JPH04193894A - 入尿トリプシンインヒビターの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、人尿トリプシンインヒビターを工業的規模で
実施することかできる精製方法に関する。

〔従来の技術〕

人尿中にトリプシンインヒビターか含有されていること
は知られている。人尿トリプシンインヒビター（以下、
ＵＴＩと略す）は、分子量６８０００、等電点ｐＨ２〜
３の糖タンパク質であり、特にｌ・リプシン、キモトリ
プシン、プラスミンなどを阻害する（須見ら、日本生理
誌、３９．５３（１９７７））ことから、抗炎症剤とし
て臨床応用されている。

例えば、純度９９％以上、比活性２５００単位／Ｉｍｇ
以上、エンドトキシン濃度２０ｐｇ／　ｌ−リプシンイ
ンヒビター１ｍｇ以下のＵＴＩが抗炎症剤として使用さ
れている。

ところで、大量の尿から工業的規模でＵＴＩを回収、精
製するには（Ｉ）高純度の［ＪＴｒを得る、（ＩＩ）操
作が簡便である、（ＩＩＩ）効率がよい、（ＩＶ）再現
性がよい、（Ｖ）分解・失活がない等が要求されている
。

ＵＴｌの精製方法としては、多くは電気泳動をはじめと
する実験室的手法を精製工程中に組み込んだ方法が知ら
れているのみで、これらは小量規模の精製方法でしかな
い。従来の方法として例えば、メタノール沈澱、固定化
トリプシンアフィニティークロマトグラフィー、調製用
電気泳動を組み合わせた方法（Ｂ、Ｊ、Ｂｒｏｍｋｅ　
ｅｔ、ａｌ、　；　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｍｅｄ。

２７．５６（１９８２））　、過塩素酸処理、固定化ト
リプシンアフィニティークロマトグラフィー、等電点電
気泳動、ゲル濾過を組み合わせた方法（Ｅｎｚｙｍｅ　
：３５、２２５（１９８６り等か報告されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明者らは、人尿中に存在する［ＪＴＩを工業的規模
でかつ上記医薬用としての純度を有するまで容易に高純
度化する新規方法について鋭意研究を重ねた結果、本発
明を完成した。

〔課題を解決するための手段］ すなわち、本発明は以下を要旨とするものである。

１、　下記の工程からなることを特徴とする人尿トリプ
シンインヒビターの精製方法。

第１工程：尿を濃縮または吸着剤で回収・濃縮して尿原
液を得る工程 第２工程：第１工程で得られた尿原液を陰イオン交換体
に酸性条件下で吸着させた後に 、塩濃度を高くしてその吸着物質を溶 出させる工程 第３工程：第２工程で得られた溶液を疎水クロマト担体
に高塩濃度の条件下で吸着させ た後に、塩濃度を低くしてその吸着物 質を溶出させる工程 第４工程：第３工程で得られた溶液を逆相クロマト担体
に吸着させた後、溶離液の極性 を低くしてその吸着物質を溶出させる 工程 ２、　第１工程で得られた尿原液に亜鉛、カルシウム、
銅、バリウム、およびアルミニウムの金属塩から選ばれ
た少なくとも１種以上の金属塩を添加した後、生じた沈
澱を除去することを特徴とするｌ記載の人尿トリプシン
インヒビターの精製方法。

以下、さらに本発明について詳しく説明する。

まず、請求項１の発明について説明すると、この発明は
、大量の尿から工業的規模で医薬品に適する高純度のＵ
Ｔ［を得るための精製方法であって、上記した第１工程
から第４工程までの工程から成るものである。

以下、工程別に説明する。

この工程は、大量の尿からＵＴＩを抽出する際、濃縮ま
たは吸着剤による回収・濃縮を行うものである。その−
数的な手段としては限外濾過濃縮および水酸化アルミニ
ウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、カオリン、シリカ
ゲル、イオン交換樹脂、キトサン等の吸着剤による方法
が例示される。限外濾過濃縮の場合は、方式等は特に限
定されない。

