JPH0675503B2

JPH0675503B2 - 新規キトサナーゼｕｔｋとその製造法及び生産菌

Info

Publication number: JPH0675503B2
Application number: JP2119993A
Authority: JP
Inventors: 泰内田; 治信太
Original assignee: ヒゲタ醤油株式会社
Priority date: 1990-05-11
Filing date: 1990-05-11
Publication date: 1994-09-28
Anticipated expiration: 2009-09-28
Also published as: JPH0420290A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は新規なキトサン分解酵素、キトサナーゼUTKと
その製造法及び生産菌に関するものである。

更に詳細には、本発明はキトサンを加水分解してキトオ
リゴ糖を生成する新規なキトサン分解酵素、キトサナー
ゼUTKとその製造法及び生産菌に関するものである。

（従来技術）キトサンは、蟹や海老の甲殻中に含まれるキチンを脱ア
セチル化して得られるＤ−グルコサミンのβ−1,4重合
体である。

近年、キトサンは金属の選択的吸着剤、廃水処理の凝集
剤、フイルム、手術の縫合糸等非常に広い用途で有用な
物質として注目されている。

また、キトサンの加水分解物であるキトオリゴ糖にも抗
細菌性、抗カビ性及び抗腫瘍活性のあることが明らかに
され、食品の保存剤、抗植物病原製剤それに医薬品とし
ての用途開発に期待が寄せられている。

一般的に、キトオリゴ糖を得る方法としては、酸または
アルカリによって加水分解することによって得ることが
可能であるが、オリゴマーの収率が非常に悪い。また、
例えば、塩酸でキトサンを加水分解した場合、ランダム
な分解の結果、得られるオリゴ糖の量はモノ−グルコサ
ミン、ジ−グルコサミン、トリ−グルコサミン、テトラ
−グルコサミンの順であり、重合度の大きい程その収量
は減少する。

しかしながら、キトオリゴ糖の生理活性は重合度の比較
的大きい部分に顕著で、キトサンを分解して、重合度が
大きく、種々の重合度の異なるオリゴ糖を得ることがで
き、しかも力価の高いキトサン分解酵素が求められてい
るのである。

従来、微生物によるキトサン分解酵素の生産については
既に特開昭62−201571、特開昭63−94971、Hedges,A.,e
t.al.,J.Bacteriol.,120,844（1974）、Tominaga,Y.,e
t.al.,Biochim.Bio−phys.Acta,410,145（1975）等の報
告があるが、産業上有効に利用できる程のキトサン分解
酵素生産菌についての報告はない。

本発明者らは、広範な微生物についてキトサン分解菌を
検索した結果、バチルス属に属する細菌、バチルスsp.U
TK（現在は、バチルス・リケニホルミスUTKと固定され
ている。）が、新規なキトサン分解酵素を生産すること
を見いだし、この酵素をキトサナーゼUTKと命名するに
到った。また、キトサナーゼUTKは、培地にキトサン、
コロイダルキトサン等の誘導物質を加えることなく、構
成的に生産される酵素である。

本発明のキトサナーゼUTKの理学化的性質は下記のとう
りである。

（１）作用及び基質特異性：キトサンに作用し、これを
分解しキトオリゴ糖を生成する。粉末キトサン、50％脱
アセチル化チキンにも作用するが、カルボキシメチルセ
ルロース（CMC）には全く作用しない。

（２）至適pH:塩酸−酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸緩衝
液、Atokins＆Pantin′ｓ緩衝液を用いた場合、至適pH
は5.6である（第１図）。

（３）pH安定性：塩酸−酢酸ナトリウム緩衝液、Mcllva
ine′ｓ緩衝液、Atokins＆Pantin′ｓ緩衝液で37℃で３
時間保温した酵素の残存活性を測定した結果、pH5〜９
で安定である（第２図）。

（５）熱安定性:0.05M酢酸緩衝液（pH5.5）で20℃〜100
℃の各温度で15分間保温し、残存活性を測定した場合40
℃まで安定である（第４図）。

（６）酵素活性の測定法：酵素活性は基質にキトサンを
１％/1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.7）としたもを用い
た。

この基質を1mlと酵素溶液1mlを37℃で10分間反応させた
後、100℃にて10分間煮沸し、反応を停止させた。

生成したグルコサミンはSchales変法（Imoto,T.,et.a
l.,Agric.Biol.Chem.,35,1154（1971））にて測定し
た。なお酵素単位は１分間当り１μモルのグリコサミン
に相当する還元力を増加させる活性を１単位とした。

（７）金属イオン等の影響 0.05M酢酸緩衝液（pH5.5）にて希釈した酵素溶液2ml
に、４×10^-3Ｍ各試薬溶液1mlを加え、37℃で15分間保
温する。その後基質1mlを加え、10分間酵素反応を行
い、残存活性を調べた。尚、試薬の代わりに蒸留水を用
いたものを100％とした相対活性で比較を行った。

以上の結果からこのキトサン分解酵素はAg⁺、Al³⁺、Cu
²⁺、Fe²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、PCBMにより阻害される。

（８）酵素の精製法本酵素の単離、精製は常法に従って行うことが出来る。
培養液より菌体を除き、その上澄液を0.02Mリン酸緩衝
液に対して透析し、低分子画分を除き、この透析画分を
コロイダルキトサンに吸着させ、この吸着画分を遠心に
より集め、沈澱物に2Mの塩化ナトリウムを含む0.02Mリ
ン酸緩衝液を加え溶出し、遠心により上澄液を集める。

