誘導体に酵素を導入して様々な酵素の改変に成功
している。このポリエチレングリコール誘導体に、ＥＩ
ＬＤＶＰＳＴ配列を有するオリゴペプチドあるいはその
繰り返し構造を有するポリペプチドを導入した化合物は
知られておらず、導入した場合にはレセプターとの結合
能の増強および血液中での安定化か期待てきる。

［発明か解決しようとする課題］ 本発明の目的は、ＥＩＬＤＶＰＳＴのオクタペプチド単
位を有する、ポリエチレンクリコール誘導体およびその
合成法を提供することである。

本発明の他の目的は、これを有効成分とする動物細胞の
接着阻害剤及び血小板凝集・粘着抑制剤を提供すること
である。

１課題を解決するための手段］ 本発明の化合物は、下記−殺伐、［または）＋＋＋。

で規定されるペプチド含有ポリエチレングリコール誘導
体であり、分子内に存在するイオン性基は適当なイオン
と塩を形成してもよい。

Ｒ″ 式中、Ｒ’　、Ｒ’はそれぞれ下記−殺伐ＦＩＩ）で表
されるペプチド残基を示す。

（［Ｘ７　Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｔ−
Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−ｊＹ））。

・・ｉｌｌ’。

式中、Ｇｌｕ、Ｉ　］　ｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、
Ｐｒｏ、Ｓｅｔ、Ｔｈｒはそれぞれグルタミン酸、イソ
ロインン、ロイノン、アスパラキン酸、バリン、プロリ
ン、セリン、トレオニン残基を表す。［Ｘ〕、［Ｙ］は
存在するかあるいは存在しないアミノ酸を表す。存在す
る場合には、［ｘ　Ｌ、　［Ｙ］かセリン、グリシン、
バリン、アスパラキン、プロリン、システィン、トレオ
ニン残基から選択されるアミノ酸残基であることが好ま
しい。特に、［Ｙ］がセリン残基であることが好ましい
。また［Ｘ］、［Ｙ］かともに存在しない場合も好まし
い。なお、このペプチド残基とトリアジン環は［ｘ］（
［Ｘ］が存在しない場合はＧｌｕ）または［Ｙ］（［Ｙ
］が存在しない場合はＴｈｒ）の位置で結合する。ｎは
１から１５０までの整数が好ましく、５から１２０まで
の整数が特に好ましい。ｍは１から５までの整数を表し
、ｍが１から３までの整数が特に好ましい。

本発明の化合物の好ましい塩の例としてはナトリウム塩
、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、塩酸
塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩が挙げられる。

以下に、本発明の好ましい化合物例を挙げるが、本発明
はこれらに限られるものではない。なお下記でＧはグリ
シンを表わす。

化合物例 数平均分子量　７．０００ 数平均分子量　１２．０００ ＥＩＬＤＶＰｓＴＥＩＬＤＶＰｓＴ 数平均分子量　９．０００ 数平均分子量　３．５００ 本発明の化合物は、レセプターとの結合能の増強および
血液中での安定化が期待され、ＥＩＬＤＶＰＳＴペプチ
ド部位かカン細胞、血小板、リンパ球等の表面に存在す
るフィブロネクチンレセプターと結合できることを利用
して、ガン転移抑制、血小板凝集抑制、リンパ球活性化
の目的に使用することができる。

次に本発明の化合物の合成法について説明する。

本発明の化合物は、たとえば次の４段階で合成すること
かできる。

■ポリエチレンクリコール誘導体ｆｌＶ）及び（Ｖ）の
合成 ■保護アミノ酸の逐次延伸による保護ペプチドの合成 ■保護ペプチドのポリエチレンクリコール誘導体への導
入による式ｍ］及び［〜＋＋＋］の化合物の合成 Ｒ３及びＲ４は式［１Ｆ）で表されるペプチド残基の保
護体を示す。

■脱保護および精製 以下、各段階を詳細に説明する。

■　−殺伐（ｍおよび［Ｖｌで表される化合物は、例え
ばＢｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ
ｕｎ、、　８３．　３８５　　（１９７８）、Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、３３．　１４６７（１９８３）に記
載されている方法によって合成でき、（Ｖｌの化合物は
市販もされている。