また、吸着剤による回収・濃縮の場合も、ＵＴＩが吸着
されるものであればその種類は特に限定されないが、そ
れぞれの吸着剤の添加量、添加条件、吸着剤からの溶出
条件などを吟味する必要がある。

例えば、水酸化アルミニウムゲル（キヨーワード２００
Ｂ　：協和化学工業（株）製）の場合は、尿を酢酸など
によりｐＨを３〜５に調整後０．２５〜２．０％となる
ように添加し、数時間撹拌吸着後、ｐＨ１０〜１２の溶
液で溶出する事によりＵＴＩを回収・濃縮することが可
能である。

さらに、ウィルス除去の目的で尿原液の加熱処理６０〜
６５°Ｃで１０〜１５時間を好ましくは実施する。

出させる工程 この工程は、第１工程で得られた尿原液をｐＨ３〜５の
緩衝液に対して透析し、あらかじめ同緩衝液で平衡化し
た陰イオン交換カラムに吸着させ、十分な洗浄後、塩濃
度を高めてＵＴＩを溶出させることができる。この場合
、陰イオン交換樹脂はジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ
）基、４級化アミノエチル（ＱＡＥ）基を官能基として
有する物が一般的であるが、これらに限定されるもので
はない。透析用およびカラム平衡化用緩衝液には、０．
０５〜０、１５Ｍ程度の塩化ナトリウムを添加しておい
てもよく、ＵＴＩの溶出する塩濃度は好ましくは０．２
５〜０、３５Ｍ塩化ナトリウムである。

この工程は、第２工程で得られた溶出液に、硫酸アンモ
ニウムを１．２〜１．５Ｍとなるように添加して試料を
作製し、あらかじめ同濃度の硫酸アンモニウムを含有す
る緩衝液で平衡化した疎水クロマトグラフィーカラム、
例えば、官能基にフェニル基、オクチル基、ブチル基を
有する担体を充填したカラムに試料を給送しタンパク質
を吸着させ、硫酸アンモニウム濃度を１．０〜０．６５
Ｍに低下させることで溶出される画分をＵＴＩ活性画分
として分取し、他の夾雑タンパク質と分離した。

第２工程と第３工程の実施順序は、逆であっても最終的
な精製結果には何ら影響がなく、任意に選択してもよい
。

工程 この工程は、第３工程で得られた溶液をそのままアルキ
ル基（Ｃ，、Ｃ，、Ｃ４、Ｃ，、Ｃ，８）やシアノプロ
ピル基、フェニル基などの疎水性基を化学的に結合させ
たシリカあるいはポリスチレン樹脂を固定相としだカラ
ム（いわゆる逆相系カラム）に給送し、吸着させカラム
を十分に洗浄した後溶離液（移動相）の極性を低くする
ことでＵＴＩを分画回収するものである。逆相系カラム
は特に限定されず、上記のような様々な官能基、様々な
粒径（３〜１００μｍ）、様々な孔径（１００〜１００
０人）の物が適用可能であるが、一般にタンパク質を扱
う場合は、より孔径の大きい担体でアルキル鎖の比較的
短いものが好ましい。また、粒径は分離能に大きな影響
を及ぼすが、粒径の小さな担体は非常に高価であり工業
的規模での使用には不向きである。本発明に使用する担
体の粒径は、１５〜６０μｍ程度であれば全く問題ない
。このような樹脂として、ベーカーボンドＷＰ−ブチル
（Ｃ４）（１５μｍ　、　４０μｍ　：　Ｊ、Ｔ、Ｂａ
ｋｅｒ社製）が例示されるがこれに制限されるものでは
ない。極性を低下させる溶離剤としては含水有機溶媒が
移動相として用いられ、アセトニトリル、２−プロパツ
ール、メタノール、エタノール等およびこれらの配合溶
媒が主に使用されているが、医薬品を工業的規模で製造
する目的ではエタノールの使用が好ましい。

