JPH0420290A

JPH0420290A - 新規キトサナーゼｕｔｋとその製造法及び生産菌

Info

Publication number: JPH0420290A
Application number: JP11999390A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Uchida; 泰内田; Osamu Shinoda; 信太　治
Original assignee: Higeta Shoyu Co Ltd
Current assignee: Higeta Shoyu Co Ltd
Priority date: 1990-05-11
Filing date: 1990-05-11
Publication date: 1992-01-23
Anticipated expiration: 2009-09-28
Also published as: JPH0675503B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は新規なキトサン分解酵素、キトサナーゼＵＴＫ
　とその製造法及び生産菌に関するものである。

更に詳細には、本発明はキトサンを加水分解してキトオ
リゴ糖を生成する新規なキトサン分解酵素、キトサナー
ゼＬＩＴＫ　とその製造法及び生産菌に関するものであ
る。

（従来技術）キトサンは、蟹や海老の甲殻中に含まれるキチンを脱ア
セチル化して得られるＤ−グルコサミンのβ−１，４重
合体である。

近年、キ１−サンは金属の選択的吸着剤、廃水処理の凝
集剤、フィルム、手術の縫合糸等非常に広い用途で有用
な物質として注目されている。

また、キ１−サンの加水分解物であるキトオリゴ糖にも
抗細菌性、杭カビ性及び抗腫瘍活性のあることが明らか
にされ、食品の保存剤、抗植物病原製剤それに次薬品と
しての用途開発に期待が寄せられている。

一般的に、キトオリゴ糖を得る方法としては、酸または
アルカリによって加水分解することによって得ることが
可能であるが、オリゴマーの収率が非常に悪い。また、
例えば、塩酸でキトサンを加水分解した場合、ランダム
な分解の結果、得られるオリゴ糖の量はモノ−グルコサ
ミン、ジ−グルコサミン、トリーグルコサミン、テ）〜
ラーグルコサミンの順であり、重合度の大きい程その収
量は減少する。

しかしながら、キトオリゴ糖の生理活性は重合度の比較
的大きい部分に顕著で、キトサンを分解して、重合度が
大きく、種々の重合度の異なるオリゴ糖に得ることがで
き、しかも力価の高いキ１〜サン分解酵素が求められて
いるのである。

従来、微生物によるキ１〜サン分解酵素の生産について
は既に特開昭６２−２０１．５７１、特開昭６３−９４
９７１、＋１ｅ＋：１ｇｅｓ、　Ａ、、　ａｔ、　ａｌ
、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１２０．８４４
（１９７４）、Ｔｏｍｉｎａｇａ＋　ｙ、ｌ　ｅｔ、　
ａｌ、、、　Ｂｊｏｃｈｉｍ、　Ｂｊ。

ｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　４１０．１４５（＋９７５）
等の報告があるが、産業上有効に利用できる程のキトサ
ン分解酵素生産菌についての報告はない。

本発明者らは、広範な微生物についてキトサン分解酵素バチルスｓｐ、１ＩＴＫが、新規なキトサン分解酵素を
生産することを見いだし、この酵素をキｌ〜サナーゼＩ
ＪＴＫと命名するに到った。

本発明のキ１−サナーゼＵＴＫの理化学的性質は下記の
とうりである。

（１）作用：キ１−サンに作用し、これを分解しキトオ
リゴ糖を生成する。

（２）至適ｐＨ：塩酸−酢酸すＩ〜リウム緩衝液、酢酸
緩衝液、Ａｔｏｋｊ、ｎｓ　＆　Ｐａｎｔｉｎ’ｓ緩衝
液を用いた場合、至適ρ１１は５゜６である（第１−図
）。

（３）　ｐＨ安定性：塩酸−酢酸ナトリウム緩衝液、Ｍ
ｃｌ　Ｊｖａ］ｎｅ’ｓ緩衝液、ＡＬｏｋｊｎｓ　＆　
Ｐａｎｔｊｎ’ｓ緩衝液で３７℃で３時間保温した酵素
の残存活性を測定した結果、Ｐ１１５〜９で安定である
（第２図）。

（５）熱安定性：　０．０５Ｍ酢酸緩衝液（Ｐ＋＋　５
．５）で２０℃〜１００℃の各温度で１５分間保温し、
残存活性をｉｆｆ！ｌ定した場合４０℃まで安定である
（第４図）。

（６）酵素活性の測定法：酵素活性は基質にキトサンを
１−％／ＬＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，７）とし
たものを用いた。

