JPH0698019B2 - タンパク質の精製 - Google Patents
タンパク質の精製Info
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- JPH0698019B2 JPH0698019B2 JP61503570A JP50357086A JPH0698019B2 JP H0698019 B2 JPH0698019 B2 JP H0698019B2 JP 61503570 A JP61503570 A JP 61503570A JP 50357086 A JP50357086 A JP 50357086A JP H0698019 B2 JPH0698019 B2 JP H0698019B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Cephalosporin Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本出願は、1985年６月20日に出願された出願番号第06/7
47,119号の一部継続出願である。
47,119号の一部継続出願である。
背 景 本発明は、一般にクロマトグラフィー技術を用いたタン
パク質の精製に関する。特に、糖タンパク質、特に自然
の物質（例えば血液や尿）及び組み換え物質（例えば、
遺伝的に形質転換された哺乳動物細胞培養液）起源の、
シアル酸を高濃度に含有する糖タンパク質（例えば、エ
リトロポエチン（erythro-poietin）のような赤血球造
血因子（erythropoietic factor））のような生物学的
に活性を有するタンパク質の迅速且つ有効な分離操作に
関するものである。
パク質の精製に関する。特に、糖タンパク質、特に自然
の物質（例えば血液や尿）及び組み換え物質（例えば、
遺伝的に形質転換された哺乳動物細胞培養液）起源の、
シアル酸を高濃度に含有する糖タンパク質（例えば、エ
リトロポエチン（erythro-poietin）のような赤血球造
血因子（erythropoietic factor））のような生物学的
に活性を有するタンパク質の迅速且つ有効な分離操作に
関するものである。
生化学的に重要な物質の分離において、従来多くの技術
が提案されている。従来一般に用いられている分離技術
には、限外濾過法、カラム等電点電気泳動法（column e
lectrofocusing）、平板等電点電気泳動法（flat-bed e
ctrofocusing）、ゲル濾過法、電気泳動法、等電点電気
泳動法、様々な形態のクロマトグラフィー法等がある。
従来一般に用いられるクロマトグラフィー技術の中に
は、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラ
フィーがある。前者は、異なった純電荷（net charge）
を有する液体成分が、異なったイオン強度の溶出液によ
る溶出（段階的に或いは連続勾配によって）によって分
離される分離方法である。正の電荷或いは負の電荷を有
するゲルマトリックス（樹脂）が、反対の純電荷をもっ
た成分を吸着（結合）するために用いられる。分離（溶
出）の際には、荷電されたサンプル成分が、選択された
溶出液中の塩イオンによって交換され、イオン強度の特
異性によって特異的なサンプル成分が溶出される。逆相
吸着クロマトグラフィーは、極性の相違に基づく液体サ
ンプル成分の分離を含んでいる。サンプル成分は、非共
有結合によって粒状のゲルマトリックス（樹脂）に吸着
される。その後、段階的或いは連続的勾配溶出によっ
て、溶出液中の非極性溶媒による交換で、成分の選択的
脱着がなされる。
が提案されている。従来一般に用いられている分離技術
には、限外濾過法、カラム等電点電気泳動法（column e
lectrofocusing）、平板等電点電気泳動法（flat-bed e
ctrofocusing）、ゲル濾過法、電気泳動法、等電点電気
泳動法、様々な形態のクロマトグラフィー法等がある。
従来一般に用いられるクロマトグラフィー技術の中に
は、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラ
フィーがある。前者は、異なった純電荷（net charge）
を有する液体成分が、異なったイオン強度の溶出液によ
る溶出（段階的に或いは連続勾配によって）によって分
離される分離方法である。正の電荷或いは負の電荷を有
するゲルマトリックス（樹脂）が、反対の純電荷をもっ
た成分を吸着（結合）するために用いられる。分離（溶
出）の際には、荷電されたサンプル成分が、選択された
溶出液中の塩イオンによって交換され、イオン強度の特
異性によって特異的なサンプル成分が溶出される。逆相
吸着クロマトグラフィーは、極性の相違に基づく液体サ
ンプル成分の分離を含んでいる。サンプル成分は、非共
有結合によって粒状のゲルマトリックス（樹脂）に吸着
される。その後、段階的或いは連続的勾配溶出によっ
て、溶出液中の非極性溶媒による交換で、成分の選択的
脱着がなされる。
前述の多くの分離技術は、通常は比較的小さな疎水性分
子及び親水性分子の分離に用いられるが、それらの技術
は、例えばタンパク質、特に、リポタンパク質、核タン
パク質、糖タンパク質等の複合タンパク質分離の際には
幾分か利用の面で限界がある。タンパク質の分離技術分
野について開示したものとしては、Brown等,Analytical
Biochemistry,99,1−21（1979）及びRubinstein,Analy
tical Biochemistry,99,1−７（1979）がある。また、
“VYDAC Comprehensive Guide to Reverse Phase Mater
ials for HPLC",The Sep/A/Ra/Tions Groups,Hesperia,
CA.と、共同出願人であるStricklandとParsonsの共働者
等の刊行物すなわち,Endocrinology,114，（６）,2223
−2227（1984）参照。さらに、例えば、逆相液体高速ク
ロマトグラフィー法（reverse phase HPLC procedure）
が、タンパク質或いはポリペプチドの分離に提案され或
いは用いられてきたように、一般的に推奨された非極性
溶媒には、アセトニトリルのような所望のタンパク質か
ら分離、取扱が困難な試薬を使用しなければならなかっ
た。Parsons等,supra参照。特に水溶性のエタノールと
ギ酸の混合液のような、エタノールによる溶出を開示し
たものは、僅かに一つだけである。Takagaki等,Journal
of Biological Chemistry,５，（４）,1536−1541（19
80）参照。
子及び親水性分子の分離に用いられるが、それらの技術
は、例えばタンパク質、特に、リポタンパク質、核タン
パク質、糖タンパク質等の複合タンパク質分離の際には
幾分か利用の面で限界がある。タンパク質の分離技術分