■　保護アミノ酸を逐次伸長する方法としては、既知の
方法、すなわち、泉屋ら著「ペプチド合成の基礎と実験
」　（丸善）やＢｏｄａｎｓｚｋｙ著“ＰＲＩＮＣＩＰ
ＬＥＳ　ＯＦ　ＰＥＰＴＩＤＥ　５ＹＮＴＨＥＳＩＳ″
、“ＴＨＥ　ＰＲＡＣＴＩＣＥＯＦ　ＰＥＰＴＩＤＥ　
５ＹＮＴＨＥＳＩＳ”　（ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａ
ｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）に記載されている方法かいず
れも有効である。縮合反応の段階では、ＤＣＣ〜ａｄｄ
ｉｔｉｖｅ法、アシド法、混酸無水物法、活性エステル
法のいずれを採用してもよいか、１−ヒドロキシベンゾ
トリアゾールとジシクロへキンルカルホシイミトを併用
するＤＣＣ−ａｄｄｉｔｉｖｅ法か最も良好な結果を与
える。

■　−殺伐（Ｖｌｌおよび［ＶＩｌ）で表される化合物
は、−殺伐［ＩＶ］および［Ｖｌで表されるポリエチレ
ングリコール誘導体および保護ペプチドをこれらか溶解
する有機溶媒中で塩基存在下室温で攪拌、反応させるこ
とにより得られる。

■　保護基を脱保護するのに用いられる条件は、用いた
保護基の種類に大きく依存する。通常使用される脱保護
条件は、接触水素添加、トリフルオロ酢酸、無水フッ化
水素、トリフルオロメタンスルホン酸−チオアニソール
混合系、トリフルオロ酢酸−チオアニソール混合系等で
あるが、保護基の種類によってはさらに多様な手段か可
能である。また、目的物の精製は、ケルろ適法等を用い
ることにより行うことかできる。

本発明において数平均分子量はゲルパーミェーションク
ロマトグラフィー（Ｇ　Ｐ　Ｃ）による測定結果をもと
に算出することかできる。

ＧＰＣの測定条件は以下のとおりである。

カラム：ＴＳＫｇｅｌ　　（東洋曹達製）Ｇ１００ＯＨ
。

排除限界分子量　　１０００ カラム寸法　　　　７．５１ＤＸ６００ｍｍ　　　１本
Ｇ２０００Ｈ。

排除限界分子量　　１００００ カラム寸法　　　　７．５１Ｄ　Ｘ　６００　ｍｍ　　
　２本Ｇ２５００Ｈ。

排除限界分子量　　２００００ カラム寸法　　　　７．５１Ｄ　Ｘ６００　ｍｍ　　　
１本溶媒、テトラヒドロフラン 流量：１ｍｌ／ｍｉロ カラム温度＝４０°Ｃ 検出器：Ｕ〜’、Ｒ１併用 ＴＳＫスタンダードポリエチレンオキサイドで検量線を
作成。

数平均分子量は、高分子学会編「高分子科学実験法」　
（東京化学同人１９８１年）Ｐ、２０４〜２０８に記載
の一般的な方法、すなわち線分法を用いて計算した。得
られたクロマトクラムを等間隔のカウント（Ｄ）に分割
して１番目の高分子種のヘースラインからのピーク高さ
をＨｉとし、以下の関係式（１）を利用して求めた。

ΣｉＮｉ Σ１ＨｉＤ Σ１（ＨｉＤ／Ｍｉ） ΣＩＨ１ Σ１（Ｈｉ／Ｍｉ） によって Ｍ　ｎ　＝□ Σｉ（Ｌ／Ｍｉ）　　（Ｈｉ／Σ１Ｈｊｉ・・・・・関
係式（１） ここで、Ｎ１は１番目の高分子種の数を表わし、Ｍｌは
１番目の高分子種の分子量を表わす。（Ｍｉは前記の検
量線から求めることができる。）。

