JPS6327360B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 本発明は一般に新規なポリペプチド、とくに下
記の序列： Ｒ−Ｘ−LYS−Ｙ−GLN−R′ ここでＸはALA、Ｄ−ALAもしくはSARであ
り；ＹはSER、Ｄ−ALA、SARもしくは２−
Me−ALAであり；ＲはＨ、GLNもしくはSAR
であり；そしてR′はOHもしくはNH₂である、 を有するペプチドに関する。 多くのポリペプチドは動物の種々の組織および
器官（血液を含む）から単離されてきていること
はよく知られている。これらのポリペプチドの多
く、たとえば、種々の免疫グロブリン、胸腺ホル
モンチモポイエチンなどは、体中の免疫機能に関
係する。事実、出願人は、米国特許第4002602号
および同第4002740号ならびにいくつかの化学論
文に記載されているように、これらのポリペプチ
ドのいくつかを単離しかつ合成した。 約過去10年まで、胸腺についてほとんど知られ
ていなかつたが、現在は胸腺はホ乳類および鳥類
における免疫機能になくてはならない主な器官の
１つであることが理解された。胸腺の考えられる
機能および初期の推測および実験について強い興
味がもたれていたにもかかわらず、最近まで胸腺
の機能についてほとんど知られていなかつた。し
かし現在認識されているように、胸腺は上皮（内
分泌）およびリンパ様（免疫学）の両方の成分を
もつ複合器官であり、このように胸腺は体の免疫
機能中に含まれる。胸腺は第３鰓弓から誘導され
た上皮間質と、ヘモポイエチン組織に由来する幹
細胞から誘導されたリンパ球とからなる、
Goldstein、et al.、The Human Thymus、
Heinemann、ロンドン、1969。リンパ球は胸腺
および葉内で成熟した胸腺誘導細胞、いわゆるＴ
細胞と呼して分化し、このＴ細胞は血液、リン
パ、脾およびリンパ節に循環する。胸腺内の幹細
胞分化の誘発は、胸腺の上皮細胞の分泌により中
介されるように思われる。 胸腺は体の免疫特性と結合することがしばらく
知られ、それ故、大きな興味が胸腺から単離され
た物質に示されてきた。これに関して、牛の胸腺
中に存在する物質に関する科学的研究に基づく比
較的多数の論文が最近刊行された。事実、出願人
はこの分野における研究に関する多数の論文を刊
行した。関連ある刊行物は、たとえば、次に見出
される：The Lancet、July20、1968、pp.119−
122；Triangle、Vol.、No.１、pp.7−14、
1972；Annals of the New York Academy of
Sciences、Vol.183、pp.230−240、1971；および
Clinical and Experimental Immunology、
Vol.4、No.２、pp.181−189、1969；Nature、
Vol.247、pp.11−14、1974；Proceedings of the
National Academy of Sciences USA、
Vol.71、pp.1474−1478、1974；Cell、Vol.5、
pp.361−365および367−370、1975；Lancet、
VoL.2、pp.256−259、1975、；Proceedings of
the National Academy of Sciences USA、
Vol.71、pp.1474−1478、1974；Cell、Vol.5、
pp.361−365および367−370、1975；Lancet、
Vol.2、pp.256−259、1975；Proceedings of the
National Academy of Sciences USA、
Vol.72、pp.11−15、1975；Biochemistry、
Vol.14、pp.2214−2218、1974；Nature、
Vol.225、pp.423−424、1975。 免疫機能をもつリンパ球の第２のクラスはＢリ
ンパ球またはＢ細胞である。これらは鳥類におけ
るザ・バーサ・オブ・フアブリシウス（the
Bursa of Fabricius）においてかつホ乳類にお
けるまだ確認されていない器官により分化され
る。Ｔ細胞とＢ細胞は免疫の多くの面で協同す
る。参照、たとえば、出願人による論文、
Science、193、319（July23、1976）およびCold
Spring Harbor Symposia on Quantitative
Biology、Vol.XLI、５（1977）。 ノナペプチド物質は最近豚の血清からJ.F.
Bach、et alにより単離され、そして“facteur
thymique serique”（FTS）と確認された。この
物質の単離およびその構造はC.R.Acad.Sc.Paris、
ｔ、283（November29、1976）、Series Ｄ−1605
およびNature 266、55（March3、1977）に開示さ
れている。このノナペプチドの構造はGLX−
ALA−LYS−SER−GLN−GLY−GLY−SER
−ASNとして確認され、ここで“GLX”はグル
タミンまたはピログルタミン酸を表わす。GLX
がグルタミンまたはピログルタミン酸である物質
は合成された。これらの論文において、Bachが
開示しているように、彼のノナペプチドFTSは
Ｅロゼツテ検定の使用によりＴ細胞（Ｂ細胞では
ない）を選択的に分化した。Bachは、したがつ
て、彼の物質が胸腺のホルモンであると結論し
た。最近、本出願によるこのノナペプチドの活性
のいつそう完全な研究によりFTSはＴ細胞およ
びＢ細胞の両方を分化し、それ故、その活性がサ
イモポイエチン（thymopoeitin）よりもユビク
イチン（ubiquitin）にいつそう似ていることが
明らかにされた。Brand、Gilmourおよび
Goldstein、Nature、269：597（1977）。 このFTSノナペプチドの合成した４−アミノ
酸ポリペプチドセグメントは上の刊行物中に考察
