JPH09501833A

JPH09501833A - ヒトエリスロポイエチン受容体断片及びそれに対する抗体

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Publication number: JPH09501833A
Application number: JP7507168A
Authority: JP
Inventors: リー，ジョン・ワイ
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-08-16
Filing date: 1994-08-15
Publication date: 1997-02-25
Also published as: US5843726A; CA2169629A1; EP0776370B1; US7053184B2; WO1995005469A1; KR100355159B1; US20020031806A1; CA2169629C; EP0776370A4; EP0776370A1; DE69434704T2; KR960704052A; ATE323771T1; DE69434704D1

Abstract

(57)【要約】ヒトエリスロポイエチン受容体細胞外ドメインを有する融合タンパク質を発現するE．coli組換えプラスミドが開示されている。このベクターから産生される精製された融合タンパク質も開示されている。この融合タンパク質は、エリスロポイエチン受容体細胞外ドメインを融合タンパク質のその他の部分から分離するのに好適な切断部位を有する。精製された細胞外ドメインポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体もまた開示されている。精製されたヒトエリスロポイエチン受容体断片ポリペプチドは、エリスロポイエチンに結合する。本発明のこれらの物、組成物及び方法は、エリスロポイエチン受容体に対するリガンド結合の研究及びエリスロポイエチン受容体の量の定量、ならびに受容体構造及びシグナル伝達の理解のために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトエリスロポイエチン受容体断片及びそれに対する抗体発明の分野本発明は、精製されたヒトエリスポイエチン受容体の細胞外ドメインポリペプチドに関する。より具体的には、本発明は、エリスロポイエチンに対する親和性を保持しているヒトエリスロポイエチン受容体の細胞外ドメインポリペプチド、そのようなポリペプチドの製造に使用するのに適したＤＮＡ配列、及びそのようなポリペプチドを認識する抗体に関する。発明の背景エリスロポイエチン（Ｅｐｏ）は、哺乳動物の腎臓及び肝臓で産生される分子量３４キロダルトン(kDa)の糖タンパクホルモンである。Ｅｐｏは血球増生の鍵となる成分であり、赤血球前駆細胞の増殖及び分化を誘導する。Ｅｐｏ活性はまた、グロビン及びカルボニックアンヒドラーゼを含む多数の赤芽球系(erythroid )特異的遺伝子の活性化に関連している。参照：Bondurant et al.，Mol. Cell.B iol. 5: 675-683(1985); Koury et al., J. Cell. Physiol. 126: 259-265(1986 )。エリスロポイエチン受容体（ＥｐｏＲ）は、他の多くの成長因子受容体、例えばインターロイキン（ＩＬ）−３、ＩＬ−４及びＩＬ−６受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）受容体、ならびにプロラクチン及び成長ホルモン受容体を包含する造血／サイトカイン／成長因子受容体ファミリーの一員である。参照：Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6934-6938(19 90)。サイトカイン受容体ファミリーのメンバーは、４個の保存されたシステイン残基及び膜貫通領域のすぐ外側に位置するトリプトファン−セリン−Ｘ−トリプトファン−セリンモチーフを有する。その保存された配列は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与するものと考えられている。参照：Chiba et al., Biochem. Biopys. Res. Comm . 184: 485-490(1992)。最近、ＥｐｏＲｃＤＮＡがマウスの肝臓から単離され〔参照：Tojo et al., Biochem. Biopys. Res. Comm. 148: 443-48(1987)〕、ヒト胎児肝臓からも単離された。参照：Jones et al., Blood 76: 31-35(1990)；Winkelmann et al., Bl ood 76:24-30(1990)。ヒトｃＤＮＡは、分子量が〜５５kDaの、約５０８個のアミノ酸から構成されたポリペプチド鎖をコードする。ヒトＥｐｏＲのゲノミッククローンも単離され、その配列が分析された。参照：Penny and Forget, Genomi cs 11: 974-80(1991); Noguchi et al., Blood 78: 2548-2556(1991)。コーディング配列の分析から、シグナルペプチドは約２４個のアミノ酸残基からなり、細胞外ドメインには約２２６個のアミノ酸残基が存在し、約２３個のアミノ酸が細胞膜中ドメインに存在し、約２３５個のアミノ酸が細胞質ドメインに存在するものと予測される。参照：D′Andrea and Zon, J. Clin. Invest. 86: 681-687(19 90); Jones et al., Blood 76: 31-35(1990); Penny and Forget, Genomics 11: 974-80(1991)。成熟ヒトＥｐｏＲタンパク質は、約４８４個のアミノ酸からなっている。ヒトの赤芽球系前駆細胞（erythroid progenitor cells）は、全てＥｐｏ受容体を有することが示された。赤芽球系前駆細胞が成熟するに従って、Ｅｐｏの結合は減少し、網状赤血球上ではＥｐｏ受容体が検出されなくなる。参照：Sawada et al., J, Clin. Inve st. 80: 357-366(1987); Sawada et al., J. Cell. Physiol. 137: 337(1988)。Ｅｐｏは、赤芽球系前駆細胞の細胞生存力(viability)を維持させ、それらが細胞分裂及び分化を行うことを可能にする。Ｅｐｏに反応性である赤芽球系前駆細胞の２種類の主要なものは、バースト形成ユニット−赤芽球系細胞(burst-formi ng units-erythroid; ＢＦＵ−Ｅ)及びコロニー形成ユニット−赤芽球系細胞（c olony-forming units-erythroid; ＣＦＵ−Ｅ）である。そのＥｐｏ受容体数は、正常ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＥにおけるＥｐｏに対する応答と非常によく相関している。Ｅｐｏ受容体数は、ヒト及びマウス細胞においてＣＦＵ−Ｅ段階で最大値に達した後、減少するように見える。