JPH04211367A - ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの製造方法及び該酵素の使用 - Google Patents
ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの製造方法及び該酵素の使用Info
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- JPH04211367A JPH04211367A JP3057058A JP5705891A JPH04211367A JP H04211367 A JPH04211367 A JP H04211367A JP 3057058 A JP3057058 A JP 3057058A JP 5705891 A JP5705891 A JP 5705891A JP H04211367 A JPH04211367 A JP H04211367A
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- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ペプチジルグリシンα
−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ （ｐｅｐｔｉｄ
ｙｌｇｌｙｃｉｎｅ α−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｎｇ
ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ： ＰＡＭ）， α−
ヒドロキシグリシルペプチドを対応するグリシン延長ペ
プチドから製造するために前記酵素を使用する場合、及
びα−ヒドロキシグリシルペプチドそれ自体に関する。
−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ （ｐｅｐｔｉｄ
ｙｌｇｌｙｃｉｎｅ α−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｎｇ
ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ： ＰＡＭ）， α−
ヒドロキシグリシルペプチドを対応するグリシン延長ペ
プチドから製造するために前記酵素を使用する場合、及
びα−ヒドロキシグリシルペプチドそれ自体に関する。
【０００２】
【従来の技術】ペプチドＣ−末端アミド化酵素と称され
る酵素は、次：Ｒ−ＮＨ−ＣＨ２ −ＣＯＯＨ（式中、
Ｒはペプチドを表わし、そして−ＮＨ−ＣＨ２ −ＣＯ
ＯＨは該ペプチドのＣ−末端に存在するグリシン残基を
表わす）により表わされるグリシン延長ペプチドを、次
：Ｒ−ＮＨ２（ここで、アミノ基は、ペプチドのＣ−末
端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化している）
により表わされるα−アミド化ペプチドに転換する反応
を触媒する一群の酵素である。
る酵素は、次：Ｒ−ＮＨ−ＣＨ２ −ＣＯＯＨ（式中、
Ｒはペプチドを表わし、そして−ＮＨ−ＣＨ２ −ＣＯ
ＯＨは該ペプチドのＣ−末端に存在するグリシン残基を
表わす）により表わされるグリシン延長ペプチドを、次
：Ｒ−ＮＨ２（ここで、アミノ基は、ペプチドのＣ−末
端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化している）
により表わされるα−アミド化ペプチドに転換する反応
を触媒する一群の酵素である。
【０００３】多くの生物学的に活性なペプチドがＣ−末
端アミド化構造を有し、そしてそれらの生物学的活性の
ためにこの構造が必須であることが知られているが、し
かしながら化学合成又は遺伝子組換技法によりＣ−末端
α−アミド化ペプチドを直接製造することは困難である
。
端アミド化構造を有し、そしてそれらの生物学的活性の
ためにこの構造が必須であることが知られているが、し
かしながら化学合成又は遺伝子組換技法によりＣ−末端
α−アミド化ペプチドを直接製造することは困難である
。
【０００４】この困難を克服するため、Ｃ−末端α−ア
ミド化ペプチドを製造するためにペプチジルグリシンα
−アミド化酵素を使用する多くの試みがなされている。 例えばＥＰ ０，３０８，０６７はＭＴＣ腫瘍由来のα
−アミド化酵素組成物及びその使用を記載している。
ミド化ペプチドを製造するためにペプチジルグリシンα
−アミド化酵素を使用する多くの試みがなされている。 例えばＥＰ ０，３０８，０６７はＭＴＣ腫瘍由来のα
−アミド化酵素組成物及びその使用を記載している。
【０００５】Ｍｉｚｕｎｏ Ｋ． ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． Ｖｏｌ
．１４８， Ｎｏ．２， ｐｐ５４６−５５２， １９
８７ は、アフリカツメガエル （Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌ
ａｅｖｉｓ） 体皮由来のα−アミド化酵素ＡＥ−Ｉを
記載しており、そして Ｏｈｓｕｙｅ Ｋ．ら、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．
Ｖｏｌ．１５０， Ｎｏ．３， ｐｐ１２７５−１２
８１， １９８８ はアフリカツメガエル体皮由来の他
のタイプのα−アミド化酵素ＡＥ−ＩＩを記載している
。
． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． Ｖｏｌ
．１４８， Ｎｏ．２， ｐｐ５４６−５５２， １９
８７ は、アフリカツメガエル （Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌ
ａｅｖｉｓ） 体皮由来のα−アミド化酵素ＡＥ−Ｉを
記載しており、そして Ｏｈｓｕｙｅ Ｋ．ら、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．
Ｖｏｌ．１５０， Ｎｏ．３， ｐｐ１２７５−１２
８１， １９８８ はアフリカツメガエル体皮由来の他
のタイプのα−アミド化酵素ＡＥ−ＩＩを記載している
。
【０００６】ＥＰ ０，２９９，７９０は、アフリカツ
メガエル由来の前記酵素をコードするｃＤＮＡのそれぞ
れプラスミドｐＸＡ４５７及びｐＸＡ７９９へのクロー
ニングを記載している。しかしながら、大腸菌 （Ｅ．
ｃｏｌｉ）での該ｃＤＮＡの発現は、おそらく、発現さ
れた酵素の正しくないフォルディングのため、又は他の
理由により、わずかな活性のみを有する生成物をもたら
し、その理由の１つは生成物が真のα−アミド化活性を
有さないことである。
メガエル由来の前記酵素をコードするｃＤＮＡのそれぞ
れプラスミドｐＸＡ４５７及びｐＸＡ７９９へのクロー
ニングを記載している。しかしながら、大腸菌 （Ｅ．
ｃｏｌｉ）での該ｃＤＮＡの発現は、おそらく、発現さ
れた酵素の正しくないフォルディングのため、又は他の
理由により、わずかな活性のみを有する生成物をもたら
し、その理由の１つは生成物が真のα−アミド化活性を
有さないことである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】今や、驚くべきことに
、アフリカツメガエルのＡＥ−Ｉは真のα−アミド化酵
素ではなくα−ヒドロキシル化酵素であること、及びＲ
−ＮＨ−ＣＨ２ −ＣＯＯＨからのＲ−ＮＨ２ への前
記の転換が２段階で生ずることが見出された。
、アフリカツメガエルのＡＥ−Ｉは真のα−アミド化酵
素ではなくα−ヒドロキシル化酵素であること、及びＲ
−ＮＨ−ＣＨ２ −ＣＯＯＨからのＲ−ＮＨ２ への前
記の転換が２段階で生ずることが見出された。
【０００８】第一段階はペプチジルグリシンα−ヒドロ
キシル化モノオキシゲナーゼにより触媒され、そして中
間体生成物Ｒ−ＮＨ−ＣＨＯＨ−ＣＯＯＨを導く。前記
のα−アミド化酵素の他の幾つかも真のアミド化酵素で
はなく反応の第一段階のみを触媒し、そしてそれ故にペ
プチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナー
ゼであることが支持される。
キシル化モノオキシゲナーゼにより触媒され、そして中
間体生成物Ｒ−ＮＨ−ＣＨＯＨ−ＣＯＯＨを導く。前記
のα−アミド化酵素の他の幾つかも真のアミド化酵素で
はなく反応の第一段階のみを触媒し、そしてそれ故にペ
プチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナー
ゼであることが支持される。
【０００９】高力価を有するペプチジルグリシンα−ヒ
ドロキシル化モノオキシゲナーゼの製造方法が必要であ
る。生物学的に活性なペプチド又は酵素の製造のための
手段として、米国特許Ｎｏ．４，７４５，０５１はバキ
ュロウイルス （ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）−昆虫細胞
発現系を記載している。
ドロキシル化モノオキシゲナーゼの製造方法が必要であ
る。生物学的に活性なペプチド又は酵素の製造のための
手段として、米国特許Ｎｏ．４，７４５，０５１はバキ
ュロウイルス （ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）−昆虫細胞
発現系を記載している。
【００１０】本発明の１つの目的は、高い力価を有する
ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナ
ーゼの製造方法、及びこのα−ヒドロキシル化モノオキ
シゲナーゼを用いてのα−ヒドロキシグリシルペプチド
の製造方法を提供することである。
ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナ
ーゼの製造方法、及びこのα−ヒドロキシル化モノオキ
シゲナーゼを用いてのα−ヒドロキシグリシルペプチド
の製造方法を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、バキュロウイ
ルス−昆虫細胞発現系を用いて遺伝子組換法により高力
価のペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシ
ゲナーゼを製造する方法を提供する。
ルス−昆虫細胞発現系を用いて遺伝子組換法により高力
価のペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシ
ゲナーゼを製造する方法を提供する。
【００１２】さらに具体的には、本発明はペプチジルグ
リシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの製造方
法を提供し、この方法は、ペプチジルグリシンα−ヒド
ロキシル化モノオキシゲナーゼをコードするＤＮＡが導
入されている組換バキュロウイルスによりトランスフェ
クトされた昆虫細胞を培養して該酵素を生産せしめ、そ
して所望により培養物から該酵素を回収することを含ん
で成る。
リシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの製造方
法を提供し、この方法は、ペプチジルグリシンα−ヒド
ロキシル化モノオキシゲナーゼをコードするＤＮＡが導
入されている組換バキュロウイルスによりトランスフェ
クトされた昆虫細胞を培養して該酵素を生産せしめ、そ
して所望により培養物から該酵素を回収することを含ん
で成る。
【００１３】本発明はまた、Ｃ−末端α−ヒドロキシグ
リシルペプチドの製造方法を提供し、この方法は、次の
式（Ｉ）： Ｒ−ＮＨ−ＣＨ２ −ＣＯＯＨ
（Ｉ）（式中、Ｒ
はペプチドを表わし、そして−ＮＨ−ＣＨ２ −ＣＯＯ
Ｈは該ペプチドＲのＣ−末端に存在するグリシン残基を
表わす）により表わされるＣ−末端グリシン延長ペプチ
ドを、本発明の方法により製造された酵素を用いて、次
の式（ＩＩ）： Ｒ−ＮＨ−ＣＨＯＨ−ＣＯＯＨ
（ＩＩ）で表わされるＣ−
末端α−ヒドロキシグリシルペプチドに転換することを
含んで成る。
リシルペプチドの製造方法を提供し、この方法は、次の
式（Ｉ）： Ｒ−ＮＨ−ＣＨ２ −ＣＯＯＨ
（Ｉ）（式中、Ｒ
はペプチドを表わし、そして−ＮＨ−ＣＨ２ −ＣＯＯ
Ｈは該ペプチドＲのＣ−末端に存在するグリシン残基を
表わす）により表わされるＣ−末端グリシン延長ペプチ
ドを、本発明の方法により製造された酵素を用いて、次
の式（ＩＩ）： Ｒ−ＮＨ−ＣＨＯＨ−ＣＯＯＨ
（ＩＩ）で表わされるＣ−
末端α−ヒドロキシグリシルペプチドに転換することを
含んで成る。
【００１４】本発明のペプチジルグリシンα−ヒドロキ
シル化モノオキシゲナーゼは、上に定義したＣ−末端α
−ヒドロキシル化活性を有し種々の起原に由来する任意
の酵素を包含する。好ましくは、本発明のペプチジルグ
リシンα−ヒドロキシル化酵素は前記の文献に開示され
ているもの、例えばアフリカツメガエル体皮由来のＡＥ
−Ｉ及びＡＥ−ＩＩ、並びに目的とする酵素活性を有す
るそれらの断片である。最も好ましくは、本発明の酵素
はＡＥ−Ｉである。
シル化モノオキシゲナーゼは、上に定義したＣ−末端α
−ヒドロキシル化活性を有し種々の起原に由来する任意
の酵素を包含する。好ましくは、本発明のペプチジルグ
リシンα−ヒドロキシル化酵素は前記の文献に開示され
ているもの、例えばアフリカツメガエル体皮由来のＡＥ
−Ｉ及びＡＥ−ＩＩ、並びに目的とする酵素活性を有す
るそれらの断片である。最も好ましくは、本発明の酵素
はＡＥ−Ｉである。
【００１５】本発明の酵素をコードするＤＮＡは常法に
従って調製することができる。例えば、α−ヒドロキシ
