JPH04210595A - Ｔｘａ２受容体およびそれをコードする遺伝子 - Google Patents
Ｔｘａ２受容体およびそれをコードする遺伝子Info
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- JPH04210595A JPH04210595A JP2410885A JP41088590A JPH04210595A JP H04210595 A JPH04210595 A JP H04210595A JP 2410885 A JP2410885 A JP 2410885A JP 41088590 A JP41088590 A JP 41088590A JP H04210595 A JPH04210595 A JP H04210595A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
［０００１］
【産業上の利用分野】本発明はＴＸＡ２受容体をコード
する遺伝子、該遺伝子を用いるＴＸＡ２受容体の製造法
、該製造法により得られるＴＸＡ２受容体、該遺伝子を
発現する宿主、該遺伝子と特異的にハイブリダイズする
プローブ、および該プローブを用いる該遺伝子の検出法
に関する。 ［００Ｏ２］
する遺伝子、該遺伝子を用いるＴＸＡ２受容体の製造法
、該製造法により得られるＴＸＡ２受容体、該遺伝子を
発現する宿主、該遺伝子と特異的にハイブリダイズする
プローブ、および該プローブを用いる該遺伝子の検出法
に関する。 ［００Ｏ２］
【従来の技術】トロンホキサシ（ＴＸ）Ａ２は非常に不
安定なアラキドン酸代謝産物で、強力な血小板凝集因子
であり、かつ、血管および器官平滑筋の収縮作用を有す
る。 また、ＴＸＡ２は、心筋梗塞、発作、および気管支喘息
のような疾病の媒介物質であることが示唆されている。 本発明ｎらは、先に、ＴＸＡ２の安定な誘導体Ｓ−１４
５を用いることにより、ヒＩ〜血小板ＴＸＡ２受容体を
見かけ上純粋になるまで精製した（Ｕｓｈｉｋｕｂｉ、
Ｆ、ら、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２６４゜１
６４９１−１６５０１ （１９８９））。 ［０００３］
安定なアラキドン酸代謝産物で、強力な血小板凝集因子
であり、かつ、血管および器官平滑筋の収縮作用を有す
る。 また、ＴＸＡ２は、心筋梗塞、発作、および気管支喘息
のような疾病の媒介物質であることが示唆されている。 本発明ｎらは、先に、ＴＸＡ２の安定な誘導体Ｓ−１４
５を用いることにより、ヒＩ〜血小板ＴＸＡ２受容体を
見かけ上純粋になるまで精製した（Ｕｓｈｉｋｕｂｉ、
Ｆ、ら、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２６４゜１
６４９１−１６５０１ （１９８９））。 ［０００３］
【発明が解決しようとする課題］ ＴＸＡ２を含む生物
学的に活性なアラキドン酸代謝物は、総称してエイコサ
ノイドと呼ばれ、３０以上の物質からなる大きなファミ
リーであり、そのファミリーのそれぞれが特異的な受容
体に作用し、種々の活性を表わす。このファミリーに属
する物質の受容体の構造は、未だ解明されていない。こ
のファミリーに属する１つの物質の受容体の構造が明ら
かになれば、その他の物質の受容体構造の解明が容易に
なり、病態生理学的に重要なこれらの物質を制御する、
より選択的な薬剤の開発が可能になる。ＴＸＡ２受容体
に特異的に結合する薬剤の探索やＴＸＡ２受容体そのも
のの研究には、比較的大量のＴＸＡ２受容体が必要であ
るが、それに必要な量のＴＸＡ２受容体を供給し得る手
段が無いのが現状である。また、ＴＸＡ２受容体を発現
する細胞は、そのアゴニスＩ−やアンタゴニストの探索
や、受容体からの信号伝達機構の解明研究に必須である
が、現在、容易に充分に得ることはできない。さらに、
現在、ヒト細胞中のＴＸＡ２受容体遺伝子の発現を、特
異的に検出する手段も無い。 ［０００４］ 【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒト血小
板ＴＸＡ２受容体のアミノ酸配列の一部に対応するオリ
ゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒｌ〜胎盤からこの
受容体をコードするｃＤＮＡクローンを単離し、またヒ
ト巨核細胞性白血病細胞の培養物から部分的なりローン
を単離した。その胎盤ｃＤＮＡは３４３個のアミノ酸か
らなるタンパク質をコードし、このタンパク質は７つの
膜通過部位を有していると推定された。Ｃ０８−７細胞
で発現されたこのタンパク質は、血小板ＴＸＡ２受容体
と同じ親和性で種々の試薬と結合し、Ｘｅｎｏｐｕｓ
ＯＯＣ’ｙｔｅで発現されたものはアゴニス１へ刺激に
よりＣａ２”活性化ＣＩ−チャンネルを開いた。ノーザ
ンブロツ１−分析および上記２つのクロンのヌクレオチ
ド配列の決定により、血小板および血管組織に存在する
ＴＸＡ２受容体は同一のちのであることが示唆された。 ［０００５１本発明によるＴＸＡ２受容体のアミノ酸配
列および遺伝子配列の決定により、ＴＸＡ２が属するフ
ァミリーの他の物質の受容体構造の解明が容易になる。 本発明はまた、該遺伝子を宿主中で発現させるＴＸＡ２
受容体の製造法、および、それにより得られるＴＸＡ２
受容体を提供し、これにより、病態生理学的に重要な媒
介物質を制御する、より選択的な薬剤の開発が可能にな
る。本発明はさらに、該遺伝子を発現する宿主を提供し
、これにより、ＴＸＡ２受容体のアゴニストやアンタゴ
ニストの探索や、受容体からの信号伝達機構の解明研究
を行なうことができる。最後に、本発明は、該遺伝子と
特異的にハイブリダイズするプローブを提供するもので
あり、これにより該遺伝子の特異的な検出が可能になっ
た。 ［０００６］すなわち、本発明はまず、ＴＸＡ２受容体
をコードする遺伝子を提供し、好ましくは、該ＴＸＡ２
受容体は配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するも
のである。本発明で言うＴＸＡ２受容体をコードする遺
伝子とは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列をコード
するものだけでなく、ＴＸＡ２受容体活性を有する、特