エタノール濃度は２０〜５０％が適当であり、好ましく
は３０〜４０％である。

以上、上記した第１工程から第４工程までのＵＴＩの精
製方法を実施することにより大量の尿から工業的規模で
医薬品に適する高純度のＵＴＩを得ることができる。

次に、請求項２の発明について説明すると、この発明は
大量の尿から工業的規模で医薬品に適する高純度のＵＴ
Ｉを得るためあ精製方法であって請求項１の改良発明で
ある。

すなわち、請求項Ｉ記載の第１工程の後に、金属塩によ
る処理工程を実施するものである。この工程は、尿原液
中の夾雑タンパク質およびムコ多糖類をはじめとする粘
性物質をＵＴＩの活性損失することなく除去するもので
ある。これにより請求項１記載の第２工程以降において
は、（Ｉ）カラムに対する負荷を軽減し、（ＩＩ）十分
な分離を行うことができる。

この金属塩処理工程は、第１工程で得られた尿原液に亜
鉛、カルシウム、銅、バリウム、アルミニウムの各金属
塩から選ばれた少なくとも一種以上の金属塩を添加した
後、生じた沈澱を除去するものである。この沈澱は、夾
雑タンパク質およびムコ多糖類をはじめとする粘性物質
等である。

添加する金属塩は、亜鉛、カルシウム、銅、バリウム、
アルミニウムの硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、塩化物等が利
用可能であり、添加濃度は１０ｍＭ〜５Ｍ程度であり、
好ましくは、０．１〜１．０Ｍである。添加方法は、特
に限定されないか、添加した金属塩が均一に溶解する条
件か望ましく、４〜８０°Ｃの温度範囲の中で撹拌及び
／又は振とうしつつ添加し、０．５〜２４時間放置する
のが好ましい。

この工程の後に、請求項１記載の第２工程から第４工程
を同様に引き続き実施するものである。

以上、上記した第１工程から第５工程までのｔＪＴｌの
精製方法を実施することにより、大量の尿から工業的規
模でかつ、良好な操作性で、医薬品に適する高純度のＵ
ＴＩを得ることかできる。また本発明の請求項１及び２
の精製方法を実施することにより、医薬品に混入し、体
内に投与されたときに発熱作用を誘発する物質、Ｃ）わ
ゆるパイロジエンの除去も可能である。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例　１ 第１工程 正常人尿１０００　Ａに塩酸を添加し、ｐＨを４．０に
調整して酸処理床を得た。この酸処理床に５Ｋｇの水酸
化アルミニウムゲル（キヨーワード２００Ｂ　；協和化
学工業（株）製）を添加し、室温にて３時間撹拌した。

１時間の静置後、上清と吸着剤をデカンテーションで分
離し、さらに吸引濾過により水で吸着剤を洗浄した。こ
の洗浄吸着剤を１％アンモニア５０Ａで２時間撹拌溶出
を行ない、遠心分離（８０００回転、６０分）により溶
出液を得た。

第２工程 第１工程で得られた尿原液を、６５°Ｃの恒温水槽中で
撹拌下、１０時間加熱処理した。処理後生じた沈澱は、
遠心分離（８５００回転、６０分）により除去した。こ
の溶液を、パイロジエンフリー水で希釈し電気伝導度を
１５ｍｍｈｏに調整し、さらに酢酸でｐＨを４に合わせ
た。５０ｍＭ　ＮａＣ１を含有する０、　１Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ４，０）であらかじめ平衡化しておいた陰イオ
ン交換カラム（ＤＥＡＢ−セルロファインＡ３００、生
化学工業（株）製）（直径５ｃｍ、高さ３０ｃｍ）に給
送し、同バッファーで十分に洗浄した。