野について開示したものとしては、Brown等,Analytical
Biochemistry,99,1−21（1979）及びRubinstein,Analy
tical Biochemistry,99,1−７（1979）がある。また、
“VYDAC Comprehensive Guide to Reverse Phase Mater
ials for HPLC",The Sep/A/Ra/Tions Groups,Hesperia,
CA.と、共同出願人であるStricklandとParsonsの共働者
等の刊行物すなわち,Endocrinology,114，（６）,2223
−2227（1984）参照。さらに、例えば、逆相液体高速ク
ロマトグラフィー法（reverse phase HPLC procedure）
が、タンパク質或いはポリペプチドの分離に提案され或
いは用いられてきたように、一般的に推奨された非極性
溶媒には、アセトニトリルのような所望のタンパク質か
ら分離、取扱が困難な試薬を使用しなければならなかっ
た。Parsons等,supra参照。特に水溶性のエタノールと
ギ酸の混合液のような、エタノールによる溶出を開示し
たものは、僅かに一つだけである。Takagaki等,Journal
of Biological Chemistry,５，（４）,1536−1541（19
80）参照。
高分子量の複合タンパク質の分離調製においては、前述
の技術の使用には明らかに限界がある。即ち、他の無数
の複合タンパク質と結びついている場合が多い自然に存
在する物質から、極少量存在する様々な複合ウィルスと
真核生物のタンパク質を分離精製して、治療や免疫予防
や診断薬に用いるといった、最近力の入れられている分
野においては、特に問題が多い。一例として、エリトロ
ポエチン、トロンボポエチン（thrombopoietin）、グラ
ニュロポエチン（granulopoietin）、顆粒細胞マクロフ
ァージコロニー刺激因子（granulocyte−macrophage co
lony stimulating factor）のような生化学的に重要な
哺乳動物造血因子（mammalian hematopoietic factor）
は、再生不良性貧血（aplastic anemia）患者の尿から
は極少量しか分離できない。尿液体源からの回収操作
は、一般的に非常に複雑であり、コストが高く、煩雑で
あり、しかも活性物質の回収率が比較的低い。生物学的
に活性を有する尿のエリトロポエチン調製物（高分子量
でシアル酸を多く含むタンパク質）を得るために広く用
いられている方法は、Miyake等,Journal of Biological
Chemistry,252（15）,5558−5564（1977）に開示され
ている。これは七つのステップからなり、イオン交換ク
ロマトグラフィー、エタノール沈澱、ゲル濾過、吸着ク
ロマトグラフィー等の方法を用いて、70,400Units/mgの
力価を有する糖タンパク質が21％の収率で得られること
が報告されている。
の技術の使用には明らかに限界がある。即ち、他の無数
の複合タンパク質と結びついている場合が多い自然に存
在する物質から、極少量存在する様々な複合ウィルスと
真核生物のタンパク質を分離精製して、治療や免疫予防
や診断薬に用いるといった、最近力の入れられている分
野においては、特に問題が多い。一例として、エリトロ
ポエチン、トロンボポエチン（thrombopoietin）、グラ
ニュロポエチン（granulopoietin）、顆粒細胞マクロフ
ァージコロニー刺激因子（granulocyte−macrophage co
lony stimulating factor）のような生化学的に重要な
哺乳動物造血因子（mammalian hematopoietic factor）
は、再生不良性貧血（aplastic anemia）患者の尿から
は極少量しか分離できない。尿液体源からの回収操作
は、一般的に非常に複雑であり、コストが高く、煩雑で
あり、しかも活性物質の回収率が比較的低い。生物学的
に活性を有する尿のエリトロポエチン調製物（高分子量
でシアル酸を多く含むタンパク質）を得るために広く用
いられている方法は、Miyake等,Journal of Biological
Chemistry,252（15）,5558−5564（1977）に開示され
ている。これは七つのステップからなり、イオン交換ク
ロマトグラフィー、エタノール沈澱、ゲル濾過、吸着ク
ロマトグラフィー等の方法を用いて、70,400Units/mgの
力価を有する糖タンパク質が21％の収率で得られること
が報告されている。
真核生物のタンパク質を大量に調製するために、組み換
え方法が広範囲に適用されているのは、生物学的に活性
を有する物質を得るために必要な、量の点から及び簡単
な精製の点から、所望の分子を得る可能性を実質的に増
大するためであった。一例を挙げると、生物学的活性を
保持するために、所望の組み換えタンパク質を糖付加す
る必要がない場合に、組み換え宿主大腸菌（E.coli）の
中で、タンパク質性汚染物質やプロテアーゼ等を殆ど含
まない不溶性“封入体”の形態で、大量のタンパク質が
屡々生産される。適切な第２及び第３の立体配座を形成
するための糖付加（glycosylation）及び／或いは宿主
細胞膜の処理が、生物学的活性には必要であるが、酵母
や哺乳動物細胞のような真核宿主の培養（例えば、COS
−１、CHO細胞）によって、より適切な組み換え宿主が
もたらされる。しかしながら、これらの宿主を用いた場
合には、生物学的に活性を有する形態のタンパク質を高
収率で得るのが困難になってしまう。宿主細胞溶解物は
屡々、（組み換えタンパク質に関して）分子量、電荷、
極性、溶解性が非常に類似したタンパク質性構成成分を
含んでおり、分離が困難である。さらに、宿主にとって
内存性のタンパク質分解酵素が、所望のタンパク質の生
物学的活性な損なう大きな原因となる。組み換え物質が
宿主細胞によって培養液上清中に分泌されている場合に
は、培養液に用いられている組成が複雑なために、形質
転換された哺乳動物細胞培養液から、所望のタンパク質
を分離する際にも同様な問題が生じる。
え方法が広範囲に適用されているのは、生物学的に活性
を有する物質を得るために必要な、量の点から及び簡単
な精製の点から、所望の分子を得る可能性を実質的に増
大するためであった。一例を挙げると、生物学的活性を
保持するために、所望の組み換えタンパク質を糖付加す
る必要がない場合に、組み換え宿主大腸菌（E.coli）の
中で、タンパク質性汚染物質やプロテアーゼ等を殆ど含
まない不溶性“封入体”の形態で、大量のタンパク質が
屡々生産される。適切な第２及び第３の立体配座を形成
するための糖付加（glycosylation）及び／或いは宿主
細胞膜の処理が、生物学的活性には必要であるが、酵母
や哺乳動物細胞のような真核宿主の培養（例えば、COS
−１、CHO細胞）によって、より適切な組み換え宿主が