に下記のＳ−１４５と特異的に結合する受容体タンパク
質をコードする全ての遺伝子を意味する。この遺伝子は
、受容体のコード領域だけでなくその前後に、プロモー
ター／オペレーター配列、ＳＤ配列、ターミネータ−、
ポリアデニル化信号などの、発現に有用な配列を有して
いてもよく、該受容体の発現を阻害しない配列であれば
如何なる配列を有していてもよい。従って、該遺伝子を
有するプラスミドやウィルス遺伝子、該遺伝子の発現ベ
クターも本発明に含まれる。また、ここで言う遺伝子と
は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを意味するが、その
一方に限定されるものではない。 ［０００７１本発明は、上記遺伝子を宿主中で発現させ
ることを特徴とするＴＸＡ２受容体の製造法および該製
造法により得られるＴＸＡ２受容体を提供する。該宿主
は、真核細胞であることが望ましい。本発明の製造法に
は、ＤＮＡのみならず、ｍＲＮＡを用いてもよい。本発
明のＴＸＡ２受容体は、配列番号：１．に記載のアミノ
酸配列を有するものだけでなく、ＴＸＡ２受容体活性を
有する、特に下記のＳ、−１４５と特異的に結合する受
容体タンパク賃金てを意味する。 ［０００８］本発明は、上記遺伝子を発現する宿主をも
提供する。該宿主としては、真核細胞、特に、Ｘｅｎｏ
ｐｕｓの卵母細胞やＣＯ３−７細胞が好ましいが、当該
技術分野で良く知られた宿主／ベクター系を用いて、大
腸菌や枯草菌などの原核細胞宿主、酵母やＣＨＯ細胞な
どの真核細胞宿主など公知のすべての宿主で該遺伝子を
発現することが可能である。 ［０００９］本発明はさらに、上記遺伝子と特異的にハ
イブリダイズしうるプローブを提供する。このプローブ
とは、例えば下記のＭＥＧクローンのＨｉｎｃＩＩ断片
（５８６ｂｐ）が挙げられるが、上記遺伝子と特異的に
ハイブリダイズし、これを特異的に検出し得るものであ
れば如何なるものでもよい。また、ＤＮＡに限定されず
、ＲＮＡでもよい。このプローブは、適当な標識物、好
ましくは、放射性物質（３２Ｐなど）で標識しておくの
が好ましい。このプローブを、通常のノーザンプロット
分析法などに従い、試料中の遺伝子とハイブリダイズさ
せることにより、該遺伝子を特異的に検出することが可
能になる。 ［００１０］以下に、本発明をさらに詳細に説明する。 精製されたヒト血小板ＴＸＡ２受容体をタンパク質分解
反応に付し、４つの部分的アミノ酸配列を決定した。こ
の配列の一部を、４１−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドプ
ローブのデザインに用いた。このプローブを用いて、ヒ
ｈ巨核細胞性白血病培養細胞Ｍ Ｅ Ｇ−０１（Ｎａｋ
ａｊ ｉｍａ、 Ｍ、ら、 Ｂｉｏｅｈｅｍ、 Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、 １５８． ９
５８−９６５ （１９８８））のＣＤＮＡライブラリー
をスクリーニングし、１．４ｋｂ挿入物を有する１つの
陽性クローン（ＭＥＧ）を単離した。ＭＥＧのヌクレオ
チド配列を決定したところ、これは部分的クローンであ
ることが判明した。そのため、ＭＥＧのＨｉｎｃＩＩ断
片（５８６ｂｐ）をヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングするためのプローブとして用いた。胎盤は
、ノーザンプロット分析において最も強く反応したため
、ｅＤＮＡ源として選択した。その結果、全コード領域
を含む２．９ ｋｂの挿入物を有する１、つの陽性ク
ローン（ＨＰＬ）が単離された。本発明の追試にあたっ
ては、蘭列表の配列番号：１に記載のＤＮＡ配列に基づ
き合成したプローブを用いてスクリーニングを行なえば
、容易にＴＸＡ２受容体をコードするクローンが単離で
きるであろう。 （００１１，１図］および配列表に、ＨＰＬの制限酵素
地図、ヌクレオチド配列（２，９３２ｂｐ）および推定
されるアミノ酸配列を示す。オープンリーディングフレ
ームは、 ３４３アミノ酸からなるタンパク質 （相対
分子量：３７，４２９）をコードした。ＭＥＧは、２ケ
所の置換があるが、配列番号：１のＨＰＬの１５７２か
ら２９２３番目のヌクレオチド配列に対応し、その重複
部分における推定のアミノ酸配列は同一であった。ＨＰ
Ｉ−のＮ末端配列は、アミノ酸酪列を決定した４つの部
分の１つと一致し、そこには２つのＮ−グリコシレイジ
ョン部位があるが、ペプチド分析においてシグナル配列
は見出されなかった。推定されたアミノ酸配列の疎水性
分析により、膜通過部位と考えられる７ケ所の疎水性部
位（配列番号：１における、■：３０〜５２、ＩＩ ：
６７〜８６、ＩＩＩ ： １０７〜］２８、ＩＶ：１
５０〜１７２、Ｖ：１９４〜２１９、ＶＩ：２４７〜２
７０、ＶＩＩ：２９０〜３１１）が明らかになった。 ［００１，２］本受容体とロドプシン型受容体とを比較
した結果、本受容体と他の受容体との間には、特に膜通
過部位と推定された部分において、かなりの相同性があ
り、これは本受容体がこの受容体ファミリーに属してい
ることを示唆している。ロドプシンおよびサブスタンス
Ｐの受容体と同様に、本発明のＴＸＡ２受容体の３番目
の膜通過部位にはＡｓｐが無く、これはアドレナリン受
容体においてはリガンドのアミノ基に結合するものと推
定されている。他方、本発明のＴＸＡ２受容体は、７番
目の膜通過部位に、牛ロドプシンのＬ ｙ ｓ ２９６
に対応する位置にある、Ａｒｇ”９５を有している。後
者のアミノ酸残基は、ロドプシン分子の膜結合部位であ
ると同定されている。本発明のＴＸＡ２受容体の構造的
特徴は、この受容体のＪガントが酸性であるという特徴
を反映したものであろう。 ［００１３］このＴＸＡ２受容体の３番目の細胞質内環
状部は３０残基以下からなり、この環状部のＮ末端はロ
ドプシンと高い相同性を示す。しかし、この環状部のＣ
末端には、他の受容体で見られるような塩基性アミノ酸
に富む部分がない。これらの部位は、結合Ｇタンパク質
との結合やその特異性を決定する部分である。本発明の
ＴＸＡ２受容体に結合するＧタンパク質は、百日咳毒や
コレラ毒に感受性を示さないことが知られているが、未
だ同定されていない。 ［００１４］短いＣ末端の工部は、セリンおよびトレオ
ニンを合わせて６つ有しており、アドレナリン受容体、