グリシルペプチド又はα−アミド化ペプチドが天然に発
現される材料、例えばアフリカツメガエル体皮、ウシ下
垂体中葉、ラット心房、等から常法に従って全ＲＮＡを
抽出する。次に、常法、例えば Ｃｈｉｒｇｗｉｎ Ｊ
．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８， ５２
９４−５２９９ （１９７７）の方法に従ってオリゴｄ
Ｔ−セルロースカラムクロマトグラフィーによりポリ（
Ａ）＋ ＲＮＡ を単離する。
従って調製することができる。例えば、α−ヒドロキシ
グリシルペプチド又はα−アミド化ペプチドが天然に発
現される材料、例えばアフリカツメガエル体皮、ウシ下
垂体中葉、ラット心房、等から常法に従って全ＲＮＡを
抽出する。次に、常法、例えば Ｃｈｉｒｇｗｉｎ Ｊ
．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８， ５２
９４−５２９９ （１９７７）の方法に従ってオリゴｄ
Ｔ−セルロースカラムクロマトグラフィーによりポリ（
Ａ）＋ ＲＮＡ を単離する。
【００１６】次に、常法に従って、例えばλファージ中
に、又は Ｏｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇ， Ｍｏｌｅｃ
．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２， １６１−１７０，
１９８２の方法に従ってｃＤＮＡライブラリーを作製し
、そしてこのｃＤＮＡライブラリーを、例えばウシ、カ
エル又はラットに由来するペプチジルグリシンα−ヒド
ロキシル化モノオキシゲナーゼをコードするｃＤＮＡの
公表されている配列〔Ｍｉｚｕｎｏ． Ｋ．ら （１９
８７）， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅ
ｓ． Ｃｏｍｍ． １４８ ， ５４６−５５２ ；
Ｅｉｐｐｅｒ， Ｂ．Ａ．ら （１９８７）， Ｍｏｌ
ｅｃ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １ ， Ｎｏ．
１１， ７７７−７９０ ； Ｏｈｓｕｙｅ． Ｋ．
ら （１９８８）， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｓ
． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １５０，１２７５−１２８
１ ； Ｓｔｏｆｆｅｒｓ， Ｄ．Ａ．ら （１９８９
）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ， ８６， ７３５−７３９ を参照のこと
〕に従って設計された合成オリゴヌクレオチドプローブ
を用いてハイブリダイゼーション法によりスクリーニン
グする。
に、又は Ｏｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇ， Ｍｏｌｅｃ
．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２， １６１−１７０，
１９８２の方法に従ってｃＤＮＡライブラリーを作製し
、そしてこのｃＤＮＡライブラリーを、例えばウシ、カ
エル又はラットに由来するペプチジルグリシンα−ヒド
ロキシル化モノオキシゲナーゼをコードするｃＤＮＡの
公表されている配列〔Ｍｉｚｕｎｏ． Ｋ．ら （１９
８７）， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅ
ｓ． Ｃｏｍｍ． １４８ ， ５４６−５５２ ；
Ｅｉｐｐｅｒ， Ｂ．Ａ．ら （１９８７）， Ｍｏｌ
ｅｃ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １ ， Ｎｏ．
１１， ７７７−７９０ ； Ｏｈｓｕｙｅ． Ｋ．
ら （１９８８）， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｓ
． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １５０，１２７５−１２８
１ ； Ｓｔｏｆｆｅｒｓ， Ｄ．Ａ．ら （１９８９
）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ， ８６， ７３５−７３９ を参照のこと
〕に従って設計された合成オリゴヌクレオチドプローブ
を用いてハイブリダイゼーション法によりスクリーニン
グする。
【００１７】本発明の好ましい態様においては、ＥＰ
０，２９９，７９０に記載されているＡＥ−ＩのＤＮＡ
配列に従って合成されたオリゴヌクレオチドプローブを
用いてｃＤＮＡがクローニングされる。
０，２９９，７９０に記載されているＡＥ−ＩのＤＮＡ
配列に従って合成されたオリゴヌクレオチドプローブを
用いてｃＤＮＡがクローニングされる。
【００１８】本発明によれば、本発明の酵素をコードす
るＤＮＡ、例えばｃＤＮＡをバキュロウイルストランス
ファーベクターに挿入して組換バキュロウイルストラン
スファーベクターを作製し、そして次にこの組換バキュ
ロウイルストランスファーベクターをバキュロウイルス
ＤＮＡと共に同時−トランスフェクトして相同性組換を
行う。
るＤＮＡ、例えばｃＤＮＡをバキュロウイルストランス
ファーベクターに挿入して組換バキュロウイルストラン
スファーベクターを作製し、そして次にこの組換バキュ
ロウイルストランスファーベクターをバキュロウイルス
ＤＮＡと共に同時−トランスフェクトして相同性組換を
行う。
【００１９】バキュロウイルストランスファーベクター
は通常、バキュロウイルスＤＮＡのセグメントを含有す
るプラスミドであり、このセグメントはバキュロウイル
スの複製のために必須でない遺伝子を含んで成る。バキ
ュロウイルスの複製のために必須でない遺伝子は、例え
ば、ポリヘドリン （ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ） 構造遺
伝子及びそのプロモーターを含んで成るポリヘドリン遺
伝子である。
は通常、バキュロウイルスＤＮＡのセグメントを含有す
るプラスミドであり、このセグメントはバキュロウイル
スの複製のために必須でない遺伝子を含んで成る。バキ
ュロウイルスの複製のために必須でない遺伝子は、例え
ば、ポリヘドリン （ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ） 構造遺
伝子及びそのプロモーターを含んで成るポリヘドリン遺
伝子である。
【００２０】この様なバキュロウイルストランスファー
ベクターは例えばｐＡｃＹＭ１〔Ｍａｔｓｕｕｒａ，
Ｙ．ら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． （１９８７）
６８， １２３３−１２５０）； 並びにｐＡｃ３１
１， ｐＡｃ３６０， ｐＡｃ３７３及びｐＡｃ３８０
（米国特許Ｎｏ．４，７４５，０５１）等である。
ベクターは例えばｐＡｃＹＭ１〔Ｍａｔｓｕｕｒａ，
Ｙ．ら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． （１９８７）
６８， １２３３−１２５０）； 並びにｐＡｃ３１
１， ｐＡｃ３６０， ｐＡｃ３７３及びｐＡｃ３８０
（米国特許Ｎｏ．４，７４５，０５１）等である。
【００２１】本発明において使用されるバキュロウイル
スは、例えば、オートグラファ・カリホルニカ （Ａｕ
ｔｏｇｒａｐｈａ ｃｏｌｉｆｏｒｎｉｃａ ） 核
多角体病ウイルス （ＡｃＭＮＰＶ） 、トリコプルシ
ア・ニ （Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ） ＭＮ
ＰＶ、ラチプルシア・オウ （Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ
ｏｕ） ＭＮＰＶ、ガレリア・メロネラ （Ｇａｌｌ
ｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ） ＭＮＰＶ等であ
る。
スは、例えば、オートグラファ・カリホルニカ （Ａｕ
ｔｏｇｒａｐｈａ ｃｏｌｉｆｏｒｎｉｃａ ） 核
多角体病ウイルス （ＡｃＭＮＰＶ） 、トリコプルシ
ア・ニ （Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ） ＭＮ
ＰＶ、ラチプルシア・オウ （Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ
ｏｕ） ＭＮＰＶ、ガレリア・メロネラ （Ｇａｌｌ
ｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ） ＭＮＰＶ等であ
る。
【００２２】オートグラファ・カリホルニカ核多角体病
ウイルスとバキュロウイルストランスファーベクターｐ
Ａｃ７００， ｐＡｃ７０１， ｐＡｃ７０２， ｐＶ
Ｌ１３９２ 及びｐＶＬ１３９３ との組合せを含んで
成るキットがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている
。
ウイルスとバキュロウイルストランスファーベクターｐ
Ａｃ７００， ｐＡｃ７０１， ｐＡｃ７０２， ｐＶ
Ｌ１３９２ 及びｐＶＬ１３９３ との組合せを含んで
成るキットがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている
。
【００２３】本発明において使用される昆虫細胞は樹立
された昆虫細胞系、例えばスポドプテラ・フルギペルダ
（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）
、例えばＳｆ９ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１），
Ｓｆ２１、マメストラ・ブラッシカ （Ｍａｍｅｓｔｒ
ａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ ） 等である。
された昆虫細胞系、例えばスポドプテラ・フルギペルダ
（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）
、例えばＳｆ９ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１），
Ｓｆ２１、マメストラ・ブラッシカ （Ｍａｍｅｓｔｒ
ａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ ） 等である。
【００２４】ボンビックス・モリ （Ｂｏｍｂｙｘ ｍ
ｏｒｉ）核多角体病ウイルス （Ｂｍ ＮＰＶ） を用
いるボンビックス・モリ細胞システムも本発明のために
利用できる。
ｏｒｉ）核多角体病ウイルス （Ｂｍ ＮＰＶ） を用
いるボンビックス・モリ細胞システムも本発明のために
利用できる。
【００２５】相同性組換は、実施例３に記載するように
、常法に従って行われる。本発明によれば、相同性組換
は数％という高い頻度で起こり、そして野性型の白色プ
ラーク中のポリヘドリン−陰性透明プラークとして好結
果の組換ウイルスを選択することができる。従って、目
的とする組換ウイルスを容易に且つ再現性よく選択する
ことができる。
、常法に従って行われる。本発明によれば、相同性組換
は数％という高い頻度で起こり、そして野性型の白色プ
ラーク中のポリヘドリン−陰性透明プラークとして好結
果の組換ウイルスを選択することができる。従って、目
的とする組換ウイルスを容易に且つ再現性よく選択する
ことができる。
【００２６】トランスフェクトされた昆虫細胞は常法に
従って培養される。すなわち、トランスフェクトされた
昆合細胞は、昆虫細胞が増殖し得る任意の組織培養培地
、例えば哺乳類血清が補充されたＴＣ １００培地又は
Ｇｒａｃｅの培地、無血清培地ＥＸ−ＣＥＬＬ４００
等の中で、２０℃〜３０℃、好ましくは２７℃〜２８
℃、例えば２７℃の温度にて、２〜１０日間、好ましく
は３〜５日間培養される。
従って培養される。すなわち、トランスフェクトされた
昆合細胞は、昆虫細胞が増殖し得る任意の組織培養培地
、例えば哺乳類血清が補充されたＴＣ １００培地又は
Ｇｒａｃｅの培地、無血清培地ＥＸ−ＣＥＬＬ４００
等の中で、２０℃〜３０℃、好ましくは２７℃〜２８
℃、例えば２７℃の温度にて、２〜１０日間、好ましく
は３〜５日間培養される。
【００２７】本発明によれば、発現された酵素の９０％
以上が培養上清に分泌され、そしてそれ故に目的とする
酵素を常法に従って、例えば遠心分離、塩析法、又は種
々のクロマトグラフ法、あるいはこれらの組み合せによ
り回収することができる。
以上が培養上清に分泌され、そしてそれ故に目的とする
酵素を常法に従って、例えば遠心分離、塩析法、又は種
々のクロマトグラフ法、あるいはこれらの組み合せによ
り回収することができる。
【００２８】こうして調製された精製酵素が式（Ｉ）の
グリシン延長ペプチドに対して、例えばＣ−末端グリシ
ン残基により延長されたヒトカルシトニンの７個のＣ−
末端アミノ酸残基と同じモデルペプチドＡｌａ−Ｉｌｅ
−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
に対して、あるいはカルシトニンの、例えばヒトカルシ
トニン、サケカルシトニン、ニワトリカルシトニン、ウ
ナギカルシトニン、ラットカルシトニン、ブタカルシト
ニン、ヒツジカルシトニンもしくはウシカルシトニンの
Ｃ−末端グリシン延長前駆体に対して、又はヒト成長ホ
ルモン放出因子 （ＧＨＲＦ） 、ヒトカルシトニン遺