されたノナペプチドの特性の多くを有することが
ここでわかつた。 したがつて本発明の１つの目的は、生物学的に
重要である新規なポリペプチドを提供することで
ある。 本発明のほかの目的は、Ｔ−リンパ球ならびに
Ｂ−リンパ球の両方の分化を誘発する能力をも
ち、それ故、人間および動物の免疫系において高
度に有用である新規なポリペプチドを提供するこ
とである。 主題のポリペプチドは、次の一般式で記載でき
る： ．Ｒ−Ｘ−LYS−Ｙ−GLN−R′ ここでＸおよびＹは前述のとおりであり、そし
てＲはＨ、GLNもしくはSARであり；そして
R′はOHもしくはNH₂であり、そしてペプチドセ
グメントは、前述のように、活性なアミノ酸セグ
メントの生物学的活性に実質的に影響を及ぼさな
い。活性なテトラセグメントはBachにより単離
された天然に産出する物質中のいつそう長い序列
内に含有されるので、末端アミノ基および末端カ
ルボン酸基は、いくつかのポリペプチドの場合の
ように、テトラペプチドセグメントの生物学的活
性について必須ではないと理解すべきである。。
したがつて、本発明の範囲はそれぞれＨおよび
OHで置換されたテトラペプチドセグメントばか
りでなく、かつまたここに開示する生物学的活性
に影響を及ぼさない１または２以上の他の官能基
で末端が置換されたものを包含すると考えられ
る。しかしBachらが記載したノナペプチドは本
発明の範囲から特別に排除されると、明りように
解される。 この説明から、これらの官能基は遊離アミノ基
上のアシル化および遊離カルボン酸基上のアミド
化のような普通の置換、ならびに追加のアミノ酸
およびポリペプチドの置換を包含すると解されよ
う。これらの観点において、本発明のポリペプチ
ドセグメントは、活性テトラペプチドセグメント
が一部分を形成する天然のノナペプチドと同じ生
物学的活性を示すので、高度に異常と思われる。
したがつてこの分子の要件はその立体化学、すな
わちこの分子の特別の「折り重なり」によつて発
生すると信じられる。これに関して、ポリペプチ
ド結合は剛性ではなくて柔軟であり、そしてポリ
ペプチドはシート、らせんなどとして存在できる
と理解すべきである。結局、全分子は柔軟であ
り、ある方法で折り重なるであろう。本発明にお
いて、新規なテトラペプチドセグメントは多分天
然のノナペプチド中の対応するテトラセグメント
と同様な方法で、同じ生物学的特性を示すよう
に、「折り重なる」であろうことが発見された。
この理由で、テトラペプチドセグメントは、置換
基が生物学的活性に実質的に影響を及ぼさない
か、あるいは分子の自然の「折り重なり」を妨害
しないかぎり、種々の官能基で末端が置換される
ことができる。 この分子の生物学的活性および天然の折り重ね
を保持するための能力は、本発明のテトラペプチ
ドセグメントが上に開示した論文中でJ.F.Bach
によりFTSとして開示された天然の９−アミノ
酸ペプチドと同じ生物学的活性を示すという事実
によつて、明らかに例証される。このノナペプチ
ドにおいて、本発明の１つのテトラペプチド序列
は、分子内であるが、ここに記載する他のアミノ
酸との組み合せでのみ確認できる。本発明のテト
ラペプチドセグメントはノナペプチドFTSと同
じ生物学的活性を提供するので、テトラペプチド
セグメントの末端アミノ酸残基上のアミノ酸およ
びペプチド鎖はその生物学的特性に影響を及ぼさ
ないことが明らかである。 したがつて式中のＲおよびR′は次の置換基
を表わすものである。 Ｒ R′ 水 素 OH GLN NH₂ SAR 本発明の１つの好ましい態様は、ＸがＬ−アラ
ニル、ＹがＬ−セリル、Ｒが水素、そしてR′が
OHであるときである。この好ましい態様は化学
的に次のように記号化できる： 第２の好ましい態様はＸおよびＹがおのおのサ
ルコシル、Ｄ−アラニル、およびＹはさらに２−
メチルアラニルからなる群より選ばれるものであ
る；いつそう好ましい態様はＸがサルコシル、Ｙ
がサルコシルまたはＤ−アラニル、Ｒが水素、そ
してR′がNH₂であるものである。 また本発明の範囲内にはポリペプチドの製薬上
許容される塩が包含される。ポリペプチドと塩を
形成できる酸として、次の酸を例として述べるこ
とができる：無機酸、たとえば、塩酸、臭化水素
酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン
酸など、および有機酸、ギ酸、酢酸、プロピオン
酸、グリコール酸、乳酸、ピルビル酸、シユウ
酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル
酸、アントラニル酸、クエン酸、ナフタレンスル
ホン酸またはスルフアニル酸などである。 本発明を通じて、ペプチドのアミノ酸成分は便
利なように略号で表示される。これらの略号は次
のとおりである。Ｄ−アミノ酸は略号の前に
「Ｄ」を位置させることによつて指示され、たと
えば、Ｄ−アラニンは「Ｄ−ALA」で表わされ
る。 アミノ酸 略号の標示 Ｌ−アラニン ALA Ｌ−アスパラギン酸 ASP Ｌ−アスパラギン ASN Ｌ−セリン SER Ｌ−グルタミン酸 GLU Ｌ−グルタミン GLN Ｌ−ロイシン LEU Ｌ−リシン LYS Ｌ−スレオニン THR グリシン GLY Ｌ−バリン VAL サルコシン SAR ２−メチルアラニン ２−Me−ALA 本発明のポリペプチドは４−アミノ酸ペプチド
類（およびそれらの置換された誘導体）であり、
これらは上に参照したBachらの論文に開示され
ているように牛の血液から単離された９−アミノ
酸ポリペプチドFTSに類似する特性を示すこと
がわかつた。本発明のペプチドはＴ−前駆物質細
胞ならびにＢ−前駆物質細胞の分化を誘発する能
力において特別に特徴づけられる。主題のポリペ
プチドのあるものは、後述するニワトリの誘発検
定において１ピコグラム（ｐｇ）／ml程度に低い
濃度において活性である。 本発明のポリペプチドはBachにより開示され
たノナペプチドと同じ方法で試験管内のインミユ
