JPH04198866A - 診断薬用担体ラテックス及び診断薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野） 本発明は新規な診断薬用担体ラテックス及び診断薬に関
するものである。さらに詳しくいえば、本発明は共有結
合により抗原や抗体を固定化しつる高感度な診断薬用担
体ラテックス、及びこのものから得られる高感度診断薬
に関するものである。

［従来の技術］ 従来、臨床検査における診断法の１つとして、抗原又は
抗体の免疫活性物質を担体ラテックス粒子に結合させる
ことによって、血清中の抗体又は抗原を担体ラテックス
粒子の凝集反応として検出する診断法が、その簡便性と
迅速性の点から広（用いられている。

このような診断法に用いられる担体ラテックスに要求さ
れる性能としては、例えば感度が良いこと、少ない抗原
量や抗体量で検査ができること、化学的に長時間保存し
うろこと、再現性を有することなどが必須条件として挙
げられる。しかしながら、従来担体ラテックスとしては
、ポリスチレン系やポリメタクリル酸メチル系の共重合
体ラテックスが用いられているが、これらの担体ラテッ
クスは、前記の要求性能を完全には満たしておらず、必
ずしも十分に満足しうるちのではない。

また、抗原又は抗体を感作する方法には、担体ラテック
ス粒子に抗原又は抗体を物理的に吸着させる方法と化学
的に共有結合させる方法とがある。

しかしながら、一般に用いられる物理的吸着方法におい
ては、担体ラテックス粒子と抗原又は抗体との間に吸着
解離平衡があるので、感作後の操作や、保存中あるいは
測定中に感作した抗原又は抗体が担体ラテックス粒子か
ら解離し、その結果感度が低下するのを免れないという
欠点がある。

一方、担体ラテックス粒子に抗原又は抗体を共有結合さ
せて感作する方法においては、感度は高（なるものの、
該担体ラテックス粒子の官能基濃度をコントロールしに
（いために、均質な表面状態の粒子が得られにくかった
り、担体ラテックス粒子の保存安定性が低下したりする
上、非検体と反応させる際に、対応する陽性物質のみで
なくて、陰性物質に対しても非特異的凝集反応を起こし
やすいなどの欠点がある。

このような非特異的凝集反応を抑制し、かつ保存安定性
を向上させるために、例えば抗原又は抗体を固定化した
担体に保護コロイドを添加する方法や、担体ラテックス
として親水性重合体ラテックスを用いる方法が試みられ
ている。

前者の方法としては、例えば抗原又は抗体を担体に固定
化したのち、牛血清アルブミン、ゼラチンなどの親水性
タンパク質を添加する方法が提案されているが（特開昭
５６−１５８９４７号公報）、この方法においては、検
体測定中にタンパク質相互作用により、妨害反応が生じ
るおそれがあることが指摘されている。また、後者の方
法としては、例えばスルホン酸基を有するビニル系単量
体を共重合させたラテックスを用いる方法（特開昭６３
−２７３０６０号公報）、共重合体中のグリンシルメタ
クリレート単位におけるエポキシ基を加水分解してジヒ
ドロキジル基に変換したラテックスを用いる方法（特開
昭６０−２３５０６１号公報）などが提案されている。

しかしながら、このような方法においては、親水性部分
であるスルホン酸基やジヒドロキジル基の濃度を増加さ
せると、担体ラテックスの分散安定性は向上するものの
、抗原又は抗体と共有結合させる活性点濃度が減少する
ために抗原又は抗体の固定化量が減少して感度が低下す
るのを免れないという問題が生じるし、逆に親水性部分
の濃度を減少させると担体ラテックスの安定性が損なわ
れるのを免れないという問題が生じる。このように、担
体ラテックスの分散安定性と免疫学的反応性をバランス
よく両立させることは極めて困難であるのが実情であス 抗原又は抗体と共有結合させるための担体ラテックス粒
子における官能基としては、例えばカルホキノル基、ア
ミノ基、イミノ基、エポキン基、メルカプト基などが提
案されており（例えば特開昭６３−６４６３号公報など
）、そして、カルボキシル基の活性化の方法として、カ
ルボンイミド、ジアルデヒド、Ｎ−ヒドロキノスクシン
イミドなどを反応させる方法も知られている。