伝子関連ペプチド （ＣＧＲＰ） 、黄体形成ホルモン
−放出ホルモン （ＬＨＲＨ） 等に対して反応する時
、式（ＩＩ）で表わされる対応するα−ヒドロキシグリ
シルペプチドが生産される。
グリシン延長ペプチドに対して、例えばＣ−末端グリシ
ン残基により延長されたヒトカルシトニンの７個のＣ−
末端アミノ酸残基と同じモデルペプチドＡｌａ−Ｉｌｅ
−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
に対して、あるいはカルシトニンの、例えばヒトカルシ
トニン、サケカルシトニン、ニワトリカルシトニン、ウ
ナギカルシトニン、ラットカルシトニン、ブタカルシト
ニン、ヒツジカルシトニンもしくはウシカルシトニンの
Ｃ−末端グリシン延長前駆体に対して、又はヒト成長ホ
ルモン放出因子 （ＧＨＲＦ） 、ヒトカルシトニン遺
伝子関連ペプチド （ＣＧＲＰ） 、黄体形成ホルモン
−放出ホルモン （ＬＨＲＨ） 等に対して反応する時
、式（ＩＩ）で表わされる対応するα−ヒドロキシグリ
シルペプチドが生産される。
【００２９】この様なα−ヒドロキシグリシルペプチド
の製造は、ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノ
オキシゲナーゼ含有調製物を用いて、対応するグリシン
延長ペプチドから出発して、水性媒体、例えば緩衝液、
例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＥＳ−Ｎａ緩衝液
、ＴＥＳ−Ｎａ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等の中
で、１６℃〜３７℃、好ましくは約３０℃にて行われる
。
の製造は、ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノ
オキシゲナーゼ含有調製物を用いて、対応するグリシン
延長ペプチドから出発して、水性媒体、例えば緩衝液、
例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＥＳ−Ｎａ緩衝液
、ＴＥＳ−Ｎａ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等の中
で、１６℃〜３７℃、好ましくは約３０℃にて行われる
。
【００３０】使用される酵素の量は、例えば、１×１０
２ 〜１×１０６ ユニット／ｍｇ基質蛋白質、そして
好ましくは１×１０３ 〜５×１０５ ユニット／ｍｇ
基質蛋白質である。ペプチジルグリシンα−ヒドロキシ
ル化モノオキシゲナーゼ含有調製物は該酵素を含有する
任意の調製物、例えば培養上清、上清濃縮物、濃縮又は
部分精製された酵素調製物、精製された酵素等であるこ
とができる。これらの酵素調製物は貯蔵のために凍結乾
燥することができる。
２ 〜１×１０６ ユニット／ｍｇ基質蛋白質、そして
好ましくは１×１０３ 〜５×１０５ ユニット／ｍｇ
基質蛋白質である。ペプチジルグリシンα−ヒドロキシ
ル化モノオキシゲナーゼ含有調製物は該酵素を含有する
任意の調製物、例えば培養上清、上清濃縮物、濃縮又は
部分精製された酵素調製物、精製された酵素等であるこ
とができる。これらの酵素調製物は貯蔵のために凍結乾
燥することができる。
【００３１】上記の方法により製造されたα−ヒドロキ
シグリシルペプチドＲ−ＮＨ−ＣＨＯＨ−ＣＯＯＨは任
意のα−ヒドロキシグリシルペプチドであり、これには
カルシトニンの前駆体、例えばヒトカルシトニン、サケ
カルシトニン、ニワトリカルシトニン、ウナギカルシト
ニン、ラットカルシトニン、ブタカルシトニン、ヒツジ
カルシトニンもしくはウシカルシトニンの前駆体、又は
ヒト成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）の前駆体、ヒト
カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、黄体形
成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）の前駆体等が包含
される。カルシトニンの前駆体が好ましく、特にヒトカ
ルシトニンの前駆体が特に好ましい。
シグリシルペプチドＲ−ＮＨ−ＣＨＯＨ−ＣＯＯＨは任
意のα−ヒドロキシグリシルペプチドであり、これには
カルシトニンの前駆体、例えばヒトカルシトニン、サケ
カルシトニン、ニワトリカルシトニン、ウナギカルシト
ニン、ラットカルシトニン、ブタカルシトニン、ヒツジ
カルシトニンもしくはウシカルシトニンの前駆体、又は
ヒト成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）の前駆体、ヒト
カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、黄体形
成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）の前駆体等が包含
される。カルシトニンの前駆体が好ましく、特にヒトカ
ルシトニンの前駆体が特に好ましい。
【００３２】従って本発明はまた、式：Ｒ−ＮＨ−ＣＨ
ＯＨ−ＣＯＯＨの前記のＣ−末端α−ヒドロキシグリシ
ルペプチド、ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モ
ノオキシゲナーゼによるその製造方法、及び式：Ｒ−Ｎ
Ｈ２（式中、アミノ基はペプチドのＣ−末端アミノ酸の
α−カルボキシル基をアミド化している）の対応するα
−アミド化ペプチドの製造のためのその使用に関する。
ＯＨ−ＣＯＯＨの前記のＣ−末端α−ヒドロキシグリシ
ルペプチド、ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モ
ノオキシゲナーゼによるその製造方法、及び式：Ｒ−Ｎ
Ｈ２（式中、アミノ基はペプチドのＣ−末端アミノ酸の
α−カルボキシル基をアミド化している）の対応するα
−アミド化ペプチドの製造のためのその使用に関する。
【００３３】Ｒ−ＮＨ−ＣＨＯＨ−ＣＯＯＨは生理的条
件下で驚く程安定であり、そして塩基、例えばアルカリ
金属水酸化物、例えばＮａＯＨの添加により、塩基性ｐ
Ｈ値において、特に約ｐＨ９〜約ｐＨ１２、好ましくは
約ｐＨ１０〜約ｐＨ１１において、例えばｐＨ１１にて
数分間又はｐＨ１０にて３０分間のインキュベーション
によりＲ−ＮＨ２ に転換され得る。
件下で驚く程安定であり、そして塩基、例えばアルカリ
金属水酸化物、例えばＮａＯＨの添加により、塩基性ｐ
Ｈ値において、特に約ｐＨ９〜約ｐＨ１２、好ましくは
約ｐＨ１０〜約ｐＨ１１において、例えばｐＨ１１にて
数分間又はｐＨ１０にて３０分間のインキュベーション
によりＲ−ＮＨ２ に転換され得る。
【００３４】
【実施例】次に、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、これにより本発明の範囲を限定するものではない
。 実施例１． アフリカツメガエル体皮からのペプチジ
ルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコ
ードするｃＤＮＡのクローニングアフリカツメガエルの
体皮から全ＲＮＡを抽出し、そしてＣｈｉｒｇｗｉｎ，
Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８，
５２９４−５２９９ （１９７７）の方法に従ってオリ
ゴ（ｄＴ）−セルロースカラムクロマトグラフィーによ
りポリ（Ａ）＋ ＲＮＡ を単離する。１０μｇのポリ
（Ａ）＋ ＲＮＡ 及び５μｇのベクタープライマーＤ
ＮＡを用いて、 Ｏｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇ， Ｍｏ
ｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２， １６１−１
７０， １９８２ の方法によりｃＤＮＡライブラリー
を作製する。
るが、これにより本発明の範囲を限定するものではない
。 実施例１． アフリカツメガエル体皮からのペプチジ
ルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコ
ードするｃＤＮＡのクローニングアフリカツメガエルの
体皮から全ＲＮＡを抽出し、そしてＣｈｉｒｇｗｉｎ，
Ｊ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８，
５２９４−５２９９ （１９７７）の方法に従ってオリ
ゴ（ｄＴ）−セルロースカラムクロマトグラフィーによ
りポリ（Ａ）＋ ＲＮＡ を単離する。１０μｇのポリ
（Ａ）＋ ＲＮＡ 及び５μｇのベクタープライマーＤ
ＮＡを用いて、 Ｏｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇ， Ｍｏ
ｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２， １６１−１
７０， １９８２ の方法によりｃＤＮＡライブラリー
を作製する。
【００３５】アフリカツメガエルのヒドロキシル化酵素
ＡＥ−Ｉの公表されている配列に従って、ＡＥ−Ｉ〔Ｍ
ｉｚｕｎｏ Ｋ． ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １４８， ５４６−５
５５ （１９８７）〕中の１０３Ｈｉｓ−１１２Ｉｌｅ
に相当する２９ｂｐの合成オリゴヌクレオチド（ＣＡＴ
ＣＡＣＡＴＧＣＴＴＣＴＡＴＴＴＧＧＡＴＧＣＡＡＴＡ
Ｔ）をハイブリダイゼーションプローブとして用いる。
ＡＥ−Ｉの公表されている配列に従って、ＡＥ−Ｉ〔Ｍ
ｉｚｕｎｏ Ｋ． ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １４８， ５４６−５
５５ （１９８７）〕中の１０３Ｈｉｓ−１１２Ｉｌｅ
に相当する２９ｂｐの合成オリゴヌクレオチド（ＣＡＴ
ＣＡＣＡＴＧＣＴＴＣＴＡＴＴＴＧＧＡＴＧＣＡＡＴＡ
Ｔ）をハイブリダイゼーションプローブとして用いる。
【００３６】制限酵素地図の作成及びヌクレオチド配列
の分析により、陽性クローンの１つｐＡＥ−Ｉ−３１０
がアフリカツメガエルのヒドロキシル化酵素ＡＥ−Ｉ
のｃＤＮＡを含有することが見出される。ＳｍａＩ末端
とＤｒａ Ｉ末端とに挟まれたｃＤＮＡのヌクレオチド
配列を配列表の配列番号：１に示す。
の分析により、陽性クローンの１つｐＡＥ−Ｉ−３１０
がアフリカツメガエルのヒドロキシル化酵素ＡＥ−Ｉ
のｃＤＮＡを含有することが見出される。ＳｍａＩ末端
とＤｒａ Ｉ末端とに挟まれたｃＤＮＡのヌクレオチド
配列を配列表の配列番号：１に示す。
【００３７】実施例２． 組換トランスファーベクタ
ーｐＡｃＹＭ１／ＡＥ−Ｉの作製（図１及び図２）出発
トランスファーベクターｐＡｃＹＭ１はバキュロウイル
スのポリヘドリン遺伝子を含有するプラスミドであり、
Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｙ．ら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒ
ｏｌ． （１９８７） ６８， １２３３−１２５０
に詳細に記載されている。
ーｐＡｃＹＭ１／ＡＥ−Ｉの作製（図１及び図２）出発
トランスファーベクターｐＡｃＹＭ１はバキュロウイル
スのポリヘドリン遺伝子を含有するプラスミドであり、
Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｙ．ら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒ
ｏｌ． （１９８７） ６８， １２３３−１２５０
に詳細に記載されている。
【００３８】昆虫細胞発現系のためのトランスファーベ
クターを作製するため、ｃＤＮＡクローン ｐＡＥ−Ｉ
−３１０ を制限酵素Ｓｍａ Ｉ及びＤｒａ Ｉにより
二重消化する。
クターを作製するため、ｃＤＮＡクローン ｐＡＥ−Ｉ
−３１０ を制限酵素Ｓｍａ Ｉ及びＤｒａ Ｉにより
二重消化する。
【００３９】次に、Ｓｍａ Ｉ／Ｄｒａ Ｉ断片をｐＳ
ＶＬベクター （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中のＳｍａ Ｉ
部位に挿入する。望ましい方向のプラスミドをｐＳＶＬ
／ＡＥ−Ｉ−３１０ と命名する。次に、このプラスミ
ドを制限酵素Ｐｓｔ Ｉ及びＢａｍＨＩにより二重消化
する。このクローンの生ずる１．３Ｋｂｐ 断片はヒド
ロキシル化酵素ＡＥ−Ｉのコード領域を含有していた。
ＶＬベクター （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中のＳｍａ Ｉ
部位に挿入する。望ましい方向のプラスミドをｐＳＶＬ
／ＡＥ−Ｉ−３１０ と命名する。次に、このプラスミ
ドを制限酵素Ｐｓｔ Ｉ及びＢａｍＨＩにより二重消化
する。このクローンの生ずる１．３Ｋｂｐ 断片はヒド
ロキシル化酵素ＡＥ−Ｉのコード領域を含有していた。
【００４０】この断片をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによ
り平滑末端化し、次にＢａｍＨＩリンカーと連結しそし
て制限酵素ＢａｍＨＩにより消化する。あらかじめ制限
酵素ＢａｍＨＩにより処理されそして脱リン酸化された
バキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＹＭ１
に前記修飾された断片を挿入することによりｐＡｃＹＭ
１／ＡＥ−Ｉを調製する。
り平滑末端化し、次にＢａｍＨＩリンカーと連結しそし