本発明のペプチド含有ポリエチレングリコール誘導体は
、細胞接着性蛋白質のコア配列（ＥＩＬＤＶＰＳＴ４を
有し、該コア配列を介して細胞接着性蛋白質と同様の機
序で細胞に接着する。そのため、細胞接着性蛋白質のア
ゴニストまたはアンタコニストとして様々の生物活性を
示す。そのほかにも、免疫調整作用、創傷治癒作用、毛
細血管中で起こる癌細胞による血小板凝集の抑制作用、
神経疾患治癒作用等の広範な生物活性か認められる。

従って、本発明のペプチド含有ポリエチレングリコール
誘導体は、その少なくとも一種を、場合により慣用の担
体または医薬用製剤とともに、癌転移抑制剤、創傷治癒
剤、免疫調整剤、血小板凝集抑制剤または神経疾患治療
剤として患者に投与−することが可能である。特に動物
細胞接着阻害剤または血小板凝集・粘着抑制剤としての
使用が好ましい。その投与量は、０．２　ｕ　ｇ／ｋｇ
　〜４００ｍｇ／ｋｇ）範囲で症状、年令、体重等に基
ついて決定される。

本発明のペプチド含有ポリエチレングリコール誘導体は
、ペプチド系医薬に一般に使用されている投与方法、即
ち非経口投与方法、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮
下投与等によって投与するのか好ましい。そのような注
射用製剤を製造する場合、本発明のペプチド含有ポリエ
チレンクリコール誘導体を例えば、後記実施例で示すよ
うにＰＢＳ　（Ｎａ）Ｉ２ＰＯｔ　ｏ、ｏ　０５Ｍ、　
ＮａＣ１０，０７Ｍ）または生理食塩水に溶解して、注
射用製剤としてもよく、あるいは０．ＩＮ程度の酢酸水
等に溶解した後、凍結乾燥製剤としてもよい。このよう
な製剤には、グリシンやアルブミン等の慣用の安定化剤
を添加してもよく、血中半減期を延長させる等の目的の
ために、コラ−ケンやリポソームを担体として用いても
よい。

さらに、本発明のペプチド含有ポリエチレンクリコール
誘導体は、例えばリポソーム中に包含したマイクロカプ
セル剤とすれば、経口投与剤とすることも可能であり、
座剤、舌下錠、点鼻スプレー剤等の形によれば、消化管
以外の粘膜から吸収させることも可能である。

実施例１ 以下に本発明の化合物（］）の合成例を示す。

化合物（１）を以下の合成経路で合成した。なお、アミ
ノ酸、各種保護基および脱保護試薬は通常用いられる略
号を使って表した。また、他の化合物例もここに例示し
た方法で合成できる。

Ｂｚｌ　　ペンシル基、 ＴＦＡ：ｈリフルオロ酢酸、 Ｂｏｃ：ｔ−ブトキシカルホニル基、 ＨＯＢｔ：１−ヒドロキンヘンシトリアゾール、２　ペ
ンシルオキンカルホニル基、 ＤＣＣ・シンクロへキンルヵルボンイミド以下にそれぞ
れの合成法を記す。

（１ｂ）の合成 文献（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏ
ｍｍｕｎ、、　　８３．　３８５　（１９７８）、Ｌｉ
ｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、３３．　１４６７（１９８３）
）に記載の方法により、アルドリッチ社から購入した平
均分子量５，０００のポリエチレングリコールモノメチ
ルエーテル（ｌａ）（１０ｇ、２ｍｍｏｌ）を充分乾燥
し、トルエン（１００ｍｌ）、炭酸ナトリウム（５ｇ）
、塩化シアヌル（１，１ｇ、　　６ｍｍｏｌ）を加え、
室温で６０分間攪拌した。反応液か室温になるまで放冷
した後にろ過し、ろ液にヘキサンを加えて結晶化した。