この上澄液をCM−セファデックスＣ−50カラムクロマト
グラフィー（第５図）などの精製手段によって精製され
る。

（９）分子量本酵素の分子量はセファアクリルｓ−200を用いた、ゲ
ル濾過法により測定すると、28,000と計算される。結果
は第６図に示した。

本発明のキトサナーゼUTK生産菌、バチルスsp.UTKは微
工研にFERM P−11442として寄託されており（現在は、
バチルス・リケニホルミスUTK（Bacillus licheniformi
s UTK）と固定され、先のFERM P−11442より移管されて
FERM BP−3794として寄託されている。）、バチルスsp.
UTK（すなわち、バチルス・リケニホルミスUTK）の菌学
的性質は次に示される。

（Ａ）形態的性質（肉汁寒天培地）細胞の大きさ： 3.5μ〜5.0μx0.5μ〜0.9μ 細胞の形：桿菌細胞の多形性の有無：無運動性の有無：有周鞭毛胞子の有無：有グラム染色：培養18〜48時間陽性（Ｂ）生理学的性質カタラーゼ：＋オキシダーゼ：＋メチルレッド： − Ｖ−Ｐテスト：＋（pH5.5）ゼラチンの液化：＋澱粉の加水分解：＋ウレアーゼ： − クエン酸の資化性Christensen: ＋硫化水素の精製TSI: ＋インドールの生成： − 脱窒反応：＋亜硝酸塩の還元： − Ｏ−Ｆテスト：発酵酸素の影響：微好気性耐熱性： 90℃ 生育pH: pH5〜９糖類からの酸及びガスの生成糖の種類ガスの生成酸の生成グルコース − ＋マンノース − ＋シュークロース − ＋ラムノース − − ラクトース − − マルトース − − セロビオース − ＋ラフィノース − − 澱粉 − ＋グリセリン − ＋ソルビット − − イノシット − − 食塩耐性５％＋７％＋本発明においては、バチルス・リケニホルミスUTKを培
養培地で好気的に培養し、培養中にキトサナーゼUTKを
蓄積させることができる。

得られた培養液を遠心分離して、上清液を粗酵素液と
し、この粗酵素液を透析して、低分子物質を除去し、コ
ロイダルキトサンを利用した吸着法によって精製し、更
に陽イオン交換カラムクロマトグラフィーによって精製
し、高力価キトサナーゼUTKを得ることができる。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１バチルス・リケニホルミスUTK（FERM BP−3794）を三角
フラスコ中でペプトン2.0％、肉エキス1.0％、酵母エキ
ス0.6％、食塩0.5％（pH5.0）の組成を有する培地50ml
に植菌し、30℃で２日間培養する。これを種菌として、
同じ組成の培地１に接種し、30℃で２日間培養を行っ
た。

次に、この培養液を遠心分離（8,000rpm×15分）し、上
澄液を集めて粗酵素液とした。得られた粗酵素液は、0.
02Mリン酸緩衝液に対して透析し低分子物質を除いた。

この透析内液５容に対いてコロイダルキトサン（調製
法：キトサン10gに脱イオン水500mlを加えて膨潤させ、
1M酢酸90mlを加えて溶解させる。これに1M酢酸ナトリウ
ム250mlを加えて、1N水酸化カリウムでpHを８に調整す
る。次に、ブレンダーで撹拌して均一なコロイド状にす
る。これを必要時遠心分離し、沈澱のみを使用。）を加
えて吸着させた。

この吸着物を遠心分離し、上澄みを捨て、0.02Mリン酸
緩衝液（pH7.5）１容を加え沈澱を遠心洗浄した。

続いて、沈澱に3Mの塩化ナトリウムを含む0.02Mリン酸
緩衝液（pH7.5）を２容加え37℃で１時間振盪させ、吸
着した酵素を溶出させた。この溶出画分を0.05Mリン酸
緩衝液（pH7.0）に対して透析し脱塩した。

続いてCM−セファデックスＣ−50による陽イオン交換ク
ロマトグラフィを行い、0.05Mリン酸緩衝液（０〜0.6M
塩化ナトリウムの直線濃度勾配:pH7.0）で溶出し、活性
画分を集めた。この活性画分を透析により脱塩し、凍結
乾燥することにより25mgのキトサナーゼUTKを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はキトサナーゼUTKの至適pHを示す図で、第２図
はそのpH安定性を示す図、第３図はその至適温度を示す
図で、第４図はその熱安定性を示す図で、第５図は実施
例１の精製におけるキトサナーゼUTKのCM−セファデッ
クスＣ−50カラムクロマトグラフィーを示す図である。第６図はキトサナーゼUTKの分子量の測定図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:10）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の理化学的性質を有するキトサナーゼUT
K （ａ）作用及び基質特異性：キトサンに作用し、これを
加水分解しキトオリゴ糖を生成する。粉末キトサン、50
％脱アセチル化キチンにも作用するが、カルボキシメチ
ルセルロース（CMC）には全く作用しない。（ｂ）至適pH:pH5.6（塩酸−酢酸ナトリウム緩衝液、酢
酸緩衝液、Atokins＆Pantin′ｓ緩衝液を用いた場合）（ｃ）pH安定性：塩酸−酢酸ナトリウム緩衝液、Mcllva
ine′ｓ緩衝液、Atokins＆Pantin′ｓ緩衝液で37℃で３
時間保温した酵素の残存活性を測定した結果、pH5〜９
で安定である。（ｄ）至適温度:50℃ （ｅ）熱安定性:0.05M酢酸緩衝液（pH5.5）で20℃〜100
℃の各温度で15分間保温し、残存活性を測定した場合40
℃まで安定である。
【請求項２】バチルス属に属するキトサナーゼUTK生産
菌を培養し、培養物からキトサナーゼUTKを採取するこ
とを特徴とするキトサナーゼUTKの製造法。
【請求項３】キトサナーゼUTKを生産するバチルス・リ
ケニホルミス。