もたらされる。しかしながら、これらの宿主を用いた場
合には、生物学的に活性を有する形態のタンパク質を高
収率で得るのが困難になってしまう。宿主細胞溶解物は
屡々、（組み換えタンパク質に関して）分子量、電荷、
極性、溶解性が非常に類似したタンパク質性構成成分を
含んでおり、分離が困難である。さらに、宿主にとって
内存性のタンパク質分解酵素が、所望のタンパク質の生
物学的活性な損なう大きな原因となる。組み換え物質が
宿主細胞によって培養液上清中に分泌されている場合に
は、培養液に用いられている組成が複雑なために、形質
転換された哺乳動物細胞培養液から、所望のタンパク質
を分離する際にも同様な問題が生じる。
従って、液体源から生物学的活性を有するタンパク質を
回収するために適した、迅速で且つ効果的な分離調製方
法が、当該技術分野においては求められている。とりわ
け、哺乳動物細胞培養液の上清のような種々の物質で、
“汚染”された液体から、組み換えエリトロポエチンの
ような組み換え複合タンパク質を回収する際には必要で
ある。
回収するために適した、迅速で且つ効果的な分離調製方
法が、当該技術分野においては求められている。とりわ
け、哺乳動物細胞培養液の上清のような種々の物質で、
“汚染”された液体から、組み換えエリトロポエチンの
ような組み換え複合タンパク質を回収する際には必要で
ある。
Kuen Linによって、“エリトロポエチンの製造（Produc
tion of Erythropoietin）という名称で、1984年11月30
日に出願された共同出願の米国係属特許出願第675,298
号（1984年12月11日に出願された国際出願US84/02021
で、1985年６月20日にWO85/02610として公開予定に対応
する）の開示を、本発明の背景に関係するので、特に、
哺乳動物のエリトロポエチンを大量に製造するために適
用される組み換え方法に関する技術分野に言及している
ので、本明細書に参照として組み入れた。
tion of Erythropoietin）という名称で、1984年11月30
日に出願された共同出願の米国係属特許出願第675,298
号（1984年12月11日に出願された国際出願US84/02021
で、1985年６月20日にWO85/02610として公開予定に対応
する）の開示を、本発明の背景に関係するので、特に、
哺乳動物のエリトロポエチンを大量に製造するために適
用される組み換え方法に関する技術分野に言及している
ので、本明細書に参照として組み入れた。
要 約 本発明は、タンパク質の分離に適した、特にエリトロポ
エチンの分離に適したよく知られたクロマトグラフィー
分離操作を、個々にまたは組み合わせた方法を提供する
ものである。特に前述のエリトロポエチンとしては、培
養液、特に哺乳動物宿主細胞培養液上清から生物学的に
活性を有する形態の組み換えエリトロポエチンである。
エチンの分離に適したよく知られたクロマトグラフィー
分離操作を、個々にまたは組み合わせた方法を提供する
ものである。特に前述のエリトロポエチンとしては、培
養液、特に哺乳動物宿主細胞培養液上清から生物学的に
活性を有する形態の組み換えエリトロポエチンである。
本発明による一態様によれば、逆相液体クロマトグラフ
ィー分離によって、培養液からエリトロポエチンを迅速
に且つ効果的に回収することができる。この逆相液体ク
ロマトグラフィーは、C4或いはC6樹脂に所望の成分を選
択的に結合させて、約50〜80％のエタノール水溶液を用
いて、pH4.5〜8.0で溶出させるものである。本発明のこ
の態様を効果的に実施するための好ましい条件として
は、C4樹脂を用い、pH7.0で、段階的に或いは連続的勾
配を用い、約60％のエタノール水溶液を用いて溶出すれ
ば、哺乳動物宿主細胞培養液上清から、生物学的に活性
を有する組み換えエリトロポエチンが高収率で回収され
る。培養液上清は、好ましくはクロマトグラフィー処理
を実施する前に濃縮しておき、さらに集めたエリトロポ
エチンを含んだ溶出画分からエタノールを除去するため
に、適切なステップを実施する。上述の優れ且つ簡単な
分離操作によって、収率50％以上で、高い比活性を有す
るエリトロポエチンの分離が可能となる。
ィー分離によって、培養液からエリトロポエチンを迅速
に且つ効果的に回収することができる。この逆相液体ク
ロマトグラフィーは、C4或いはC6樹脂に所望の成分を選
択的に結合させて、約50〜80％のエタノール水溶液を用
いて、pH4.5〜8.0で溶出させるものである。本発明のこ
の態様を効果的に実施するための好ましい条件として
は、C4樹脂を用い、pH7.0で、段階的に或いは連続的勾
配を用い、約60％のエタノール水溶液を用いて溶出すれ
ば、哺乳動物宿主細胞培養液上清から、生物学的に活性
を有する組み換えエリトロポエチンが高収率で回収され
る。培養液上清は、好ましくはクロマトグラフィー処理
を実施する前に濃縮しておき、さらに集めたエリトロポ
エチンを含んだ溶出画分からエタノールを除去するため
に、適切なステップを実施する。上述の優れ且つ簡単な
分離操作によって、収率50％以上で、高い比活性を有す
るエリトロポエチンの分離が可能となる。
本発明による他の態様によれば、陰イオン交換クロマト
グラフィーによって、培養液からエリトロポエチンを迅
速に且つ効果的に回収することができる。この陰イオン
交換クロマトグラフィーは、選択された陽イオン樹脂に
エリトロポエチンを選択的に結合させ、存在する酸性プ
ロテアーゼに対して結合物質の保護処理をして、pH4.0
〜6.0の酸の水溶液を用いて、エリトロポエチンのpKaよ
りも大きなpKaを有する結合物質を選択的に溶出して、
さらに約pH7.0の塩の水溶液を用いて溶出する。エリト
ロポエチンを含んだ溶出画分は、生物学的活性物質に富
んでいるが、さらに、例えばエタノールを除去してゲル
濾過などの処理をすることも可能である。本発明のこの
態様を効果的に実施するための好ましい条件としては、
DEAEアガロース樹脂（ジエチルアミノエチルアガロース
樹脂）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーを用い
れば、哺乳動物宿主細胞培養液上清から、生物学的に活
性を有する組み換えエリトロポエチンが高収率で回収さ
れる。DEAEカラムを充填して、つづいて生じる酸性プロ
テアーゼの活性化を防ぐために、尿素を添加し、さら
に、約pH4.3の酸の水溶液を用いて酸洗いして、エリト
ロポエチンよりも大きなpKaを有する液体結合成分を選
択的に溶出する。その後、pHを約7.0に調整して、塩の
水溶液を用いて段階的或いは連続的勾配にかけて、生物
学的に活性を有するエリトロポエチンを選択的に溶出さ
せる。
グラフィーによって、培養液からエリトロポエチンを迅
速に且つ効果的に回収することができる。この陰イオン
交換クロマトグラフィーは、選択された陽イオン樹脂に
エリトロポエチンを選択的に結合させ、存在する酸性プ