参照：Sawada et al., J. Clin. Inve st. 80: 357-366(1987); Landschulz et al., Blood 73: 1476-1486(1989)。Ｅｐｏが除去された後のＥｐｏ受容体の回復は、タンパク質合成に依存するように見えるが、これは、分解によるＥｐｏ受容体のダウンレギュレーションと、続いてＥｐｏが除去されると受容体が新たに合成され増加することによる受容体のアップレギュレーションとを示唆する。参照：Sawyer and Hankins, Blood 72: 13 2(1988)。巨核球及び赤芽球系前駆細胞のＥｐｏ受容体の研究によると、血小板新生作用(thrombopoiesis)と血球増生の調節の間には関連があり、両方の細胞タイプによる細胞分裂の刺激がＥｐｏ受容体数によって制御されている。Berridge et al., Blood 72: 970-977(1988)。Ｅｐｏ受容体はクローニングされたが、Ｅｐｏ受容体に対するＥｐｏの結合に関与する正確なメカニズム及びその後の血球増生プロセスとの関係は、知られていない。Ｅｐｏ受容体（ＥｐｏＲ）の特徴づけは、天然の原料から得ることのできるＥｐｏＲの量が極めて少量であるので、困難である。したがって、血球増生を刺激するＥｐｏとその受容体との相互作用のメカニズムは、今でも未知の状態である。参照：D′Andrea and Zon, J. Clin. Invest. 86: 681-687(1990)。最近、このメカニズムは、白血病生成（leukemogenesis）における成長因子とその受容体の役割を理解するのに非常に興味深いものとなっており、変化した造血成長因子とその受容体が、腫瘍生成及び白血病生成に関与する可能性がある。参照：Dunb ar et al., Science 245:1493-1496(1989); Li et al., J. Virol. 57: 534-538 (1986)。特定の細胞タイプのＥｐｏ応答性と細胞タイプのＥｐｏ親和性との間の相関に関するいくつかの研究から、一致しない結果が報告されている。これらの研究には、相当するプラスミドベクターから由来するいくつかの非ネイティブアミノ酸配列を有する組換えＥｐｏ又はＥｐｏＲが使用された。参照：Berridge et al., Blood 72: 970-977(1988); Harris et al., J. Biol. Chem. 267: 15205-09(19 92)。これらの組換えＥｐｏ又はＥｐｏＲ分子の三次構造的変化及び／又は他の特徴が、ネイティブ（未変性）タンパク質の特性を変化させた可能性がある。したがって、外来の（例えば、ベクターの）アミノ酸配列を含まない、実質的に純粋なＥｐｏ受容体の断片を得ることは、重要な進歩となる。このような断片が機能的活性を保有しているかどうかを予測することはできないが、それにもかかわらず、ＥｐｏはＥｐｏ受容体の細胞外ドメインに結合するので、精製された細胞外ドメイン断片は特に有用であるだろう。発明の要約カルボキシ末端付近にトロンビンのタンパク分解的切断部位を有するポリペプチドを発現させることのできる第一のヌクレオチド配列と、基本的に全長ヒトエリスロポイエチン受容体ｃＤＮＡのコーディング配列のヌクレオチド７３乃至７５０（配列番号４に挙げられている）からなる第二のヌクレオチド配列とを含む発現ベクターが開示されている。Ｅｐｏ受容体ｃＤＮＡのコーディング配列断片は、タンパク分解的切断部位の３′側（下流側）に位置しており、タンパク分解的切断部位と同じ翻訳リーディングフレーム内にある。Ｅｐｏ受容体ｃＤＮＡのコーディング配列断片は、第一のポリヌクレオチド配列と翻訳において隣接するように方向づけされている。基本的に発現ベクターによって生成されたポリペプチドからなり、トロンビンのタンパク分解的切断部位を有する第一のセグメントと、基本的に全長ヒトエリスロポイエチン受容体タンパク質の約第２５アミノ酸乃至約第２５０アミノ酸（配列番号４に挙げられている）からなる第二のセグメントとを含む精製された融合タンパク質が開示されている。第二のセグメントは、第一のセグメントのカルボキシ末端に共有結合によりカップリングされている。基本的に全長ヒトエリスロポイエチン受容体タンパク質配列の約第２５アミノ酸乃至約第２５０アミノ酸からなる精製されたタンパク質は、融合タンパク質をトロンビンで切断することによって生成することができる。精製されたヒトエリスロポイエチン受容体ポリペプチドの細胞外ドメインに対する親和性を有する抗体が開示されている。この抗体は、全長ヒトエリスロポイエチン受容体タンパク質配列の約第２５アミノ酸乃至約第２５０アミノ酸を含むポリペプチドに対し親和性を示す。固相試薬及び固相試薬に作動的にカップリングされている抗体を含有するイムノアッセイ組成物が開示されている。また、固相試薬及び固相試薬に作動的にカップリングされている精製されたタンパク質を含むイムノアッセイ組成物も開示されている。基本的に全長ヒトエリスロポイエチン受容体タンパク質の約第２５アミノ酸乃至約第２５０アミノ酸からなる実質的に純粋なヒトエリスロポイエチン受容体ポリペプチドを得る方法が開示されている。実質的に純粋なヒトエリスロポイエチン受容体ポリペプチドは、エリスロポイエチンに特異的に結合できる能力を保持している。上記方法は、ポリペプチドの切断を可能にする条件下で融合タンパク質をトロンビンで処理することによって分解混合物を形成し；分解混合物を、ポリペプチドと固相試薬とのカップリングを可能にする条件下でエリスロポイエチンとカップリングされている固相試薬に加えて、ポリペプチド−固相組成物を形成し；ポリペプチド−固相組成物を洗浄して、結合していない物質を除去し；実質的に純粋なヒトエリスロポイエチン受容体ポリペプチドを、ポリペプチド−固相組成物より溶出させる工程、を包含する。図面の簡単な説明図１は、発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ内に挿入されたヒトエリスロポイエチン受容体ｃＤＮＡの５′コーディング配列の約６７８bpを含有するプラスミドｐＪＹＬ２６を図式的に示したものである。図１は、ｐＪＹＬ２６から発現される組換え融合タンパク質ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈをも示す。図２ａは、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈを発現する大腸菌(E．coli)細胞抽出液をグルタチオン親和性カラム上で精製して回収した画分の２８０nmでの吸光度(Ａ₂₈₀) を示す。図２ｂは、トロンビンで処理されたＥｐｏＲｅｘ−ｔｈをエリスロポイエチン親和性クロマトグラフィーに適用した結果、回収されたＥｐｏ−ｂｐを含有する画分のＡ₂₈₀ を示す。図３は、トロンビンによるＥｐｏＲｅｘ−ｔｈの切断を示す、クマシーブルーで染色されたポリアクリルアミドゲルの写真である。図４は、Ｅｐｏ−ｂｐに対するヒツジ抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体の結合を示す、ウェスタンブロットである。図５は、標識されていないＥｐｏの存在下及び不在下での、Ｅｐｏ−ｂｐに対する多様な濃度のヒト ¹²⁵Ｉ−Ｅｐｏの結合を示す。図６は、トリプシンでＥｐｏ−ｂｐを切断した後に観察されるポリペプチドのバンドを示す、クマシーブルーで染色されたポリアクリルアミドゲルの写真である。