０、３Ｍ　ＮａＣ１を含有する０、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ４，０）により溶出される両分を、　ＵＴ［活性画分
として分取した。この両分の活性回収率は８６％であり
、比活性は１５２７０／ｍｇてあった。

第３工程 第２工程で得られた溶液に、硫酸アンモニウムを１．３
Ｍとなるように添加し、これをあらかじめ１．３Ｍ硫酸
アンモニウムを含有する緩衝液で平衡化したフェニルセ
ファロースカラム（ファルマシア社製）（直径２．６ｃ
ｍ′、高さ３０ｃｍ）に給送し、同バッファーで十分に
洗浄した。０．８５Ｍ硫酸アンモニウムを含有する緩衝
液により溶出される両分を、ＵＴＩ活性画分として分取
した。

この両分の活性回収率は９１％であり、比活性は２３８
８Ｕ／ｍｇであった。

第４工程 第３工程て得られた溶液を、あらかじめ２％エタノール
溶液で平衡化したベーカーボンドＷＰ−ブチル（Ｃ４）
　　（４０μｍ　：　Ｊ、Ｔ、Ｂａｋｅｒ社製）充填カ
ラム（直径７ｃｍ　、高さｌ１ｃｍ）に給送し、吸着さ
せた後カラム容積の１０倍量の同エタノール溶液で洗浄
し、さらに３０％エタノール溶液で溶出される画分をＵ
ＴＩ活性画分として分取した。

この両分の活性回収率は８９％であり、比活性は２６４
１０／ｍｇであった。また、エンドトキシン濃度は３、
１ｐｇ／ｍｇ−ＵＴＩであった。純度は、電気泳動法お
よびＨＰＬＣ法により９９％以上と推定された。

実施例　２ 第１工程 正常人尿１０００Ｉ！に塩酸を添加し、ｐＨを４．０に
調整して酸処理床を得た。この酸処理床に５Ｋｇの水酸
化アルミニウムゲル（キョーワード２００Ｂ　；協和化
学工業（株）製）を添加し、室温にて３時間撹拌した。

１時間の静置後、上清と吸着剤をデカンテーションて分
離し、さらに吸引濾過により水で吸着剤を洗浄した。こ
の洗浄吸着剤を１％アンモニア５０Ａで２時間撹拌溶出
を行ない、遠心分離（８０００回転、６０分）により溶
出液を得た。

第２工程 第１工程で得られた尿原液を塩酸で中和後、０．５Ｍと
なるように塩化亜鉛を添加し、室温３時間放置後遠心分
離（８５００回転、６０分）により沈澱を除去した。こ
の塩化亜鉛処理液をペリコンカセット（ミリボア社製）
による限外濾過で５１まで濃縮し亜鉛処理圧原液とした
。

第３工程 第２工程で得られた尿原液を、６５°Ｃの恒温水槽中で
撹拌下、１０時間加熱処理した。処理後再度生じた沈澱
は、遠心分離（８５００回転、６０分）により除去した
。この溶液を、パイロジエンフリー水で希釈し電気伝導
度を１５ｍｍｈＯに調整し、さらに酢酸でｐＨを４に合
わせた。５０ｍＭ　ＮａＣ１を含有する０、１Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ４，０）であらかじめ平衡化しておいた陰イ
オン交換カラム（ＤＥＡＥ−セルロファインＡ３００　
：生化学工業（株）製）（直径５ｃｍ　、高さ３０ｃｍ
）に給送し、同バッファーで十分に洗浄した。

０．３Ｍ　ＮａＣ１を含有するＯ、　１Ｍ酢酸緩衝液（
ｐＨ４，０）により溶出される両分を、ｔＪＴＩ活性画
分として分取した。この画分の活性回収率は８８％であ
り、比活性は１８２９Ｕ／ｍｇてあった。