ロテアーゼに対して結合物質の保護処理をして、pH4.0
〜6.0の酸の水溶液を用いて、エリトロポエチンのpKaよ
りも大きなpKaを有する結合物質を選択的に溶出して、
さらに約pH7.0の塩の水溶液を用いて溶出する。エリト
ロポエチンを含んだ溶出画分は、生物学的活性物質に富
んでいるが、さらに、例えばエタノールを除去してゲル
濾過などの処理をすることも可能である。本発明のこの
態様を効果的に実施するための好ましい条件としては、
DEAEアガロース樹脂（ジエチルアミノエチルアガロース
樹脂）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーを用い
れば、哺乳動物宿主細胞培養液上清から、生物学的に活
性を有する組み換えエリトロポエチンが高収率で回収さ
れる。DEAEカラムを充填して、つづいて生じる酸性プロ
テアーゼの活性化を防ぐために、尿素を添加し、さら
に、約pH4.3の酸の水溶液を用いて酸洗いして、エリト
ロポエチンよりも大きなpKaを有する液体結合成分を選
択的に溶出する。その後、pHを約7.0に調整して、塩の
水溶液を用いて段階的或いは連続的勾配にかけて、生物
学的に活性を有するエリトロポエチンを選択的に溶出さ
せる。
本発明によるさらに他の態様によれば、前述のイオン交
換クロマトグラフィーと逆相液体クロマトグラフィー操
作を連続的に用いたエリトロポエチン回収操作が提供さ
れる。特にエリトロポエチン（特に組み換えエリトロポ
エチン）が、培養液（哺乳動物宿主細胞培養液上清）か
ら、下記の段階的方法で回収される。培養液上清プール
（好ましくは、前もって完全に濾過して濃縮した）を、
約pH7.0のイオン交換カラムに通して、陽イオン樹脂
（好ましくはDEAEアガロース）にエリトロポエチンを選
択的に結合させる。結合している物質は酸性プロテアー
ゼによる分解（好ましくは、尿素を加える）に対して安
定であって、エリトロポエチンよりも大きなpKa値を有
する結合物質を、約pH4.0〜6.0の酸の水溶液（好ましく
は約pH4.3）で、一回或いはそれ以上洗って溶出させ
る。その後、約pH7.0の塩の水溶液を用いて、生物学的
に活性を有するエリトロポエチンを溶出させる。このエ
リトロポエチンを含んだ溶出画分を、C6樹脂或いは好ま
しくはC4樹脂の逆相液体クロマトグラフィーにかけて、
エリトロポエチンを選択的に結合させる。その後、約pH
4.5〜8.0（好ましくはpH7.0）で、約50〜80％（好まし
くは約60％）のエタノール水溶液を用いて、結合してい
る生物学的に活性を有するエリトロポエチンを溶出す
る。所望のエリトロポエチンは、エリトロポエチンを含
んだ溶出画分から分離する（280nmの吸光度によって定
量される）。その後、エタノールを除去して、例えば、
20mMクエン酸ナトリウム/100mM塩化ナトリウム,pH6.8〜
7.0のような調整成分の緩衝液を用いて、生成物をゲル
濾過（例えばセファクリルＳ−200カラム（Sephacryl S
−200 column））にかけることも可能である。
換クロマトグラフィーと逆相液体クロマトグラフィー操
作を連続的に用いたエリトロポエチン回収操作が提供さ
れる。特にエリトロポエチン（特に組み換えエリトロポ
エチン）が、培養液（哺乳動物宿主細胞培養液上清）か
ら、下記の段階的方法で回収される。培養液上清プール
（好ましくは、前もって完全に濾過して濃縮した）を、
約pH7.0のイオン交換カラムに通して、陽イオン樹脂
（好ましくはDEAEアガロース）にエリトロポエチンを選
択的に結合させる。結合している物質は酸性プロテアー
ゼによる分解（好ましくは、尿素を加える）に対して安
定であって、エリトロポエチンよりも大きなpKa値を有
する結合物質を、約pH4.0〜6.0の酸の水溶液（好ましく
は約pH4.3）で、一回或いはそれ以上洗って溶出させ
る。その後、約pH7.0の塩の水溶液を用いて、生物学的
に活性を有するエリトロポエチンを溶出させる。このエ
リトロポエチンを含んだ溶出画分を、C6樹脂或いは好ま
しくはC4樹脂の逆相液体クロマトグラフィーにかけて、
エリトロポエチンを選択的に結合させる。その後、約pH
4.5〜8.0（好ましくはpH7.0）で、約50〜80％（好まし
くは約60％）のエタノール水溶液を用いて、結合してい
る生物学的に活性を有するエリトロポエチンを溶出す
る。所望のエリトロポエチンは、エリトロポエチンを含
んだ溶出画分から分離する（280nmの吸光度によって定
量される）。その後、エタノールを除去して、例えば、
20mMクエン酸ナトリウム/100mM塩化ナトリウム,pH6.8〜
7.0のような調整成分の緩衝液を用いて、生成物をゲル
濾過（例えばセファクリルＳ−200カラム（Sephacryl S
−200 column））にかけることも可能である。
本発明の他の態様或いは利点は、下記の好ましい実施例
の詳細な説明を考慮することによって明白となるであろ
う。
の詳細な説明を考慮することによって明白となるであろ
う。
詳細な説明 本発明の実施は、前述の米国特許出願第675,298号の実
施例10に記載された方法で調製したプールしたCHO細胞
上清で実施した、下記の実施例によって適切に開示され
ているものである。特に、この処理された上清は、MTX
（メトトレクセイト）によって“増幅（amplified）”
されたCHO pDSVL−gHuEPO株を、前述の米国出願の第62
頁に記載されているように、無血清培地で回転ビン培養
をおこなって得たものである。実施例１では、逆相液体
クロマトグラフィーによって、生物学的活性を有する組
み換えヒトエリトロポエチンの回収について言及してい
る。実施例２は、同じ上清材料で実施した複合回収操作
に関する。実施例３は、その結果生成された物質で実施
した、RIAと生体内（in vivo）検定に関する。
施例10に記載された方法で調製したプールしたCHO細胞
上清で実施した、下記の実施例によって適切に開示され
ているものである。特に、この処理された上清は、MTX
（メトトレクセイト）によって“増幅（amplified）”
されたCHO pDSVL−gHuEPO株を、前述の米国出願の第62
頁に記載されているように、無血清培地で回転ビン培養
をおこなって得たものである。実施例１では、逆相液体
クロマトグラフィーによって、生物学的活性を有する組
み換えヒトエリトロポエチンの回収について言及してい
る。実施例２は、同じ上清材料で実施した複合回収操作
に関する。実施例３は、その結果生成された物質で実施
した、RIAと生体内（in vivo）検定に関する。
実施例 １ 第１回目と第２回目（７日）の培養サイクルの上清をプ
ールすることによって得られた未濃縮の培養液上清を、
C4基質（VYDAC 214TP−Ｂ）で充填して密閉した（高圧
配置の）実験用カラムにのせる。0.45×10mmのカラム
で、流速は1ml/minである。サンプルを流した後、生物
学的に活性を有する組み換えエリトロポエチンを、pH7.
