JPH04211373A - 包括固定化生体触媒およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は微生物菌体若しくはその
処理物を、水不溶性ポリウロン酸で包括固定化した化学
的強度の強い固定化生体触媒およびその製造法に関する
。

【０００２】

【従来の技術】酵素若しくは微生物を、生体触媒として
食品や医薬等の生産に応用する場合、これらを固定化す
ることによって再利用や連続使用を可能にすることが工
業的に望ましい。固定化の手法はこれまでに多数開発さ
れているが、大別すると、担体結合法、架橋法及び包括
法の３つに分類される。

【０００３】このうち、アルギン酸カルシウム等の如き
ポリウロン酸多価金属塩のゲルによる包括固定化法は、
酵素とゲルが直接結合しない点や、固定化の際の反応条
件が緩やかであるという点から、生体触媒の固定化に伴
なう失活が一般的に少なく、最も有効な固定化法の１つ
とされている。

【０００４】

【本発明が解決しようとする問題点】しかしながら、例
えばアルギン酸カルシウムゲルはｐＨが約６を越え、ゲ
ルを形成するカルシウムイオンやアルミニウムイオン等
の多価金属イオンが存在しない反応液や、ナトリウムイ
オン、リン酸イオン、硫酸イオン等のイオンを含む反応
液中では、ゲルが徐々に膨潤するため生体触媒がゲルか
ら漏出し、長期間の連続使用に耐えないという問題点を
有している。これはアルギン酸のカルボキシル陰イオン
を架橋しているカルシウムイオンが上記条件によって脱
落してしまうことが原因である。

【０００５】このゲルの膨潤による問題点を回避するた
め、以下の様な反応系及びゲルの改良法が試みられてい
る。

【０００６】１）反応液中にカルシウムイオンを添加す
る方法（例えばＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ．，２５，１８６（１９８６）］。

【０００７】２）難溶性カルシウム塩等の無機物をゲル
に混入する方法（例えば特開昭６３−１６０５８４号公
報）。

【０００８】３）ポリエチレンイミン等の多カチオン性
高分子でゲルを、コーティングする方法［例えばＢｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２６，１３９３（１
９８４）］。

【０００９】４）グルタルアルデヒドや、グルタルアル
デヒドとヘキサメチレンジアミンでゲルをコーティング
する方法［例えばＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ
．，２１，１６９７（１９７９）］。

【００１０】しかし、上記１）の方法は、工業的に実施
した場合に分離、精製工程等へカルシウムイオンの悪影
響が及ぶこと、２）及び３）の方法は本質的にゲルのイ
オン架橋構造に変わりはないので、程度の差こそあれ、
架橋イオンの脱落によるゲルの膨潤は避けられないこと
、４）の方法はアルデヒド基による架橋がｐＨ等の影響
で簡単に開裂する架橋であること、などのそれぞれ欠点
を有している。

【００１１】そこで本発明の第１の目的は、反応系にお
けるｐＨの影響が少なく、広いｐＨの範囲で使用するこ
とが可能な包括固定化生体触媒を提供することにある。

【００１２】本発明の第２の目的は、カルシウムイオン
やアルミニウムイオンの如きゲルを形成する多価金属イ
オンが実質的に反応系に存在しない場合や、ナトリウム
イオン、アンモニウムイオン、リン酸イオンなどのゲル
を溶解するイオンが存在する場合であっても、膨潤性し
にくい包括固定化生体触媒を提供することにある。

【００１３】本発明の他の目的は、長期間の連続反応に
も充分に耐えることが可能な包括固定化生体触媒を提供
することにある。

【００１４】本発明のさらに他の目的は、固定化に伴な
う生体触媒の活性低下が少ない包括固定化生体触媒を提
供することになる。

【００１５】本発明のさらに他の目的は、上記した優れ
た特性を有する包括固定化生体触媒の製造方法を提供す
ることにある。

【００１６】本発明のさらに他の目的は、以下の説明か
ら一層明らかとなるであろう。

【００１７】

【問題点を解決するための手段】そこで、本発明者らは
前記本発明の目的は、ポリウロン酸をアミド結合および
／またはエステル結合を介して架橋せしめることによっ
て達成されることを見出した。

【００１８】かくして本発明によれば、前記本発明の目
的および利点は微生物菌体若しくはその処理物を包括含
有する水不溶性ポリウロン酸ゲルであって、該ゲルは架
橋剤を含有し且つ該架橋剤は該ポリウロン酸のカルボキ
シル基とアミド結合および／またはエステル結合により
結合して該ポリウロン酸を架橋していることを特徴とす
る包括固定化生体触媒によって達成されることがわかっ
た。