第４工程 第３工程で得られた溶液に、硫酸アンモニウムを１．３
Ｍとなるように添加し、これをあらかじめ１．３Ｍ硫酸
アンモニウムを含有する緩衝液で平衡化したフェニルセ
ファロースカラム（ファルマシア社製）（直径２．６ｃ
ｍ、高さ３０ｃｍ）に給送し、同バッファーで十分に洗
浄した。０．８５Ｍ硫酸アンモニウムを含有する緩衝液
により溶出される両分を、ＵＴＩ活性画分として分取し
た。

この画分の活性回収率は９３％であり、比活性は２５１
６Ｕ／ｍｇであった。

第５工程 第４工程で得られた溶液を、あらかじめ２％エタノール
溶液で平衡化したべ一カーボンドＷＰ−ブチル（Ｃ４）
　（４０ｕｍ　：　Ｊ、　Ｔ、　Ｂａｋｅｒ社製）充填
カラム（直径７ｃｍ　、高さｌ１ｃｍ）に給送し、吸着
させた後カラム容積の１０倍量の同エタノール溶液で洗
浄し、さらに３０％エタノール溶液で溶出される画分を
ＵＴＩ活性画分として分取した。

この画分の活性回収率は９３％であり、比活性は２７４
９Ｕ／ｍｇであった。また、エンドトキシン濃度はタン
パク質濃度５．３ｍｇ／ｍｌにおいて注射用蒸留水レベ
ル以下であった。純度は、電気泳動法およびＨＰＬＣ法
により９９％以上と推定された。

なお、実施例１．２におけるＵＴＩ活性、タンパク質量
、エンドトキシン濃度、および純度は以下の方法により
測定した。

１、　　ＵＴ［活性：　Ｍｕｒａｍａｔｓｕ等の方法（
Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｏ、虹、　４０２（１９６５））
に準拠し、カゼイン分解決で測定した。

２、　タンパク質：　ＢＣＡ法タンパク質定量キット（
ピアス社製）を用いた。

３、　エンドトキシン濃度ニドキシカラーシステムＬＳ
−１セツトおよびＥｔ−１セツト（エントドキシン標準
液）（生化学工業社製）による比色法エンドトキシン測
定法を用いた。

４、純度検定 電気泳動法：　５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（
５ＤＳ−ＰＡＧＥ）により行い、クマシー・ブリリアン
ト・ブルー（ＣＢＢ）染色後、デンシトメーターにて定
量分析を実施した。

ＨＰＬＣ法ニジリカ系Ｃ４カラム（ＡＰ−８０３−３５
：ＹＭＣ製）を用い、０．１％ＴＦＡ存在下アセトニト
リル溶出系で分離し、ピーク面積の定量分析を実施した
。

〔発明の効果〕

本発明による、ＵＴＩの精製方法を用いることにより、
大量の尿から工業的規模てＵＴＩを簡便に、効率よく、
再現性をもって回収、精製することができるばかりでな
く、医薬品に適用できる高純度のＵＴ【を得ることか可
能となった。

特許出願人　　電気化学工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の工程からなることを特徴とする人尿トリプシ
   ンインヒビターの精製方法。 第１工程：尿を濃縮または吸着剤で回収・濃縮して尿原
   液を得る工程 第２工程：第１工程で得られた尿原液を陰イオン交換体
   に酸性条件下で吸着させた 後に、塩濃度を高くしてその吸着物 質を溶出させる工程 第３工程：第２工程で得られた溶液を疎水クロマト担体
   に高塩濃度の条件下で吸着 させた後に、塩濃度を低くしてその 吸着物質を溶出させる工程 第４工程：第３工程で得られた溶液を逆相クロマト担体
   に吸着させた後、溶離液の 極性を低くしてその吸着物質を溶出 させる工程 ２、第１工程で得られた尿原液に亜鉛、カルシウム、銅
   、バリウム、およびアルミニウムの金属塩から選ばれた
   少なくとも１種以上の金属塩を添加した後、生じた沈澱
   を除去することを特徴とする請求項１記載の人尿トリプ
   シンインヒビターの精製方法。