0の10mMのトリス（Tris）からpH7.0の80％のEtOH/10mM
Trisまでの直線勾配で溶出した。タンパク質の濃度をUV
モニターで230nmで測定して、約60％のエタノール（EtO
H）の溶出画分を集めた。
ールすることによって得られた未濃縮の培養液上清を、
C4基質（VYDAC 214TP−Ｂ）で充填して密閉した（高圧
配置の）実験用カラムにのせる。0.45×10mmのカラム
で、流速は1ml/minである。サンプルを流した後、生物
学的に活性を有する組み換えエリトロポエチンを、pH7.
0の10mMのトリス（Tris）からpH7.0の80％のEtOH/10mM
Trisまでの直線勾配で溶出した。タンパク質の濃度をUV
モニターで230nmで測定して、約60％のエタノール（EtO
H）の溶出画分を集めた。
実施例 ２ この実施例の複合回収操作は、実施例１よりも大きな上
清画分で、イオン交換クロマトグラフィーと逆相クロマ
トグラフィー操作を連続的に実施することから成る。こ
のクロマトグラフィー操作の前に、濃縮と完全濾過を行
い、つづいてゲル濾過処理ステップを行う。
清画分で、イオン交換クロマトグラフィーと逆相クロマ
トグラフィー操作を連続的に実施することから成る。こ
のクロマトグラフィー操作の前に、濃縮と完全濾過を行
い、つづいてゲル濾過処理ステップを行う。
1.濃縮と完全濾過 第１回目と第２回目（７日）の培養サイクルで得た上清
を別々に、Pellicon限外濾過装置（Millipore,Bedford,
Mass.）を用いて、分子量10,000以下の物質を除去して3
0倍に濃縮した。濃縮した第１回目と第２回目の培養サ
イクルの培養液を集めて、約pH7.0の10mMトリス（Tri
s）でPellicon装置を用いて完全濾過した。（この完全
濾過した培養液に、イオン交換クロマトグラフィーにか
ける前に、CuSO4を20μＭ加えてもよい。）10,000或い
は30,000の分子量をカットする限外濾過装置はすべて使
用可能であり、また、完全濾過は、pHが約6.0〜8.5の適
切な低イオン強度を有するすべての緩衝液で行うことが
可能である。
を別々に、Pellicon限外濾過装置（Millipore,Bedford,
Mass.）を用いて、分子量10,000以下の物質を除去して3
0倍に濃縮した。濃縮した第１回目と第２回目の培養サ
イクルの培養液を集めて、約pH7.0の10mMトリス（Tri
s）でPellicon装置を用いて完全濾過した。（この完全
濾過した培養液に、イオン交換クロマトグラフィーにか
ける前に、CuSO4を20μＭ加えてもよい。）10,000或い
は30,000の分子量をカットする限外濾過装置はすべて使
用可能であり、また、完全濾過は、pHが約6.0〜8.5の適
切な低イオン強度を有するすべての緩衝液で行うことが
可能である。
2.イオン交換クロマトグラフィー 前述のステップ１で濃縮、完全濾過した培養液を、比較
的低密度のDEAEアガロースカラム（Bio−Rad,Richmond,
CA.）に加える。その後、約pH4.5で5mM酢酸/1mMグリシ
ン/6M尿素を含む４倍量の溶液で洗う。また、洗浄液に
は、所望でないタンパク質のスルフヒドリル基を酸化さ
せるために、20μＭのCuSO4を含んでもよい。グリシン
は存在するシアン酸塩と反応して、吸収される。尿素
は、低いpHで酸性プロテアーゼに対する安定化、及びタ
ンパク質の可溶化を助ける働きをもつ。エリトロポエチ
ンよりも大きなpKa値を有する結合物質を溶出した後
で、カラムのpHを中性化させ且つ尿素を除去するため
に、カラムを25mM NaCl/10mM Trisを用いて洗う。生物
学的に活性を有するエリトロポエチンは、約pH7.0で75m
M NaCl/10mM Trisを用いて溶出する。CuSO4（20μＭ）
は、中性化のための洗浄及び／或いは溶出ステップの双
方で用いることができる。
的低密度のDEAEアガロースカラム（Bio−Rad,Richmond,
CA.）に加える。その後、約pH4.5で5mM酢酸/1mMグリシ
ン/6M尿素を含む４倍量の溶液で洗う。また、洗浄液に
は、所望でないタンパク質のスルフヒドリル基を酸化さ
せるために、20μＭのCuSO4を含んでもよい。グリシン
は存在するシアン酸塩と反応して、吸収される。尿素
は、低いpHで酸性プロテアーゼに対する安定化、及びタ
ンパク質の可溶化を助ける働きをもつ。エリトロポエチ
ンよりも大きなpKa値を有する結合物質を溶出した後
で、カラムのpHを中性化させ且つ尿素を除去するため
に、カラムを25mM NaCl/10mM Trisを用いて洗う。生物
学的に活性を有するエリトロポエチンは、約pH7.0で75m
M NaCl/10mM Trisを用いて溶出する。CuSO4（20μＭ）
は、中性化のための洗浄及び／或いは溶出ステップの双
方で用いることができる。
3.逆相クロマトグラフィー この操作は、開放コラム、低圧条件を用いること以外
は、実質的に実施例１の操作と同じである。上述のステ
ップ２の緩衝液において硫酸銅を用いた場合には、銅の
除去を促進するために、逆相カラムにのせる前に、1mM
のEDTAをエリトロポエチンの画分に加える。エリトロポ
エチンの“ピーク”は、直線勾配の約60％エタノールの
画分にみられるが、これを集めて、例えば、pH7.0の10m
M Trisで５倍に希釈して、エタノール濃度を下げて、エ
タノールを除去しやすくする。エリトロポエチンをDEAE
カラムに結合させて、少量の緩衝液（20mMクエン酸ナト
リウム/100mM塩化ナトリウム）で溶出して、エタノール
を除去する。
は、実質的に実施例１の操作と同じである。上述のステ
ップ２の緩衝液において硫酸銅を用いた場合には、銅の
除去を促進するために、逆相カラムにのせる前に、1mM
のEDTAをエリトロポエチンの画分に加える。エリトロポ
エチンの“ピーク”は、直線勾配の約60％エタノールの
画分にみられるが、これを集めて、例えば、pH7.0の10m
M Trisで５倍に希釈して、エタノール濃度を下げて、エ
タノールを除去しやすくする。エリトロポエチンをDEAE
カラムに結合させて、少量の緩衝液（20mMクエン酸ナト
リウム/100mM塩化ナトリウム）で溶出して、エタノール
を除去する。
4.ゲル濾過 エタノールを除去したステップ３で得られた生成物を、
Sephacryl S−200（Pharmacia,Piscataway,N.J.）のカ
ラムにのせる。このカラムを、pH6.8〜7.0の20mMクエン
酸ナトリウム/100mM塩化ナトリウムの調製緩衝液で展開
する。
Sephacryl S−200（Pharmacia,Piscataway,N.J.）のカ
ラムにのせる。このカラムを、pH6.8〜7.0の20mMクエン
酸ナトリウム/100mM塩化ナトリウムの調製緩衝液で展開
する。