発明の詳細な説明組換えヒトＥｐｏ及び全長ヒトＥｐｏ受容体ｃＤＮＡクローンを使用することができるにもかかわらず、ＥｐｏとＥｐｏ受容体との間の相互作用、又は赤芽球系前駆細胞の増殖及び分化に関与する信号伝達メカニズムについては、ほとんど知られていない。プラスミド発現ベクターは、そのベクター内に挿入されたクローニングされたコーディング配列からタンパク質を発現させることができるようにする。一般的に、発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの選択及び維持のための選択可能なマーカー及び複製起点、ならびに挿入された遺伝子に融合させるのに適した、ポリペプチドの高レベル発現の誘導のための誘導可能な調節要素を包含する。ベクターのタンパク分解的切断部位配列の下流に、好都合な制限部位を設計して工作するのが好ましい。Ｅｐｏコーディング配列断片に融合させるのに好ましいポリペプチドは、カルボキシ末端にトロンビンのタンパク分解的切断部位を有するグルタチオンＳトランスフェラーゼである。本明細書に開示された本発明のための発現ベクターは、ＥｐｏＲの細胞外ドメインを融合タンパク質の一部として発現させ、この融合タンパク質は、その後に切断することによって精製されたＥｐｏＲの細胞外ドメインを製造することができる。ＥｐｏＲの細胞外ドメインをコードする配列は、この配列を適切なリーディングフレームで発現ベクターに挿入するのに適したいずれの方法を利用して工作してもよい。例えば、第一のプライマーは細胞外ドメインの５′末端のコーディング配列に対応し、第二のプライマーは細胞外ドメインの３′末端のコーディング配列に相補的であるように、一対のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを合成することができる。プライマーは、目的とする標的配列の末端に対応するプライマーの部分に続いて好都合な制限酵素部位を有するようにするのが好ましい。プライマーは、全長ヒトＥｐｏＲｃＤＮＡ鋳型（template）からＥｐｏＲの細胞外ドメインを増幅させるのに使用される。生成されたＰＣＲ産物を、その後発現ベクターにクローニングする。各末端に同一の制限部位を有するよりは、異なる制限部位を有するようにＰＣＲプライマーを合成するのが好ましい。ＰＣＲ産物の各末端に異なる制限部位が存在すると、ヒトＥｐｏＲのコーディング配列断片をセンス(sense)方向に挿入させることが容易になる。ヒトエリスロポイエチン受容体の細胞外ドメインを一部分として含有する融合タンパク質の高レベル発現は、宿主細胞の培養物中で組換えプラスミド発現ベクターからの発現を誘導することによってなされる。以下では、融合タンパク質はＥｐｏＲｅｘ−ｔｈと呼び、精製されたヒトエリスロポイエチン受容体の細胞外ドメインはＥｐｏ−ｂｐと呼ぶ。細胞タンパク質抽出物は、発現している大腸菌培養物から適当ないずれかの方法で調製するのが好ましい。ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈは、上記抽出物から望むとおりに精製してもよい。例えば、抽出物を、融合タンパク質のＥｐｏ−ｂｐコーディング配列の上流の部分と結合することのできるカラムに通過させてもよい。融合タンパク質はカラムに結合するが、一方、抽出物中の他のタンパク質は、カラムマトリックスへの融合タンパク質の結合を可能にする緩衝液でカラムを洗浄する際に溶出される。ＥｐｏＲｅｘ− ｔｈは、その後に緩衝液条件を変化させることによって高純度で溶出させることができる。Ｅｐｏ−ｂｐの精製は、精製されたＥｐｏＲｅｘ−ｔｈを適当な切断方法で切断することによって精製することができる。例えば、上流ポリペプチド及びＥｐｏ−ｂｐ間の切断部位は、臭化シアンに感受性であってもよく、あるいは、部位特異的プロテアーゼ切断に感受性であってもよい。好ましい態様において、トロンビンのタンパク分解的切断部位は、上流ポリペプチドの内部であるが、上流ポリペプチドコーディング配列のカルボキシ末端に位置する好都合な制限クローニング部位の５′側に位置するように設計する。切断されたＥｐｏ−ｂｐポリペプチドセグメントは、サイズ排除クロマトグラフィー、等電点電気泳動又は親和性クロマトグラフィーのような精製技術により、上流ポリペプチドセグメントから分離してもよい。更に、望ましい場合には、必要によって２種類以上の精製技術を使用して適切な程度の純度を得てもよい。好ましい精製技術は、親和性クロマトグラフィーである。例えば、プロテアーゼで処理した融合タンパク質混合物を、Ｅｐｏとカップリングされたアガロースビーズで充填されたカラムに適用してもよい。切断されたＥｐｏ−ｂｐセグメントはＥｐｏ−アガロースに結合するが、一方、上流ポリペプチドセグメントはカラムを通過する。Ｅｐｏ−ｂｐは、その後に液相のｐＨを低くすることによって溶出させることができる。本発明の一態様において、ヒトＥｐｏＲ（ｈＥｐｏＲ）のアミノ酸第２５乃至第２５０をコードする配列は、ｐＧＥＸ−２Ｔ（Pharmacia，Mec hanicsburg，PA）にクローニングする。ｐＧＥＸ−２Ｔは、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードする配列と作動的に連結されたＩＰＴＧ誘導性プロモーターを有する。ＧＳＴコーディング配列の３′末端には、正しいリーディングフレームでトロンビンのタンパク分解的切断部位、ならびにＧＳＴに共有結合によりカップリングされるようにコーディング配列を挿入することのできる好都合なクローニング部位がある。ｈＥｐｏＲの第２５乃至第２５０アミノ酸を含有するＰＣＲ産物は、好適なＤＮＡ鋳型、例えば全長ヒトＥｐｏＲｃＤＮＡから製造する。細胞外ドメインコーディング配列の５′末端及びＢａｍＨＩ部位を含有するＰＣＲプライマーを合成し、細胞外ドメインコーディング配列の３′末端に相補的な配列及びＥｃｏＲＩ部位を含有するＰＣＲプライマーを合成する。ｐＧＥＸ−２Ｔ内でＢａｍＨＩ部位は、ＧＳＴコーディング配列に関してＥｃｏＲＩ部位の５′側に位置するようにする。ＰＣＲ産物をｐＧＥＸ−２Ｔにクローニングし、予測される大きさのプラスミドを有する形質転換された大腸菌コロニーを同定する。アミノ末端のＧＳＴセグメント及びカルボキシ末端のＥｐｏＲ細胞外ドメインセグメントを有する融合タンパク質は、ＩＰＴＧで転写を誘導することによって形質転換された大腸菌で発現させる。ＩＰＴＧは、融合タンパク質コーディング配列の上流に位置するｌａｃプロモーターに対する抑制を解除する。ある量の融合タンパク質が蓄積されるのに十分な時間発現させた後、細胞を溶解し、好適ないずれかの方法で粗抽出物を得る。粗抽出物混合物は、融合タンパク質を、他の多くの細胞タンパク質と共に含有する。融合タンパク質ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈは、望ましい場合にはこの抽出物から精製してもよい。好ましい態様においては、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈを、グルタチオン（ＧＳＨ）にカップリングされたアガロースビーズで充填されたカラムを通過させる。