さらにトルエン・アセトン・ヘキサンの溶媒系からこの
結晶を再結晶させ精製し、白色粉末（７ｇ）を得た。

（１ｄ）の合成 国産化学（株から購入した（ｌｃ）（３０，９ｇ、０、
　１ｍｏｌ）、トリエチルアミン（１４ｍｌ）、臭化ベ
ンジル（１７，１ｇ）、酢酸エチル（２００ｍｌ）の混
合物を３時間加熱這流した。反応液を室温になるまで放
冷した後に、ＩＮ炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩
水各２００ｍ１で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し
た。硫酸ナトリウムをろ過して除き、ろ液を減圧濃縮し
て無色油状物を得た。

この反応混合物をシリカゲルクロマトクラフィー（溶出
液ヘキサンノ酢酸エチル４０：１）で精製し、　（ｌｄ
）（３９ｇ）を得た。

（１ｅ）の合成 （ｌｄ）　　（７，９９ｇ、　　２０ｍｍｏｌ）を塩化
メチレン２０ｍ１に溶解し、ＴＦＡ２０ｍｌを加えて室
温で３０分間攪拌した。溶媒を減圧留去した後にクロロ
ホルム１００ｍ１を加え、飽和食塩水各１００ｍ１で数
回洗浄し、無水硫酸ナト（ノウムで乾燥した。

硫酸ナトリウムをろ過して除き、ろ液を減圧濃縮して無
色油状物を得た。これとＢｏｃ、５ｅｒ（Ｂｚｌ）（国
産化学（掬から購入）　　（５，９０ｇ。

２０ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（４，５４ｇ、　　２２ｍｍｏ
ｌ）、ＨＯＢ　ｔ　（２，７６ｇ、　　１８ｍｍｏｌ）
　、Ｎ−メチルモルホリン（２，２ｍｌ、２０ｍｍｏｌ
）　ＤＭＦ　８０ｍｌの混合物を０℃で３時間、さらに
室温で］２時間攪拌した。ＤＣＵｒｅａを除去した後に
溶媒を減圧留去し、クロロホルム１００ｍ１を加え、Ｉ
Ｎ炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水各２００＋ｎ
ｌで一洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナ
トリウムをろ過して除き、ろ液を減圧濃縮し、ｔｉｅ（
薄層クロマトグラフィー）で単独スポットなので精製す
ることなく次の反応に用いた。

（ｉｆ）の合成 （１ｅ）の合成と同様に行った。ＴＦＡで脱保護した後
に、ＢｏｃＰｒｏ　（国産化学■から購入）（４，３０
ｇ、　　２０ｍｍｏｌ）　、ＤＣＣ（４，５４ｇ。

２２ｍｍｏｌ）　、ＨＯＢ　ｔ　（２，７６ｇ、　　］
　８ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（２，２ｍＬ　
　２０ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ８０ｍｌを加えて縮合反応し
た。ｔｉｃで単独スポットなので精製することなく次の
反応に用いた。

ユ上ヱＬΩ登式 （１ｅ）の合成と同様に行った。ＴＦＡで脱保護した後
に、ＢｏｃＶａｌ（国産化学■から購入）（４，３５ｇ
、２０ｍｍｏｌ）　、ＤＣＣ（４，５４ｇ。

２２ｍｍｏｌ）　、ＨＯＢ　ｔ　　（２，７６ｇ、　　
ｌ　８ｍｍｏｌ）　　、Ｎ−メチルモルホリン（２，２
ｍｌ、　　２０ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ８０ｍｌを加えて縮
合反応した反応混合物をシリカゲルクロマトグラフィー
（溶出液クロロホルム１メタノール９・ｌ）で精製し、
（１ｇ）（１３，９ｇ）を得た。

（１ｈ）の合成 （ｌｅ）の合成と同様に行った。（Ｉｇ）（１３、９ｇ
＋　　１８ｍｍｏｌ）とＴＦＡで脱保護した後に、Ｂｏ
ｃＡｓｐ　（ＯＢｚ　］）　　（５，８２ｇ、　　］　
８ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（４，０８ｇ、　　１９．　８ｍ
ｍｏｌ）　、ＨＯＢ　ｔ（２，４８ｇ、　　１６．　２
ｍｍｏｌ）　、Ｎ−メチルモルホリン（２，０ｍｌ、　
　１８ｍｍｏｌ）　、ＤＭＦ　８０ｍｌを加えて縮合反
応した。反応混合物をシリカゲルクロマトクラフィー（
溶出液クロロホルム１メタノール９　ｌ）で精製し、（
ｌｈ）（１６，７ｇ）を得た。