て制限酵素ＢａｍＨＩにより消化する。あらかじめ制限
酵素ＢａｍＨＩにより処理されそして脱リン酸化された
バキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＹＭ１
に前記修飾された断片を挿入することによりｐＡｃＹＭ
１／ＡＥ−Ｉを調製する。
【００４１】
実施例３． 組換えバキュロウイルスの作製（図３）
細胞介在相同性組換えにより、ＡＥ−ＩｃＤＮＡを含有
するトランスファープラスミドを野性型オートグラファ
・カリホルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）
のゲノムに組込む。この野性型ＡｃＭＮＰＶはＩｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎから市販されている。
細胞介在相同性組換えにより、ＡＥ−ＩｃＤＮＡを含有
するトランスファープラスミドを野性型オートグラファ
・カリホルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）
のゲノムに組込む。この野性型ＡｃＭＮＰＶはＩｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎから市販されている。
【００４２】次に、１μｇのウイルス ＤＮＡを２５〜
１００ μｇのプラスミドｐＡｃＹＭ１／ＡＥ−Ｉの
ＤＮＡと、９５μｌの ＨＥＰＥＳ緩衝液〔２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ （ｐＨ７．０）／１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４
／５ｍＭ ＫＣｌ／１４０ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭグ
ルコース〕中で混合し、そして５０μｌの２．５Ｍ Ｃ
ａＣｌ２により沈澱させた後、ＤＮＡ粒子を２×１０６
個のＳｆ９細胞上に置き、そしてこの培養物を室温に
て１時間インキュベートする。
１００ μｇのプラスミドｐＡｃＹＭ１／ＡＥ−Ｉの
ＤＮＡと、９５μｌの ＨＥＰＥＳ緩衝液〔２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ （ｐＨ７．０）／１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４
／５ｍＭ ＫＣｌ／１４０ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭグ
ルコース〕中で混合し、そして５０μｌの２．５Ｍ Ｃ
ａＣｌ２により沈澱させた後、ＤＮＡ粒子を２×１０６
個のＳｆ９細胞上に置き、そしてこの培養物を室温に
て１時間インキュベートする。
【００４３】次に、この培養物の上清を、１０％のウシ
胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有する Ｇｒａｃｅの培地
（ＧＩＢＣＯ）２ｍｌにと交換する。２７℃にて４日間
のインキュベーションの後、上清を採取し、そして１０
〜１０００倍に希釈し、そして次にプラーク・アッセイ
を行う。ゲノム中に挿入された外来 ＤＮＡを有する組
換えバキュロウイルスから形成されるプラークを視覚観
察により非−組換え体ウイルスのプラークから区別する
ことができる。
胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有する Ｇｒａｃｅの培地
（ＧＩＢＣＯ）２ｍｌにと交換する。２７℃にて４日間
のインキュベーションの後、上清を採取し、そして１０
〜１０００倍に希釈し、そして次にプラーク・アッセイ
を行う。ゲノム中に挿入された外来 ＤＮＡを有する組
換えバキュロウイルスから形成されるプラークを視覚観
察により非−組換え体ウイルスのプラークから区別する
ことができる。
【００４４】２個のポリヘドリン−陰性プラークを視覚
スクリーニングにより拾い、そしてこれらの組換えウイ
ルスの更なる精製及び増幅を標準的方法（Ａ Ｍａｎｕ
ａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃ
ｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ， Ｍ
．Ｄ． Ｓｕｍｍｅｒｓ， Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５） に従って行う
。
スクリーニングにより拾い、そしてこれらの組換えウイ
ルスの更なる精製及び増幅を標準的方法（Ａ Ｍａｎｕ
ａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃ
ｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ， Ｍ
．Ｄ． Ｓｕｍｍｅｒｓ， Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５） に従って行う
。
【００４５】実施例４． 酵素の製造まず、５×１０
６ 個のＳｆ９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）細胞を単
離された組換ウイルスとＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉ
ｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ； 感染多重度）１
０にて混合し、そして８ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ４００
（ＪＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） 無血清培地を補充す
る。感染された昆虫細胞をＥＸ−ＣＥＬＬ４００ 培地
中で２７℃にて７日間培養する。
６ 個のＳｆ９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）細胞を単
離された組換ウイルスとＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉ
ｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ； 感染多重度）１
０にて混合し、そして８ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ４００
（ＪＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） 無血清培地を補充す
る。感染された昆虫細胞をＥＸ−ＣＥＬＬ４００ 培地
中で２７℃にて７日間培養する。
【００４６】上記の様にして調製された昆虫細胞培養培
地をＡｍｉｃｏｎ濃縮器により４０倍に濃縮し、そして
濃縮された試料を ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５ゲル炉過
カラムＰＤ−１０ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用して
低分子量物質を除去する。このカラムから溶出した酵素
活性は−２０℃にて少なくとも２ケ月間安定である。
地をＡｍｉｃｏｎ濃縮器により４０倍に濃縮し、そして
濃縮された試料を ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５ゲル炉過
カラムＰＤ−１０ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用して
低分子量物質を除去する。このカラムから溶出した酵素
活性は−２０℃にて少なくとも２ケ月間安定である。
【００４７】ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モ
ノオキシゲナーゼの酵素活性を、Ｊｏｎｅｓ Ｂ．Ｎ．
ら （Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６８， ２７２
−２７９， １９８８）の方法に従って、但しわずかに
改変した方法で測定する。標準的測定条件は ２００ｍ
Ｍ ＴＥＳ−Ｎａ／２ｍＭ アスコルビン酸／ １５
０ｍＭ ＫＪ／１μｌ ＣｕＳＯ４ ／２ｍＭ
Ｎ−エチルマレイミド／２０μＭ Ｎ−ダンシル−Ｔ
ｙｒ −Ｐｈｅ −Ｇｌｙ ／ １００μｇ／ｍｌカタ
ラーゼ中ｐＨ６．４であり、そして反応は３０℃にて酵
素の添加により開始しそして１５〜３０分間後に最終濃
度５０ｍＭへのＥＤＴＡの添加により反応を停止させ、
次に最終濃度０．２ＮへのＮａＯＨの添加及びＨＣｌ
による中和を行う。
ノオキシゲナーゼの酵素活性を、Ｊｏｎｅｓ Ｂ．Ｎ．
ら （Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６８， ２７２
−２７９， １９８８）の方法に従って、但しわずかに
改変した方法で測定する。標準的測定条件は ２００ｍ
Ｍ ＴＥＳ−Ｎａ／２ｍＭ アスコルビン酸／ １５
０ｍＭ ＫＪ／１μｌ ＣｕＳＯ４ ／２ｍＭ
Ｎ−エチルマレイミド／２０μＭ Ｎ−ダンシル−Ｔ
ｙｒ −Ｐｈｅ −Ｇｌｙ ／ １００μｇ／ｍｌカタ
ラーゼ中ｐＨ６．４であり、そして反応は３０℃にて酵
素の添加により開始しそして１５〜３０分間後に最終濃
度５０ｍＭへのＥＤＴＡの添加により反応を停止させ、
次に最終濃度０．２ＮへのＮａＯＨの添加及びＨＣｌ
による中和を行う。
【００４８】６２．５ｍＭ ＣＨ３ＣＯＯＮａ／３３
％アセトニトリル（ｐＨ７．０）の均一 （ｉｓｏｃｒ
ａｔｉｃ）条件を用いてＨｉ−ｐｏｒｅ （４． ６×
４０ｍｍ） カラム （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で試料を分
析する。 １ユニットの酵素活性を、１分間当り１ｐｍｏｌｅ の
生成物を生成する酵素の量として定義する。
％アセトニトリル（ｐＨ７．０）の均一 （ｉｓｏｃｒ
ａｔｉｃ）条件を用いてＨｉ−ｐｏｒｅ （４． ６×
４０ｍｍ） カラム （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で試料を分
析する。 １ユニットの酵素活性を、１分間当り１ｐｍｏｌｅ の
生成物を生成する酵素の量として定義する。
【００４９】培養の結果を図４に示す。この図において
、実線は上記の方法に従って測定した活性を示し、そし
て点線はアルカリ処理及び中和を行わないで測定した結
果を示す。なお、α−ヒドロキシグリシン延長ペプチド
はアルカリ処理、例えばｐＨ１１にて数分間、又はｐＨ
１０にて３０分間のアルカリ処理により対応するα−ア
シド化ペプチドに転換され得る。
、実線は上記の方法に従って測定した活性を示し、そし
て点線はアルカリ処理及び中和を行わないで測定した結
果を示す。なお、α−ヒドロキシグリシン延長ペプチド
はアルカリ処理、例えばｐＨ１１にて数分間、又はｐＨ
１０にて３０分間のアルカリ処理により対応するα−ア
シド化ペプチドに転換され得る。
【００５０】酵素を精製するため、前記のようにして調
製した培養液（５００ｍｌ）を次のように処理する。低
速遠心分離により細胞を除去した後、培地を１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｃｌ／０．１％Ｌｕｂｒｏｌ （ｐＨ７．５
）（緩衝液Ａ）に対して透析し、そして緩衝液Ａにより
平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ＤＥ５２）のカラム
（２．６×２２ｃｍ）に適用する。
製した培養液（５００ｍｌ）を次のように処理する。低
速遠心分離により細胞を除去した後、培地を１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｃｌ／０．１％Ｌｕｂｒｏｌ （ｐＨ７．５
）（緩衝液Ａ）に対して透析し、そして緩衝液Ａにより
平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ＤＥ５２）のカラム
（２．６×２２ｃｍ）に適用する。
【００５１】緩衝液Ａ中０〜１．０Ｍ ＮａＣｌの直
線塩濃度グラジエントによりヒドロキシル化酵素活性を
溶出し、そしてヒドロキシル化酵素活性を含有する画分
を集め、５０ｍＭＭＥＳ−Ｎａ （ｐＨ５．７）に対し
て透析し、そして５０ｍＭ ＭＥＳ−Ｎａ （ｐＨ５
．７）により平衡化したＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ５／５カ
ラム （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用する。
線塩濃度グラジエントによりヒドロキシル化酵素活性を
溶出し、そしてヒドロキシル化酵素活性を含有する画分
を集め、５０ｍＭＭＥＳ−Ｎａ （ｐＨ５．７）に対し
て透析し、そして５０ｍＭ ＭＥＳ−Ｎａ （ｐＨ５
．７）により平衡化したＭｏｎｏ Ｓ ＨＲ５／５カ
ラム （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用する。
【００５２】同じ緩衝液中０〜５００ｍＭ ＮａＣｌの
直線塩濃度グラジエントによりヒドロキシル化酵素を溶
出する。高活性を有する画分をプールし、そして緩衝液
Ａに対して透析し、次に緩衝液Ａにより平衡化したＤＥ
ＡＥ ＧＬＡＳＳカラム （Ｎａｃｕｌａｉ）に負荷す
る。ヒドロキシル化酵素を、緩衝液Ａ中０〜５００ｍＭ
ＮａＣｌの直線グラジエントにより溶出する。