ＧＳＨはＧＳＴの基質であり、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈのＧＳＴセグメントは高い親和力で固定化されたＧＳＨに結合する。したがって、融合タンパク質はカラムに結合するが、一方、抽出物中の事実上全ての他のタンパク質は結合しない。洗浄後、還元されたＧＳＨを液相に添加することによって、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈをカラムから溶出することができる。本発明の一態様において、精製されたヒトエリスロポイエチン受容体の細胞外ドメインポリペプチドは、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈをトロンビンで消化することによって製造してもよい。その結果生成されたＧＳＴ及びＥｐｏ−ｂｐの消化混合物を、次にＥｐｏ親和性カラムに適用してもよい。Ｅｐｏ−ｂｐはそのリガンドであるＥｐｏに結合するが、一方、ＧＳＴはカラムを通過する。Ｅｐｏ−ｂｐは、適切な溶出緩衝液、例えば０．１Mグリシン（pH３．０）を使用することによって精製された形態で溶出することができる。ヒトエリスロポイエチン受容体の細胞外ドメインに対する抗体は、そのようなポリペプチドの精製された調製物を動物の免疫系に提示する（presentation）ことによって製造することができる。例えば、精製されたＥｐｏ−ｂｐを、ラット、マウス、ウサギ又はヒツジのような動物に、皮下注射、筋内注射、又は腹腔内注射で注入してもよい。追加免疫注射は、望ましい場合、間隔をおいて行うことができる。Ｅｐｏ−ｂｐに対する循環抗体は、抗原を注入された動物の免疫系によって生成され、これらの抗体は、血液、好ましくは血清から回収することができる。抗Ｅｐｏ−ｂｐ血清は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ等の多様なアッセイフォーマットでＥｐｏ− ｂｐを検出するのに利用することができる。例えば、検出すべきＥｐｏ−ｂｐは、精製されたＥｐｏ−ｂｐ調製物、細菌又は真核細胞抽出物、インビトロ細胞培養物からの真核細胞、血清試料又は個体から採取した生体組織や細胞中のものであってよい。抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体は、Ｅｐｏ−ｂｐ同様に、完全な（インタクトな）ヒトＥｐｏＲの細胞外ドメインを認識するものと予測される。Ｅｐｏ−ｂｐに対するモノクローナル抗体は、当業界において公知の方法で製造することができる。参照：D′Andrea et al., Blood 75: 874-80(1990); Goldwasser et al., 米国特許第 4,558,005号；Harlow and Lane, Antibodies-Lab Manual, Cold Spr ing Harbor Laboratory, 1988。Ｅｐｏ−ｂｐに対する抗体は、好ましくはＥｐｏＲの細胞外ドメインに対して特異的な結合親和性を有する。例えば、精製されたＥｐｏ−ｂｐを注射した動物の血清は、精製されたＥｐｏ−ｂｐ１０μｇをポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動し、１：２，０００の希釈倍率の抗Ｅｐｏ−ｂｐ血清に露出させた場合、ウェスタンブロットにおいて検出可能なＥｐｏ−ｂｐに対する結合力を示すべきである。本明細書に開示されたＥｐｏＲの精製された細胞外ドメインは、そのような純粋なヒトＥｐｏ受容体断片（すなわち、非ヒト又は非Ｅｐｏ受容体アミノ酸配列を含有していない）として得られる最初のものである。本明細書に開示された実験は、この断片がヒトＥｐｏに特異的に結合する能力を保持していることを明らかにしている。本明細書に開示されたタンパク質及び抗体は、ＥｐｏとＥｐｏ受容体との間の相互作用を理解するのに有用である。本発明の精製されたＥｐｏ− ｂｐは、更に、Ｅｐｏ受容体の構造を研究し、赤芽球系前駆細胞の分化及び増殖メカニズムの調節に関与する因子を同定するのにも有用である。更に、本明細書に開示された本発明は、Ｅｐｏ及びＥｐｏ受容体を同定し定量すること、ならびに、造血系の悪性度及びある種の心臓血管系障害を理解することにも有用である。すなわち、ヘマトクリット及び／又はヘモグロビンレベルの増減が、血圧に影響を与え、他の循環系の問題を引き起こす可能性がある。本発明は、下記の説明的な態様を参照することによって更に理解できるが、これらは単純に例示的なものであり、特許請求の範囲の記載のとおりの本発明の真の範囲を限定するものとしてとらえるべきではない。例１材料グルタチオン（ＧＳＨ）−アガロース、ｐＧＥＸ−２Ｔ発現ベクター及びセファデックス（Sephadex）Ｇ−５０は、ファルマシア（Pharmacia; Mechanicsburg, PA）から購入した。ＰＣＲ試薬は、パーキン−エルマー・シータス(Perkin Elmer Cetus; Norwalk, CT)から購入し、アフィゲル( Affigel)１５は、バイオラッド（BioRad; Richmond，CA）から購入した。バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ、制限酵素及びイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）は、ＢＲＬギブコ(BRL Gibco; Gaithersburg, MD)から購入した。Geneclean IIは、Bio 101(La Jolla, CA)から購入した。ニトロセルロースは、Schleicher & Schuell Co.(Keene, NH)から購入した。化学蛍光(Chem luminescence: ECL)試薬及び ¹²⁵Ｉ−Ｅｐｏは、アマシャム(Amersham; Arlingt on Heights, IL)から購入し、標識されていないＥｐｏは、Chugai-Upjohn(Rosem ont, IL)から贈与を受けた。フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）、トロンビン、トリプシン及びトリトンＸ−１００は、シグマケミカル社(Sigma Chemical Company; St. Louis, MO)から購入した。ビオチン化ウサギ抗ヒツジ抗体及びアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼは、ピアス社（Pierce Co.; Rockford, IL）から購入した。全長ヒトエリスロポイエチン受容体（ＥｐｏＲ）ｃＤＮＡ調製物であるＬＡＰ３７は、エール（Yale）大学(New Haven, CT)の Bernard G. Forget博士から提供を受けた。その他の全ての試薬は試薬等級のものを使用した。例２ＥｐｏＲｃＤＮＡ組換えベクターの構築組換えプラスミド発現ベクターｐＪＹＬ２６を、ヒトＥｐｏ受容体の細胞外ドメインコーディング配列を含有するＰＣＲ産物及びプラスミドベクターｐＧＥＸ−２Ｔから構築した。このプラスミドの構築を下記に説明する。ＰＣＲ増幅は、全長ヒトＥｐｏＲｃＤＮＡであるＬＡＰ３７を鋳型として使用して行った。５′−センスプライマーとしては、５′−ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＡＡＣ−３′を使用した。