しかしながら、カルボキシル基が担体ラテックス粒子に
多数存在すると担体ラテックスは安定性が良好になるも
のの、抗原又は抗体の感作後の再分散時にラテックス粒
子が凝集して、抗原抗体反応を阻害するおそれがあるし
、担体ラテックス粒子中のカルボキシル基濃度が低いと
十分な量のカルボジイミドやＮ−ヒドロキノスクシンイ
ミドを結合させることができないという問題が生じる。

このように、担体ラテックスの物理的安定性と抗原又は
抗体の固定化をバランスよく両立させた方法は、これま
で見い出されていない。

また、カルボキシル基は、脱水縮合により抗原又は抗体
のアミノ基と共有結合を形成するが、水の存在が反応の
妨げになり、選択的に高収率で抗原又は抗体と反応しつ
るカルボキシル基をもつ重合体粒子を含有して成る担体
ラテックスは、まだ得られていないのが実情である。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、このような事情のもとで、抗原抗体反応を利
用したラテックス診断薬に用いられる、非特異的凝集反
応が少なく、かつ分散安定性に優れた高感度な診断薬用
担体ラテックス、及びこの担体ラテックスを用いた高感
度診断薬を提供することを目的としてなされたものであ
る。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意研究を重
ねた結果、特定の不飽和単量体混合物を乳化重合させて
得られた所定の粒子径を有する共重合体粒子を含有して
成るラテックスにより、その目的を達成しうることを見
い出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った
。

すなわち、本発明は、（Ａ）一般式 ％式％ （式中のＲ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ水素原子又は
炭素数１〜４のアルキル基であり、それらは同一であっ
てもよいし、たがいに異なっていてもよい） で表されるンクロカーボネート基を有する不飽和単量体
０．１〜２０重量％、（Ｂ）水酸基含有不飽和単量体０
，１〜２０重量％、（Ｃ）多官能不飽和単量体０．１〜
５０重量％及び（Ｄ）その他の不飽和単量体残部から成
る単量体混合物を乳化重合させて得られた平均粒子径０
０１〜２μｍの共重合体粒子を含有して成る診断薬用担
体ラテックス、及びこの担体ラテックスの共重合体粒子
に抗原又は抗体を固定化させて成る診断薬を提供するも
のである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明の担体ラテックスを製造するには、原料として、
前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）成分が用いられ
る。該（Ａ）成分の前記一般式（Ｉ）で表されるシクロ
カーボネート基を有する不飽和単量体としては、例えば
４−（メタ）アクリロイルオキシメチル−１，３−ジオ
キソラン−２−オン［（メタ）アクリロイルは、アクリ
ロイルとメタクリロイルを表す］、４−（メタ）アクリ
ロイルオキシエチル−１，３−ジオキソラン−２−オン
、４−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−１，３−
ジオキソラン−２−オン、４−（メタ）アクリロイルオ
キシブチル−１，３−ジオキソラン−２−オンなどを挙
げることができる。

これらの（Ａ）成分の不飽和単量体は１種用いてもよい
し、２種以上を組み合わせて用いてもよ（、またその使
用量は、単量体混合物の重量に基づき０．１〜２０重量
％、好ましくは２〜１５重量％の範囲で選ばれる。この
量が０．１重量％未満では抗原又は抗体を十分に固定化
することができないし、２０重量％を超えると担体ラテ
ックスの分散安定性が低下する傾向がみられる。

該（Ｂ）成分の水酸基含有不飽和単量体としては、例え
ば２−ヒドロキソエチル（メタ）アクリレート［（メタ
）アクリレートはアクリレートとメタクリレートを表す
］、２−ヒドロキノプロピル（メタ）アクリレート、３
−ヒドロキンプロピル（メタ）アクリレート、グリセロ
ール（メタ）アクリレートなどが挙げられる。

これらの（Ｂ）成分の不飽和単量体は１種用いてもよい
し、２種以上を組み合わせて用いてもよく、また、その
使用量は、単量体混合物の重量に基づき０．１〜２０重
量％、好ましくは３〜１５重量％の範囲で選ばれる。こ
の量が０．１重量％未満では担体ラテックスの分散安定
性に劣るし、２０重量％を超えると重合安定性が低下す
るとともに得られる担体ラテックスの分散安定性がむし
ろ損なわれる傾向がみられる。