特にβ１受容体に相同性を示す。この構造は、信号伝達
経路がアゴニストにより誘導されて非感受性になること
に関連していると思われる。β受容体と同様に、ＴＸＡ
２受容体はアゴニス１〜刺激により非感受性になる。 ［００１５］ ＨＰＬがＴＸＡ２受容体をコードしてい
ることを確認するため、ＨＰＬの２．０ｋｂ断片を真核
細胞発現ベクターＣＤＭ８ （Ｓｅｅｄ、 Ｂ、、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３２９．８４０−８４２（１９８７））にサ
ブクローン化し、このプラスミドをＣ０８−７細胞に導
入した。リガンドとの結合は、選択的ＴＸＡ２受容体ア
ンタゴニストである［３Ｈ］Ｓ−１４５（Ｕｓｈｉｋｕ
ｂｉ、 Ｆ。 ら、Ｅｉｅｏｓａｎｏｉｄｓ ２．２１−２７ （１
９８９））を用いて調べた。 形質転換したＣＯ８細胞の膜は、飽和まで［３Ｈ］Ｓ−
１４５と結合し、その解離定数（Ｋｄ）は１．２μＭで
あった。 これは、新鮮な血小板由来の膜について観察されるもの
に匹敵する。この結合の特異性は、種々のプロスタノイ
ドやＴＸＡ２誘導体を用いて分析した。ＴＸＡ２アゴニ
スト（ＳＴＡ２）とアンタゴニスト（Ｓ−１４５，０Ｎ
Ｏ−３７０８）は、［” Ｈｌ Ｓ−１４５の結合と、
他の細胞のＴＸＡ２受容体について観察されたものと同
一のオーダーで、競合した。他のプロスタグランジン（
ＰＧｓ）および不活性なＴＸＡ２代謝物（ＴＸＢ２）は
、コノ競合反応におイテ、１／１００以下の活性しか示
さなかった。 ［ｏ Ｏ１６］ ＴＸＡ２受容体の刺激により、ＰＩ転
移やＣａ２”移動が誘発されることが知られている。よ
って、ＰＩ転移と連動したアゴニスト刺激により内因性
Ｃａ２”依存性ＣＩ−チャンネルが開く、Ｘｅｎｏｐｕ
ｓの卵母細胞で本発明のクローンを発現させた。このク
ローンのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡを注射した卵母
細胞へ、１μＭの５ＴＡ２を作用させたところ、数百ｎ
Ａの速い内部電流が起こり、続いて低幅の電流の遅い相
が現れた。この応答反応は、１０Ｍ程度の低い５ＴＡ２
濃度においても観察された。ＰＧＤ２やＰＧＦ２αは、
１μＭでこのような応答反応を引き起こさなかった。Ｐ
Ｇ Ｅ １、Ｅ２、■２のような他のＰＧＳおよびＴ
Ｘ Ｂ ２はいずれも、このような実験条件下では、
応答反応を引き起こさなかった。以上のように、ＨＰＬ
によりコードされるタンパク質は、ＴＸＡ２受容体の特
徴であるリガンド結合能を有し、本来の受容体が起こす
応答反応と同じ反応を引き起こした。 ［００１７］種々の組織におけるＴＸＡｚ受容体ｍＲＮ
Ａの発現をノーザンプロットにより分析することは、受
容体サブタイプの存在が議論されているため、興味深い
ことである。ラットの種々の組織由来のポリ（Ａ）”Ｒ
ＮＡを用いて詳細に分析してみたが、たぶんこの受容体
の種特異性のため、はとんどシグナルは現れなかった。 従って、ヒト胎盤、ヒト肺、培養ＭＥＧ−０１細胞由来
のポリ（ＡＬ”ＲＮＡについて分析を行なった。胎盤と
肺はＴＸＡｚ受容体に富む代表的な組織である。過酷な
条件下で、３つの全てのレーンの２．８ｋｂに、大きな
ハイブリダイゼイションバンドが観察され、胎盤ＲＮＡ
が最も強いものであった。このレーンでは、３．５ｋｂ
に小さなバンドが存在した。この３．５ｋｂのバンドは
、長時間反応させることにより、ＭＥＧ−０１のポリ
（Ａ）ＲＮＡのレーンでも明瞭になった。 これらの結
果と、ＭＥＧおよびＨＰＬが同一のアミノ酸配列をコー
ドするという上記の見知から、同一種のｍＲＮＡが血小
板前駆細胞や多血前組織で発現されることが示唆された
３゜［００１８］生物学的に活性なアラキドン酸代謝物
は、総称してエイコサノイドと呼ばれるが、３０以上の
物質からなる大きなファミリーであり、そのファミリー
のそれぞれが特異的な受容体に作用し、種々の活性を表
わす。エイコサノイド受容体のクローニングにより、こ
のファミリ〜の他の物質の受容体構造の解明が容易にな
り、病態生理学的に重要な媒介物質を制御する、より選
択的な薬剤の開発が可能になる。 ［００１９］
学的に活性なアラキドン酸代謝物は、総称してエイコサ
ノイドと呼ばれ、３０以上の物質からなる大きなファミ
リーであり、そのファミリーのそれぞれが特異的な受容
体に作用し、種々の活性を表わす。このファミリーに属
する物質の受容体の構造は、未だ解明されていない。こ
のファミリーに属する１つの物質の受容体の構造が明ら
かになれば、その他の物質の受容体構造の解明が容易に
なり、病態生理学的に重要なこれらの物質を制御する、
より選択的な薬剤の開発が可能になる。ＴＸＡ２受容体
に特異的に結合する薬剤の探索やＴＸＡ２受容体そのも
のの研究には、比較的大量のＴＸＡ２受容体が必要であ
るが、それに必要な量のＴＸＡ２受容体を供給し得る手
段が無いのが現状である。また、ＴＸＡ２受容体を発現
する細胞は、そのアゴニスＩ−やアンタゴニストの探索
や、受容体からの信号伝達機構の解明研究に必須である
が、現在、容易に充分に得ることはできない。さらに、
現在、ヒト細胞中のＴＸＡ２受容体遺伝子の発現を、特
異的に検出する手段も無い。 ［０００４］ 【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒト血小
板ＴＸＡ２受容体のアミノ酸配列の一部に対応するオリ
ゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒｌ〜胎盤からこの
受容体をコードするｃＤＮＡクローンを単離し、またヒ
ト巨核細胞性白血病細胞の培養物から部分的なりローン
を単離した。その胎盤ｃＤＮＡは３４３個のアミノ酸か
らなるタンパク質をコードし、このタンパク質は７つの
膜通過部位を有していると推定された。Ｃ０８−７細胞
で発現されたこのタンパク質は、血小板ＴＸＡ２受容体
と同じ親和性で種々の試薬と結合し、Ｘｅｎｏｐｕｓ
ＯＯＣ’ｙｔｅで発現されたものはアゴニス１へ刺激に
よりＣａ２”活性化ＣＩ−チャンネルを開いた。ノーザ
ンブロツ１−分析および上記２つのクロンのヌクレオチ
ド配列の決定により、血小板および血管組織に存在する
ＴＸＡ２受容体は同一のちのであることが示唆された。 ［０００５１本発明によるＴＸＡ２受容体のアミノ酸配
列および遺伝子配列の決定により、ＴＸＡ２が属するフ