このプライマーは、５′末端にＢａｍＨＩリンカー配列を有しており、その後に全長ヒトＥｐｏＲタンパク質のアミノ酸第２５乃至第２９をコードする配列が存在する。３′−アンチセンスプライマーとしては、５′−ＴＧＡＡＴＴＣＧＧＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＣＴ−３ ′を使用した。このプライマーは、ＥｃｏＲＩリンカーを有しており、その後に全長ＥｐｏＲのアミノ酸第２２６乃至第２２２をコードする配列に相補的な配列が存在する。パーキンエルマー−シータスＰＣＲキットを使用し、ＬＡＰ３７ｃＤＮＡ０．１μｇ、各プライマー２０pM、ｄＮＴＰ混合物（ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＡＴＰ）１．２５mM、Ｔａｑポリメラーゼ０．５μｌ及びＰＣＲキットに供給された１０×緩衝液を用いてＰＣＲを行った。プログラミングが可能なＰＴＣ−１００サーマルコントローラー(M.J. Research, Inc. W atertown, MA)を使用して、９４℃で１分間変性させ、５５℃で１分間アニーリングさせた後、７２℃で１．５分間伸長させるサイクルを２５回反復して増幅させた。ＰＣＲ産物（〜６００bp）及びｐＧＥＸ−２Ｔ（〜４．９kb）の大きさを、１％ Seakem及び２％ Nusieveアガロース(FMC Bioproducts, Rockland, ME)のゲル上で、１×ＴＡ緩衝液（５０×ＴＡは、１L 中にトリス塩基２４２ｇ及び酢酸５７．１mlを含有する）中でＨａｅIIスタンダードを用いて移動させ、確認した。ＰＣＲ産物及びｐＧＥＸ−２Ｔの両方を、製造者の指示(Bio101, La Jolla, CA)のとおりにGeneclean II方法によってゲルスライスから精製した。ＰＣＲ産物及びｐＧＥＸ−２Ｔの濃度を、ＯＤ２６０での吸光度により概算した。その後、両ＤＮＡを、連結する前に３７℃で４時間ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化した。消化産物を、１％ Seakem及び２％ Nusieve アガロースゲル上で分析した。ＰＣＲ産物及びｐＧＥＸ−２Ｔ断片の両方をゲルから切り出し、Geneclean II方法によって再び精製した。連結は、ＰＣＲ産物及びｐＧＥＸ−２Ｔをそれぞれ１μg/μl で含有する混合物で行った。混合物を、４５℃で５分間インキュベートし、０℃に冷却させた。その後、１０×バクテリオファージＴ４ＤＮＡ緩衝液１μｌ、１０×バクテリオファージＤＮＡリガーゼ１μｌ、１０mMＡＴＰを加えて総量を１０μｌとした。次に、混合物全体を１６℃の循環水槽内で一晩インキュベートした。生成された連結物は、サイズスタンダード、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ＰＣＲ産物、及び連結産物（ＰＣＲ産物＋ｐＧＥＸ−２Ｔ）を含むレーンを用いて、１％アガロースゲル上、１×ＴＡ緩衝液中を１００ボルトで移動させる電気泳動によって確認した。連結産物は、〜５．５kbであることが確認された。その後、連結混合物のアリコートを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させた(連結混合物２０μg/ＪＭ１０９２００μl)。形質転換のためには、大腸菌混合物を静かに反転させて混合した後、氷浴中で３０分間インキュベートし、４２℃で正確に９０秒間インキュベートした。その後、混合物を氷浴中で１乃至２分間冷却させ、ＬＢ培地（１L中に、バクトトリプトン１０ｇ、バクトイースト５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ含有、pH７．５、オートクレーブしたもの）５００μｌを添加した。３７℃で４５分間インキュベートした後、ＬＢ混合物を、ＬＢ／Ａｍｐ寒天ペトリプレート上に、５０、７５、１２５、１５０及び３００mlの量で展開した。寒天ペトリプレートは、１LのＬＢ培地当たり１５ｇの寒天（オートクレーブしたもの）及び１００μg/Lのアンピシリンを含有する、２０乃至３０mlのＬＢ／Ａｍｐ培地で製造した。対照ＬＢ／Ａｍｐプレートは、完全な（インタクトな）ｐＧＥＸ−２Ｔ、消化されたｐＧＥＸ−２Ｔ及びＰＣＲ産物のみで作成した。プレートは、ベンチ上で数時間おいて液体を吸収させた後、逆にして３７℃で２４時間培養した。成長したコロニーを、格子を付したプレートに植え、これを再び３７℃で２４時間培養する一方、全てのコロニーの別のセットをＬＢ／Ａｍｐ培地各５ml中で一晩生育させた。各コロニーからミニプレップ（miniprep）法でＤＮＡを抽出した。各コロニーをＬＢ／Ａｍｐ培地（５０μg/ml Ａｍｐ貯蔵液の２μl/ml）５mlと共に緩く栓をした１５mlプラスチック試験管に入れ、激しく振とうしながら３７℃インキュベーター中で一晩培養した。次の日、各培養物の１．５mlを、４℃、１４，０００×ｇで３分間マイクロ遠心分離してペレットにし、ＳＴＥＴ９３μｌ及びリゾチーム貯蔵液１７μｌ（ＳＴＥＴ：５％スクロース＋５％トリトンＸ−１００＋５０mMトリス、pH８．０＋５０mMＥＤＴＡ、pH８．０、４℃ 保存；リゾチーム貯蔵液：５mg/ml、冷凍庫に保存）中に再懸濁させた。その後、再懸濁された混合物を室温で１０分間インキュベートし、２分間沸騰させた後、４℃、１４，０００×ｇで１５分間マイクロ遠心分離した。ペレットを滅菌した楊枝で除去し、ＲＮＡｓｅ(１００mg/ml)２μｌを上清に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、氷冷イソプロパノール１１０ μｌを加えて、混合物を４回反転させた後、４℃、１４，０００×ｇで１５分間ペレットにした。次いで、ペレット（ＤＮＡ）を〜１mlの７０％エタノールで洗浄し、残存するＳＴＥＴ及びその他の不純物を除去し、ペレットを再び４℃、１４，０００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを１乃至２時間空気中で乾燥させた後、滅菌したｄＨ₂Ｏ２５μｌ中に再懸濁させた。抽出されたＤＮＡを、ＴＡ緩衝液中の０．８％アガロースゲル上で、色素フロント線がゲルの長さの４／５程移動するまで１００ボルトで泳動し、確認した。ゲルを、室温で１５分間、静かに振とうしながらエチジウムブロマイド（０．５ μg/ml）で染色し、ｄＨ₂Ｏで１５分間脱色した。ＤＮＡバンドは、ＵＶ光下で調べた。予測された大きさのＤＮＡを有する培養物を、ＥｃｏＲＩ及び／又はＥｃｏＲＩ＋ＢａｍＨＩで消化した後、ＴＡ緩衝液中の１％アガロースゲルで調べた。ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ消化は、試料混合物を、ＤＮＡ２μｇ当たりＥｃｏＲＩ又はＢａｍＨＩ１μｇの比率で制限酵素と混合し、試料容量１０μｌ当たり制限酵素キットに包含されている１０×反応緩衝液１μｌを用いて、３７℃の水槽で２時間インキュベートすることによって行った。ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＩ＋ＢａｍＨＩで消化したＤＮＡサイズを１％アガロースゲルで調べた後、約〜５．