この基質をｉｍＱと酵素溶液Ｊ−ＩＩＱを３７℃で１０
分間反応させた後、１００℃にて１０分間煮沸し、反応
を停止させた。

生成したグルコサミンは５ｃｈａｌｅｓ変法（Ｉｍｏｔ
ｏ。

Ｔ、、　ｅｔ、　ａｌ、、　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｊｏｌ、
　Ｃｈｅｍ、、　３５．１１５４（１９７１））にて測
定した。なお酵素単位は１分間当り１μモルのグルコサ
ミンに相当する還元力を増加させる活性を１単位とした
。

（７）金属イオン等の影響０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）にて希釈した酵素
溶液２ｍＭに、４Ｘ］、０−３Ｍ各試薬溶液１ｍＱ＆加
え、３７℃で１５分間保温する。その後基質１ｍＱを加
え、１０分間酵素反応を行い、残存活性を調べた。尚、
試薬の代わりに蒸留水を用いたものを１００％とした相
対活性で比較を行った。

表　１　金属等の影響阻害物　　残存活性（％）　　阻害物　　残存活性（％
）無添加　　　１００　　　　　　　ＫＣＱ　　　　　
　９３．２ＡｇＮＯ３６，１，Ｋ２ＣｒＯ７０，８Ａ（
１，（ＳＯ，）３３．４　　　　　　Ｍｇ５ｏ、　　　
　　８４．１ＢａＣＱ２８３．２　　　　　　ＭｎＣＱ
、　　　　　１．０５ＣａＣＱ、］　１０　　　　　　
　ＮａＣＱ２１０６ＣｄＣＱ、、　　　　　２６．３　
　　　　　ＮｉＣｌ１．、　　　　３４．０ＣｏＣＱ２
８８．９　　　　　　ＰｂＣ１１１，、９，２ＣＬＩＣ
Ｑ７．　　　　　６．６　　　　　　Ｚｎ（ＣＨａＣＯ
Ｏ）　　　２６．５ＦｅＳ０４５．８　　　　　　ＰＣ
ＭＢ　　　　　　１１．９μｇＣＱ、１１．９　　　　
　　ＥＤＴＡ　　　　　　７４．４ＩＣＨ２ＣＯＯＨ２
］、８以上の結果からこのキトサン分解酵素はＡｇ＋、ＡＱ”
、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２４、Ｈｇ　２”、ｐ　ｂ　２　＋、
ＰＣＢＭ　＆こより阻害される。

（８）酵素の精製法本酵素のｍ離、精製は常法に従って行うことが出来る。

培養液より菌体を除き、その」澄液液を０．０２Ｍリン
酸緩衝液にたいして透析し、低分子画分を除き、この透
析画分をコロイダルキトサンに吸着させ、この吸着画分
を遠心によりあつめ、沈澱物に２Ｍの塩化ナトリウムを
含む０．０２Ｍリン酸緩衝液を加え溶出し、遠心により
上澄液を果める。

この］二澄液をＣトセファテックスＣ−５０カラムクロ
マ１−グラフィー（第５図）などの精製手段によって精
製される。

（９）分子−量本酵素の分子量はセファアクリル５−２００を用いた、
ゲル濾過法により測定すると、２８　、０００と計算さ
れる。結果は第６図に示した。

本発明のキ１ヘサナーゼＵＴＫ生産菌、バチルスｓｐ。

ＩＪＴには微工研にＦＩＥＲＭ　Ｐ−１１４４２として
寄託されており、また、バチルスｓｐ、ＵＴＫの菌学的
性質は次に示される。

（Ａ）形態的性質（肉汁寒天培地）細胞の大きさ＝　　　４μ〜６μ×１μ〜１．５μ細胞
の形：　　　　　桿菌細胞の多形性の有無：無運動性の有無：　　　無胞子の有無：　　　　有ダラム染色：　　　　培養１８〜４時間　陽性（Ｂ）生
理学的性質カタラーゼ：　　　　　　　　　＋オキシダーゼ：　　　　　　　　十メチルレット： ■−Ｐテスト：　　　　　　　＋（ｐｉｆ　５．５）ゼラチンの液化；　　　　　　　＋澱粉の加水分解：　　　　　　　＋ウレアーゼ：クエン酸の資化性Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ　：硫化水素
の生成ＴＳＩ　：　　　　　　十インドールの生成：脱窒反応：亜硝酸塩の還元：０−１７テスト：　　発酵酸素の影響：　　　微好気性耐熱性二９０℃ 生育ｐＨ：　　　　　　ｐＨ５〜９糖類からの酸及びガスの生成糖の種類　　　　ガスの生成グルコースマンノースシュークロースラムノースラクトースフル１ヘースセロビオースラフィノース澱粉グリセリンソルビットイノシソ１− 食塩耐性　５％　　　＋７％　　　＋酸の生成本発明においては、バチルスｓｐ　、　ＵＴＫを培養培
地で好気的に培養し、培養中にキトサナーゼＵＴＫを蓄
積させることができる。