【００１９】以下本発明についてさらに詳細に説明する
。

【００２０】本発明におけるポリウロン酸としは、通常
微生物の包括固定化用のゲルとして使用されるものであ
ればよく、好適なものとしては、アルギン酸、ペクチン
酸またはこれらの混合物が挙げられる。

【００２１】本発明において不溶性ポリウロン酸の架橋
に使用される架橋剤は、ポリウロン酸のカルボキシル基
と反応してアミド結合および／またはエステル結合を形
成することが出来る官能基を分子中に２個またはそれ以
上有するものである。かかる官能基としては、アミノ基
、ヒドロキシ基またはこれらの官能性誘導体基である。

【００２２】使用される架橋剤は、それ自体水溶性であ
るのが好ましく、得に好ましいのは水溶性高分子化合物
である。

【００２３】架橋剤の具体例としては、例えばエチレン
ジアミン、エチレングリコール、グリセロール、エタノ
ールアミン、ジエタノールアミンなどの低分子化合物；
例えばポリビニルアルコール、ポリアルキレンイミン（
例えばポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポ
リブチレンイミンなど）、ポリアリルアミンおよびポリ
ビニルアミン等の高分子化合物が挙げられる。これらの
中で高分子化合物が好ましく、とりわけ入手の容易性及
び反応性の点から、ポリエチレンイミンまたはポリアリ
ルアミンが特に好ましい。

【００２４】前記した高分子化合物の平均分子量は、得
に制限を受けないが、ポリビニルアルコールの場合約１
０，０００〜約１００，０００、ポリアルキレンイミン
の場合約３００〜約１００，０００好ましくは約１，０
００〜約７０，０００、ポリアリルアミンの場合約５，
０００〜約１００，０００、ポリビニルアミンの場合約
１０，０００〜約５０，０００の範囲のものが有利であ
る。

【００２５】一方本発明で固定化されるべき微生物とし
ては細菌、酵母、カビ、放線菌等いずれも応用可能であ
り、これらの処理物等も用いることができる。

【００２６】ここでいう処理物とは、菌体の破壊物、磨
砕物、自己消化物等培養で得られる全てのものをさし、
更には菌体、菌体の破壊物を凝集若しくは予備的に固定
化したものも含まれる。

【００２７】さらに、本発明は、前記微生物以外に、動
物細胞、或いは植物細胞などと包括固定化に応用するこ
とができる。この動物細胞、植物細胞は天然由来のみな
らず人為的手段、例えば遺伝子組換え技術或いは細胞融
合技術で得られたもの例えばハイブリトニマであっても
よい。

【００２８】本発明による包括固定化生体触媒は、微生
物菌体若しくはその処理物を包括含有する水不溶性ポリ
ウロン酸ゲルと、水性媒体中で前記架橋剤とを縮合剤の
存在下に反応せしめることにより形成させることができ
る。

【００２９】その際使用される縮合剤としては、水溶性
カルボジイミド試薬が好ましい例として挙げられる（Ｊ
．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２１，４３９，１９５６）。そ
の具体例としてはＮ−（３−ジメチルアミノ）プロピル
−Ｎ′−エチルカルボジイミド塩酸塩が挙げられ、この
化合物はアルドリッチ社等から市販されており入手容易
であり好ましい。

【００３０】本発明の固定化生体触媒を調製するに当た
って、まずアルギン酸のナトリウム塩、カリウム塩或い
は、アンモニウムまたはペクチン酸等の水溶性ポリウロ
ン酸化合物の水溶液に菌体若しくはその処理物である生
体触媒を均一に懸濁させた液を調製する。

【００３１】ここでこの懸濁液の組成は、ポリウロン酸
化合物を５〜１００ｇ／ｌ、特に１０〜５０ｇ／ｌ、生
体触媒を１０〜９００ｇ（湿重量）／ｌ、特に５０〜２
００ｇ（湿重量）／ｌの濃度で含んでいるのが好ましい
。次にこの懸濁液を用いた固定化および架橋化は以下の
いずれか１つの手法によって行うのが適当である。