ノサイト（immunocyte）前駆物質細胞の分化を
誘発することがわかつた。こうして本発明のポリ
ペプチドは、胸腺分化抗原Th−１の獲得によつ
て測定されるようなＴ−前駆物質細胞、ならびに
分化抗原Bu−１の獲得によつて測定されるよう
なＢ−前駆物質細胞の両方の分化を誘発すること
がわかつた。換言すると、主題のポリペプチドは
Th−1⁺T−リンパ球およびBu−1⁺B−リンパ球
の両方の分化を誘発する能力を有する。 また、主題のポリペプチドは同種移植抗原によ
り刺激すると細胞毒性リンパ球を生体内で生産す
る能力を増加することがわかつた。すなわち、主
題のポリペプチドを、たとえば、ラツトに投与す
ると、ラツトの脾細胞の試験管内検定によつて測
定して細胞毒性リンパ球前駆物質の生産を促進す
る。細胞毒性リンパ球の発生は同種移植片対宿主
反応における移植片の拒否の程度に直接に対応す
るので、上の発見は主題のポリペプチドの免疫学
的利用をさらに裏付ける。 本発明のポリペプチドの分化生物学的特性の重
要性の理解を提供するため、免疫に関係する胸腺
の機能は広義には、Ｔ細胞と呼ばれる、胸腺誘導
細胞またはリンパ球の生産であると述べることが
できることに注意すべきである。Ｔ細胞は再循環
する小型リンパ球のプールの大きな比率を形成す
る。Ｔ細胞は免疫学的に特異性をもち、細胞が中
介する免疫応答（たとえば、同種移植片の応答）
において奏効細胞として直接に含まれる。しかし
Ｔ細胞は体液性抗体を分泌しない。これらの抗体
は胸腺の影響に独立に骨髄から直接に誘導された
細胞（Ｂ細胞という）によつて分泌されない。し
かし、多くの抗原に対して、Ｂ細胞はそれらが抗
体を生産する前に適当な反応性Ｔ細胞の存在を要
求する。この細胞協同法の機構は、また完全には
理解されていない。 この説明から、作動的関係において、胸腺は細
胞の免疫の発現に必要であり、そして多くの体液
抗体は応答し、そして胸腺内でヘモポイエチン幹
細胞のＴ細胞への分化を誘発することによりこれ
らの系に影響を及ぼすということができる。この
誘発の影響は胸腺の上皮細胞の分泌、すなわち、
胸腺ホルモンにより中介される。 さらに、胸腺の作動およびリンパ球の細胞系を
理解するため、幹細胞は骨髄中に生じ、血液流に
より胸腺に到着することを指摘すべきであろう。
胸腺内で、幹細胞は免疫的に十分なＴ細胞に分化
されるようになり、Ｔ細胞は血液流へ移動し、そ
してＢ細胞と一緒に組織、リンパおよび血液流の
間を循環する。 抗体（Ｂ細胞）を分泌する体の細胞はまたヘモ
ポイエチン幹細胞から発現するが、それらの分化
は胸腺によつて決定されない。鳥類において、そ
れらは胸腺に類似する器官、いわゆるザ・バー
サ・オブ・フアブリシウス（the Bursa of
Fabricius）中で分化される。ホ乳類において、
同等な器官は発見されてきておらず、そしてこれ
らの細胞は骨髄内で分化すると考えられる。それ
故、それらは骨髄誘導細胞またはＢ細胞と名付け
られる。この分化をなす生理学的物質は完全に知
られていない状態である。 上に指摘したように、本発明のポリペプチドは
人間および動物の処理において治療的に有用であ
る。新規なポリペプチドはヘモポイエチン組織に
由来するリンパ造成幹細胞の、本体の免疫応答に
かかり合うことができる胸腺誘導リンパ球（Ｔ細
胞）および免疫適応Ｂ細胞の両方へ、の分化を誘
発する能力をもつので、本発明の生成物は多数の
治療的用途をもつと考えられる。第１に、この化
合物は胸腺の示した機能のいくつかを実施する能
力をもつので、種々の胸腺の機能および免疫の分
野における応用をもつ。応用の第１分野はデイジ
ヨウジ・シンドローム（DiGeorge Syndrome）、
すなわち胸腺の先天的不存在である状態の処置で
ある。以下にさらに記載するように、主題のポリ
ペプチドの１種を注射すると、この欠乏を克服す
るであろう。他の応用は、体の推定Ｂ細胞分化ホ
ルモンの欠乏である、無ガンマグロブリン血症に
おいてである。主題のポリペプチドの１種の注射
はこの欠乏を克服するであろう。主題のポリペプ
チドは低濃度においてきわめて活性であるので、
細胞の免疫および体液免疫の治療的刺激を増加す
ることにおいて体の集合的免疫を増進するのに有
用であり、これにより生体内の慢性感染を含む病
気、たとえば菌またはマイコプラスマの感染、結
核、らい、急性および慢性のウイルスの感染など
の処置に有用である。さらに、主題のペプチド
は、細胞または体液の免疫が打膿である領域、と
くに前述のDiGeorge Syndromeのような免疫に
おける欠乏である場合に有用であると考えられ
る。さらに、ポリペプチドはその特性のためＴ細
胞の表面抗原の発現の誘発、ミトゲン
（mitogen）および抗原への応答性、および抗体
を生成するＢ細胞の能力を高める細胞分裂性を達
成する機能的能力の発現の誘発において試験管内
で有用である。それらは補体のための表面受体の
発現によつて測定されるように、Ｂ細胞の発現の
誘発において試験管内で有用である。主題のペプ
チドはまたユビキニンに応答性であるリンパ球の
無制御の増殖の抑制（出願人の米国特許第
4002602に記載される）において有用である。主
題のポリペプチドの重要な特性は、Ｔ細胞の特性
をもつ細胞を回復する生体内能力、およびさらに
Ｂ細胞の特性をもつ細胞を回復する生体内能力で
ある。したがつてそれらは相対的または絶対的Ｂ
細胞の欠乏ならびに相対的または絶対的Ｔ細胞の
欠乏の処置に有用であり、そしてこれらの欠乏は
それぞれＢ細胞または胸腺を分化する組織の欠乏
のため、または他の原因のためであるかどうかに
は無関係である。 本発明のポリペプチドのほかの重要な特性は、
それらが非常に低い濃度で活性であるということ
である。すなわち、ポリペプチドは一般に約1n
ｇ／mlの濃度で活性であるが、ある著しく効力の
あるポリペプチド（Ｈ−SAR−LYS−Ｄ−ALA
−GLN−NH₂およびＨ−SAR−LYS−SAR−
GLN−NH₂）は約0.1pｇ／mlからの範囲の濃度
で活性である。担体は標準の食塩溶液を含むよく