直線塩濃度グラジエントによりヒドロキシル化酵素を溶
出する。高活性を有する画分をプールし、そして緩衝液
Ａに対して透析し、次に緩衝液Ａにより平衡化したＤＥ
ＡＥ ＧＬＡＳＳカラム （Ｎａｃｕｌａｉ）に負荷す
る。ヒドロキシル化酵素を、緩衝液Ａ中０〜５００ｍＭ
ＮａＣｌの直線グラジエントにより溶出する。
【００５３】精製の結果を表１に示す。
【表１】
【００５４】変性 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により、精製された蛋白質が均一であることが証
明され、そしてその分子量が４１ｋＤａ であることが
示される。 ゲル炉過により決定された見かけ分子量は４３ｋＤａ
である。
気泳動により、精製された蛋白質が均一であることが証
明され、そしてその分子量が４１ｋＤａ であることが
示される。 ゲル炉過により決定された見かけ分子量は４３ｋＤａ
である。
【００５５】なお、ペプチドのヒドロキシル化のために
はペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲ
ナーゼを １００％均一にまで精製する必要はなく、不
純物はグリシン延長ペプチドのヒドロキシル化を妨害し
ない。
はペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲ
ナーゼを １００％均一にまで精製する必要はなく、不
純物はグリシン延長ペプチドのヒドロキシル化を妨害し
ない。
【００５６】実施例５． Ｃ−末端α−ヒドロキシグ
リシン延長ヒトカルシトニンの製造 ２６ｍｇのＣ−末端グリシン延長ヒトカルシトニンを、
２ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸、０．１ｍｇ／ｍｌカタ
ラーゼ及び１０ｍＭ ＫＩを含有する０．２Ｍ Ｍ
ＥＳ−Ｎａに添加する。次に、この溶液に０．６ｍｇの
精製されたペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノ
オキシゲナーゼを加える。
リシン延長ヒトカルシトニンの製造 ２６ｍｇのＣ−末端グリシン延長ヒトカルシトニンを、
２ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸、０．１ｍｇ／ｍｌカタ
ラーゼ及び１０ｍＭ ＫＩを含有する０．２Ｍ Ｍ
ＥＳ−Ｎａに添加する。次に、この溶液に０．６ｍｇの
精製されたペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノ
オキシゲナーゼを加える。
【００５７】３０℃にて５時間のインキュベーションの
後、反応溶液をＳｅｐ−ｐａｋ カートリッジ（Ｗａｔ
ｅｒｓ） により処理し、そして凍結乾燥する。この凍
結乾燥されたサンプルを９０％酢酸に溶解し、そしてＢ
ｉｏ−Ｒａｄ Ｈｉ Ｐｏｒｅ ＲＰ ３０４ （１０
×２５０ｍｍ）カラムに適用する。１０ｍＭ蟻酸アンモ
ニウム（ｐＨ４．０）中直線アセトニトリルグラジエン
ト（１９〜２３％）により溶出を行う。
後、反応溶液をＳｅｐ−ｐａｋ カートリッジ（Ｗａｔ
ｅｒｓ） により処理し、そして凍結乾燥する。この凍
結乾燥されたサンプルを９０％酢酸に溶解し、そしてＢ
ｉｏ−Ｒａｄ Ｈｉ Ｐｏｒｅ ＲＰ ３０４ （１０
×２５０ｍｍ）カラムに適用する。１０ｍＭ蟻酸アンモ
ニウム（ｐＨ４．０）中直線アセトニトリルグラジエン
ト（１９〜２３％）により溶出を行う。
【００５８】生成物ペプチドを含有する画分を凍結乾燥
する。蟻酸アンモニウム（ｐＨ４．０）中直線アセトニ
トリルグラジエント（８〜５０％）を用いてＢｉｏ−Ｒ
ａｄ Ｈｉ Ｐｏｒｅ ＲＰ ３０４ （４．６×２５
０ｍｍ）上で行われた分析ＨＰＬＣは、得られた生成物
が純粋であることを示す。
する。蟻酸アンモニウム（ｐＨ４．０）中直線アセトニ
トリルグラジエント（８〜５０％）を用いてＢｉｏ−Ｒ
ａｄ Ｈｉ Ｐｏｒｅ ＲＰ ３０４ （４．６×２５
０ｍｍ）上で行われた分析ＨＰＬＣは、得られた生成物
が純粋であることを示す。
【００５９】生成物の分析：３０μｇの得られた生成物
を、ＰＴＨアナライザーを装着した気相蛋白質シーケン
サーにより Ｅｄｍａｎ分解にかける。得られたアミノ
酸構造はヒトカルシトニンの３２アミノ酸鎖のそれに相
当する。
を、ＰＴＨアナライザーを装着した気相蛋白質シーケン
サーにより Ｅｄｍａｎ分解にかける。得られたアミノ
酸構造はヒトカルシトニンの３２アミノ酸鎖のそれに相
当する。
【００６０】水（９０％のＨ２Ｏ 及び１０％の２Ｈ２
Ｏ， ｐＨ３．２）に溶解した５ｍｇの生成物を１Ｈ−
ＮＭＲ により分析する。プロトンシグナルを ＤＱＦ
−ＣＯＳＹ （Ｄｏｕｂｌｅ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｆｉｌ
ｔｅｒｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｈｉｆｔ Ｃｏｒｒ
ｅｌａｔｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）により帰属
させる。５．４ｐｐｍ における共鳴が ＮＭＲスペク
トルにおいてα−プロトンに帰属される。
Ｏ， ｐＨ３．２）に溶解した５ｍｇの生成物を１Ｈ−
ＮＭＲ により分析する。プロトンシグナルを ＤＱＦ
−ＣＯＳＹ （Ｄｏｕｂｌｅ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｆｉｌ
ｔｅｒｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｈｉｆｔ Ｃｏｒｒ
ｅｌａｔｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）により帰属
させる。５．４ｐｐｍ における共鳴が ＮＭＲスペク
トルにおいてα−プロトンに帰属される。
【００６１】このα−プロトンの共鳴は他のα−プロト
ンに対して大きなダウンフィールドシフト（ｄｏｗｎｆ
ｉｅｌｄ ｓｈｉｆｔ）を示す。この結果は、前記ペプ
チドがその構造中にα−ヒドロキシグリシン残基を含有
することを示唆する。
ンに対して大きなダウンフィールドシフト（ｄｏｗｎｆ
ｉｅｌｄ ｓｈｉｆｔ）を示す。この結果は、前記ペプ
チドがその構造中にα−ヒドロキシグリシン残基を含有
することを示唆する。
【００６２】２０μｇの生成物をポジティブ・イオン・
ファスト・アトム・ボンバートメント・マス・スペクト
ル法 （ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｆａｓｔ ａｔｏ
ｍ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒ
ｏｍｅｔｒｙ ； ＦＡＢ−ＭＳ）により分析する。質
量数３４９０附近に明瞭なピークが得られ、これはα−
ヒドロキシグリシン延長ヒトカルシトニンに一致する。 ヒトカルシトニンについては、ＦＡＢ−ＭＳにおいて３
４２０の質量類（計算値：３４１８）が得られる。
ファスト・アトム・ボンバートメント・マス・スペクト
ル法 （ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｆａｓｔ ａｔｏ
ｍ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒ
ｏｍｅｔｒｙ ； ＦＡＢ−ＭＳ）により分析する。質
量数３４９０附近に明瞭なピークが得られ、これはα−
ヒドロキシグリシン延長ヒトカルシトニンに一致する。 ヒトカルシトニンについては、ＦＡＢ−ＭＳにおいて３
４２０の質量類（計算値：３４１８）が得られる。
【００６３】実施例６． ヒトカルシトニンの製造グ
リシン延長ヒトカルシトニンの時間依存的転換を測定す
るため、２５ｍｇのグリシン延長ヒトカルシトニン （
ｈＣＴ−Ｇｌｙ）を実施例４において得られた濃縮され
た培地５．２５ｍｌと共に３０℃にて、５ｍＭ Ｌ−
アスコルビン酸、０．５μＭ ＣｕＳＯ４， ２０
μｇ／ｍｌカタラーゼ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ），
１０ｍＭ ＫＩ， ０．２５ｍＭ Ｎ−エチルマレイ
ミド、１アセトニトリル及び０．１％ Ｌｕｂｒｏｌ
ｔｙｐｅ ＰＸを含有する０．２Ｍ リン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ６．２）１５ｍｌ中でインキュベート
する。
リシン延長ヒトカルシトニンの時間依存的転換を測定す
るため、２５ｍｇのグリシン延長ヒトカルシトニン （
ｈＣＴ−Ｇｌｙ）を実施例４において得られた濃縮され
た培地５．２５ｍｌと共に３０℃にて、５ｍＭ Ｌ−
アスコルビン酸、０．５μＭ ＣｕＳＯ４， ２０
μｇ／ｍｌカタラーゼ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ），
１０ｍＭ ＫＩ， ０．２５ｍＭ Ｎ−エチルマレイ
ミド、１アセトニトリル及び０．１％ Ｌｕｂｒｏｌ
ｔｙｐｅ ＰＸを含有する０．２Ｍ リン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ６．２）１５ｍｌ中でインキュベート
する。
【００６４】インキュベーション中の種々の時点で４μ
ｌの試料を採取して１１％ ＨＣＯＯＮＨ４（ｐＨ４
）／１０％アセトニトリルにより５０倍に希釈し、そし
て次に２５μｌの試料をＨＰＬＣカラム〔緩衝液Ａ（移
動相）、１０ｍＭ ＨＣＯＯＮＨ４（ｐＨ４．０）／
１０％アセトニトリル；緩衝液Ｂ，１０ｍＭ ＨＣＯ
ＯＮＨ４（ｐＨ４．０）／５０％アセトニトリル；カラ
ム Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｈｉ−Ｐｏｒｅ ＲＰ ３０４
， ４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ×２５０ｍｍ 〕にかける。
ｌの試料を採取して１１％ ＨＣＯＯＮＨ４（ｐＨ４
）／１０％アセトニトリルにより５０倍に希釈し、そし
て次に２５μｌの試料をＨＰＬＣカラム〔緩衝液Ａ（移
動相）、１０ｍＭ ＨＣＯＯＮＨ４（ｐＨ４．０）／
１０％アセトニトリル；緩衝液Ｂ，１０ｍＭ ＨＣＯ
ＯＮＨ４（ｐＨ４．０）／５０％アセトニトリル；カラ
ム Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｈｉ−Ｐｏｒｅ ＲＰ ３０４
， ４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ×２５０ｍｍ 〕にかける。
【００６５】図５は、発現された酵素による ｈＣＴ−
Ｇｌｙの時間依存的転換を示しており、この図において
白円は基質 ｈＣＴ−Ｇｌｙを示し、そして黒円は生成
物を示す。
Ｇｌｙの時間依存的転換を示しており、この図において
白円は基質 ｈＣＴ−Ｇｌｙを示し、そして黒円は生成
物を示す。
【００６６】２００ｍｌの培養上清に由来する濃縮され
た上清５ｍｌを用いて４時間のインキュベーションの後
２５ｍｇの ｈＣＴ−Ｇｌｙがヒトカルシトニン（ｈＣ
Ｔ）に転換され、反応は １５０μｌの０．５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ （ｐＨ７．０）の添加により停止され、そして
前記のようにこの溶液がアルカリにより処理される。
た上清５ｍｌを用いて４時間のインキュベーションの後
２５ｍｇの ｈＣＴ−Ｇｌｙがヒトカルシトニン（ｈＣ
Ｔ）に転換され、反応は １５０μｌの０．５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ （ｐＨ７．０）の添加により停止され、そして
前記のようにこの溶液がアルカリにより処理される。
【００６７】次に、反応混合物をＳｅｐｐａｋ Ｃ−
１８カラム （Ｗａｔｅｒｓ） に通し、そして半分取
用逆相ＨＰＬＣカラム （ＹＭＣ ＳＨ−３４３−５，
２０ｍｍ Ｉ．Ｄ×２５０ｍｍ）上で、溶剤Ａ（２３
％アセトニトリル中１０ｍＭ酢酸アンモニウム）から溶
剤Ｂ（３０％アセトニトリル中同じ緩衝液） への６０
分間にわたる流速１０ｍｌ／分での直線グラジエントに
よる溶出により ｈＣＴを精製する。
１８カラム （Ｗａｔｅｒｓ） に通し、そして半分取
用逆相ＨＰＬＣカラム （ＹＭＣ ＳＨ−３４３−５，
２０ｍｍ Ｉ．Ｄ×２５０ｍｍ）上で、溶剤Ａ（２３
％アセトニトリル中１０ｍＭ酢酸アンモニウム）から溶
剤Ｂ（３０％アセトニトリル中同じ緩衝液） への６０
分間にわたる流速１０ｍｌ／分での直線グラジエントに
よる溶出により ｈＣＴを精製する。
【００６８】ｈＣＴを含有する画分を集めそして凍結乾
燥し、そして ｈＣＴはクロマトグラフィーにより純粋
であることが見出される。この生成物はさらに、アミノ
酸アナライザーによる分析、気相アミノ酸シーケンサー
による分析及びＦＡＢ−ＭＡＳＳスペクロロメーターに
よる分析によって ｈＣＴであることが確認される。
燥し、そして ｈＣＴはクロマトグラフィーにより純粋
であることが見出される。この生成物はさらに、アミノ
酸アナライザーによる分析、気相アミノ酸シーケンサー
による分析及びＦＡＢ−ＭＡＳＳスペクロロメーターに
よる分析によって ｈＣＴであることが確認される。
【００６９】微生物の寄託
プラスミドｐＡｃＹＭ１を含有する大腸菌は、工業技術
院微生物工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１−
３）にブダペスト条約のもとに微工研条寄第２７９６号
（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７９６） として１９９０年３月