【００３２】（１）懸濁液をカルシウムイオンやアルミ
ニウイオン等を含むゲル化水溶液に滴下、吐出、湿潤等
を行うそれ自体公知の手法に従って水不溶性のゲルを得
、このものを架橋剤と縮合剤の混合水溶液に投入し、放
置若しくは撹拌する方法、 （２）懸濁液に１〜２００ｇ／ｌ、好ましくは１０〜５
０ｇ／ｌの濃度となる量の架橋剤を添加した後に、前記
した如き公知の手法で水不溶性ゲルを得、このものを縮
合剤の水溶液若しくは縮合剤と架橋剤の混合水溶液に投
入し、放置若しくは撹拌する方法、 （３）ゲル化水液に架橋剤と縮合剤を加えておき、この
ものに懸濁液を滴下、吐出、湿潤等をし、放置若しくは
撹拌する方法。

【００３３】前記した手法のうち、（１）および（２）
の方法が好ましく殊に（１）の方法が優れている。

【００３４】上記ゲル化及び架橋処理に於ける処理液の
ｐＨは２〜１２、特に５〜８が好ましい。架橋剤の濃度
は１〜２００ｇ／ｌ、特に３〜１００ｇ／ｌが好ましい
。縮合剤は、使用するポリウロン酸化合物のカルボキシ
ル基のモル数に対して、０．１〜５倍のモル量使用する
のが好ましい。処理温度、処理時間はそれぞれ５〜５０
℃、１〜１００時間が好ましい。また、処理に用いる溶
媒は水が好ましいが、必要に応じてアルコール、アセト
ン、アセトニトリル、エーテル、ジメチルホルムアミド
等の有機溶媒若しくはそれらの混合物を用いてもかまわ
ない。

【００３５】処理を終えた包括固定化生体触媒はろ過に
よって回収し、次いで充分に水洗した後に目的とする触
媒反応に用いることができる。

【００３６】本発明における包括固定化生体触媒は、前
述したように、膨潤しにくいという優れた特徴を有して
いる。具体的には本発明の包括固定化生体触媒を、その
１００重量倍の０．２Ｍリン酸２ナトリウム水溶液中に
入れ、４０℃で２時間振とう後の包括固定化生体触媒の
重量は、元の２倍以下に過ぎない。

【００３７】本発明の包括固定化生体触媒の形状は特に
限定されず、球状、繊維状、膜状、立方体状等いずれで
あっても差支えなく、その大きさは繊維状または膜状で
あればその太さまたは厚さは平均して５ｍｍ以下、好ま
しくは２ｍｍ以下、球状または立方体状であればその体
積は平均１５０ｍｍ３以下、好ましくは５０ｍｍ３以下
である。

【００３８】

【発明の効果】本発明の固定化生体触媒はポリウロン酸
のカルボニル基がアミド結合やエステル結合の共有結合
によって架橋された構造を有する生体触媒包括ゲルであ
り、従来のポリウロン酸多価金属塩によって生体触媒を
包括したゲルと比較して、反応液のｐＨや液中のイオン
の影響による膨潤が著しく押さえられる。すなわち、該
固定化生体触媒は化学的強度が極めて高く、ポリウロン
酸ゲルの工業的利用の範囲を一層拡げる効果を有する。

【００３９】

【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。

【００４０】実施例　　１ 市販のアルギン酸ナトリウム（粘度：２０℃、１０ｇ／
ｌ水溶液で８００〜１２００ｃｐｓ）を６０〜７０℃の
熱水に溶かし、５０ｇ／ｌの水溶液を調製し、室温迄冷
却した。

【００４１】次に、下記表１の組成から成る培地（ｐＨ
７．２）で３０℃、２４時間培養したアミノ酸ラセマー
ゼを含有するシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ　　ｐｕｔｉｄａ）ＩＦＯ１２９９６　　１０
ｇ（湿重量）に上記水溶液６０ｍｌを加え、さらに水を
加えて全容を１００ｍｌとし良く混合した。

【００４２】このものを０．１Ｍの塩化カルシウム水溶
液（４００ｍｌ）中に滴下し、さらにそのまま２時間緩
やかに撹拌して球状のアルギン酸カルシウムゲル５３．
１ｇ（湿重量）を得た。

【００４３】

【表１】

【００４４】次に上記ゲルの架橋化を下記方法に従って
実施した。

【００４５】すなわち、ポリエチレンイミン１０ｇ／ｌ
水溶液を濃硫酸で中和し、これにＮ−（３−ジメチルア
ミノ）プロピル−Ｎ′−エチルカルボジイミド塩酸塩５
５０ｍｇを加えた架橋化液（４９ｍｌ）中に上記ゲル１
０．０ｇを加え、２３℃で１２時間緩やかに撹拌した。