得られた培養液を遠心分離して、上清液を粗酵素液とし
、この粗酵素液を透析して、低分子物質を除去し、コロ
イダルキトサンを利用した吸着法によって精製し、更に
陽イオン交換カラムクロマ１−グラフィーによって精製
し、高力価キトサナーゼＵＴＫ　を得ることができる。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１バチルスｓｐ、ＵＴＫ、　ＦＩＥＲＭ　Ｐ−］、］、４
４２を三角フラスコ中でペプトン２．０％、肉エキス１
．０％、酵母エキス０．６％、食塩０．５％（ｐＨ５，
０）の組成を有する培地５０ｍＱに植菌し、３０℃で２
日間培養する。これを種菌として、同じ組成の培地ＩＱ
に接種し、３０℃で２日間培養を行った。

次に、この培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ　Ｘ　
１５分）し、上澄液を集めて粗酵素液とした。得られた
粗酵素液は、０．０２Ｍリン酸緩衝液に対して透析し低
分子物質を除いた。

この透析内液５容に対してコロイダルキ１ヘサン（調製
法：キトサンＬｏｇに脱イオン水５００ｍＱを加えて膨
潤させ、ＩＭＭ酸９０ｍＱを加えて溶解させる。

これに１Ｍ酢酸すｌ−リウム２５０ｍＱを加えて、ＩＮ
水酸化カリウムでｐＨを８に調整する。次に、ブレンタ
ーで撹拌して均一なコロイド状にする。これを必要時遠
心分離し、沈澱のみを使用。）を加えて吸着させた。

この吸着物を遠心分離し、上澄みを捨て、０．０２Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　］容を加え沈澱を遠心洗浄
した。

続いて、沈澱に３Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）を２容加え３７℃で１時間
振盪させ、吸着した酵素を溶出させた。この溶出画分を
０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に対して透析し
脱塩した。

続いてＣＭ−セファデックスＣ−５０による陽イオン交
換クロマＩ−グラフイ螢行い、０．０５Ｍリン酸緩衝液
（Ｏ〜０，６Ｍ塩塩化ナトリフ１１直線濃度勾配：ｐｌ
ｉ７．０）で溶出し、活性画分を集めた。この活性画分
を透析により脱塩し、凍結乾燥することにより２５ｍｇ
のキＩ−ザナーセＩＩＴＫを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はキｌ−サナーゼｔｌＴＫの至適［〕１１を示す
図で、第２図はそのｐＨ安定性を示す図で、第３図はそ
の至適温度を示す図で、第４図はその熱安定性を示す図
で、第５図は実施例１の精製におけるキ１−サナーゼＬ
ＩＴＫのＣトセファデソクスＣ−５０カラムタロマｈグ
ラフイーを示す図である。第６図はキＩ−サナーゼＵＴＫの分子量の測定図である
。代理人　弁理士　戸　ＩＴＩ　　親　男第図ｉ−１最適一１− Ａｔｋｉｎｓ　＆　Ｐａｎｔ　ｉｎ’　ｓｕｆｆｅｒ＋２第図ｐＨ安定一イ）− Ｒｉ　ｎｇｅ　ｒｕｆｆｅｒ第図（℃）最適温度第図（’Ｃ）熱安定性手続補正帯平成　３年５月２９日

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次の理化学的性質を有するキトサナーゼＵＴＫ（
ａ）作用：キトサンに作用し、これを加水分解しキトオ
リゴ糖を生成する。（ｂ）至適ｐＨ：ｐＨ５．６（塩酸−酢酸ナトリウム緩
衝液、酢酸緩衝液、Ａｔｏｋｉｎｓ＆Ｐａｎｔｉｎ’ｓ
緩衝液を用いた場合）（ｃ）ｐＨ安定性：塩酸−酢酸ナトリウム緩衝液、Ｍｃ
ｌｌｖａｉｎｅ’ｓ緩衝液、Ａｔｏｋｉｎｓ＆Ｐａｎｔ
ｉｎ’ｓ緩衝液で３７℃で３時間保温した酵素の残存活
性を測定した結果、ｐＨ５〜９で安定である。（ｄ）至適温度：５０℃ （ｅ）熱安定性：０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）
で２０℃〜１００℃の各温度で１５分間保温し、残存活
性を測定した場合４０℃まで安定である。
（２）バチルス属に属するキトサナーゼＵＴＫ生産菌を
培養し、培養物からキトサナーゼＵＴＫを採取すること
を特徴とするキトサナーゼＵＴＫの製造法。
（３）バチルスｓｐ．ＵＴＫ。