７日寄託された。
院微生物工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１−
３）にブダペスト条約のもとに微工研条寄第２７９６号
（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７９６） として１９９０年３月
７日寄託された。
【００７０】プラスミドｐＳＶＬ／ＡＥ−Ｉ−３１０
を含有する大腸菌は、工業技術院微生物工業技術研究所
にブダペスト条約のもとに微工研条寄第２７９７号（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−２７９７） として１９９０年３月７日
に寄託された。配列表配列番号：１ 配列の長さ：１３９１塩基対 配列型：核酸 鎖の数：（二本鎖） トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ起 源 生物名：アフリカツメガエル 性 質：アフリカツメガエルのペプチジルグリシンα
−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ遺伝子ＧＧＧＡＡ
ＧＡＡＴＧ ＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧ ＧＴＴＡＣＣＴＧ
ＣＧ ＧＧＧＣＴＡＧＣＡＣ ＴＧＡＴＧＧＡＧＴＡ
５０ ＧＧＧＧＧＧＡＴＴＧ ＡＴＣＣＡＧＣ
ＴＴＣ ＣＴＡＡＴＴＡＣＣＡ ＧＧＡＴＴＡＣＡＡＣ
ＴＴＧＣＣＴＴＴＡＡ １００ ＴＴＴＡＣＴ
ＣＣＴＧ ＣＡＧＴＡＡＧＧＣＡ ＣＡＧＡＣＣＡＣＡ
Ｇ ＧＧＴＧＧＡＣ ＡＴＧ ＧＣＣ ＡＧＣ ＣＴＣ
１４９
Ｍｅｔ
Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
−３７ −３５ＡＧＴ ＡＧＣ ＡＧＣ
ＴＴＴ ＣＴＴ ＧＴＧ ＣＴＣ ＴＴＴ ＣＴＣ
ＴＴＡ ＴＴＴ ＣＡＧ ＡＡＣ ＡＧＣ １９１
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａ
ｓｎ Ｓｅｒ −３０
−２５
−２０ ＴＧＣ ＴＡＣ ＴＧＴ
ＴＴＣ ＡＧＧ ＡＧＴ ＣＣＣ ＣＴＣ ＴＣＴ Ｇ
ＴＣ ＴＴＴ ＡＡＧ ＡＧＧ ＴＡＴ ２３３
Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐ
ｒｏ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｒ
ｇ Ｔｙｒ −１５
−１０ ＧＡＧ
ＧＡＡ ＴＣＴ ＡＣＣ ＡＧＡ ＴＣＡ ＣＴＴ Ｔ
ＣＣ ＡＡＴ ＧＡＣ ＴＧＣ ＴＴＧ ＧＧＡ ＡＣ
Ｃ ２７５ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａ
ｒｇ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｃｙ
ｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ −５
１
５ ＡＣＧ ＣＧＧ ＣＣＣ ＧＴＴ ＡＴＧ Ｔ
ＣＴ ＣＣＡ ＧＧＣ ＴＣＡ ＴＣＡ ＧＡＴ ＴＡ
Ｔ ＡＣＴ ＣＴＡ ３１７ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｐ
ｒｏ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅ
ｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ １０
１５
２０ ＡＴ ＡＴＣ ＣＧ
Ｃ ＡＴＧ ＣＣＡ ＧＧＡ ＧＴＡ ＡＣＴ ＣＣＧ
ＡＣＡ ＧＡＧ ＴＣＧ ＧＡＣ ＡＣＡ ３５
９ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ
Ａｓｐ Ｔｈｒ ２５
３０
３５ ＴＡＴ ＴＴＧ ＴＧＣ ＡＡＧ ＴＣＴ
ＴＡＣ ＣＧＧ ＣＴＧ ＣＣＡ ＧＴＧ ＧＡＴ
ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＣＣ ４０１ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ
４０
４５ ５０
ＴＡＴ ＧＴＡ ＧＴＴ ＧＡＣ ＴＴＣ ＡＧＡ
ＣＣＡ ＣＡＴ ＧＣＣ ＡＡＴ ＡＴＧ ＧＡＴ Ａ
ＣＴ ＧＣＡ ４４３ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｖａｌ
Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｌａ Ａ
ｓｎ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ
５５
６０ ６５
ＣＡＴ ＣＡＣ ＡＴＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＴＴＴ Ｇ
ＧＡ ＴＧＣ ＡＡＴ ＡＴＡ ＣＣＴ ＴＣＴ ＴＣ
Ｃ ＡＣＴ ４８５ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｍｅｔ Ｌ
ｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｉｌ
ｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ
７０
７５ ＧＡＴ ＧＡＴ ＴＡＣ ＴＧＧ Ｇ
ＡＣ ＴＧＴ ＡＧＴ ＧＣＧ ＧＧＡ ＡＣＴ ＴＧ
Ｃ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＡＡ ５２７ Ａｓｐ Ａ
ｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｌ
ａ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌｙｓ
８０ ８５
９０ ＴＣＣ Ａ
ＧＴ ＡＴＡ ＡＴＧ ＴＡＴ ＧＣＣ ＴＧＧ ＧＣ
Ａ ＡＡＧ ＡＡＴ ＧＣＡ ＣＣＡ ＣＣＣ ＡＣＣ
５６９ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｔｙ
ｒ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｈｒ ９５
１００
１０５ ＡＡＡ ＣＴＴ ＣＣＡ ＧＡ
Ａ ＧＧＡ ＧＴＴ ＧＧＣ ＴＴＴ ＣＧＴ ＧＴＴ
ＧＧＡ ＧＧＧ ＡＡＡ ＴＣＡ ６１１ Ｌｙ
ｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ
Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ １１０
１１５
１２０ ＧＧＣ ＡＧＴ ＡＧＡ ＴＡＴ ＴＴＴ
ＧＴＧ ＣＴＴ ＣＡＡ ＧＴＴ ＣＡＣ ＴＡＴ
ＧＧＡ ＡＡＴ ＧＴＧ ６５３ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ
Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｖａｌ
１２５
１３０
１３５ ＡＡＡ ＧＣＡ ＴＴＣ ＣＡＧ ＧＡＴ
ＡＡＡ ＣＡＴ ＡＡＡ ＧＡＴ ＴＧＣ ＡＣＧ Ｇ
ＧＧ ＧＴＧ ＡＣＡ ６９５ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ａ
ｓｐ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｈｒ
１４０
１４５ ＧＴＡ ＣＧＡ ＧＴＡ
ＡＣＡ ＣＣＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＣＡＡ ＣＣＧ Ｃ
ＡＡ ＡＴＴ ＧＣＡ ＧＧＣ ＡＴＴ ７３７
Ｖａｌ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌ
ｙｓ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌ
ｙ Ｉｌｅ １５０
１５５ １６０
ＴＡＴ ＣＴＴ ＴＣＡ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＴＧ Ｇ
ＡＣ ＡＣＴ ＧＴＴ ＡＴＴ ＣＣＡ ＣＣＴ ＧＧ
Ｇ ＧＡＡ ７７９ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｍ
ｅｔ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌ
ｅ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ １６５
１７０
１７５ ＧＡＧ ＧＣＡ Ｇ
ＴＴ ＡＡＴ ＴＣＴ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＣＣ ＴＧ
Ｃ ＣＴＣ ＴＡＣ ＡＡＣ ＡＧＧ ＣＣＧ ８
２１ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓ
ｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｓｎ
Ａｒｇ Ｐｒｏ １８０
１８５
１９０ ＡＣＡ ＡＴＡ ＣＡＣ ＣＣ
Ａ ＴＴＴ ＧＣＣ ＴＡＣ ＡＧＡ ＧＴＣ ＣＡＣ
ＡＣＴ ＣＡＴ ＣＡＧ ＴＴＧ ８６３ Ｔｈ
ｒ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｙｒ
Ａｒｇ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｎ
Ｌｅｕ １９５
２００
２０５ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＧＴＡ
ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＴＴ ＡＧＡ ＧＴＧ ＡＧＡ
ＣＡＴ ＧＧＣ ＡＡＧ ＴＧＧ ９０５ Ｇｌｙ
Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔ
ｒｐ ２１０
２１５ ＴＣＴ ＴＴＡ
ＡＴＴ ＧＧＴ ＡＧＡ ＣＡＡ ＡＧＣ ＣＣＡ
ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＣＡ ＣＡＧ ＧＣＡ ＴＴＴ
９４７ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ
Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇ
ｌｎ Ａｌａ Ｐｈｅ ２２０
２２５
２３０ ＴＡＣ ＣＣＴ ＧＴＡ ＧＡＧ ＣＡＴ
ＣＣＡ ＧＴＡ ＧＡＧ ＡＴＴ ＡＧＣ ＣＣＴ Ｇ
ＧＧ ＧＡＴ ＡＴＴ ９８９ Ｔｙｒ Ｐｒｏ
Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｉ
ｌｅ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｉｌｅ
２３５ ２４０
２４５ ＡＴＡ
ＧＣＡ ＡＣＣ ＡＧＧ ＴＧＴ ＣＴＧ ＴＴＣ Ａ
ＣＴ ＧＧＴ ＡＡＡ ＧＧＣ ＡＧＧ ＡＣＧ ＴＣ
Ａ １０３１ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｃ
ｙｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌ
ｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｓｅｒ ２５０
２５５
２６０ ＧＣＡ ＡＣＡ Ｔ
ＡＴ ＡＴＴ ＧＧＧ ＧＧＣ ＡＣＡ ＴＣＴ ＡＡ
Ｃ ＧＡＴ ＧＡＡ ＡＴＧ ＴＧＴ ＡＡＴ １０
７３ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｙ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｍｅｔ
Ｃｙｓ Ａｓｎ ２６５
２７０
２７５ ＴＴＡ ＴＡＣ ＡＴＣ ＡＴＧ ＴＡＴ ＴＡＣ Ａ
ＴＧ ＧＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＣＡＴ ＧＣＴ ＡＣ
Ｇ ＴＣＡ １１１５ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｍ
ｅｔ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌ
ａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
２８０
２８５ ＴＡＣ ＡＴＧ ＡＣＣ ＴＧＴ Ｇ
ＴＡ ＣＡＧ ＡＣＡ ＧＧＴ ＧＡＡ ＣＣＡ ＡＡ
Ｇ ＣＴＡ ＴＴＴ ＣＡＡ １１５７ Ｔｙｒ Ｍ
ｅｔ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｎ
２９０ ２９５
３００ ＡＡＣ Ａ
ＴＣ ＣＣＴ ＧＡＧ ＡＴＴ ＧＣＡ ＡＡＴ ＧＴ
Ｔ ＣＣＣ ＡＴＴ ＣＣＴ ＧＴＡ ＡＧＣ ＣＣＴ
１１９９ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌ
ｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｐｒｏ
Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｒｏ ３０５
３１０
３１５ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴ
Ｇ ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＧＡ ＣＡＴ ＧＧＴ ＣＡＣ
ＣＡＣ ＣＡＴ ＡＣＡ ＧＡＡ １２４１ Ａｓ
ｐ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｇｌｙ
Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｔｈｒ
Ｇｌｕ ３２０
３２５
３３０ ＧＣＴ ＧＡＧ ＣＣＴ ＧＡＧ ＡＡＧ
ＡＡＴ ＡＣＡ ＧＧＡ ＣＴＴ ＣＡＧ ＣＡＧ
ＣＣＴ ＡＡＡ ＣＧＡ １２８３ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ
３３５
３４０
３４５ ＧＡＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＴＡ
ＴＴＡ ＧＡＴ ＣＡＧ ＧＧＴ ＣＴＣ ＡＴＴ Ａ
ＣＣ ＴＴＡ ＧＧＧ １３２５ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｇ
ｌｙ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
３５０
３５５ ＧＡＴ ＡＧＣ ＧＣＡ
ＧＴＧ ＴＧＡ ＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡ ＣＡＴＧＡＴ
ＣＣＣＴ ＡＴＡＣＣＧＴＴＧＡ １３７０
Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｖａｌ ３６０ ＡＧＧＧＧＡＴＧＡＣ ＣＣＡＡＴＣＡＴＴＴ Ｔ
１３９１
を含有する大腸菌は、工業技術院微生物工業技術研究所
にブダペスト条約のもとに微工研条寄第２７９７号（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−２７９７） として１９９０年３月７日
に寄託された。配列表配列番号：１ 配列の長さ：１３９１塩基対 配列型：核酸 鎖の数：（二本鎖） トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ起 源 生物名：アフリカツメガエル 性 質：アフリカツメガエルのペプチジルグリシンα
−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ遺伝子ＧＧＧＡＡ
ＧＡＡＴＧ ＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧ ＧＴＴＡＣＣＴＧ
ＣＧ ＧＧＧＣＴＡＧＣＡＣ ＴＧＡＴＧＧＡＧＴＡ
５０ ＧＧＧＧＧＧＡＴＴＧ ＡＴＣＣＡＧＣ
ＴＴＣ ＣＴＡＡＴＴＡＣＣＡ ＧＧＡＴＴＡＣＡＡＣ
ＴＴＧＣＣＴＴＴＡＡ １００ ＴＴＴＡＣＴ
ＣＣＴＧ ＣＡＧＴＡＡＧＧＣＡ ＣＡＧＡＣＣＡＣＡ
Ｇ ＧＧＴＧＧＡＣ ＡＴＧ ＧＣＣ ＡＧＣ ＣＴＣ
１４９
Ｍｅｔ
Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
−３７ −３５ＡＧＴ ＡＧＣ ＡＧＣ
ＴＴＴ ＣＴＴ ＧＴＧ ＣＴＣ ＴＴＴ ＣＴＣ
ＴＴＡ ＴＴＴ ＣＡＧ ＡＡＣ ＡＧＣ １９１
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａ
ｓｎ Ｓｅｒ −３０
−２５
−２０ ＴＧＣ ＴＡＣ ＴＧＴ
ＴＴＣ ＡＧＧ ＡＧＴ ＣＣＣ ＣＴＣ ＴＣＴ Ｇ
ＴＣ ＴＴＴ ＡＡＧ ＡＧＧ ＴＡＴ ２３３
Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐ
ｒｏ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｒ
ｇ Ｔｙｒ −１５
−１０ ＧＡＧ
ＧＡＡ ＴＣＴ ＡＣＣ ＡＧＡ ＴＣＡ ＣＴＴ Ｔ
ＣＣ ＡＡＴ ＧＡＣ ＴＧＣ ＴＴＧ ＧＧＡ ＡＣ
Ｃ ２７５ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａ
ｒｇ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｃｙ
ｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ −５
１
５ ＡＣＧ ＣＧＧ ＣＣＣ ＧＴＴ ＡＴＧ Ｔ
ＣＴ ＣＣＡ ＧＧＣ ＴＣＡ ＴＣＡ ＧＡＴ ＴＡ
Ｔ ＡＣＴ ＣＴＡ ３１７ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｐ
ｒｏ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｓｅ
ｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ １０
１５
２０ ＡＴ ＡＴＣ ＣＧ
Ｃ ＡＴＧ ＣＣＡ ＧＧＡ ＧＴＡ ＡＣＴ ＣＣＧ
ＡＣＡ ＧＡＧ ＴＣＧ ＧＡＣ ＡＣＡ ３５
９ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ
Ａｓｐ Ｔｈｒ ２５
３０
３５ ＴＡＴ ＴＴＧ ＴＧＣ ＡＡＧ ＴＣＴ
ＴＡＣ ＣＧＧ ＣＴＧ ＣＣＡ ＧＴＧ ＧＡＴ
ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＣＣ ４０１ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｌａ
４０
４５ ５０
ＴＡＴ ＧＴＡ ＧＴＴ ＧＡＣ ＴＴＣ ＡＧＡ
ＣＣＡ ＣＡＴ ＧＣＣ ＡＡＴ ＡＴＧ ＧＡＴ Ａ
ＣＴ ＧＣＡ ４４３ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｖａｌ
Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｌａ Ａ
ｓｎ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ
５５
６０ ６５
ＣＡＴ ＣＡＣ ＡＴＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＴＴＴ Ｇ
ＧＡ ＴＧＣ ＡＡＴ ＡＴＡ ＣＣＴ ＴＣＴ ＴＣ
Ｃ ＡＣＴ ４８５ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｍｅｔ Ｌ
ｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｉｌ
ｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ
７０
７５ ＧＡＴ ＧＡＴ ＴＡＣ ＴＧＧ Ｇ
ＡＣ ＴＧＴ ＡＧＴ ＧＣＧ ＧＧＡ ＡＣＴ ＴＧ
Ｃ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＡＡ ５２７ Ａｓｐ Ａ
ｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｌ
ａ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌｙｓ
８０ ８５
９０ ＴＣＣ Ａ
ＧＴ ＡＴＡ ＡＴＧ ＴＡＴ ＧＣＣ ＴＧＧ ＧＣ
Ａ ＡＡＧ ＡＡＴ ＧＣＡ ＣＣＡ ＣＣＣ ＡＣＣ
５６９ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｔｙ
ｒ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｈｒ ９５
１００
１０５ ＡＡＡ ＣＴＴ ＣＣＡ ＧＡ
Ａ ＧＧＡ ＧＴＴ ＧＧＣ ＴＴＴ ＣＧＴ ＧＴＴ
ＧＧＡ ＧＧＧ ＡＡＡ ＴＣＡ ６１１ Ｌｙ
ｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ
Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ １１０
１１５
１２０ ＧＧＣ ＡＧＴ ＡＧＡ ＴＡＴ ＴＴＴ
ＧＴＧ ＣＴＴ ＣＡＡ ＧＴＴ ＣＡＣ ＴＡＴ
ＧＧＡ ＡＡＴ ＧＴＧ ６５３ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ
Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｖａｌ
１２５
１３０
１３５ ＡＡＡ ＧＣＡ ＴＴＣ ＣＡＧ ＧＡＴ
ＡＡＡ ＣＡＴ ＡＡＡ ＧＡＴ ＴＧＣ ＡＣＧ Ｇ
ＧＧ ＧＴＧ ＡＣＡ ６９５ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ａ
ｓｐ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｈｒ
１４０
１４５ ＧＴＡ ＣＧＡ ＧＴＡ
ＡＣＡ ＣＣＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＣＡＡ ＣＣＧ Ｃ
ＡＡ ＡＴＴ ＧＣＡ ＧＧＣ ＡＴＴ ７３７
Ｖａｌ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌ
ｙｓ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌ
ｙ Ｉｌｅ １５０
１５５ １６０
ＴＡＴ ＣＴＴ ＴＣＡ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＴＧ Ｇ
ＡＣ ＡＣＴ ＧＴＴ ＡＴＴ ＣＣＡ ＣＣＴ ＧＧ
Ｇ ＧＡＡ ７７９ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｍ
ｅｔ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌ
ｅ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ １６５
１７０
１７５ ＧＡＧ ＧＣＡ Ｇ
ＴＴ ＡＡＴ ＴＣＴ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＣＣ ＴＧ
Ｃ ＣＴＣ ＴＡＣ ＡＡＣ ＡＧＧ ＣＣＧ ８
２１ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓ
ｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａｓｎ
Ａｒｇ Ｐｒｏ １８０
１８５
１９０ ＡＣＡ ＡＴＡ ＣＡＣ ＣＣ
Ａ ＴＴＴ ＧＣＣ ＴＡＣ ＡＧＡ ＧＴＣ ＣＡＣ
ＡＣＴ ＣＡＴ ＣＡＧ ＴＴＧ ８６３ Ｔｈ
ｒ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｙｒ
Ａｒｇ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｎ
Ｌｅｕ １９５
２００
２０５ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＧＴＡ
ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＴＴ ＡＧＡ ＧＴＧ ＡＧＡ
ＣＡＴ ＧＧＣ ＡＡＧ ＴＧＧ ９０５ Ｇｌｙ
Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔ
ｒｐ ２１０
２１５ ＴＣＴ ＴＴＡ
ＡＴＴ ＧＧＴ ＡＧＡ ＣＡＡ ＡＧＣ ＣＣＡ
ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＣＡ ＣＡＧ ＧＣＡ ＴＴＴ
９４７ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｒｇ
Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇ
ｌｎ Ａｌａ Ｐｈｅ ２２０
２２５
２３０ ＴＡＣ ＣＣＴ ＧＴＡ ＧＡＧ ＣＡＴ
ＣＣＡ ＧＴＡ ＧＡＧ ＡＴＴ ＡＧＣ ＣＣＴ Ｇ
ＧＧ ＧＡＴ ＡＴＴ ９８９ Ｔｙｒ Ｐｒｏ
Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｉ
ｌｅ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｉｌｅ
２３５ ２４０
２４５ ＡＴＡ
ＧＣＡ ＡＣＣ ＡＧＧ ＴＧＴ ＣＴＧ ＴＴＣ Ａ
ＣＴ ＧＧＴ ＡＡＡ ＧＧＣ ＡＧＧ ＡＣＧ ＴＣ
Ａ １０３１ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｃ
ｙｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌ
ｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｓｅｒ ２５０
２５５
２６０ ＧＣＡ ＡＣＡ Ｔ
ＡＴ ＡＴＴ ＧＧＧ ＧＧＣ ＡＣＡ ＴＣＴ ＡＡ
Ｃ ＧＡＴ ＧＡＡ ＡＴＧ ＴＧＴ ＡＡＴ １０