知られた担体の任意のものであることができ、好
ましくはこれらの低濃度においてガラス器具への
吸着損失を防ぐ牛の血清アルブミンのようなタン
パク質希釈剤である。本発明のポリペプチドは一
般に約1μｇ／Kg体重以上の範囲において活性で
あるが、ある著しく効力のあるポリペプチドは約
1nｇ／Kg体重から活性である。DiGeorge
Syndromeの処置に対して、ポリペプチドは約１
〜約100μｇ／Kg体重の割合で投与できるが、著
しく効力のあるポリペプチドは約１〜約100n
ｇ／Kg体重の割合で投与できる。一般に、投与量
の同じ範囲を述べた他の状態または病気に使用で
きる。上の考察は非経口投与に関して与えたが、
経口投与は注射より一般に約100〜1000倍の高い
投与範囲においてまた可能である。 本発明のポリペプチドは、Journal of
American Chemical Society、85、pp2149−
2154、1963にMerrifieldが報告しているものに類
似する考えを用いて製造された。合成は保護され
たアミノ酸の、共有結合により固体樹脂粒子へ結
合した生長するペプチド鎖への、段階的付加を含
んだ。この方法により、試薬および副生物を過
により除去し、そして中間体の再結晶は排除し
た。この方法の一般的考えは、連鎖のＣ末端アミ
ノ酸の共有結合による固体重合体への結合、およ
び望む序列が組成されるまでの段階的方法におけ
る１度に１回の連続するアミノ酸の添加に依存す
る。最後に、ペプチドを固体支持体から除去し、
そして保護基を除去する。この方法は完全に固体
の粒子へ結合した生長しつつあるペプチド鎖を提
供するので、それは過しかつ試薬と副生物を洗
浄除去するのに都合のよい形態である。 アミノ酸は反応しない試薬から単に分離容易で
なくてはならないいかなる適当な重合体にも結合
できる。重合体は使用する溶媒に不溶性であるこ
とができ、あるいはある種の溶媒に可溶性であり
かつ他の溶媒に不溶性であることができる。重合
体は過を容易とする安定な物理的形態をもつべ
きである。それは第１の保護されたアミノ酸が共
有結合によりかたく結合できる官能基を含有しな
くてはならない。この目的に適当な種々な重合体
の例はセルロース、ポリビニルアルコール、ポリ
メタクリレートおよびスルホン化ポリスチレンで
あるが、本発明の合成において、一般にスチレン
とジビニルベンゼンとのクロロメチル化コポリマ
ーを使用した。有機溶媒中に可溶性であるが、水
性溶媒に不溶性の重合体を使用することもでき
る。１つのこのような重合体は塩化メチレンに可
溶性であるが、水に不溶性である、分子量が約
20000であるポリエチレン／グリコールである。
ペプチド合成におけるこの重合体の使用はF.
BayerおよびM.Mutter、Nature237、512（1972）
およびその中な含まれる参考文献に記載されてい
る。 活性であるが、反応にあずからなかつたアミノ
酸上の種々の官能基を、ポリペプチド分野で使用
される普通の保護基で反応中保護した。このよう
にリシン上の官能基を、ポリペプチド最終生成物
に悪影響を及ぼさないで序列の完成のとき除去で
きる保護基によつて保護した。合成において、ケ
イ光アミンを使用して、結合が完結したかどうか
を積極的なケイ光の指示によつて決定した（参
照、Felix、et al.、Analyt、Biochem.、52、
377、1973）。完全な結合が指示されなかつた場
合、結合を脱保護前に同じ保護したアミノ酸を用
いて反復した。 Ｃ−末端アミノ酸は重合体への種々のよく知ら
れた方法で結合できる。ハロメチル樹脂への結合
法の要約はHoriki、et al.、Chem Letters、
pp165−168（1978）およびGisin、Helv.Chim.
Acta、56、1476（1973）およびその中に記載され
ている参考文献中に記載されている。 一般的方法は、そのアミノ基が保護されたＬ−
グルタミンを、アミン含有無水アルコール中の樹
脂へ初めエステル化することを含んだ。結合した
アミノ酸樹脂を次に過し、アルコールおよび水
で洗い、乾燥した。グルタミンアミノ酸のα−ア
ミノ基上の保護基（たとえば、ｔ−BOC、すな
わち、ｔ−ブチルオキシカルボニル）を次に除去
する。遊離アミノ基をもつ生ずる結合したアミノ
酸樹脂を次に保護したＬ−セリン、好ましくはア
ルフア−ｔ−BOC−Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン
と反応させてこのＬ−セリンを結合する。反応を
次に完全な分子が製造されるまで、保護したＬ−
リシンおよびＬ−アラニンを用いて反復した。実
施した反応の順序は、次のとおりであつた： 【表】 ↓
【表】 ↓
H−Ala−Lys−Ser−Gln−OH
上の反応の順序において、R₁はα−アミノ基
の保護基であり、そしてR₂およびR₃はそれぞれ
Ｌ−セリンおよびＬ−リシンの反応性側鎖上の保
護基であり、これらはR₁が除去されてさらに反
応が行われるとき影響を受けないか、または除去
されない。好ましくは、上の中間体のペンタペプ
チド樹脂において、R₁は保護基、たとえば、ｔ
−ブチルオキシカルボニルを意味し、R₂はベン
ジルまたは置換されたベンジル（たとえば、４−
クロロベンジル）を意味し、そしてR₃は置換さ
れたベンジルオキシカルボニル（たとえば、２，
６−ジクロロベンジルオキシカルボニル）を意味
する。この樹脂はこの方法において有用であるの
で、前述の樹脂の任意のものである。 最終の中間体を製造した後、ペプチド樹脂は分
裂させてその上のR₁、R₂およびR₃保護基と樹脂
を除去する。保護基は普通の手段、たとえば無水
フツ化水素を用いる処理により除去し、生ずる遊
離ペプチドを次に回収する。 上に指摘したように、この方法の実施におい
て、反応を制御しかつ望む生成物を得るためには
アミノ基を保護またはブロツクすることが必要で
ある。有効に用いることができる適当なアミノ保
護基の例は強く塩基性のアミノ基を保護するため
の塩の形成、またはウレタン保護置換基、たとえ