また、該（Ｃ）成分の多官能不飽和単量体としては、例
えばジビニルベンゼン、ジアリルフタレート、ジアリル
テレフタレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリ
レート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート
、トリエチレングリコールシ（メタ）アクリレート、ポ
リエチレングリコールン（メタ）アクリレート、１．４
−ブタンシオールン（メタ）アクリレート、１．３−ブ
チレングリコールシ（メタ）アクリレート、１．６−ヘ
キサンシオールジ（メタ）アクリレート、ネオベンチル
グリコールン（メタ）アクリレート、グリセロールジ（
メタ）アクリレート、２，２−ビス［４−（（メタ）ア
クリロキシエトキシ〕フェニル］プロパン、トリメチロ
ールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリス
リトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリ
トールトリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトー
ルテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトー
ルペンタ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトー
ルヘキサ（メタ）アクリレートなどが挙げられる。

これらの（Ｃ）成分の多官能不飽和単量体は１種用いて
もよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよく、また
、その使用量は、単量体混合物の重量に基づき００１〜
５０重量％、好ましくは０．５〜４５重量％の範囲で選
ばれる。この量が０１重量％未満では担体ラテックス粒
子が膨潤して該ラテックスの分散安定性が不十分となる
おそれがあるし、５０重量％を超えると担体ラテックス
粒子が凝集して該ラテックスの分散安定性が低下する傾
向がみられる。

さらに、該（Ｄ）成分のその他の不飽和単量体としては
、例えばメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）
アクリレート、ｎ−プロピル（メタ）アクリレート、イ
ソプロピル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）
アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、ｔ−
ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）ア
クリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、２
−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ドデシル（メ
タ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、（メタ）
アクリロニトリル、酢酸ビニル、スチレン、α−メチル
スチレン、塩化ビニルなどが挙げられる。これらの（Ｄ
）成分のその他の不飽和単量体は１種用いてもよいし、
２種以上を組み合わせて用いてもよい。

本発明の担体ラテックスは、前記の（Ａ）、（Ｂ）、（
Ｃ）及び（Ｄ）成分の混合物から成る単量体混合物を、
水性媒体中において、界面活性剤の存在下又は不在下に
、水溶性重合開始剤を用いて乳化重合させることにより
、製造することができる。このようにして得られた担体
ラテックスは粒径が均一で、分散安定性及び保存安定性
に優れたものである。

前記乳化重合における単量体混合物の水性媒体中での濃
度は、得られる担体ラテックスの平均粒子径とも関係す
るが、通常５〜３０重量％の範囲で選ばれる。

該乳化重合に用いる水溶性重合開始剤としては、通常、
過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウ
ムなどの過硫酸塩、あるいは、これら過硫酸塩とチオ硫
酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム、千オ硫酸水素ナトリ
ウムなどのチオ硫酸塩や亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸
カリウム、亜硫酸水素カリウムなどの亜硫酸塩とのレド
ックス系重合開始剤などが挙げられるが、もちろんこれ
らに限定されるものではない。

これらの重合開始剤は、不飽和単量体の合計量に対し、
通常０１〜１０重量％の割合で用いられる。

また、該乳化重合においては、水酸基含有不飽和単量体
を使用するために、界面活性剤を必ずしも添加しな（で
もよいが、界面活性剤を添加することにより、さらに分
散安定性に優れた担体ラテックスが得られる。この界面
活性剤については、特に制限はなく、例えばアルキル硫
酸塩、モノアルキルスルホコハク酸塩、アルキルエーテ
ル硫酸塩、ポリオキンエチレンアルキルフェニルエーテ
ル硫酸塩、アルキルリン酸エステル塩、アルキルエーテ
ルリン酸エステル塩などのアニオン性界面活性剤や、ポ
リオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシェチレ
ンアルキルフェニルエーテルなどのノニオン性界面活性
剤が用いられる。これらの界面活性剤は、乳化重合系の
全量に対して１０重量％以下の割合で用いられるが、通
常は１重量％前後の割合で用いられる。

重合温度については特に制限はなく、通常２０〜１００
℃、好ましくは４０〜９０°Ｃの範囲で選ばれる。

本発明においては、担体ラテックス粒子の平均粒子径は
０．０１〜２μｍ、好ましくは０．０５〜１μｍの範囲
にあることが必要である。この粒子径が０．０１μｍ未
満では担体ラテックスに対する種々の処理や操作におい
て担体ラテックス粒子の回収が困難であるし、２μｍを
超えると担体ラテックスの分散安定性が低下する。