ァミリーの他の物質の受容体構造の解明が容易になる。 本発明はまた、該遺伝子を宿主中で発現させるＴＸＡ２
受容体の製造法、および、それにより得られるＴＸＡ２
受容体を提供し、これにより、病態生理学的に重要な媒
介物質を制御する、より選択的な薬剤の開発が可能にな
る。本発明はさらに、該遺伝子を発現する宿主を提供し
、これにより、ＴＸＡ２受容体のアゴニストやアンタゴ
ニストの探索や、受容体からの信号伝達機構の解明研究
を行なうことができる。最後に、本発明は、該遺伝子と
特異的にハイブリダイズするプローブを提供するもので
あり、これにより該遺伝子の特異的な検出が可能になっ
た。 ［０００６］すなわち、本発明はまず、ＴＸＡ２受容体
をコードする遺伝子を提供し、好ましくは、該ＴＸＡ２
受容体は配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するも
のである。本発明で言うＴＸＡ２受容体をコードする遺
伝子とは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列をコード
するものだけでなく、ＴＸＡ２受容体活性を有する、特
に下記のＳ−１４５と特異的に結合する受容体タンパク
質をコードする全ての遺伝子を意味する。この遺伝子は
、受容体のコード領域だけでなくその前後に、プロモー
ター／オペレーター配列、ＳＤ配列、ターミネータ−、
ポリアデニル化信号などの、発現に有用な配列を有して
いてもよく、該受容体の発現を阻害しない配列であれば
如何なる配列を有していてもよい。従って、該遺伝子を
有するプラスミドやウィルス遺伝子、該遺伝子の発現ベ
クターも本発明に含まれる。また、ここで言う遺伝子と
は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを意味するが、その
一方に限定されるものではない。 ［０００７１本発明は、上記遺伝子を宿主中で発現させ
ることを特徴とするＴＸＡ２受容体の製造法および該製
造法により得られるＴＸＡ２受容体を提供する。該宿主
は、真核細胞であることが望ましい。本発明の製造法に
は、ＤＮＡのみならず、ｍＲＮＡを用いてもよい。本発
明のＴＸＡ２受容体は、配列番号：１．に記載のアミノ
酸配列を有するものだけでなく、ＴＸＡ２受容体活性を
有する、特に下記のＳ、−１４５と特異的に結合する受
容体タンパク賃金てを意味する。 ［０００８］本発明は、上記遺伝子を発現する宿主をも
提供する。該宿主としては、真核細胞、特に、Ｘｅｎｏ
ｐｕｓの卵母細胞やＣＯ３−７細胞が好ましいが、当該
技術分野で良く知られた宿主／ベクター系を用いて、大
腸菌や枯草菌などの原核細胞宿主、酵母やＣＨＯ細胞な
どの真核細胞宿主など公知のすべての宿主で該遺伝子を
発現することが可能である。 ［０００９］本発明はさらに、上記遺伝子と特異的にハ
イブリダイズしうるプローブを提供する。このプローブ
とは、例えば下記のＭＥＧクローンのＨｉｎｃＩＩ断片
（５８６ｂｐ）が挙げられるが、上記遺伝子と特異的に
ハイブリダイズし、これを特異的に検出し得るものであ
れば如何なるものでもよい。また、ＤＮＡに限定されず
、ＲＮＡでもよい。このプローブは、適当な標識物、好
ましくは、放射性物質（３２Ｐなど）で標識しておくの
が好ましい。このプローブを、通常のノーザンプロット
分析法などに従い、試料中の遺伝子とハイブリダイズさ
せることにより、該遺伝子を特異的に検出することが可
能になる。 ［００１０］以下に、本発明をさらに詳細に説明する。 精製されたヒト血小板ＴＸＡ２受容体をタンパク質分解
反応に付し、４つの部分的アミノ酸配列を決定した。こ
の配列の一部を、４１−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドプ
ローブのデザインに用いた。このプローブを用いて、ヒ
ｈ巨核細胞性白血病培養細胞Ｍ Ｅ Ｇ−０１（Ｎａｋ
ａｊ ｉｍａ、 Ｍ、ら、 Ｂｉｏｅｈｅｍ、 Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、 １５８． ９
５８−９６５ （１９８８））のＣＤＮＡライブラリー
をスクリーニングし、１．４ｋｂ挿入物を有する１つの
陽性クローン（ＭＥＧ）を単離した。ＭＥＧのヌクレオ
チド配列を決定したところ、これは部分的クローンであ
ることが判明した。そのため、ＭＥＧのＨｉｎｃＩＩ断
片（５８６ｂｐ）をヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングするためのプローブとして用いた。胎盤は
、ノーザンプロット分析において最も強く反応したため
、ｅＤＮＡ源として選択した。その結果、全コード領域
を含む２．９ ｋｂの挿入物を有する１、つの陽性ク
ローン（ＨＰＬ）が単離された。本発明の追試にあたっ
ては、蘭列表の配列番号：１に記載のＤＮＡ配列に基づ
き合成したプローブを用いてスクリーニングを行なえば
、容易にＴＸＡ２受容体をコードするクローンが単離で
きるであろう。 （００１１，１図］および配列表に、ＨＰＬの制限酵素
地図、ヌクレオチド配列（２，９３２ｂｐ）および推定
されるアミノ酸配列を示す。オープンリーディングフレ
ームは、 ３４３アミノ酸からなるタンパク質 （相対
分子量：３７，４２９）をコードした。ＭＥＧは、２ケ
所の置換があるが、配列番号：１のＨＰＬの１５７２か
ら２９２３番目のヌクレオチド配列に対応し、その重複
部分における推定のアミノ酸配列は同一であった。ＨＰ
Ｉ−のＮ末端配列は、アミノ酸酪列を決定した４つの部
分の１つと一致し、そこには２つのＮ−グリコシレイジ
ョン部位があるが、ペプチド分析においてシグナル配列
は見出されなかった。推定されたアミノ酸配列の疎水性
分析により、膜通過部位と考えられる７ケ所の疎水性部
位（配列番号：１における、■：３０〜５２、ＩＩ ：
６７〜８６、ＩＩＩ ： １０７〜］２８、ＩＶ：１
５０〜１７２、Ｖ：１９４〜２１９、ＶＩ：２４７〜２
７０、ＶＩＩ：２９０〜３１１）が明らかになった。 ［００１，２］本受容体とロドプシン型受容体とを比較
した結果、本受容体と他の受容体との間には、特に膜通
過部位と推定された部分において、かなりの相同性があ
り、これは本受容体がこの受容体ファミリーに属してい
ることを示唆している。ロドプシンおよびサブスタンス