【００４６】このものをろ過・水洗することにより、目
的とする固定化菌７．０ｇを得た。以上の様にして製造
したものも含め３種類の固定化菌を用いて、そのアミノ
酸ラセマーゼ活性を測定した。３種類の固定化菌として
、 （ａ）上記実施例１で製造した固定化菌（ｂ）塩化カル
シウムで固めたのみの固定化菌（ｃ）カルボジイミド剤
を用いない以外は実施例１に従って製造した固定化菌 を用いた。各々５０粒を３０ｍｌの三角フラスコに入れ
、これに苛性ソーダでｐＨを７．８に調節した０．１ｍ
ｏｌ／ｌのＬ−セリン水溶液５ｍｌを加え、３７℃１時
間振とうした。この間のＬ−セリンからＤ−セリンへの
ラセミ化率は、キラルカラムクロマトグラフィーで測定
した。測定後の固定化菌を５分間水洗し、さらに３回同
じ活性測定を繰り返した。結果を表２に示した。

【００４７】

【表２】

【００４８】１）各々１回目のラセミ化率を１００とし
た相対値で示した。

【００４９】２）１０粒の平均値 ３）

【００５０】

【数１】

【００５１】実施例２ 前記の固定化菌を含む３種類の固定化菌をカラムに充填
し、連続反応での活性ライフを測定した。すなわち、（
ａ）前記実施例１で製造した固定化菌（ｂ）塩化カルシ
ウムで固めたのみの固定化菌（ｃ）ポリエチレンイミン
を用いない以外は実施例１に従って製造した固定化菌 を各々５ｇづつ内径１４ｍｍ、長さ１２ｃｍのガラスカ
ラムに詰め（充填高さ約７ｃｍ）、このものに０．１ｍ
ｏｌ／ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解した０．１
５ｍｏｌ／ｌのＬ−セリン水溶液を３０℃、２０ｍｌ／
ｈｒの上方流で７日間通じた。結果を表３にまとめて示
した。

【００５２】

【表３】

【００５３】

【数２】

【００５４】実施例　　３ エシェリヒア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ
ｉ）Ｋ１２　　ＹＫ２００９（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３２
４４）を表４の組成から成る培地１００ｍｌを含む５０
０ｍｌ容三角フラスコに植菌後、３７℃、２４時間培養
した。さらに該培養物の２ｖ／ｖ％を表５の組成から成
る培地１００ｍｌに植菌後、インドールアクリル酸を１
００μｇ／ｍｌの濃度で添加し、３７℃、５時間振とう
培養した。遠心分離にて集めた菌のうち５ｇ（湿重量）
に、生理食塩水２０ｇと実施例１で調製した５０ｇ／ｌ
のアルギン酸ナトリウム水溶液２５ｇを加え、氷冷下良
く混合した。

【００５５】

【表４】

【００５６】

【表５】

【００５７】このものを１０℃の０．２Ｍの塩化カルシ
ウム水溶液５０ｍｌ中に滴下し、滴下後さらに２時間緩
やかに撹拌することにより球状のアルギン酸カルシウム
ゲルを得た。一方、表６の組成から成るゲル架橋化液を
氷冷下調製し、調製直後に前述ゲルを投入、３０℃で５
０時間振とうした後、ろ過、生理食塩水による洗浄によ
り固定化エシェリヒア・コリ菌１２ｇ（ゲル径平均１．
２ｍｍ）を得た。