このようにして得られた担体ラテックスの共重合体粒子
に、抗原又は抗体を共有結合により固定化することによ
り、本発明のラテックス診断薬が得られる。固定化する
抗原及び抗体については特に制限はな（、例えば変性ガ
ンマグロブリン、リウマチ因子、抗咳因子、ヒトアルブ
ミン、ヒトアルブミン抗体、イムノグロブリンＧ、イム
ノグロブリンＡ１イムノグロブリンＭ１ストレプトマイ
シンＯ、ストレブトマインン０抗体、Ｃ−反応性タンパ
ク、Ｃ−反応性タンパク抗体、α−フェトプロティン（
ＡＦＰ）　、ＡＦＰ抗体、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）　
、ＣＥＡ抗体、ヒト胎盤ラクトケン（ＨＰＬ）　、ＨＰ
Ｌ抗体、ニストロケン抗体、インシュリン抗体、Ｂ型肝
炎表面抗体（ＨＢＳ）、梅毒トリポネーマ抗原、風疹抗
原などの免疫活性物質を挙げることができる。

これらの抗原又は抗体を、前記担体ラテックス粒子に固
定化させる方法については特に制限はなく、従来より知
られている任意の方法を適用することができる。

本発明の診断薬用担体ラテックスは、前記の抗原や抗体
以外に共重合体粒子に、酵素を固定化し、診断薬として
用いることもできる。

［実施例］ 次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本
発明はこれらの例によってなんら限定されるものではな
い。

診断薬用担体ラテックス 実施例１ 撹拌機、冷却管、温度制御装置、窒素導入管及び滴下ロ
ートを備えた２ｆの反応容器に、脱イオン水５４６重量
部及びンオクチルスルホコハク酸ナトリウム６重量部を
入れ、窒素ガスで十分に置換したのち、８０℃に昇温し
、３０分間撹拌した。次いで、これに、過硫酸カリウム
０．５重量部を蒸留水５０重量部に溶解した重合開始剤
水溶液を加えたのち、滴下ロートから（Ｄ）メタクリル
酸メチル３１５重量部、（Ｂ）ヒドロキンプロピルメタ
クリレート７重量部、（Ｃ）エチレングリコールジメタ
クリレート１６．１重量部とジビニルベンゼン１１．９
重量部及び（Ａ）４−メタクリロイルオキシメチル−１
，３−ジオキソラン−２−オン３５重量部の混合液を３
時間で滴下し、さらに８０℃で２時間重合を続け、担体
ラテックスを得た。このラテックスの性状を第１表に示
す。

実施例２〜６、比較例１〜３ 実施例１と同様にして、第１表に示す単量体組成で担体
ラテックスを製造した。各担体ラテックスの性状を第１
表に示す。

（以下余白） ヒトＣＲＰ抗体固定化うテックス診断薬実施例７ 実施例１〜６及び比較例１〜３で得られた各担体ラテッ
クスを固形分濃度が５重量％になるように、ｐＨ８，２
に調整したグリノン緩衝溶液で希釈して、ラテックス希
釈液を調製した。

一方、山羊の産出した抗ヒトＣＲＰ血涜を塩析と透析で
γ−グロブリンに濃縮したのち、アフィニティークロマ
トグラフィーにより精製したヒトＣＲＰ抗体を１０００
μｇ　／　ｍ　ｌ含有するグリシン緩衝溶液から倍数希
釈法により希釈して精製ヒトＣＲＰ抗体希釈液を調製し
た。

先のラテックス希釈液Ｉ　Ｑ　ｍ　ｎとこの精製ヒトＣ
ＲＰ抗体希釈液１０ｍ１とを混合して、室温で２時間放
置し、次いでこの混合液を遠心分離したのち、ｐＨ８，
２のグリシン緩衝溶液で固形分濃度が０．５重量％にな
るように希釈して、ヒトＣＲＰ抗体固定化うテックス診
断薬を得た。

このようにして得られたヒトＣＲＰ抗体固定化うテック
ス診断薬の評価を、抗原抗体反応によるラテックス粒子
の凝集の捏度を観察することにより行った。

すなわち、ヒトＣＲＰをｐＨ８，２のグリシン緩衝溶液
で２０倍に希釈したものを原液とし、ｐＨ８，２のグリ
シン緩衝溶液で倍数希釈法により希釈して、ヒトＣＲＰ
希釈液を調製した。次に、これをガラス製の１０穴のホ
ールグラスの各ホールに０．０４ｍ１ずつとり、次いで
ヒトＣＲＰ抗体固定化うテックス診断薬を各ホールに０
．０４ｍ１ずつ加え、ただちにホールグラスを１５０ｒ
ｐｍで３分間水平回転して混合し、回転停止後のラテッ
クス粒子の凝集を観察し、次の判定基準に従って評価し
た。