（１１）の合成 （ｌｅ）の合成と同様に行った。　（ｌｈ）（１４７、
ｇ＋　　１５ｍｍｏｌ）をＴＦＡで脱保護した後に、Ｂ
ｏｃＬｅｕ　　Ｃ３，４７ｇ、　　１５ｍｍｏｌ）　　
、ＤＣＣ（３，４０ｇ、　　１６．　５ｍｍｏｌ）　、
ＨＯＢ　ｔ　　（２゜０　？　ｇ、　　１３．　５ｍｍ
ｏｌ）　、Ｎ−メチルモルホリン（１，７ｍｌ、　　１
５ｍｍｏｌ）　、ＤＭＦ　７０ｍｌを加えて縮合反応し
た。反応’ｔｌ　＝物をノリカケルクロマトグラフィー
（溶出液クロロホルムｌメタノール９１）で精製し、（
ｌｉ）（１５，６ｇ）を得た。

（ｌ　）の合成 （１ｅ）の合成と同様に行った。　（ｌｉ）（１０、９
ｇ、　　１０ｍｍｏｌ）をＴ　Ｆ　Ａで脱保護した後に
、Ｂｏｃ　Ｉ　Ｉ　ｅ　（２，３１ｇ、　　ｌ　Ｏ＋ｎ
＋＋＋ｏｌ）　、ＤＣＣ（２，２７ｇ、　　ｌ　１ｍｍ
ｏｌ）　、ＨＯＢｔ　（１，３８ｇ、　　９ｍｍｏｌ）
　、Ｎ−メチルモル不リン（１，ｉｍ！。

１０ｍｍｏｌ）　、ＤＭＦ　５０ｍｌを加えて縮合反応
した。

反応混合物をシリカゲルクロマトクラフィ−（溶出液ク
ロロホルム１メタノール９１）で精製し、（ｌｊ）（１
１，４ｇ）を得た。

（１に’ｌの合成 （１ｅ）の合成と同様に行った。（ｌｊ）（６゜０ｇ、
　　５ｍｍｏｌ）をＴ　Ｆ　Ａで脱保護した後に、Ｂｏ
ｃＧｌｕ　　（ＯＢｚ　ｌ）　　（１，６９ｇ、　　５
ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（１，１３ｇ、　　５．　５ｍｍｏ
ｌ）　、ＨＯＢｔ（０，６９ｇ、　　４．　５ｍｍｏｌ
）　、Ｎ−メチルモルホリン（０，５５ｍｌ、　　５ｍ
ｍｏｌ）　、ＤＭＦ　３０ｍｌを加えて縮合反応した。

反応混合物をシリカゲルクロマトクラフィ−（溶出液ク
ロロホルムｌメタノール９：ｌ）で精製し、（Ｉｋ）（
６，４ｇ）を得た。

（１１）の合成 （１ｅ）の合成と同様に行った。（ｌｋ）（３゜５６　
ｇ、　　２．　５ｍｍｏｌ）をＴＦＡで脱保護した後に
、ＢｏｃＧｌｙ　（０，４４ｇ、　　２．　５＋ｎ＋ｎ
ｏｌ）　、ＤＣＣ（０，５７ｇ、　　２．７５ｍｍｏｌ
）　、ＨＯＢ　ｔ　（０゜３１　ｇ、　　２．　２５ｍ
ｍｏｌ）　、Ｎ−メチルモルホリン（０，２７ｍｌ、　
　２．　５ｍｍｏｌ）　、ＤＭＦ　２０ｍｌを加えて縮
合反応した。反応混合物をシリカゲルクロマトクラフィ
ー（溶出液クロロホルムｌメタノール９・ｌ）で精製し
、（１，１）（３，６３ｇ）を得た。