Ｐの受容体と同様に、本発明のＴＸＡ２受容体の３番目
の膜通過部位にはＡｓｐが無く、これはアドレナリン受
容体においてはリガンドのアミノ基に結合するものと推
定されている。他方、本発明のＴＸＡ２受容体は、７番
目の膜通過部位に、牛ロドプシンのＬ ｙ ｓ ２９６
に対応する位置にある、Ａｒｇ”９５を有している。後
者のアミノ酸残基は、ロドプシン分子の膜結合部位であ
ると同定されている。本発明のＴＸＡ２受容体の構造的
特徴は、この受容体のＪガントが酸性であるという特徴
を反映したものであろう。 ［００１３］このＴＸＡ２受容体の３番目の細胞質内環
状部は３０残基以下からなり、この環状部のＮ末端はロ
ドプシンと高い相同性を示す。しかし、この環状部のＣ
末端には、他の受容体で見られるような塩基性アミノ酸
に富む部分がない。これらの部位は、結合Ｇタンパク質
との結合やその特異性を決定する部分である。本発明の
ＴＸＡ２受容体に結合するＧタンパク質は、百日咳毒や
コレラ毒に感受性を示さないことが知られているが、未
だ同定されていない。 ［００１４］短いＣ末端の工部は、セリンおよびトレオ
ニンを合わせて６つ有しており、アドレナリン受容体、
特にβ１受容体に相同性を示す。この構造は、信号伝達
経路がアゴニストにより誘導されて非感受性になること
に関連していると思われる。β受容体と同様に、ＴＸＡ
２受容体はアゴニス１〜刺激により非感受性になる。 ［００１５］ ＨＰＬがＴＸＡ２受容体をコードしてい
ることを確認するため、ＨＰＬの２．０ｋｂ断片を真核
細胞発現ベクターＣＤＭ８ （Ｓｅｅｄ、 Ｂ、、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３２９．８４０−８４２（１９８７））にサ
ブクローン化し、このプラスミドをＣ０８−７細胞に導
入した。リガンドとの結合は、選択的ＴＸＡ２受容体ア
ンタゴニストである［３Ｈ］Ｓ−１４５（Ｕｓｈｉｋｕ
ｂｉ、 Ｆ。 ら、Ｅｉｅｏｓａｎｏｉｄｓ ２．２１−２７ （１
９８９））を用いて調べた。 形質転換したＣＯ８細胞の膜は、飽和まで［３Ｈ］Ｓ−
１４５と結合し、その解離定数（Ｋｄ）は１．２μＭで
あった。 これは、新鮮な血小板由来の膜について観察されるもの
に匹敵する。この結合の特異性は、種々のプロスタノイ
ドやＴＸＡ２誘導体を用いて分析した。ＴＸＡ２アゴニ
スト（ＳＴＡ２）とアンタゴニスト（Ｓ−１４５，０Ｎ
Ｏ−３７０８）は、［” Ｈｌ Ｓ−１４５の結合と、
他の細胞のＴＸＡ２受容体について観察されたものと同
一のオーダーで、競合した。他のプロスタグランジン（
ＰＧｓ）および不活性なＴＸＡ２代謝物（ＴＸＢ２）は
、コノ競合反応におイテ、１／１００以下の活性しか示
さなかった。 ［ｏ Ｏ１６］ ＴＸＡ２受容体の刺激により、ＰＩ転
移やＣａ２”移動が誘発されることが知られている。よ
って、ＰＩ転移と連動したアゴニスト刺激により内因性
Ｃａ２”依存性ＣＩ−チャンネルが開く、Ｘｅｎｏｐｕ
ｓの卵母細胞で本発明のクローンを発現させた。このク
ローンのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡを注射した卵母
細胞へ、１μＭの５ＴＡ２を作用させたところ、数百ｎ
Ａの速い内部電流が起こり、続いて低幅の電流の遅い相
が現れた。この応答反応は、１０Ｍ程度の低い５ＴＡ２
濃度においても観察された。ＰＧＤ２やＰＧＦ２αは、
１μＭでこのような応答反応を引き起こさなかった。Ｐ
Ｇ Ｅ １、Ｅ２、■２のような他のＰＧＳおよびＴ
Ｘ Ｂ ２はいずれも、このような実験条件下では、
応答反応を引き起こさなかった。以上のように、ＨＰＬ
によりコードされるタンパク質は、ＴＸＡ２受容体の特
徴であるリガンド結合能を有し、本来の受容体が起こす
応答反応と同じ反応を引き起こした。 ［００１７］種々の組織におけるＴＸＡｚ受容体ｍＲＮ
Ａの発現をノーザンプロットにより分析することは、受
容体サブタイプの存在が議論されているため、興味深い
ことである。ラットの種々の組織由来のポリ（Ａ）”Ｒ
ＮＡを用いて詳細に分析してみたが、たぶんこの受容体
の種特異性のため、はとんどシグナルは現れなかった。 従って、ヒト胎盤、ヒト肺、培養ＭＥＧ−０１細胞由来
のポリ（ＡＬ”ＲＮＡについて分析を行なった。胎盤と
肺はＴＸＡｚ受容体に富む代表的な組織である。過酷な
条件下で、３つの全てのレーンの２．８ｋｂに、大きな
ハイブリダイゼイションバンドが観察され、胎盤ＲＮＡ
が最も強いものであった。このレーンでは、３．５ｋｂ
に小さなバンドが存在した。この３．５ｋｂのバンドは
、長時間反応させることにより、ＭＥＧ−０１のポリ
（Ａ）ＲＮＡのレーンでも明瞭になった。 これらの結
果と、ＭＥＧおよびＨＰＬが同一のアミノ酸配列をコー
ドするという上記の見知から、同一種のｍＲＮＡが血小
板前駆細胞や多血前組織で発現されることが示唆された
３゜［００１８］生物学的に活性なアラキドン酸代謝物
は、総称してエイコサノイドと呼ばれるが、３０以上の
物質からなる大きなファミリーであり、そのファミリー
のそれぞれが特異的な受容体に作用し、種々の活性を表
わす。エイコサノイド受容体のクローニングにより、こ
のファミリ〜の他の物質の受容体構造の解明が容易にな
り、病態生理学的に重要な媒介物質を制御する、より選
択的な薬剤の開発が可能になる。 ［００１９］
【実施例】クローニング
ヒト血小板ＴＸＡ２受容体を、見かけ上純粋になるまで
精製しくＵｓｈｉｋｕｂｉ、 Ｆ、ら、Ｊ、 Ｂｉｏｌ
、 ＣｈｅＩ！１． ２６４．１６４９６−１６５０１
（１９８９））、シアン化臭素、リジルエンドペプチダ
ーゼおよびトリプシンによるタンパク質分解反応に付し
た。ペプチド断片は逆相ＨＰＬＣにより単離し、自動化
パルス液相タンパク質シーケンサ−によりその配列を決
定した。この配列の一部（配列番号：１の２９６から３
０９までのアミノ酸配列）から、４］、ｍｅｒの混合オ
リゴヌクレオチドプローブをデザインした。ＭＥＧ −
０１ｃＤＮＡライブラリーを、５′末端で放射ラベルし
たこのプローブでスクリーニングした。その結果、１つ
の陽性クローン、ＭＥＧが単離された。このクローン中
の１．４ｋｂ挿入配列は、精製したタンパク質の４つの
部分アミノ酸配列のうちの２つを含む１つのオープンリ
ーディングフレームを有していた。このＭＥＧの５８６
ｂｐのＨｉｎｃＩＩ断片を、次の胎盤ｃＤＮＡライブラ