５kbの大きさのプラスミドを有する１つのコロニーを選択した。このコロニー内のプラスミドを、ｐＪＹＬ２６と命名した。ｐＪＹＬ２６のダイヤグラムを、図１の上段に示す。例３ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈ融合タンパク質の精製本実施例は、２つのセグメントを有する融合タンパク質の製造及び精製を教示している。第一のセグメントは、カルボキシ末端にトロンビン切断部位を有するポリペプチドＧＳＴである。第二のセグメントは、このトロンビン切断部位で第一のセグメントに融合されている、ヒトＥｐｏ受容体の細胞外ドメインである。ＧＳＴ及びＥｐｏ−ｂｐを含有する融合タンパク質ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈは、ＧＳＨ−アガロース親和性クロマトグラフィーによって精製する。組換えベクターｐＪＹＬ２６を含む形質転換された大腸菌を、アンピシリン１００μg/mlを含有するＬＢ培地４００ml中で激しく振とうしながら３７℃で一晩生育させた。次の日、培養物を新しいＬＢ／Ａｍｐ培地４Ｌで希釈し、更に９０分間培養した後、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を１mM となるように添加した。ＩＰＴＧで誘導した４時間後に、細胞を、４℃、３，０００×ｇで１５分間遠心分離してペレットにし、５０mMリン酸ナトリウム、pH７．４、１０mM β−メルカプトエタノール（βＭＥ）、１０ mM ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１mM ＰＭＳＦ及び１mM ＤＦＰを含む溶解緩衝液１６０ml中に再懸濁させた。次いで、固体リゾチーム１６０mgを添加した。６０ cc注射器を使用して、溶解された細胞懸濁液を、１８、２１及び２３ゲージの針を３度通過させてホモジナイズし、氷上で３０分間インキュベートした。ドライアイス／メタノール凍結及び３７℃での解凍過程を３回反復し、弱く超音波処理した後、トリトンＸ−１００を１％となるように添加した。上清を、４℃、１５ ×kgで１５分間遠心分離して回収した。ＧＳＨ−アガロースカラムは、膨潤させたＧＳＨ−アガロースビーズを１０倍のベッド容量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：１６mM Ｎａ₂ＨＰＯ₄、４mM ＮａＨ₂ＰＯ₄、pH７．４、３M ＮａＣｌの塩過剰）で３回洗浄して、保存剤及び溶出性デキストランをアガロースゲルから除去することによって調製した。その後、カラムを５倍のベッド容量の等張ＰＢＳで平衡化した。ＩＰＴＧで誘導された抽出物をカラムに適用し、カラムを５倍のベッド容量のＰＢＳで２回洗浄して、ＧＳＨ−アガロースに親和性を持っていない全てのタンパク質を溶出させた。その後、５０mM トリス−ＨＣｌ、pH８．０中に５mM 還元型ＧＳＨを含有する５倍のベッド容量の溶出緩衝液を加えることにより、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈを溶出させた。１．０mlの画分を回収し、各画分のＡ₂₈₀ を測定した。Ａ₂₈₀ データを図２ａに示す。後に、画分１８乃至２３がＥｐｏＲｅｘ−ｔｈタンパク質を含有することが示された。これらの画分を合わせた。４L の細胞培養物から、平均２mgのＥｐｏＲｅｘ−ｔｈが抽出された。例４Ｅｐｏ−ｂｐの精製図１の下段に図式化したように、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈは、トロンビン特異的タンパク分解的切断部位を含有している。トロンビンは、図１に示すように、配列 −ＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＧＴＧＧＡＴＣＣ−にコードされるアミノ酸配列ＬｅｕＶａｌＰｒｏＡｒｇＧｌｙＳｅｒで特異的に切断する。参照：Smith and Johnson, Gene 67: 31-40(1988)。ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈをトロンビンと共にインキュベートしてＥｐｏ−ｂｐセグメントからＧＳＴセグメントを切断し、下記のようにＥｐｏ−アガロース親和性を利用して２つのセグメントを精製した。最も効果的なトロンビン切断を見出すため、様々の濃度のトロンビンを試した。精製したＥｐｏＲｅｘ−ｔｈを、室温又は３７℃で、ＰＢＳ緩衝液（pH７．４）中で１時間、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈ６０μｇ当たり０．０１２５、０．１２５、０．６又は２．４μｇのトロンビンを用いてインキュベートした。その結果を、ポリアクリルアミドゲル（１２．５％）電気泳動で分析した。クマシーブルーで染色した後、融合タンパク質ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈ(５５kDa)、Ｅｐｏ−ｂｐ(２９ kDa)及びＧＳＴ(２６kDa)に相当するバンドが見られた。ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈの完全消化のために、０．６μｇの濃度を選択した。結果を図３に示す。トロンビンで切断するため、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈ６０μｇを、トロンビン０．６μｇと共に室温で１時間インキュベートした。混合物を、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）又はＰＢＳ中のエリスロポイエチン−アガロースカラムに適用した。Ｅｐｏ−ｂｐを０．１Mグリシン緩衝液（pH３．０）で溶出させた。０．５mlの画分を、予め２Mトリス−ＨＣｌ（pH７．５）０．５mlを含有している試験管に回収した。Ｅｐｏ−ｂｐピークの画分１４乃至１９を合わせた後、以後の実験のため、ＴＢＳ又はＰＢＳ中で４℃で一晩透析した。４L の細胞培養調製物から出発して、およそ２００μｇのＥｐｏ−ｂｐが抽出された。Ｅｐｏ−アガロースビーズを使用してＥｐｏ−アガロースカラムを準備した。Ｅｐｏ−アガロースビーズは、０．１M ３−（Ｎ−モルフォリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）中でＥｐｏ(０．５mg/ml)を４℃で一晩透析することによって調製した。Ｅｐｏは、透析したＥｐｏ溶液１ml及び洗浄したアフィゲル(Aff igel)１５２mlを混合し、回転振盪器上で室温で２時間インキュベートすることによって、アフィゲル１５ビーズに結合させた。上清を、２，０００×ｇで３０秒間マイクロ遠心分離した後に除去した。充填されたＥｐｏ−アガロースビーズは、４℃でＴＢＳ又はＰＢＳで３回洗浄し、使用するまで保存した。目的とするタンパク質画分を回収した後、Ｅｐｏ−アガロースビーズは、ＴＢＳ又はＰＢＳで十分に洗浄し、再使用するまで４℃に保存することができる。例５Ｅｐｏ−ｂｐに対する抗体の製造本実施例は、精製されたＥｐｏ−ｂｐに対する抗体の製造を教示している。