実施例 ３ 前述した米国特許出願第675,298号に記載されたラジオ
イムノアッセイと生体内（in vivo）生物学的定量を、
実施例１と実施例２の操作で回収した組み換えエリトロ
ポエチンを用いて行った。実験結果より、実施例１と実
施例２の生成物は収率がそれぞれ、52％、16％であり、
RIA（ラジオイムノアッセイ）活性に対する生体内（in
vivo）活性の比がそれぞれ1.02と1.3であった。また別
の上清を用いて実施例２の操作を繰り返した結果、収率
は30〜50％のレベルであった。
イムノアッセイと生体内（in vivo）生物学的定量を、
実施例１と実施例２の操作で回収した組み換えエリトロ
ポエチンを用いて行った。実験結果より、実施例１と実
施例２の生成物は収率がそれぞれ、52％、16％であり、
RIA（ラジオイムノアッセイ）活性に対する生体内（in
vivo）活性の比がそれぞれ1.02と1.3であった。また別
の上清を用いて実施例２の操作を繰り返した結果、収率
は30〜50％のレベルであった。
本発明の精製ステップを行った後のエリトロポエチンの
純度は、少なくとも約95％で、殆どの場合約98％以上で
あった。組み換えエリトロポエチンの純度は、非還元SD
S−PAGE分析、還元SDS−PAGE分析、高圧液体ゲル濾過ク
ロマトグラフィーで測定した。本発明で得られた高純度
の組成物は、エライサ（ELISA）アッセイで測定した結
果、チャイニーズハムスター（Chinese hamstar）の卵
巣細胞（CHO）とウシ血清タンパク質が、0.5％以下して
含まれていなかった。本発明の方法で精製した組み換え
エリトロポエチンは、他の精製技術で以前に得られたエ
リトロポエチンに比べると、比活性が実質的に大きいも
のである。さらに、本発明の精製した組み換えエリトロ
ポエチン組成物には、limulus amebocyte（カブトガニ
のアメーバ様細胞）アッセイで測定した結果、2.5EU/ml
以下の発熱物質（pyrogen）を含んでいた。さらに、本
発明の精製した組成物には、ドットブロット分析（dot
blot analysis）で測定した結果、DNAコンタミネーショ
ンが10pg DNA/10,000units以下であった。
純度は、少なくとも約95％で、殆どの場合約98％以上で
あった。組み換えエリトロポエチンの純度は、非還元SD
S−PAGE分析、還元SDS−PAGE分析、高圧液体ゲル濾過ク
ロマトグラフィーで測定した。本発明で得られた高純度
の組成物は、エライサ（ELISA）アッセイで測定した結
果、チャイニーズハムスター（Chinese hamstar）の卵
巣細胞（CHO）とウシ血清タンパク質が、0.5％以下して
含まれていなかった。本発明の方法で精製した組み換え
エリトロポエチンは、他の精製技術で以前に得られたエ
リトロポエチンに比べると、比活性が実質的に大きいも
のである。さらに、本発明の精製した組み換えエリトロ
ポエチン組成物には、limulus amebocyte（カブトガニ
のアメーバ様細胞）アッセイで測定した結果、2.5EU/ml
以下の発熱物質（pyrogen）を含んでいた。さらに、本
発明の精製した組成物には、ドットブロット分析（dot
blot analysis）で測定した結果、DNAコンタミネーショ
ンが10pg DNA/10,000units以下であった。
高純度で精製された組み換えエリトロポエチン組成物
は、目的物以外のタンパク質が除去されている点で、製
薬的に利用可能な組成物である。本発明の方法を用いて
組み換えエリトロポエチンから不純なタンパク質を除去
することによって、ヒトに対して用いた場合に、免疫学
的反応、例えばアナフィラキシー（anaphylaxis）が減
少した精製組成物が提供できるものである。さらに、加
水分解酵素のコンタミネーションによる組み換えエリト
ロポエチンの分解を防止することによって、不純なタン
パク質の除去は、組み換えエリトロポエチン組成物の安
定性を増加することが可能である。
は、目的物以外のタンパク質が除去されている点で、製
薬的に利用可能な組成物である。本発明の方法を用いて
組み換えエリトロポエチンから不純なタンパク質を除去
することによって、ヒトに対して用いた場合に、免疫学
的反応、例えばアナフィラキシー（anaphylaxis）が減
少した精製組成物が提供できるものである。さらに、加
水分解酵素のコンタミネーションによる組み換えエリト
ロポエチンの分解を防止することによって、不純なタン
パク質の除去は、組み換えエリトロポエチン組成物の安
定性を増加することが可能である。
前述に記載した実施例は、哺乳動物細胞培養源からのエ
リトロポエチンの回収を実施するように本発明の操作を
記載したが、この操作は、哺乳動物の溶解物と上清の結
合物のような他の培養液や、酵母細胞培養の同様な培養
液に実施する回収にも適用できると思われる。同様に、
個々の操作、及び複合操作（及び特にイオン交換クロマ
トグラフィー操作）が、尿などの自然の物質からのエリ
トロポエチンの回収に有用であると期待されている。
リトロポエチンの回収を実施するように本発明の操作を
記載したが、この操作は、哺乳動物の溶解物と上清の結
合物のような他の培養液や、酵母細胞培養の同様な培養
液に実施する回収にも適用できると思われる。同様に、
個々の操作、及び複合操作（及び特にイオン交換クロマ
トグラフィー操作）が、尿などの自然の物質からのエリ
トロポエチンの回収に有用であると期待されている。
エリトロポエチンの回収に適用した前述の操作が、他の
複合タンパク質、特に組み換え方法で生成した糖タンパ
ク質の回収にも使用可能であることは、当該技術分野に
熟達したものであれば明白であろう。その回収が本発明
の範囲である糖タンパク質には、組み換え体組織のプラ
スミノゲン（plasminogen）活性化因子、Factor VIIIと
単純ヘルペスウィルス糖タンパク質Ｄ（Herpes Simplex
Virus Glycoprotein D）のような独特な生成物を含む
ものである。
複合タンパク質、特に組み換え方法で生成した糖タンパ
ク質の回収にも使用可能であることは、当該技術分野に
熟達したものであれば明白であろう。その回収が本発明
の範囲である糖タンパク質には、組み換え体組織のプラ
スミノゲン（plasminogen）活性化因子、Factor VIIIと
単純ヘルペスウィルス糖タンパク質Ｄ（Herpes Simplex
Virus Glycoprotein D）のような独特な生成物を含む