リー（Ｔ、 ＭａｎｉａｔｉＳら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８９）、 Ｃｏ ｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ
参照）のスクリーニングに用いた。１つの陽性クローン
が単離されたので、これを分析した。ＤＮＡ配列の決定
は、ジデオキシ鎖終止法を用いて、２重鎮鋳型について
行なった。 ［００２０１図１に、ヒト胎盤由来のＴＸＡ２受容体ク
ローン（ＨＰＬ）およびヒト巨核細胞性白血病培養細胞
由来のＴＸＡ２受容体クローン（ＭＥＧ）の制限酵素地
図を示す。点刻した四角の部分は、コード領域である。 ［００２１１配列表の配列番号：１に、ＨＰＬのヌクレ
オチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す。５゜
末端のＡＴＧトリプレットは、そのフレーム内に、精製
されたタンパク質の部分アミノ酸配列の全てを含むので
、翻訳開始コドンであると同定された。５゛非翻訳頭域
に１８個の他のＡＴＧが存在するが、全てリーディング
フレームが短か過ぎる。ポリアデニル化シグナルは、配
列番号：１の２９０８〜２９１３であると推定された。 タンパク質分解されたペプチドから得られた４つの配列
は、配列番号：１のアミノ酸配列の１〜１９．１３１〜
１４１．２７７〜２８４．２８９〜３２２と一致した。 配列番号：１のアミノ酸配列の４および１６のＡｓｎは
、Ｎ−グリコシレイジョン部位であると推定された。Ｍ
ＥＧは、配列番号：１のＨＰＬの１５７２から２９２３
までのヌクレオチド配列を含むが、２つの置換がある。 配列番号：１のＨＰＬの１７８６と１９１５の位置で、
いずれもＴ−＋Ｃとなっている。これらの置換は、これ
らのコドンによりコードされるアミノ酸配列を変えるも
のではない。 ［００２２３預曵 ＨＰＬをＢａｍｆ（Ｉで消化し、５゛非翻訳領域の大部
分を除去し、得られた２、０ｋｂ断片を、真核細胞発現
ベクターＣＤＭ８ （Ｓｅｅｄ、 Ｂ、、 Ｎａｔｕｒ
ｅ ２３９．８４０−８４２ （１９８７））のＨｉｎ
ｄｌＩＩ−Ｘｂａ１部位に挿入した。改良ＤＥＡＥ−デ
キストラン法（Ａｕｓｂｅｌ、 Ｆ、 Ｍ、ら、Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 ９．２．５ （Ｗｉｌｅｙ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 １９８９））に従って、ＣＯ３
−７細胞を形質転換した。形質転換の６０時間後、細胞
を回収し、１ｍＭベンザミジンと０．３ｍＭＰＭＳＦの
存在下で、上記Ａｕ５ｂｅｌ、 Ｆ、 Ｍ、らの方法に
従い細胞をホモジナイズして膜を調製した。膜は、最終
的に、２０ｍＭ Ｎａ−Ｍｅｓ （ｐＨ６，４）と５ｍ
ＭＥＧＴＡに懸濁し、［３ＨコＳ−１４５（２４Ｃｉ
／ｍｍｏ ｌ ）との結合実験を、Ｕｓｈｉｋｕｂｉ、
Ｆ、ら、 Ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄｓ ２，２１−２７
（１９８９）に記載の方法に従って行なった。競合実
験は、１ 、２５ ｎ Ｍ ［３Ｈ］Ｓ−１４５と種々
の濃度のリガンドを用いて行なった。 ［００２３］形質転換したＣｏＳ細胞の膜は、飽和まで
［３Ｈ］Ｓ−１４５と結合し、その解離定数 （Ｋｄ）
は１．２ｎＭであった。これは、新鮮な血小板由来の膜
について観察されるものに匹敵する。最大結合Ｂｍａｘ
値は、２゜２ｐｍｏ ｌ／ｍｇタンパク質であった。 （００２４］競合実験の結果、ＴＸＡ＝アゴニスト（Ｓ
ＴＡ２）とアシタゴニスト （Ｓ−１４５，０ＮＯ−３
７０８）は、他の細胞のＴＸＡ２受容体について観察さ
れたものと同一のオーダーで、［”Ｈ］Ｓ−１４５と競
合した。他のプロスタグランジン（ＰＧＤ２、ＰＧＦ２
α、ＰＧＥ２、ＰＧＩ２）および不活性なＴＸＡ２代謝
物（ＴＸＢ２）は、この競合反応において、１／１００
以下の活性しか示さなかった。 ［００２５］応答反応 ＨＰＬの２．０ｋｂのＢａｍＨＩサブクローン由来の１
ｎＶｉｔｒ。 合成ｍＲＮＡをｘｅｎｏｐｕｓの卵母細胞に注入し、４
８時間後に、電気生理学的応答反応を測定した。１０
０μＭ濃度でエタノールに溶解したＴＸＡ２アゴニスト
５ＴＡ２および他のＰＧｓを、１１．ｔＭ濃度で培地に
加え、卵母細胞の応答反応を、Ｍａｓｕ、 Ｙ、ら、
Ｎａｔｕｒｅ ３２９．８３６−８３８ （１９８７）
に記載の２マイクロピペツト電圧クランプ法により記録
した。 ［００２６］１μＭの５ＴＡ２を作用させたところ、数
百ｎＡの速い内部電流が起こり、続いて低幅の電流の遅
い相が現れた。この反応は、１．ｎＭ程度の低い５ＴＡ
２濃度においても見られた。ＰＧＤ２やＰＧＦ２αは、
１７ｚＭで反応を引き起こさなかった。ＰＧＥＩ、 Ｅ
２、■２のような他のＰＧｓおよびＴ Ｘ Ｂ ２はい
ずれも、このような実験条件下では、反応を引き起こさ
なかった。このように、ＨＰＬによりコードされるタン
パク質は、ＴＸＡ２受容体の特徴であるリガンド結合能
を有し、本来の受容体が起こす応答反応を引き起こした
。 ［００２７１ノ一ザンプロツト分析 全ＲＮＡは、ＭＥＧ−０１細胞、ヒト胎盤、ヒト肺のそ
れぞれから、チオシアン酸グアニジニウム〜塩化セシウ
ム法により調製した。ポリ（Ａ）”ＲＮＡは、オリゴ−
（ｄ Ｔ）セルロースカラムを用いて単離した。それぞ
れのポリ（Ａ）”ＲＮＡを２０ ｌＬｇ、ホルムアルデ
ヒドアガロースゲル電気泳動に付し、Ｂｙｏａｙｎｅ膜
に移し、ＵＶで架橋結合させた。フィルターは、５ｘＳ
ＳＣ緩衝液、５×デンハート溶液、５０ｍＭリン酸ナト
リウム、ｐＨ６，５，２００ｔ、、ｔ ｇ／ｍ ｌ熱変
性サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド、および０．１
％ＳＤＳ中で、４２℃、４時間、プレハイブリダイズさ
せた後、同じ緩衝液中、４２℃で１夜、ランダムプライ
ミング法により３２ｐｄＣＴＰで標識したＭＥＧクロー
ンの５８６ｂｐＨｉｎｃｌｌ断片（４Ｘ １０６ｃ、
ｐ、 ｍ、 ｍ ｌ”）とハイブリダイズさせた。こ
のフィルタ −を、０．ｌＸ５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ中