精製されたＥｐｏ−ｂｐを、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、Ｅｐｏ−ｂｐタンパク質バンドをＰＢＳ中で再懸濁させ、ヒツジに注射した。抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体を含有するヒツジ血清は、その血清を１：２，０００で希釈した場合、精製されたヒトＥｐｏ−ｂｐを検出することが示された。上記のとおり精製されたＥｐｏ−ｂｐ（０．５mg）を、２×処理(レムリ：Lae mmli)緩衝液と混合し、１０分間沸騰させた。混合物を１２．５％ＳＤＳゲルに適用し、２００ボルトで３乃至４時間電気泳動した。ゲルを０．１２５％クマシーブルーで一晩染色し、ｄＨ₂Ｏで１乃至２時間脱色した後、カミソリでゲルからＥｐｏ−ｂｐバンドを切り出した。Ｅｐｏ−ｂｐゲルスライスをＰＢＳ緩衝液１０乃至１５ml中に再懸濁させ、ゲルが小片に粉砕されてＰＢＳとの懸濁混合物を形成するまで、反復して注射器を通過させた。この懸濁液を成体のヒツジに皮下注射した。Ｅｐｏ−ｂｐは、動物体重２５kg当たりＥｐｏ−ｂｐ０．５mg以上の比率で注射した。初回の注射後３週毎に１回ずつ、初回注射と同じ用量で２回の追加免疫注射を行った。２回目の追加免疫注射後、血液を採取して抗体を回収することができる。動物による抗体の産生を維持するために、毎月注射することができる。注射部位は動物の各部位を巡回させる。参照：Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Chapter 18, 1989。注射した動物から採血するため、採血部位の毛を７０％アルコールで消毒した。耳動脈又は他の接近可能な動脈を探して毛を剃った。少量のキシレンを、耳の端の、採血部位でない所に塗布した。血液を翼状針（バタフライ）で徐々に抜いて、ヘパリンを入れていないガラス試験管に受けた。血液を室温で１時間インキュベートして凝固させ、パスツールピペットで試験管壁から血餅をはずして、試験管を４℃で一晩インキュベートした。凝固した血液混合物を、ディッシュに注いで、血餅を除去した。凝固していない残りの部分を、ガラス試験管に戻し、３００rpmで１０分間遠心分離した。Ｅｐｏ−ｂｐの精製について上述したのと同じ手順を用いて、上清（血清）を、Ｅｐｏ−ｂｐ親和性カラムに適用し、カラムに結合した抗体を、０．１Mグリシン緩衝液（pH３．０）で溶出させた。溶出液を、ＰＢＳ中で４℃で一晩透析し、５００μｌずつのアリコートに分けて−７０℃で保存した。Ｅｐｏ−ｂｐ親和性カラムは、下記の例６に記載されているＥｐｏ−ｂｐアフィゲルビーズと同じ方法で、Ｅｐｏ−ｂｐ及びアフィゲル１５アガロースビーズから調製した。この例で使用した溶液は、次のように調製する：溶解緩衝液II：５０mM ＮａＰＯ₄（０．５M 二塩基性ＰＯ₄７．７４ml＋０．５M一塩基性ＰＯ₄ ２．２６ml）＋１０mMβ−メルカプトエタノール＋１０mM ＥＤＴＡ、pH８。ＰＢＳ緩衝液：０．１５M ＮａＣｌ＋１６mM二塩基性ＰＯ₄＋６mM一塩基性ＰＯ₄、pH７．４。ＴＢＳ緩衝液：１Lにつき、２Mトリス−ＨＣｌ、pH７．４、１２．５ml＋５M ＮａＣｌ２７．５ml。２×処理（レムリ）緩衝液：０．１２５Mトリス−ＨＣｌ、pH６．８＋４％ＳＤＳ＋２０％グリセロール＋１０％β−メルカプトエタノール。ヒツジ抗Ｅｐｏ−ｂｐ血清を、Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Ed ., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に記載されているウェスタンブロッティング法及びＥＣＬ製造者(Amersham Co., Arlington Heights, IL)によって提供されているウェスタンブロッティングプロトコールによって、精製されたＥｐｏ−ｂｐに対する結合について分析した。トロンビンで切断した後、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈとＥｐｏ−ｂｐとをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動により分離した。その後、ゲルをニトロセルロース(Schleicher and Schuell Co., Keene , NH)上にブロッティングした。ブロット液（Blotto：１L中に脱脂粉乳８０ｇ、５M ＮａＣｌ３０m、２Mトリス−ＨＣｌ、pH７．５１０ml及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中のニトロセルロースに、ヒツジ抗Ｅｐｏ−ｂｐ血清を１：２，０００の希釈倍率で加え、静かに撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。一次抗体を洗浄した後、第二の試薬であるビオチン化されたウサギ抗免疫グロブリン抗ヒツジ抗体（１：１０，０００希釈）をブロット液中のニトロセルロースに加え、更に１時間室温で振とうしながらインキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼーアビジン（１：１０，０００希釈）を加え、混合物を室温で４５分インキュベートした。洗浄したニトロセルロースを、素早く化学蛍光（ＥＣＬ）試薬に浸した後、濡れた状態のブロットを直ちにKODAK Ｘ線フィルムに露出させた。図４は、各レーンに下記のタンパク質が適用されたウェスタンブロットの写真を示す：レーン１、分子量スタンダード；レーン２、トロンビンで消化したＥｐｏＲｅｘ−ｔｈ；レーン３、ＧＳＴ；レーン４、精製されたＥｐｏ−ｂｐ。図４のレーン４から分かるように、精製されたＥｐｏ−ｂｐは、１：２，０００で希釈された抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体によって検出された。精製されたＥｐｏ−ｂｐの見掛け分子量は、約２９kDaであった。例６Ｅｐｏ−ｂｐに対するＥｐｏの結合本例は、Ｅｐｏ−ｂｐに対するＥｐｏのリガンド結合及び結合に対するＥｐｏ濃度の効果を教示している。Ｅｐｏ−ｂｐビーズは、ＰＢＳ中の洗浄されたアフィゲル１５アガロースビーズに、６０μg/mlのＥｐｏ−ｂｐを添加し、タンパク質の最終濃度がＥｐｏ−ｂｐビーズ１ml当たりおよそ３０μgとなるようにして調製した。混合物を回転プラットホーム上で室温で２時間インキュベートした。氷冷ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、ペレットをＰＢＳ緩衝液１ml中に再懸濁させた。結合アッセイのため、最終懸濁液３０μl (Ｅｐｏ−ｂｐ約１．０μｇ)を種々の濃度の ¹²⁵Ｉ−Ｅｐｏと混合し、５分ごとにピペットで再懸濁させながら室温で１時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、氷冷ＰＢＳ緩衝液１mlを加えて、反応していない ¹²⁵Ｉ−Ｅｐｏを洗浄し、更に２回洗浄をくり返した。反応させたビーズを、ガンマー計数器で計数した。トリプシン消化抽出物（下記参照）からの、完全なＥｐｏ−ｂｐより小さいタンパク質も、同じ方法で適用して、リガンド結合に関する効果をテストした。