（１ｍ）の合成 （ｌｅ）（１，４８ｇ、１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン１
０ｍ１に溶解し、トリフルオロ酢酸１０ｍ１を加えて室
温で３０分間攪拌した。溶媒を減圧留去した後にクロロ
ホルム１００ｍ１を加え、ｌＮ炭酸水素すｈ　’）ラム
水溶液、飽和食塩水容１００ｍ１で数回洗浄し、無水硫
酸ナトｌ）ラムて乾燥した。硫酸ナトリウムをろ過して
除き、ろ液を減圧濃縮して白色粉末を得た。これと（ｌ
ｂ）（２，５ｇ）、トリエチルアミン（０，１ｇ）、ク
ロロホルム５０ｍ１の混合物を室温で２４時間攪拌した
。ゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　　ＬＨ−６０）により
精製し、（１ｍ）を３．５ｇ得た。

（１）の合成 （１ｍ）（３，５ｇ）を酢酸５０ｍ１に溶解し、ｌＯ％
０％パランラム１ｇを加え、室温で常圧加水素分解を２
４時間行った。触媒をセライトを用いてろ別し、溶媒を
減圧留去した。ゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　　ＬＨ−
６０）により精製し、（１）を２゜９ｇ得た。

アミノ酸分析　Ｇｌｕ（１，００）、Ｉｃｅ（０，９８
）、Ｌｅｕ　　（１，０２）　、Ａｓｐ　　（ｉｏ　Ｉ
）、〜’ａｌ　　（１，０４）、Ｐｒｏ　　（０，９７
）Ｓｅｒ　　（０，８２）　　、Ｔｈｒ　　（０，８５
）数平均分子量・７，０００ 実施例２〜４ 実施例１記載の方法にしたかって、化合物（２）、（３
）及び（４）を合成した。その物性値を表１に示す。

表　　　１ 製剤例 生理食塩水に、本発明のペプチド含有ポリエチレングリ
コール誘導体（］）を１００μｇ／ｍｌの濃度で溶解し
て、注射用製剤を調製した。この製剤は、動物細胞の接
着阻害剤及び血小板凝集・粘着抑制剤として使用可能で
ある。

試験例 「細胞接着阻害活性の測定− 本発明のペプチド含有ポリエチレングリコール誘導体は
細胞のフィブロネクチンに対する接着を阻害する。その
活性測定方法を以下に示す。ここで用いられた競争法は
基本的に生化学分野では広く用いられているものであり
、例えばｒＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ＝
　８２　８０３　（１９８１）、特開平１−３０９６８
２、同２　１７４７９７に開示されている。

実験方法 １、吸着プレートの作製 市販のフィブロネクチン（ヒト由来、コスモハイオ（掬
から購入）をＰＢＳて１０μｇ／’ｍｌに溶解し、その
溶液５０ｍ１を９６ウエルのポリスチレレプレートにい
れ、４℃で一晩保温し、コーティングした。次に非特異
吸着を防ぐ目的で生血清アルブミン（ＢＳＡ　　１％）
を加え、３７°Ｃ１１時間保温し、その後通常の洗浄操
作（ＰＢＳ）を行い充分に水きりして吸着プレートを作
製した。

２、接着阻害実験 Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ
　Ｍｅｄｉｕｍて溶解したペプチド含有ポリエチレンク
リコール誘導体溶液５０ｍ１を上記方法で作成したプレ
ートにいれ、そこへＮＲＫ４９Ｆ　（ＩＸ　ｌ　Ｏ″　
ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）　９に液を５０ｍ１加え、３７℃で
一時間保温し細胞を接着させた。ＰＢＳで３回洗浄し、
未接着の細胞を除いた後、０，０２５％ＥＤＴＡトリプ
ノン溶液て接着した細胞を剥離し、２　／’Ｏトリパン
ブルーで染色して細胞数を計測した。結果を下記表２に
示す。表中、ＥＩＬＤＶＰＳＴは、グルタミン酸−イソ
ロイ／ンーロインンーアスパラキン酸−ノ＼リン−プロ
リン−セリン−トレオニンのオクタペプチドを表す。