、６５℃で１時間、２回洗浄し、−８０℃で強化スクリ
ーンの存在下、１２日間、Ｘ線フィルムにさらした。 ［００２８］ヒト胎盤、ヒト肺、培養ＭＥ（、−０１細
胞由来のポリ（Ａ）“ＲＮＡについて分析を行なったが
、胎盤と肺はＴＸＡ２受容体に富む代表的な組織である
。過酷な条件下で、３つの全てのレーンの２．８ｋｂに
、大きなハイブリダイゼイションバンドが観察され、胎
盤ＲＮＡが最も強いものであった。この胎盤ＲＮＡのレ
ーンでは、３．５ｋｂに小さなバンドが存在した。この
バンドは、長時間反応させる ことにより、ＭＥＧ−０
１のポリ （Ａ）”ＲＮＡのレーンでも明瞭になった。 これらの結果と、ＭＥＧおよびＨＰＬが同一のアミノ酸
配列をコードするという上記の見知から、同一種のｍＲ
ＮＡが血小板前駆細胞や多血前組織で発現されることが
示唆された。
精製しくＵｓｈｉｋｕｂｉ、 Ｆ、ら、Ｊ、 Ｂｉｏｌ
、 ＣｈｅＩ！１． ２６４．１６４９６−１６５０１
（１９８９））、シアン化臭素、リジルエンドペプチダ
ーゼおよびトリプシンによるタンパク質分解反応に付し
た。ペプチド断片は逆相ＨＰＬＣにより単離し、自動化
パルス液相タンパク質シーケンサ−によりその配列を決
定した。この配列の一部（配列番号：１の２９６から３
０９までのアミノ酸配列）から、４］、ｍｅｒの混合オ
リゴヌクレオチドプローブをデザインした。ＭＥＧ −
０１ｃＤＮＡライブラリーを、５′末端で放射ラベルし
たこのプローブでスクリーニングした。その結果、１つ
の陽性クローン、ＭＥＧが単離された。このクローン中
の１．４ｋｂ挿入配列は、精製したタンパク質の４つの
部分アミノ酸配列のうちの２つを含む１つのオープンリ
ーディングフレームを有していた。このＭＥＧの５８６
ｂｐのＨｉｎｃＩＩ断片を、次の胎盤ｃＤＮＡライブラ
リー（Ｔ、 ＭａｎｉａｔｉＳら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８９）、 Ｃｏ ｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ
参照）のスクリーニングに用いた。１つの陽性クローン
が単離されたので、これを分析した。ＤＮＡ配列の決定
は、ジデオキシ鎖終止法を用いて、２重鎮鋳型について
行なった。 ［００２０１図１に、ヒト胎盤由来のＴＸＡ２受容体ク
ローン（ＨＰＬ）およびヒト巨核細胞性白血病培養細胞
由来のＴＸＡ２受容体クローン（ＭＥＧ）の制限酵素地
図を示す。点刻した四角の部分は、コード領域である。 ［００２１１配列表の配列番号：１に、ＨＰＬのヌクレ
オチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す。５゜
末端のＡＴＧトリプレットは、そのフレーム内に、精製
されたタンパク質の部分アミノ酸配列の全てを含むので
、翻訳開始コドンであると同定された。５゛非翻訳頭域
に１８個の他のＡＴＧが存在するが、全てリーディング
フレームが短か過ぎる。ポリアデニル化シグナルは、配
列番号：１の２９０８〜２９１３であると推定された。 タンパク質分解されたペプチドから得られた４つの配列
は、配列番号：１のアミノ酸配列の１〜１９．１３１〜
１４１．２７７〜２８４．２８９〜３２２と一致した。 配列番号：１のアミノ酸配列の４および１６のＡｓｎは
、Ｎ−グリコシレイジョン部位であると推定された。Ｍ
ＥＧは、配列番号：１のＨＰＬの１５７２から２９２３
までのヌクレオチド配列を含むが、２つの置換がある。 配列番号：１のＨＰＬの１７８６と１９１５の位置で、
いずれもＴ−＋Ｃとなっている。これらの置換は、これ
らのコドンによりコードされるアミノ酸配列を変えるも
のではない。 ［００２２３預曵 ＨＰＬをＢａｍｆ（Ｉで消化し、５゛非翻訳領域の大部
分を除去し、得られた２、０ｋｂ断片を、真核細胞発現
ベクターＣＤＭ８ （Ｓｅｅｄ、 Ｂ、、 Ｎａｔｕｒ
ｅ ２３９．８４０−８４２ （１９８７））のＨｉｎ
ｄｌＩＩ−Ｘｂａ１部位に挿入した。改良ＤＥＡＥ−デ
キストラン法（Ａｕｓｂｅｌ、 Ｆ、 Ｍ、ら、Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 ９．２．５ （Ｗｉｌｅｙ、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 １９８９））に従って、ＣＯ３
−７細胞を形質転換した。形質転換の６０時間後、細胞
を回収し、１ｍＭベンザミジンと０．３ｍＭＰＭＳＦの
存在下で、上記Ａｕ５ｂｅｌ、 Ｆ、 Ｍ、らの方法に
従い細胞をホモジナイズして膜を調製した。膜は、最終
的に、２０ｍＭ Ｎａ−Ｍｅｓ （ｐＨ６，４）と５ｍ
ＭＥＧＴＡに懸濁し、［３ＨコＳ−１４５（２４Ｃｉ
／ｍｍｏ ｌ ）との結合実験を、Ｕｓｈｉｋｕｂｉ、
Ｆ、ら、 Ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄｓ ２，２１−２７
（１９８９）に記載の方法に従って行なった。競合実
験は、１ 、２５ ｎ Ｍ ［３Ｈ］Ｓ−１４５と種々
の濃度のリガンドを用いて行なった。 ［００２３］形質転換したＣｏＳ細胞の膜は、飽和まで
［３Ｈ］Ｓ−１４５と結合し、その解離定数 （Ｋｄ）
は１．２ｎＭであった。これは、新鮮な血小板由来の膜
について観察されるものに匹敵する。最大結合Ｂｍａｘ
値は、２゜２ｐｍｏ ｌ／ｍｇタンパク質であった。 （００２４］競合実験の結果、ＴＸＡ＝アゴニスト（Ｓ
ＴＡ２）とアシタゴニスト （Ｓ−１４５，０ＮＯ−３
７０８）は、他の細胞のＴＸＡ２受容体について観察さ
れたものと同一のオーダーで、［”Ｈ］Ｓ−１４５と競
合した。他のプロスタグランジン（ＰＧＤ２、ＰＧＦ２
α、ＰＧＥ２、ＰＧＩ２）および不活性なＴＸＡ２代謝
物（ＴＸＢ２）は、この競合反応において、１／１００
以下の活性しか示さなかった。 ［００２５］応答反応 ＨＰＬの２．０ｋｂのＢａｍＨＩサブクローン由来の１
ｎＶｉｔｒ。 合成ｍＲＮＡをｘｅｎｏｐｕｓの卵母細胞に注入し、４
８時間後に、電気生理学的応答反応を測定した。１０
０μＭ濃度でエタノールに溶解したＴＸＡ２アゴニスト
５ＴＡ２および他のＰＧｓを、１１．ｔＭ濃度で培地に
加え、卵母細胞の応答反応を、Ｍａｓｕ、 Ｙ、ら、
Ｎａｔｕｒｅ ３２９．８３６−８３８ （１９８７）
に記載の２マイクロピペツト電圧クランプ法により記録