ば、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニルおよ
びｔ−ブチルオキシカルボニルである。分子のカ
ルボキシル末端で反応を行うアミノ基中のα−ア
ミノ基を保護するためにはｔ−ブチルオキシカル
ボニル（BOC）またはｔ−アミルオキシカルボ
ニル（AOC）を使用することが好ましい。なぜ
ならBOCおよびAOC（ｔ−アミルオキシカルボニ
ル）保護基はこのような反応に引き続いてかつ後
続する工程（このようなアミノ基自体が反応を行
う）前に比較的おだやかな酸（たとえば、トリフ
ルオロ酢酸）の作用により容易に除去され、この
処理は他の反応性側鎖を保護するために使用した
基に他の方法で影響を及ぼさない。このように、
後続する反応のためにアミノ基を保護するが、後
に分子に他の方法で影響を及ぼさない条件下で除
去できる任意の物質との反応によつて、α−アミ
ノ基は保護されうる。このような物質の例は、ア
ミノ基をアシル化する有機カルボン酸誘導体であ
る。 一般に、アミノ基はいずれも、 （式中R₄はアミノ基が後続する結合反応にあず
かるのを防ぎ、かつ分子を分解せずに除去できる
任意の基である）の基を含有する化合物との反応
によつて保護できる。このようにR₄は不飽和で
あることができ、好ましくは１〜10炭素原子をも
ち、そして好ましくはハロ−またはシアノ−置換
された直鎖または分枝鎖のアルキル；アリール、
好ましくは６〜15炭素のアリール；シクロアルキ
ル、好ましくは５〜８炭素原子のシクロアルキ
ル；アルカリール、好ましくは７〜18炭素原子の
アルカリール；または複素環式基、たとえば、イ
ソニコチニルである。アリール、アラルキルおよ
びアルカリールの部分はまたさらに１または２以
上の１〜約４炭素原子のアルキル基で置換される
ことができる。Ｒについて好ましい基の例は、ｔ
−ブチル、ｔ−アミル、トリル、キシリルおよび
ベンジルである。高度に好ましい特定のアミノ保
護基の例は、次のとおりである：ベンジルオキシ
カルボニル；置換されたベンジルオキシカルボニ
ル、ここでフエニル環は１または２以上のハロゲ
ン、たとえばClまたはBrで置換されている；ニ
トロ；低級アルコキシ、たとえばメトキシ；低級
アルキル；ｔ−ブチルオキシカルボニル、ｔ−ア
ミルオキシカルボニル；シクロヘキシルオキシカ
ルボニル；ビニルオキシカルボニル；アダマンチ
ルオキシカルボニル；ビフエニルイソプロポキシ
カルボニルなど。使用できる他の保護基の例はイ
ソニコチニルオキシカルボニル、フタロイル、ｐ
−トリルスルホニル、ホルミルなど。 本発明の一般法の実施において、ペプチドは遊
離α−アミノ基と保護されたアミノ基を有する化
合物との反応によつてつくられる。反応または結
合のため、攻撃される化合物をそのカルボキシル
基において活性化し、その結果カルボキシル基が
次に結合したペプチド鎖上の遊離アミノ基と反応
できるようにする。活性化を実現するためには、
カルボキシル基を任意の反応性基、たとえば、エ
ステル、無水物、アジド、酸塩化物などに変える
ことができる。別法として、適当な結合試薬を反
応中加えることができる。適当な結合反応は、カ
ルボジイミド（たとえば、ジシクロカーボジイミ
ド）、カルボニルジイミジゾールなどを含めて、
たとえば、Bodanszky、et al.−Peptide
Synthesis、Interscience、第２版、1976、節５に
開示されている。 これらの反応中、アミノ酸部分はアミノ基とカ
ルボキシル基の両方を含有し、通常一方の基は反
応にあずかるが、他方は保護される。結合工程前
に、攻撃されたペプチドのアルフアまたは末端ア
ミノ基上の保護基は他の保護基、たとえばリシン
分子のエプシロン−アミノ上の基に実質的に影響
を及ぼさない条件下で除去される。この工程を実
施する好ましい方法は、室温においてトリフルオ
ロ酢酸との反応によるような、おだやかなアシド
リシスである。 理解できるように、前述の一連の工程は次のよ
うな式のテトラペプチドを生ずる： ．Ｈ−ALA−LYS−SER−GLN−OH このテトラペプチドは生物学的活性に必要な本
発明の１つのテトラペプチドセグメントを含有す
る。Ｌ−アラニルおよびＬ−セリルの一方または
両方のための天然または非天然のアミノ酸残基の
置換は、アラニンおよびセリンの一方または両方
を上の合成図解において適当に保護された天然ま
たは非天然のアミノ酸で置換し、このようにして
次の式のテトラペプチドを生成することによつて
実施できる： A.H−Ｘ−LYS−Ｙ−GLN−OH ここでＸおよびＹは前記のとおりである。末端
アミノ酸基がさらに前記のように置換されること
ができる、式の置換テトラペプチドを、次に式
（Ａ）のテトラペプチドまたは保護されたペプ
チド樹脂前駆物質を適当な試薬と反応させて望む
誘導体を製造することによつて製造できる。この
タイプの反応、たとえば、アシル化、エステル
化、アミド化などはもちろん技術的によく知られ
ている。さらに、他のアミノ酸、すなわち、テト
ラペプチド序列の生物学的活性に影響を及ぼさな
いアミノ酸基は、テトラペプチド自体が合成され
た同じ反応順序によりペプチド鎖のいずれかの末
端にも付加できる。さらになお、アラニンまたは
セリンの部分の一方または両方の置換は、未置換
のテトラペプチドを合成した先行する反応順序に
おいてアラニンまたはセリンの代わりに望む置換
基（適当に保護された）を用いることによつて達
成できる。 Merrifieldの固相技術を用いて主題ポリペプチ
ドを製造したが、たとえば、M.Bodanszkyおよ
びM.A.Ondetti、Peptide Synthesis、
Interscience、1966に記載された古典的技術を用
いることもできることが明らかに考えられる。 主題のペプチドの確認および純度は、薄層クロ
マトグラフイー、電気泳動、アミノ酸分析などの
ようなよく知られた方法によつて決定した。 次の実施例により本発明を説明するが、これら
によつて本発明は限定されない。これらの実施例