表　　　２ Ｉ　　フィブロネクチンに対する細胞の接着率（％））
「血小板凝集阻害活性試験」 本発明のペプチド含有ポリエチレンクリコール誘導体の
ＩＮ　　ＶＩＴＲＯ系での血小板凝集阻害作用をヒト多
血小板血漿を用いて検定した。以下にその実験方法を示
す。

実験方法 新鮮なヒト血液に１／９量の３．８％クエン酸ナトリウ
ムを加え遠心（１０００ｒｐｍ、１０分）し、上層を多
血小板血漿として分取した。この血漿２００μｌにペプ
チド含有ポリエチレングリコール誘導体溶液２５１ｔ　
ｌ　　（ｍａＸｌ　、　　５ｍｇ　’ｍｌ）を加え、３
分間３７°Ｃてインキュ・＼−トしたのち、２’０−５
０μＭＡＤＰ（アデノノンニリン酸）溶液あるいは２０
０μｇ／ｍｌのコラーゲン溶液を２５μｌ加えて凝集の
程度を、アクリボメーターを用いて透過度を測定するこ
とにより検定した。

結果を表３に示す。

凝集阻害”Ｉ　（１−Ｔ／Ｔｏ）Ｘ　１００％Ｔ、＝ペ
プチド含有ポリエチレンクリコール誘導体非添加時の透
過度 Ｔ−ペプチド含有ポリエチレンクリコール誘導体添加時
の透過度 表　　　３

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記一般式［ I ］で表されるペプチド含有ポリ
   エチレングリコール誘導体またはその塩。 ▲数式、化学式、表等があります▼…［ I ］ ただし、ｎは１から１５０までの整数を表 す。また、Ｒ＾１は下記一般式［II］で表されるペプチ
   ド残基を示す。 （［Ｘ］Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐ
   ｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−［Ｙ］）＿ｍ…［II］ 式中、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、 Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒはそれぞれグルタミン
   酸、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、バリン
   、プロリン、セリン、トレオニン残基を表す。［Ｘ］、
   ［Ｙ］は存在するかあるいは存在しないアミノ酸を表す
   。 ｍは１から５まで整数を表す。 なお、このペプチド残基の［Ｘ］（［Ｘ］ が存在しない場合はＧｌｕ）または［Ｙ］ （［Ｙ］が存在しない場合はＴｈｒ）がトリアジン環と
   結合している。
2. （２）下記一般式［III］で表されるペプチド含有ポリ
   エチレングリコール誘導体またはその塩。 ▲数式、化学式、表等があります▼…［III］ ただし、ｎは１から１５０までの整数を表 す。また、Ｒ＾２は請求項（１）の一般式［II］で表さ
   れるペプチド残基を示す。
3. （３）一般式［II］において、［Ｘ］、［Ｙ］が存在す
   るアミノ酸残基を表し、［Ｘ］、［Ｙ］がセリン、グリ
   シン、バリン、アスパラギン、プロリン、システイン、
   トレオニン残基から選択されるアミノ酸残基である請求
   項（１）記載のペプチド含有ポリエチレングリコール誘
   導体またはその塩。
4. （４）一般式［II］において、［Ｘ］、［Ｙ］が存在す
   るアミノ酸残基を表し、［Ｘ］、［Ｙ］がセリン、グリ
   シン、バリン、アスパラギン、プロリン、システイン、
   トレオニン残基から選択されるアミノ酸残基である請求
   項（２）記載のペプチド含有ポリエチレングリコール誘
   導体またはその塩。
5. （５）請求項（１）−（４）のいずれか１項記載のペプ
   チド含有ポリエチレングリコール誘導体またはその塩を
   有効成分とする動物細胞の接着阻害剤。
6. （６）請求項（１）−（４）のいずれか１項記載のペプ
   チド含有ポリエチレングリコール誘導体またはその塩を
   有効成分とする血小板凝集・粘着抑制剤。