ものである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/16 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｂ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 昭59−155395（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−501701（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−501010（ＪＰ，Ａ) 蛋白質 核酸 酵素，27（７），1056− 1068（1982) Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ，10，305−314 （1984)
Claims (9)
- 【請求項１】培養液からエリトロポエチンを効果的に回
収する方法であって、 （１）該培養液を約pH7.0でイオン交換クロマトグラフ
ィー分離にかけて、該培養液中のエリトロポエチンを陽
イオン樹脂に選択的に結合させ、 （２）尿素含有溶液で該結合樹脂を処理し、 （３）エリトロポエチンのpKa値よりも大きいpKa値を有
する結合している汚染物質を、約4.0〜6.0のpHで酸の水
溶液を用いて処理することによって選択的に溶出し、 （４）約7.0のpHで塩の水溶液を用いて処理することに
よって、エリトロポエチンを選択的に溶出し、 （５）エリトロポエチンを含んだ溶出画分を分離する、
ことから成る前記方法。 - 【請求項２】細胞培養液からの組み換えエリトロポエチ
ンの回収に適用する請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】哺乳動物細胞培養液からのエリトロポエチ
ンの回収に適用する請求の範囲第２項に記載の方法。 - 【請求項４】哺乳動物細胞培養上清からのエリトロポエ
チンの回収に適用する請求の範囲第３項に記載の方法。 - 【請求項５】陽イオン樹脂がDEAE陽イオン樹脂である請
求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項６】培養液からエリトロポエチンを効果的に回
収する方法であって、 （１）該培養液を約pH7.0でイオン交換クロマトグラフ
ィー分離にかけて、該培養液中のエリトロポエチンを陽
イオン樹脂に選択的に結合させ、 （２）尿素含有溶液で該結合樹脂を処理し、 （３）エリトロポエチンのpKa値よりも大きいpKa値を有
する結合している汚染物質を、約4.0〜6.0のpHで酸の水
溶液を用いて処理することによって選択的に溶出し、 （４）約7.0のpHで塩の水溶液を用いて処理することに
よって、エリトロポエチンを選択的に溶出し、 （５）エリトロポエチンを含んだ溶出画分を、固定され
たC4樹脂或いはC6樹脂を含んだ逆相液体クロマトグラフ
ィー分離にかけて、該画分中のエリトロポエチンを該樹
脂に選択的に結合させ、 （６）pHが約4.5〜8.0の50〜80％のエタノール水溶液
で、該樹脂から結合したエリトロポエチンを選択的に溶
出し、 （７）溶出液のエリトロポエチンを含んだ画分を分離す
る、 ことから成る前記方法。 - 【請求項７】細胞培養液からの組み換えエリトロポエチ
ンの回収に適用する請求の範囲第６項に記載の方法。 - 【請求項８】細胞培養液が哺乳動物細胞培養液であり、
且つ以下の工程から成る請求の範囲第７項に記載の方
法： （１）該培養液を約pH7.0でイオン交換クロマトグラフ
ィー分離にかけて、該培養液中のエリトロポエチンをDE
AE陽イオン樹脂に選択的に結合させ、 （２）尿素含有溶液で該結合樹脂を処理し、 （３）エリトロポエチンのpKa値よりも大きいpKa値を有
する結合している汚染物質を、約4.3のpHで酸の水溶液
を用いて処理することによって選択的に溶出し、 （４）約7.0のpHで塩の水溶液を用いて処理することに
よって、エリトロポエチンを選択的に溶出し、 （５）エリトロポエチンを含んだ溶出画分を、固定され
たC4樹脂を含んだ逆相液体クロマトグラフィー分離にか
けて、該画分中のエリトロポエチンを該樹脂に選択的に
結合させ、 （６）pHが約7.0の60％のエタノール水溶液で、該樹脂
から結合したエリトロポエチンを選択的に溶出し、 （７）溶出液のエリトロポエチンを含んだ画分を分離す
る。 - 【請求項９】哺乳動物細胞培養液からの組み換えエリト
ロポエチンを効果的に回収する方法であって、 （１）該培養液を約pH7.0でイオン交換クロマトグラフ
ィー分離にかけて、該培養液中のエリトロポエチンをDE
AE陽イオン樹脂に選択的に結合させ、 （２）尿素含有溶液で該結合樹脂を処理し、 （３）エリトロポエチンのpKa値よりも大きいpKa値を有
する結合している汚染物質を、約4.3のpHで酸の水溶液
を用いて処理することによって選択的に溶出し、 （４）約7.0のpHで塩の水溶液を用いて処理することに
よって、エリトロポエチンを選択的に溶出し、 （５）エリトロポエチンを含んだ溶出画分を、固定され
たC4樹脂を含んだ逆相液体クロマトグラフィー分離にか
けて、該画分中のエリトロポエチンを該樹脂に選択的に
結合させ、 （６）pHが約7.0の60％エタノール水溶液で、該樹脂か
ら結合したエリトロポエチンを選択的に溶出し、 （７）溶出液のエリトロポエチンを含んだ画分を分離
し、 （８）更に分離したエリトロポエチンを含んだ画分から
エタノールを除去する、 ことから成る前記方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/747,119 US4667016A (en) | 1985-06-20 | 1985-06-20 | Erythropoietin purification |
| US747119 | 1985-06-20 | ||
| US87215286A | 1986-06-13 | 1986-06-13 | |
| US872152 | 1986-06-13 | ||
| PCT/US1986/001342 WO1986007594A1 (en) | 1985-06-20 | 1986-06-20 | Protein purification |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63503352A JPS63503352A (ja) | 1988-12-08 |
| JPH0698019B2 true JPH0698019B2 (ja) | 1994-12-07 |
Family
ID=27114696
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61503570A Expired - Lifetime JPH0698019B2 (ja) | 1985-06-20 | 1986-06-20 | タンパク質の精製 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0228452B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0698019B2 (ja) |