および明細書を通じて、部は特記しないかぎり重
量による。 実施例 本発明のポリペプチドの製造において、次の物
質を商業的に入手した： アルフア−BOC−Ｌ−グルタミン−ｏ−ニト
ロフエニル−エステル アルフア−BOC−ε−２−クロロ−ベンジル
オキシカルボニル−Ｌ−リシン アルフア−BOC−Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン アルフア−BOC−Ｌ−アラニン。 これらの試薬において、BOCはｔ−ブチルオ
キシカルボニルである。アミノ酸序列の定量のた
めの“セクエナル（Sequenal）”級試薬、ジシク
ロヘキシルカーボジイミド、ケイ光アミン
（fluorescamine）、および樹脂をまた商業的に入
手した。使用した樹脂は１％のジビニルベンゼン
と樹脂１ｇ当り0.75ミリモルの塩化物を含有す
る、200〜400メツシユの大きさのポリスチレンジ
ビニルベンゼン樹脂であつた。 ポリペプチドの製造において、２ミリモルのα
−BOC−Ｌ−グルタミンを、１ミリモルのトリ
エチルアミンを含有する無水アルコール中で２ミ
リモルのクロロメチル化樹脂へ80℃で24時間エス
テル化した。生ずるアミノ酸樹脂エステルを過
し、無水アルコールで洗い、乾燥した。その後、
他方のアミノ酸を同様に正しい序列でペプチド樹
脂の脱保護α−アミノ基へ当量のジシクロヘキシ
ルカーボジイミドを用いて結合して本発明のポリ
ペプチドを生成した。各結合後、樹脂のアリコー
トをケイ光アミンで試験し、正のケイ光が見出さ
れた場合、結合は不完全であるとして、同じ保護
アミノ酸を用いて反復した。いくつかの結合反応
の結果、中間のテトラペプチド−樹脂を製造し
た。 このペプチド−樹脂１ｇ当りスキヤベンジヤー
として1.2mlのアニソールとともに無水フツ化水
素を０℃で60分間用いてKel−Ｆ分裂装置
（Peninsula Laboratories、Inc.）中で、このペ
プチド−樹脂を分裂しかつ保護基を除去した。ペ
プチド混合物を無水エステルで洗い、そして水性
酸で抽出する。抽出液を凍結乾燥し、そしてペプ
チドを1N酢酸中Ｐ−6Bio−Gelのクロマトグラ
フイーに付した。生ずるポリペプチドは94％の純
度であると定量され、そして次の序列を有すると
決定された： Ｈ−ALA−LYS−SER−GLN−OH 確認のため、薄層クロマトグラフイーおよび電
気泳動を次のように行つた。 薄層クロマトグラフイーを30μｇの試料につい
てシリカゲル（ケイ光指示薬を有するBrinkman
Silica Gel、20×20cm、0.1mm厚さ）で次の溶離液
を用いて行なつた。 R_f ¹：ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水；
30：15：３：12 R_f ²：酢酸エチル：ピリジン：酢酸：水；５：
５：１：３ R_f ³：酢酸エチル：ｎ−ブタノール：酢酸：水；
１：１：１：１。 電気泳動を100μｇの試料についてワツトマン
（Whatman）の３mmの紙（11.5×56.5cm）上でPH
5.6のピリジン−酢酸塩の緩衝溶液および1000ボ
ルトの電位を１時間用いて行つた。 薄層クロマトグラフイーと電気泳動の両方につ
いての噴霧試薬はパウリイ（Pauly）およびニン
ヒドリン（Ninhydrin）であつた。 次の結果が得られた：R_f ¹＝不動、R_f ²＝不動、
およびR_f ³＝0.336。電気泳動は陰極に向かう9.4cm
の移動を生じた。 試験例 実施例で製造したテトラペプチドの活性と特
性を決定するため、次のニワトリの誘発検定を用
いた。この検定はBrand、et al.Science、193、
319−321（July23、1976）およびその中に含まれ
る参考文献にいつそう詳細に記載されている。 新らしく卵からかえつたニワトリの骨髄を誘発
可能な細胞源として選んだ。なぜならそれは感知
しうる程度の数のBu−1⁺またはTh−1⁺の細胞を
欠いているからである。系統SC（Hy−Line）の
５匹の新らしく卵からかえつたニワトリの大腿骨
および脛骨足根骨からプールした細胞を、超遠心
により５層の不連続の牛の血清アルブミン
（BSA）こう配上に分別した。２つの軽い層から
の細胞を合わせ、洗い、培養のため５×10⁶細
胞／mlの濃度でRPMI1630培地中の適当濃度の試
験ポリペプチドとともにけん濁した。この培地に
は15ミリモルのヘープス（hepes）、５％のγ−
グロブリン不含胎児牛の血清、デオキシリボヌク
レアーゼ（14〜18単位／ml）、ヘパリン（５単
位／ml）、ペニシリン（100単位／ml）およびスト
レプトマイシン（100μｇ／ml）が補足されてい
た。対照はBSA（1μｇ／ml）とともにまたは培地
単独で培養した。培養後、細胞を参照論文に記載
されているようにニワトリC1およびモルモツト
C2〜C9補体分屑を用いて細胞毒の検定において
試験した。各層中のBu−1⁺またはTh−1⁺細胞の
比率を細胞毒指数、100（ａ−ｂ）／ａ（ここでａ
およびｂはそれぞれ補体対照および試験配合物中
の生きている細胞の百分率である）として計算し
た。誘発された細胞の百分率は、誘発剤（通常１
〜３％）を含まない対照培養物における平均値を
試験培養物における平均値から減ずることによつ
て得た。 試験ポリペプチドの作用の特異性およびユビク
イチン（ubiquitin）に対するその類似性は、ユ
ビクイチンを100μｇ／ml濃度で添加したとき試
験ポリペプチドによるBu−1⁺B細胞およびTh−
1⁺T細胞の誘発によつて証明された。ユビクイチ
ンのこの高い投与量はユビクイチン受体を不活性
化し、こうしてこれらの受体を経て作用する薬剤
による細胞の誘発を防ぐ。 この検定の結果、実施例のテトラペプチドは
Th−1⁺TおよびBu−1⁺Bリンパ球の両方の分化
の誘発においてｎｇ／ml濃度においてユビクイチ
ンの生物学的活性に類似する生物学的活性を示し
たことが発見された。 試験例 Ａ 次の１つを試験ペプチドとして使用し、試験