非特異的結合は、標識されたＥｐｏを添加する前に混合物を１時間２００倍過剰量の標識されていないＥｐｏと予めインキュベートする以外には、同じ方法で測定した。Ｅｐｏに対するＥｐｏ−ｂｐの結合を図５に示す。図５の各点は、２乃至４回の試料の平均値である。データは平均値士ＳＥＭとして示してある。ｐ数値が０．０５未満の場合、有意であるものとした。結果を、２−テイルドステューデントｔ−テスト（two-tailed Student t-test)で分析した。Ｅｐｏ−ｂｐに対するＥｐｏの特異的結合活性は、Ｅｐｏ濃度が増加するに従って急激に増加し、 ¹²⁵ Ｉ−Ｅｐｏの濃度を８nMから１２nMに増加させると結合は３倍に増加した。Ｅｐｏ結合の見掛けの飽和状態は、１２nMで起こった。これは、 ¹²⁵Ｉ−Ｅｐｏの反応させていない上清においても確認された。Ｅｐｏ−ｂｐに対する ¹²⁵Ｉ−Ｅｐｏの結合は、 ¹²⁵Ｉ−Ｅｐｏが８nM以上である濃度条件で、標識されていないＥｐｏの存在下で有為に抑制された（両比較でｐ＜０．０００１）。非特異的結合は、予想よりも多少高かった。ウェスタンブロット及び結合アッセイで示されたＥｐｏ−ｂｐに対するＥｐｏ結合の特異性及び感度により、過剰量の標識されていないＥｐｏが ¹²⁵Ｉ−Ｅｐｏの結合を完全に排除しうることは、予期されていた。リガンド結合に関与するＥｐｏ−ｂｐの最小限の配列を見出すため、トリプシン消化実験を行った。Ｅｐｏ受容体タンパク質にはいくつかのアルギニン及びリジン部位が存在し、これらはトリプシン消化の特異的部位となることもできる。Ｅｐｏ−ｂｐのトリプシン消化は、総量２００μｌのＰＢＳ、pH６．７中で、Ｅｐｏ−ｂｐ５μｇ当たり１０、２０、３０、５０、１００μｇ及び２mgのトリプシンを用いて、３７℃で３乃至６時間行った。反応は、等量の２N酢酸を加えるか、あるいは沸騰させることによって停止した。図６から分かるように、Ｅｐｏ−ｂｐは、２０μｇ以上のトリプシンが存在する場合、効果的に切断された。トリプシンは、２mgのトリプシンを含有するレーンで２３．２kDa のタンパク質バンドとして視認可能である。トリプシンによって消化されたＥｐｏ−ｂｐは、２０kDaのタンパク質として視認可能である。図６において、レーン１は標準分子量マーカーを含み；レーン２は対照であり；レーン３乃至８は、それぞれ１０、２０、３０、５０、１００μｇ及び２mg のトリプシン濃度で３７℃で３時間消化したものを示し；レーン９乃至１４は、同じトリプシン濃度で３７℃で６時間インキュベートしたものを示す。切断されていないＥｐｏ−ｂｐはおよそ３０kDaであるので、ファルマシアセファデックスＧ−５０（ＭＷ≦３０，０００）を使用したゲル濾過クロマトグラフィーを適用して、分子量≦３０，０００のタンパク質成分を総混合物から分離した。粉末状のセファデックスＧ−５０を水和させ、等張ＰＢＳで数回洗浄して保存剤を除去した。トリプシンで消化したＥｐｏＲｅｘ−ｔｈを、ゲルカラムの上部にＰＢＳ中総量２mlで適用した。カラムを、スイングローター(swinging- bucket rotor)内で２，０００×ｇで室温で４分間遠心分離した。注射器底より回収された最初の溶出液（〜０．２ml）を、蓋を取ったマイクロ遠心チューブに回収した。この溶出液は、Ｅｐｏ−ｂｐより大きいサイズのタンパク質を含有している。更にＰＢＳ緩衝液０．２mlをカラムに加えて、１０分間遠心分離することによって、二番目の溶出液を新しい蓋を取ったマイクロ遠心チューブに回収した。この工程を２回反復した。二番目の溶出液をＥｐｏ−アガロースカラムに適用し、ピークの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びウェスタンブロッティングで調べた。図６に示すように、トリプシンで消化したＥｐｏ−ｂｐの最終産物は、およそ２０kDaであった。抗体は、切断されたＥｐｏ−ｂｐを認識しなかった。したがって、ウェスタンブロッティングによって確認されたように、トリプシン消化によってＥｐｏ−ｂｐから３０個のアミノ酸が除去されると、Ｅｐｏ−ｂｐに対する抗体による認識も完全に排除された。上記の詳細な説明は本発明に対する理解を増進させるためだけのものであり、当業者には、添付した請求の範囲の精神と領域から逸脱することなしに改変が明らかであるので、上記の詳細な説明から不必要な制限が加えられるべきではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＧ０１Ｎ 33/53 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ // Ｃ１２Ｎ 1/21 7804−4ＢＣ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】 1. （ａ）カルボキシ末端にトロンビンのタンパク分解的切断部位を有するポリペプチドを発現させることのできる第一のヌクレオチド配列；及び（ｂ）基本的に全長ヒトエリスロポイエチン受容体のｃＤＮＡコーディング配列のヌクレオチド第７３乃至第７５０からなり、上記トロンビンのタンパク分解的切断部位の３′側に位置し、上記第一の配列に翻訳的に連結されている第二の配列を含むことを特徴とする発現ベクター。 2. 基本的に、（ａ）アミノ末端及びカルボキシ末端を有し、カルボキシ末端にトロンビンのタンパク分解的切断部位を有する第一のポリペプチドセグメント；及び（ｂ）基本的に全長ヒトエリスロポイエチン受容体タンパク質のアミノ酸約第２５乃至約第２５０からなり、上記第一のポリペプチドセグメントのカルボキシ末端に共有結合によりカップリングされている第二のポリペプチドセグメントからなることを特徴とする、精製された融合タンパク質。 3. 基本的に全長ヒトエリスロポイエチン受容体タンパク質のアミノ酸約第２５乃至約第２５０からなり、ヒトエリスロポイエチンと結合することができる、精製されたヒトエリスロポイエチン受容体ポリペプチド。 4. 基本的に全長ヒトエリスロポイエチン受容体タンパク質のアミノ酸約第２５乃至約第２５０からなり、ヒトエリスロポイエチンと結合することができる、精製されたヒトエリスロポイエチン受容体ポリペプチドに対して、特異的結合親和性を有する精製された抗体。 5. （ａ）固相イムノアッセイ試薬；及び（ｂ）上記試薬に作動的にカップリングされた請求項３に記載のタンパク質を含むことを特徴とするイムノアッセイ組成物。 6. （ａ）固相試薬；及び（ｂ）上記試薬に作動的にカップリングされた請求項４に記載の抗体を含むことを特徴とするイムノアッセイ組成物。 7. 基本的に全長ヒトエリスロポイエチン受容体タンパク質のアミノ酸約第２５乃至約第２５０からなり、エリスロポイエチンと結合することができる、実質的に純粋なヒトエリスロポイエチン受容体ポリペプチドを得る方法であって、（ａ）請求項２に記載の精製された融合タンパク質を準備し；（ｂ）上記融合タンパク質を、融合タンパク質からの上記ポリペプチドの切断を可能にする条件下でトロンビンで処理し、分解混合物を形成させ；（ｃ）上記分解混合物を、上記ポリペプチドの固相試薬への結合を可能にする条件下で、エリスロポイエチンが結合されている固相試薬に添加し、ポリペプチド−固相組成物を形成させ；（ｄ）上記ポリペプチド−固相組成物を洗浄して結合していない物質を除去し；（ｅ）上記ポリペプチド−固相組成物から上記ポリペプチドを溶出させる工程を含むことを特徴とする方法。