| KR (1) | KR930003665B1 (ja) |
| AT (1) | ATE120208T1 (ja) |
| AU (1) | AU606578B2 (ja) |
| CA (1) | CA1297635C (ja) |
| DE (1) | DE3650276T2 (ja) |
| DK (1) | DK175251B1 (ja) |
| ES (1) | ES8801381A1 (ja) |
| GR (1) | GR861624B (ja) |
| IE (1) | IE69343B1 (ja) |
| IL (1) | IL79176A (ja) |
| PT (1) | PT82811B (ja) |
| WO (1) | WO1986007594A1 (ja) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5179199A (en) * | 1986-10-20 | 1993-01-12 | Genzyme Corporation | Protein purification |
| IL118201A (en) * | 1995-05-11 | 2004-12-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Preparation comprising a protein with human erythropoietin activity which is free of serum and non-recombinant mammalian protein and process for the preparation thereof |
| KR100374308B1 (ko) * | 1995-07-27 | 2003-12-18 | 주식회사 엘지생명과학 | 재조합차이니스햄스터오바리세포로부터발현된수두바이러스의지피i당단백질의정제방법 |
| JP2001520009A (ja) * | 1997-10-16 | 2001-10-30 | ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド | 鳥の導入遺伝子についてのマグナム特異的プロモーターを含むベクター |
| US6210924B1 (en) | 1998-08-11 | 2001-04-03 | Amgen Inc. | Overexpressing cyclin D 1 in a eukaryotic cell line |
| BR9917606A (pt) * | 1998-11-06 | 2002-12-31 | Bio Sidus S A | Procedimento para a purificação de eritropoetina humana recombinante a partir de sobrenadantes de cultivo de células e eritropoetina humana recombinante obtida com tal procedimento |
| DE60228460D1 (de) * | 2002-12-13 | 2008-10-02 | Bioceuticals Arzneimittel Ag | Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Erythropoietin |
| US7423139B2 (en) | 2004-01-20 | 2008-09-09 | Insight Biopharmaceuticals Ltd. | High level expression of recombinant human erythropoietin having a modified 5′-UTR |
| DE102004027816A1 (de) * | 2004-06-08 | 2006-01-05 | Bioceuticals Arzneimittel Ag | Verfahren zur Reinigung von Erythropoietin |
| IL165484A0 (en) | 2004-11-30 | 2006-01-15 | Applied Research Systems | Production of proteins |
| EP1966232A1 (en) * | 2005-12-23 | 2008-09-10 | Novo Nordisk A/S | Purification of proteins using preparative reverse phase chromatography (rpc) |
| KR100900033B1 (ko) * | 2007-11-21 | 2009-06-01 | 한국생명공학연구원 | 인간 에리스로포이에틴의 정제방법 |
| DE102008002209A1 (de) * | 2008-06-04 | 2009-12-10 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Aufreinigung von Erythropoietin |
| CN102164954B (zh) | 2008-09-23 | 2018-04-06 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 促红细胞生成素的纯化 |
| DE102008054716A1 (de) | 2008-12-16 | 2010-06-17 | Evonik Degussa Gmbh | Inprozesskontrolle in einem Verfahren zur Herstellung von EPO |
| AU2010241154A1 (en) * | 2009-04-22 | 2011-10-27 | Bayer Bioscience N.V. | Production of multi-antennary N-glycan structures in plants |
| EA022396B1 (ru) | 2009-09-23 | 2015-12-30 | Ратиофарм Гмбх | Способ очистки рекомбинантного эритропоэтина человека (epo), эритропоэтин, очищенный данным способом, и фармацевтические композиции, содержащие такой эритропоэтин |
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