７３ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｙ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｍｅｔ
Ｃｙｓ Ａｓｎ ２６５
２７０
２７５ ＴＴＡ ＴＡＣ ＡＴＣ ＡＴＧ ＴＡＴ ＴＡＣ Ａ
ＴＧ ＧＡＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＣＡＴ ＧＣＴ ＡＣ
Ｇ ＴＣＡ １１１５ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｍ
ｅｔ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌ
ａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
２８０
２８５ ＴＡＣ ＡＴＧ ＡＣＣ ＴＧＴ Ｇ
ＴＡ ＣＡＧ ＡＣＡ ＧＧＴ ＧＡＡ ＣＣＡ ＡＡ
Ｇ ＣＴＡ ＴＴＴ ＣＡＡ １１５７ Ｔｙｒ Ｍ
ｅｔ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｎ
２９０ ２９５
３００ ＡＡＣ Ａ
ＴＣ ＣＣＴ ＧＡＧ ＡＴＴ ＧＣＡ ＡＡＴ ＧＴ
Ｔ ＣＣＣ ＡＴＴ ＣＣＴ ＧＴＡ ＡＧＣ ＣＣＴ
１１９９ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌ
ｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｐｒｏ
Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｒｏ ３０５
３１０
３１５ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴ
Ｇ ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＧＡ ＣＡＴ ＧＧＴ ＣＡＣ
ＣＡＣ ＣＡＴ ＡＣＡ ＧＡＡ １２４１ Ａｓ
ｐ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｍｅｔ Ｇｌｙ
Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｔｈｒ
Ｇｌｕ ３２０
３２５
３３０ ＧＣＴ ＧＡＧ ＣＣＴ ＧＡＧ ＡＡＧ
ＡＡＴ ＡＣＡ ＧＧＡ ＣＴＴ ＣＡＧ ＣＡＧ
ＣＣＴ ＡＡＡ ＣＧＡ １２８３ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ
３３５
３４０
３４５ ＧＡＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＴＡ
ＴＴＡ ＧＡＴ ＣＡＧ ＧＧＴ ＣＴＣ ＡＴＴ Ａ
ＣＣ ＴＴＡ ＧＧＧ １３２５ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｇ
ｌｙ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
３５０
３５５ ＧＡＴ ＡＧＣ ＧＣＡ
ＧＴＧ ＴＧＡ ＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡ ＣＡＴＧＡＴ
ＣＣＣＴ ＡＴＡＣＣＧＴＴＧＡ １３７０
Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｖａｌ ３６０ ＡＧＧＧＧＡＴＧＡＣ ＣＣＡＡＴＣＡＴＴＴ Ｔ
１３９１
【図１】図１は、中間体プラスミドｐＳＶＬ／ＡＥ−Ｉ
−３１０ の作製過程を示す。
−３１０ の作製過程を示す。
【図２】図２は、組換バキュロウイルストランスファー
ベクターｐＡｃＹＭ１／ＡＥ−Ｉの作製過程を示す。
ベクターｐＡｃＹＭ１／ＡＥ−Ｉの作製過程を示す。
【図３】図３は、組換バキュロウイルスの作製過程を示
す。
す。
【図４】図４は、組換バキュロウイルスによりトランス
フェクトされた昆虫細胞による無血清培地でのペプチジ
ルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの生
産を示す。
フェクトされた昆虫細胞による無血清培地でのペプチジ
ルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの生
産を示す。
【図５】図５は、濃縮された昆虫細胞培養培地を用いて
の、グリシン延長ヒトカルシトニン（ｈＣＴ−Ｇｌｙ）
からヒトカルシトニン（ｈＣＴ）への経時的転換を示す
。
の、グリシン延長ヒトカルシトニン（ｈＣＴ−Ｇｌｙ）
からヒトカルシトニン（ｈＣＴ）への経時的転換を示す
。
Claims (13)
- 【請求項１】 ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル
化モノオキシゲナーゼをコードするＤＮＡが導入された
組換えバキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）に
よりトランスフェクトされた昆虫細胞を培養して該酵素
を生産せしめることを含んで成るペプチジルグリシンα
−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの製造方法。 - 【請求項２】 前記組換バキュロウイルスが、ポリヘ
ドリン遺伝子を含有するトランスファープラスミドにペ
プチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナー
ゼをコードするｃＤＮＡ断片を挿入して組換トランスフ
ァーベクターを作製しそして相同性組換えにより前記ｃ
ＤＮＡ断片をバキュロウイルスのゲノムに挿入すること
により調製されたものである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記トランスファーベクターがｐＡｃ
ＹＭ１であり、そして前記バキュロウイルスがオートグ
ラファ・カリホルニカ （Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃ
ａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ） 核多角体病ウイルス（Ａｃ
ＭＮＰＶ） である、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記ペプチジルグリシンα−ヒドロキ
シル化モノオキシゲナーゼを精製された形又は濃縮され
た形で回収する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 Ｃ−末端α−ヒドロキシグリシルペプ
チドの製造方法であって、次の式（Ｉ）：
Ｒ−ＮＨ−ＣＨ２ −ＣＯＯ
Ｈ
（Ｉ）（式中、Ｒはペプチドを表わし、そして
−ＮＨ−ＣＨ２ −ＣＯＯＨは該ペプチドＲのＣ−末端
に存在するグリシン残基を表わす）により表わされるＣ
−末端グリシン延長ペプチドを、請求項１に記載の方法
により製造された酵素を用いて、次の式（ＩＩ）： Ｒ−ＮＨ−ＣＨ
ＯＨ−ＣＯＯＨ
（ＩＩ）により示されるＣ−末端
α−ヒドロキシグリシルペプチドに転換することを含ん
で成る方法。 - 【請求項６】 前記α−ヒドロキシグリシルペプチド
が、Ｃ−末端がα−ヒドロキシグリシル化されたヒトカ
ルシトニン、サケカルシトニン、ニワトリカルシトニン
、ウナギカルシトニン、ラットカルシトニン、ウシカル
シトニン、ブタカルシトニン、ヒツジカルシトニン、ヒ
ト成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）、ヒトカルシトニ
ン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）又は黄体形成ホルモ
ン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）である、請求項５に記載の
方法。 - 【請求項７】 前記α−ヒドロキシグリシルペプチド
が、Ｃ−末端がα−ヒドロキシグリシル化されたヒトカ
ルシトニンである、請求項５に記載の方法。 - 【請求項８】 次の式（ＩＩ）： Ｒ−ＮＨ−ＣＨ
ＯＨ−ＣＯＯＨ
（ＩＩ）で表わされるＣ−末端α
−ヒドロキシグリシルペプチドを塩基で処理することに
より転換することを含んで成る、次の式（Ｉ）： Ｒ−ＮＨ２
（Ｉ）で表わされるＣ−末端
α−アミド化ペプチドの製造方法。 - 【請求項９】 前記式（ＩＩ）の出発物質が請求項５
に記載の方法により得られたものである、請求項８に記
載の方法。 - 【請求項１０】 前記式（ＩＩ）の出発物質が、Ｃ−
末端がα−ヒドロキシグリシル化されたヒトカルシトニ
ンである、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】 Ｃ−末端に追加のα−ヒドロキシグ
リシンユニットを有するカルシトニン。 - 【請求項１２】 ヒトカルシトニンである請求項１１
に記載のカルシトニン。 - 【請求項１３】 ペプチジルグリシンα−ヒドロキシ
ル化モノオキシゲナーゼの測定方法であって、ａ）該酵
素の作用のために最適なｐＨ値を有する反応媒体中でＣ
−末端にグリシン残基を有する基質ペプチドと試験サン
プルとを反応せしめ； ｂ）反応混合物のｐＨ値をｐＨ１０以上に上げ；ｃ）該
媒体を中和ｐＨに中和し；そしてｄ）生成したＣ−末端
アミド化ペプチドの量を決定する； 段階を含んで成る方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3057058A JPH04211367A (ja) | 1990-03-21 | 1991-03-20 | ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの製造方法及び該酵素の使用 |
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB909006354A GB9006354D0 (en) | 1990-03-21 | 1990-03-21 | Process for production of peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase and use thereof |
| GB90063546 | 1990-03-21 | ||
| JP21053590 | 1990-08-10 | ||
| GB909026082A GB9026082D0 (en) | 1990-03-21 | 1990-11-30 | Process for production of peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase and use thereof |
| GB90260829 | 1990-11-30 | ||
| JP3057058A JPH04211367A (ja) | 1990-03-21 | 1991-03-20 | ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの製造方法及び該酵素の使用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04211367A true JPH04211367A (ja) | 1992-08-03 |
Family
ID=27265000
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3057058A Pending JPH04211367A (ja) | 1990-03-21 | 1991-03-20 | ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの製造方法及び該酵素の使用 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0448513A3 (ja) |
| JP (1) | JPH04211367A (ja) |
| AU (1) | AU7355991A (ja) |
| CA (1) | CA2038569A1 (ja) |
| IE (1) | IE910934A1 (ja) |
| PT (1) | PT97069A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5871995A (en) * | 1989-08-15 | 1999-02-16 | Shiseido Company, Ltd. | Purified enzymes participating in C-terminal amidation |
| ES2583259T3 (es) | 2009-12-01 | 2016-09-20 | Novo Nordisk A/S | Nuevas liasas alfa-amidantes de peptidil alfa-hidroxiglicina |
| WO2019078095A1 (en) * | 2017-10-16 | 2019-04-25 | Ajinomoto Co., Inc. | PROCESS FOR PRODUCTION OF PROTEIN HAVING ALPHA-HYDROXYLANTIC PEPTIDYLGLYCIN MONOOXYGENASE ACTIVITY |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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