例の検定を反復した： Ｈ−GLN−ALA−LYS−SER−GLN−OH Ｈ−SAR−ALA−LYS−SER−GLN−OH 各場合において、ユビクイチンの生物学的活
性に類似する生物学的活性が観測された。 Ｂ 次の１つを試験ペプチドとして使用し、試験
例の検定を反復した： Ｈ−SAR−LYS−Ｄ−ALA−GLN−NH₂ Ｈ−SAR−LYS−SAR−GLN−NH₂ Ｈ−Ｄ−ALA−LYS−Ｄ−ALA−GLN−
NH₂ 各場合において、ユビクイチンの生物学的活
性に類似する生物学的活性が観測された。これ
らのポリペプチドの最初のものに対して、この
活性は約1pｇ／ml〜約100pｇ／mlの濃度の範
囲で観測された。第２のポリペプチドに対し
て、活性は0.1pｇ／ml程度に低い濃度で観測さ
れた。 実施例 − 置換ポリペプチドの製造について前述した反応
技術を用いて、次の式をもつポリペプチドを製造
する： Ｒ−Ｘ−LYS−Ｙ−GLN−R′ これらのペプチドアミドはベンズヒドリルアミ
ン樹脂上で技術的に知られた固相合成法によつて
製造した。 【表】 実施例−において製造したポリペプチド
は、活性なポリペプチドセグメントについてここ
に記載したような生物学的活性を保持する。 確認のため、薄層クロマトグラフイーと電気泳
動を次のように実施した。 薄層クロマトグラフイーは20μｇの試料につい
て、シリカゲル（Kieselgel、５×20cm）および
溶離液としてｎ−ブタノール：酢酸：酢酸エチ
ル：水（１：１：１：１の比率）（R_f ¹）と、セル
ロース6064（Eastman、20×20cm）および溶離液
としてｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水
（15：10：３：12の比率）（R_f ²）を用いて実施し
た。 電気泳動は50μｇの試料について、Whatman
No.３の紙（5.7×55cm）上でPH5.6のピリジン−酢
酸塩緩衝溶液および1000ボルトの電位を１時間用
いて実施した。 薄層クロマトグラフイーおよび電気泳動の両方
についての噴霧液はパウリイ（Pauly）およびニ
ンヒドリン（Ninhydrin）であつた。 次の結果が得られた（両方のR_fの値および電
気泳動をＨ−ARG−LYS−ASP−VAL−TYR
−OHに関して与える）： 【表】 実施例１の薄層クロマトグラフイーおよび電気
泳動法に従い、次の結果が実施例の化合物につ
いて得られる：R_f ¹＝（0.155）、R_f ²＝不動、R_f ³＝
0.265および電気泳動の移動は陰極に向かつて
13.1cmである。 実施例 − ポリペプチド連鎖を延長することについて前述
した反応技術を用いて、活性アミノ酸序列を含有
するが、末端アミノ基およびカルボキシル基Ｒお
よびR′で置換されて式 Ｒ−ALA−LYS−SER−GLN−R′ のポリペプチドを提供し、下表に記載するアミノ
酸で置換されたポリペプチドを製造する。 実施例 Ｒ R′ GLN OH SAR OH 実施例−において製造したポリペプチド誘
導体は、活性なポリペプチドセグメントについて
ここに記載したような生物学的活性を保持する。 実施例およびの化合物について実施例の
薄層クロマトグラフイーおよび電気泳動を行う
と、次の結果が得られる： 【表】 試験例 主題のポリペプチドの実用性をさらに例証する
ため、この実施例は同種移植抗原による刺激のと
き生成された細胞毒性リンパ球の度数を推定する
ためのマイクロ培養検定を記載する。対照動物と
種々の濃度の薬物を注射した動物との間の細胞毒
性前駆物質の度数を、限界希釈検定により比較し
た。 材料および方法 マウス インブリード（Inbreed）C57BL／6J（めす、
８週）をジヤクソン研究所（Jackson
Laboratory、Bar Harbor、Maine）から得た。 インブリードDBA／2J（おすまたはめす）をま
たジヤクソン研究所から得た。 培 地 リン酸塩緩衝食塩溶液（PBS）、RPMI1640、
胎児牛の血清（FCS）−（ロツト番号R776116）、
Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−２
−エタンスルホン酸（HEPES）緩衝剤をギボ
（Gibo、Grand Island）から得た；２−メルカプ
トエタノールをイーストマン・コダツク
（Eastman Kodak、Rochester、N.Y.）から得
た。細胞をPBSで洗い、そして10％FCS、10ミ
リモルのHEPES緩衝剤および５×10^-5モルの２
−メルカプトエタノールを含有するRPMI中で培
養した。 薬物の処置 試験動物（C57BL／6J）を0.2mlの体積中の
種々の濃度のＨ−SAR−LYS−SAR−GLN−
NH₂（薬物；標示番号G040）で注射（静脈内また
は腹膜内）１、24時間後それらを検査のため殺し
た。 細胞の調製 C57BL／6JマウスまたはDBA／2Jマウスの脾
からの細胞懸濁液を、器官を細かく切り、それら
を金網（60ゲージ）を通して５c.c.の注射器のプラ
ンジヤーでフアルコンペトリ皿（falcon3002、15
×60mm）中に押し込むことによつて調製した。こ
の細胞懸濁液を室温で静置して、組織の大きい片
を沈降させた。この細胞懸濁液を次に15mlのコー
ニング（Corning）遠心管に移し、ベツクメン
（Beckmen）TJ−６遠心機中で1500RPMにおい
て10分間回転した。すべての細胞懸濁液をPBS
で少なくともさらに３回洗つた。第３回目の洗浄
後、応答体（C57BL／6J）細胞を培地中に再懸
濁し、自動血球計数器（Coulter counter）で計
数した。DBA／2J（刺激体細胞）をRPMI中に
10⁷細胞／mlに再懸濁した。30μｇのマイトマイシ
ンＣをDBA／2J脾細胞の各１mlに加え、この混
合物を37℃で30分間培養した。マイトマイシンＣ
の処置後、脾細胞をPBSで３回洗い、過剰のマ
イトマイシンＣを除去した。DBA細胞を次に培