一：凝集が全くみられない ±：凝集の有無が判定しにくい ＋：明らかに凝集がみられる ＋＋：強い凝集がみられる ＋＋十：さらに強い凝集がみられる また、ラテックス診断薬調製後３か月経過したのちの保
存安定性を次のようにして求めた。

すなわち、ヒトＣＲＰ抗体固定化ラテックス診断薬を、
４℃の冷蔵庫で３か月保存したのち、固形分濃度が０．
１重量％になるように、ｐＨ８，２のグリシン緩衝溶液
で希釈し、軽く振とうしたのちの分散状態を２００倍の
光学顕微鏡で観察して下記の判定基準に従って保存安定
性を評価した。

Ａ：均一であって、凝集が認められない。

Ｂ：肉眼では認められないが、顕微鏡では凝集の存在が
認められる。

Ｃ：肉眼でもよくみると、凝集が認められる。

Ｄ：肉眼で明瞭な凝集が認められる。

これらの結果を第２表に示す。

第２表から、本発明のヒトＣＲＰ抗体固定化ラテックス
診断薬は、ヒトＣＲＰ希釈液と反応して低濃度でもラテ
ックス粒子が凝集することが分かる。また、この診断薬
は３か月経過してもラテックス粒子の凝集を起こさず、
保存安定性に優れていることが分かる。

スペーサー基含有ヒトｃＲＰ抗体固定化うテックス診断
薬 実施例８ 実施例１〜６及び比較例１〜３で得られた診断薬用担体
ラテックスを固形分濃度が５重量％になるようにｐＨ８
，２のグリシン緩衝溶液で希釈したのち、この溶液１．
０ｍｌにｍ−キンリレンジアミン水溶液（０，０３ｍｏ
ｆ／ｆ）を１０ｍ１加え、室温で３時間反応させた。次
いで反応混合物を遠心分離洗浄して、未反応ｍ−キシリ
レンンアミンを除去したのち、ｐＨ８，２のグリシン緩
衝溶液で固形分濃度が５重量％になるように分散させて
スペーサー化ラテックス分散液を得た。次に、この分散
液１０　ｍ　ｌに、１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド２０　ｍ　ｇを蒸留水２
　ｍ　ｌに溶解させた水溶液と実施例７で調製した精製
ヒトＣＲＰ抗体希釈液１０ｍｌとを加えて混合し、室温
で３時間反応を行った。次いでこの混合溶液を遠心分離
したのち、ｐＨ８，２のグリシン緩衝溶液で固形分濃度
が０５重量％になるように調整し、スペーサー基含有ヒ
トＣＲＰ抗体固定化うテンクス診断薬を得た。

このようにして得られたラテックス診断薬について、実
施例７と同様な方法で抗原抗体反応を行うとともに、保
存安定性を求めた。その結果を第３表に示す。

第３表から、本発明のスペーサー基含有ヒトＣＲＰ抗体
固定化ラテックス診断薬は、ヒトＣＲＰ希釈液と反応し
て、低濃度でもラテックス粒子が凝集することが分かる
。また、この診断薬は３か月経過してもラテックス粒子
の凝集を起こさず保存安定性に優れることが分かる。

（以下余白） ［発明の効果］ 本発明の診断薬用担体ラテックスは、常温で選択的に抗
原又は抗体を共有結合により固定化して感作することが
でき、この感作したものは、抗原又は抗体が非特異的凝
集反応を起こしにく（て、感度が高い上、保存安定性に
優れているため、ラテックス診断薬として極めて有用で
ある。

また、該担体ラテックスは酵素を固定化することもでき
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １（Ａ）一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中のＲ＾１、Ｒ＾２及びＲ＾３は、それぞれ水素原
   子又は炭素数１〜４のアルキル基であり、それらは同一
   であってもよいし、たがいに異なっていてもよい） で表されるシクロカーボネート基を有する不飽和単量体
   ０．１〜２０重量％、 （Ｂ）水酸基含有不飽和単量体０．１〜２０重量％、 （Ｃ）多官能不飽和単量体０．１〜５０重量％及び （Ｄ）その他の不飽和単量体残部から成る単量体混合物
   を乳化重合させて得られた平均粒子径０．０１〜２μｍ
   の共重合体粒子を含有して成る診断薬用担体ラテックス
   。 ２　請求項１記載の診断薬用担体ラテックスの共重合体
   粒子に抗原又は抗体を固定化させて成る診断薬。