した。 ［００２６］１μＭの５ＴＡ２を作用させたところ、数
百ｎＡの速い内部電流が起こり、続いて低幅の電流の遅
い相が現れた。この反応は、１．ｎＭ程度の低い５ＴＡ
２濃度においても見られた。ＰＧＤ２やＰＧＦ２αは、
１７ｚＭで反応を引き起こさなかった。ＰＧＥＩ、 Ｅ
２、■２のような他のＰＧｓおよびＴ Ｘ Ｂ ２はい
ずれも、このような実験条件下では、反応を引き起こさ
なかった。このように、ＨＰＬによりコードされるタン
パク質は、ＴＸＡ２受容体の特徴であるリガンド結合能
を有し、本来の受容体が起こす応答反応を引き起こした
。 ［００２７１ノ一ザンプロツト分析 全ＲＮＡは、ＭＥＧ−０１細胞、ヒト胎盤、ヒト肺のそ
れぞれから、チオシアン酸グアニジニウム〜塩化セシウ
ム法により調製した。ポリ（Ａ）”ＲＮＡは、オリゴ−
（ｄ Ｔ）セルロースカラムを用いて単離した。それぞ
れのポリ（Ａ）”ＲＮＡを２０ ｌＬｇ、ホルムアルデ
ヒドアガロースゲル電気泳動に付し、Ｂｙｏａｙｎｅ膜
に移し、ＵＶで架橋結合させた。フィルターは、５ｘＳ
ＳＣ緩衝液、５×デンハート溶液、５０ｍＭリン酸ナト
リウム、ｐＨ６，５，２００ｔ、、ｔ ｇ／ｍ ｌ熱変
性サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド、および０．１
％ＳＤＳ中で、４２℃、４時間、プレハイブリダイズさ
せた後、同じ緩衝液中、４２℃で１夜、ランダムプライ
ミング法により３２ｐｄＣＴＰで標識したＭＥＧクロー
ンの５８６ｂｐＨｉｎｃｌｌ断片（４Ｘ １０６ｃ、
ｐ、 ｍ、 ｍ ｌ”）とハイブリダイズさせた。こ
のフィルタ −を、０．ｌＸ５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ中
、６５℃で１時間、２回洗浄し、−８０℃で強化スクリ
ーンの存在下、１２日間、Ｘ線フィルムにさらした。 ［００２８］ヒト胎盤、ヒト肺、培養ＭＥ（、−０１細
胞由来のポリ（Ａ）“ＲＮＡについて分析を行なったが
、胎盤と肺はＴＸＡ２受容体に富む代表的な組織である
。過酷な条件下で、３つの全てのレーンの２．８ｋｂに
、大きなハイブリダイゼイションバンドが観察され、胎
盤ＲＮＡが最も強いものであった。この胎盤ＲＮＡのレ
ーンでは、３．５ｋｂに小さなバンドが存在した。この
バンドは、長時間反応させる ことにより、ＭＥＧ−０
１のポリ （Ａ）”ＲＮＡのレーンでも明瞭になった。 これらの結果と、ＭＥＧおよびＨＰＬが同一のアミノ酸
配列をコードするという上記の見知から、同一種のｍＲ
ＮＡが血小板前駆細胞や多血前組織で発現されることが
示唆された。
［００２９］配列番号：１
配列の長さ： ２９３２
配列の型：核酸
鎖の数二二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：配列の種類： ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ
ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス＝Ｎ。 起源 生物名：ヒト 組織の種類：胎盤 クローン名：）ｆＰＬ 配列の特徴 特徴を表す記号： ｐｏｌｙＡ ｓｉｇｎａｌ存在位置
： ２９０８． 、２９１３ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列
ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス＝Ｎ。 起源 生物名：ヒト 組織の種類：胎盤 クローン名：）ｆＰＬ 配列の特徴 特徴を表す記号： ｐｏｌｙＡ ｓｉｇｎａｌ存在位置
： ２９０８． 、２９１３ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列
【図１］ ＨＰＬおよびＭＥＧの制限酵素地図である。
【図１】
Claims (11)
- 【請求項１】ＴＸＡ＿２受容体をコードする遺伝子。
- 【請求項２】該ＴＸＡ＿２受容体が配列番号：１に記載
のアミノ酸配列を有するものである請求項１に記載の遺
伝子。 - 【請求項３】請求項１または２に記載の遺伝子を宿主中
で発現することにより得られるＴＸＡ＿２受容体。 - 【請求項４】該宿主が真核細胞である請求項３に記載の
ＴＸＡ＿２受容体。 - 【請求項５】請求項１または２に記載の遺伝子を宿主中
で発現させることを特徴とするＴＸＡ＿２受容体の製造
法。 - 【請求項６】該宿主が真核細胞である請求項５に記載の
製造法。 - 【請求項７】請求項１または２に記載の遺伝子を発現す
る宿主。 - 【請求項８】真核細胞である請求項７に記載の宿主。
- 【請求項９】請求項１または２に記載の遺伝子と特異的
にハイブリダイズしうるプローブ。 - 【請求項１０】ＭＥＧのＨｉｎｃＩＩ断片である請求項
９に記載のプローブ。 - 【請求項１１】請求項９または１０に記載のプローブを
ハイブリダイズさせることを特徴とする請求項１または
２記載の遺伝子の検出方法。
Priority Applications (8)
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|---|---|---|---|
| JP2410885A JP2987818B2 (ja) | 1990-12-14 | 1990-12-14 | Ｔｘａ２受容体およびそれをコードする遺伝子 |
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| DE69120380T DE69120380T2 (de) | 1990-12-14 | 1991-12-13 | TXA2-Rezeptor und dafür kodierendes Gen |
| DK91121454.2T DK0490410T3 (da) | 1990-12-14 | 1991-12-13 | TXA2-Receptor og derfor kodende gen |
| AT91121454T ATE139564T1 (de) | 1990-12-14 | 1991-12-13 | Txa2-rezeptor und dafür kodierendes gen |
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