地中に再懸濁し、自動血球計数器で計数した。 混合リンパ球培養（MLC） MLCをマイクロタイター（microtiter）トレ
ー（Linbro Chemicals、New Haven、Conn.、
IS−MVC−96）中で始めた。各トレーは96−Ｖ
底の溜めを含有した。平板のへりを取り囲む外側
の溜めは細胞の培養に使用しなかつたが、PBS
を満たして培養溜めからの蒸発を避けた。60の試
料を各Ｖ底トレー中で調製した。通常各トレーは
３種の応答体細胞の濃度（おのおのの20の複製）
と１種の刺激細胞の濃度を含有した。応答体細胞
は通常7.5×10⁵、５×10⁵および2.5×10⁵／mlの濃
度に懸濁し、そして0.1mlを各溜めに加えた。使
用した刺激体細胞濃度は10⁶、2.5×10⁶、５×
10⁶／mlであり、また0.1mlを各溜めに加えた。同
じ刺激体細胞濃度を全平板を通して使用した。刺
激体細胞を含まない応答体細胞だけを含有する対
照平板を、また培地による背景刺激を推定するた
め調製した。細胞を５％のCO₂を含有する湿度調
節培養器内で37℃において６日間培養した。 標的赤血球 細胞毒性検定に使用した標的赤血球はDBA肥
満細胞腫細胞ラインP815であつた。この細胞ラ
インをDBA／2Jマウスの普通の通過により維持
した。５×10⁸P815細胞を各通過を使用し、そし
て担体の腹腔からの腫瘍細胞を通過後４〜５日使
用した。腹腔からの腫瘍細胞をPBSで３回洗い、
次に10μci／10⁷細胞の濃度のCr⁵¹で標識した。標
識は湿度調節培養器内で37℃において１時間行つ
た。標識細胞を次にPBSで３回洗つて過剰の標
識物質を除去した。 細胞毒検定 ６日間培養した後、0.1mlの培地を各溜めから、
細胞ペレツトを乱さないようにして、取り出し
た。次に、自動マイクロピペツト（MLAピペツ
ト）を用いて、2.5×10⁴のCr⁵¹で標識した識的赤
血球を含有する100μの標的赤血球を各溜めに
入れ、この方法の間細胞ペレツトを再懸濁した
（新らしいピペツトチツプを各溜めに使用しなけ
ればならない）。マイクロタイタートレーを次に
室温でソーバル（Sorvall）GLC−2B中で
1000RPMにおいて７分間回転した。トレーを次
に37℃で４時間培養した。100マイクロリツター
の上層液を次にガンマ計数管
（Amershen196271）中に取り出した。これらの
管を次にベツクメンガンマカウンター
（Beckmen310）中で計数した。これらの管は通
常１分間計数した。 細胞毒性リンパ球（CLP）の前駆物質の度数の
測定 限界希釈分析はポアソン確率分布により記載し
た全応答または無応答の検定である。無応答の確
率はゼロ次の項P₀＝e^-〓^N（ここでδ＝CLPの度数、
そしてＮ＝溜め当りのリンパ球の数）により与え
られる。このように無応答培地の比率対細胞の投
与量の対数のプロツトは−δのこう配、CLPの
度数をもつ直線を生ずるであろう。 実施例において、刺激体細胞を含有しないちよ
うど応答体細胞を含有する20の溜めからの背景ク
ロムの解放（自発解放）を平均した。試験溜めは
それらの計数が2.07標準偏差より大きく平均自発
生値より大きい場合正と評点をつけた（Ｐ＜
0.05）。自発生細胞溶解は標的赤血球中へ加えた
全計数の通常９〜15％の範囲であつた。ポアソン
の等式P₀＝e^-〓^Nに従い、P₀＝e^-1＝0.37（37％の無
応答培養に相当する）のとき、δ＝１／Ｎ、こう
して37％の無応答培養に相当する応答細胞の数の
逆数がCLPの度数である。通常溜め当りの細胞
の数および無応答百分率のためのそれらの対応す
る値はコンピユーターに入れた。このコンピユー
ターはこれらの点および37％の無応答培養に対応
する溜め当りの細胞の数を通る最適の回帰線を計
算する。その値の逆数はCLPの度数である。 結 果 各刺激体細胞濃度のための細胞毒性リンパ球前
駆物質の度数を、薬物投与量の関数としてプロツ
トした。20復製の平均および標準偏差をまた比較
のため計算した。使用した３種の刺激体細胞濃度
は10⁵（最適以下の刺激）、2.5×10⁵（最適の刺激）
および５×10⁵（最適以上の刺激）であつた。試験
した薬物は最適以下の刺激剤濃度の存在で約1p
ｇ／マウス〜約100nｇ／マウス（約50pｇ／Kg〜
約5μｇ／Kg体重に等しい）の濃度において細胞
毒性リンパ球前駆物質の生成を促進することがわ
かつた。試験薬物はそれ故これらの濃度において
免疫調整剤として作用して処置したマウスの細胞
の免疫応答を増加する。 本発明をある種の好ましい態様について説明し
てきた。しかし、当業者にとつて変更は自明と思
われるので、本発明は前記態様に限定されると考
えてはならない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の序列： Ｒ−Ｘ−LYS−Ｙ−GLN−R′ ここでＸはALA、Ｄ−ALAもしくはSARであ
   り；ＹはSER、Ｄ−ALA、SARもしくは２−
   Me−ALAであり；ＲはＨ、GLNもしくはSAR
   であり；そしてR′はOHもしくはNH₂である、 を有するペプチド。 ２ ＲはＨ、ＸはALA、ＹはSER、そしてR′は
   OHである特許請求の範囲第１項記載のペプチ
   ド。 ３ ＲはＨ、ＸはSAR、ＹはＤ−ALA、そして
   R′はNH₂である特許請求の範囲第１項記載のペ
   プチド。 ４ ＲはＨ、ＸはSAR、ＹはSAR、そしてR′は
   NH₂である特許請求の範囲第１項記載のペプチ
   ド。 ５ ＲはＨ、ＸはＤ−ALA、ＹはＤ−ALA、そ
   してR′はNH₂である特許請求の範囲第１項記載
   のペプチド。 ６ ＲはＨ、ＸはSAR、Ｙは２−Me−ALA、
   そしてR′はNH₂である特許請求の範囲第１項記
   載のペプチド。 ７ ＲはGLN、ＸはALA、ＹはSER、そして
   R′はOHである特許請求の範囲第１項記載のペプ
   チド。 ８ ＲはSAR、ＸはALA、ＹはSER、そして
   R′はOHである特許請求の範囲第１項記載のペプ
   チド。