【００５８】

【表６】

【００５９】この固定化エシェリヒア・コリ菌のトリプ
トファンシンターゼ活性をＹａｎｏｆｓｋｙ等の方法（
Ｏ．Ｈ．Ｓｍｉｔｈ　　ａｎｄ　　Ｃ．Ｙａｎｏｆｓｋ
ｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｆｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
　　ｖｏｌ５，７９４−８０４（１９６２））に従って
測定した結果、４６μｍｏｌ／ｇ−ゲル・２０ｍｉｎで
あった。 実施例　　４ エシェリヒア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ
ｉ））Ｋ−１２　　ＹＫ３００４（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−
３２４４）を表７の組成から成る培地１００ｍｌを含む
５００ｍｌ容三角フラスコに植菌後、３７℃、１３時間
培養した。さらに該培養物の２ｖ／ｖ％を表８の組成か
ら成る培地１．５ｌ（ｐＨ７．２、３７℃）に植菌し、
３ｌ培養槽で通気しながら撹拌培養した。培養液の濁度
（ＯＤ６６０ｎｍ）が１５前後に達したところで、Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ２ＯおよびＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏをそれぞ
れ終濃度４００ｍｇ／ｌおよび１００ｍｇ／ｌとなるよ
うに添加した。また、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸
素電極にて測定し、グルコース濃度がゼロになり、培養
液の溶存酸素値が上昇を始めた時点で、グルコースを１
％となるように添加した。培養を継続し、ＯＤ６６０の
増加が観察されなくなった時点で培養終了し、菌体を遠
心分離により回収した。うち５ｇ（湿重量）を用いて実
施例３記載の方法により固定化エシェリヒア・コリ菌１
１．５ｇを得た。このもののトリプトファナーゼ活性は
以下の様に測定した。すなわち固定化エシェリヒア・コ
リ菌に表９に示した反応液を加え、３７℃、１時間振と
うした。 固定化菌をろ別し、水を加えて全量を１ｌにして生成Ｌ
−トリプトファンを完全に溶解させた後、その生成量を
高速液体クロマトグラフィー（島津製ＬＣ−５Ａ）によ
り定量した。その結果、固定化エシェリヒア・コリのト
リプトファナーゼ活性は０．２４ｇトリプトファン／ｇ
−ゲル・ｈｒであった。

【００６０】

【表７】

【００６１】

【表８】

【００６２】

【表９】

【００６３】実施例　　５ ブレビバクテリウムフラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　　ｆｌａｖｕｍ）Ｍ．Ｊ２３３−ＡＢ−４１（
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９８）を表１０の組成から成る
培地１００ｍｌを含む５００ｍｌ容三角フラスコに植菌
後、３０℃、２４時間培養した。さらに該培養物の２ｖ
／ｖ％を表１１の組成から成る培地（ｐＨ７．６）に植
菌し、３３℃、２０時間３ｌ培養槽で通気しながら撹拌
培養した。遠心分離で集めた菌のうち５ｇ（湿重量）を
用いて実施例３記載の方法により固定化ブレビバクテリ
ウム・フラバム菌１５ｇを得た。このもののアスパルタ
ーゼ活性は以下の様に測定した。すなわち固定化ブレビ
バクテリウム・フラバム菌に表１２に示した反応液を加
え、４６℃、１時間振とうしアスパラギン酸の減少量を
高速液体クロマトグラフィー（島津製ＬＣ−５Ａ）によ
り定量した。その結果、固定化ブレビバクテリウム・フ
ラバム菌のアスパルターゼ活性は１３０μｍｏｌｅ／ｇ
−ゲル・ｈｒであった。

【００６４】

【表１０】

【００６５】

【表１１】

【００６６】

【表１２】

【００６７】［＊印：和光純薬（株）製非イオン系界面
活性剤商品名］ 実施例　　６ 実施例１、３、５で調製した本発明の固定化菌および架
橋剤を用いない以外はそれぞれの実施例に従って調製し
た固定化菌の計６種類を１ｇづつとり、０．２Ｍ　　Ｎ
ａ２ＨＰＯ３１００ｍｌ（ｐＨ９）を含む２００ｍｌ容
三角フラスコに加え４０℃、１．５時間振とうした。膨
潤の度合いを知る為に、ろ別して回収した固定化菌の重
量を測定した結果を表１３にまとめて示す。

【００６８】

【表１３】

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　微生物菌体若しくはその処理物を包括
   含有する水不溶性ポリウロン酸ゲルであって、該ゲルは
   架橋剤を含有し且つ該架橋剤は該ポリウロン酸のカルボ
   キシル基とアミド結合および／またはエステル結合によ
   り結合して該ポリウロン酸を架橋していることを特徴と
   する包括固定化生体触媒。
2. 【請求項２】　　該ポリロン酸は、アルギン酸、ペクチ
   ン酸またはこれらの混合物である請求項１記載の固定化
   生体触媒。
3. 【請求項３】　　該架橋剤は、アミノ基、ヒドロキシ基
   またはこれらの官能性誘導体基を、分子中に少なくとも
   ２個有する請求項１記載の固定化生体触媒。
4. 【請求項４】　　該架橋剤は、アミノ基、ヒドロキシ基
   またはこれらの官能性誘導体基を分子中に少なくとも２
   個有する水溶性高分子化合物である請求項１記載の固定
   化生体触媒。
5. 【請求項５】　　該水溶性高分子化合物は、ポリビニル
   アルコール、ポリアルキレンイミン、ポリアリルアミン
   およびポリビニルアミンからなる群から選ばれた少なく
   とも一種である請求項１記載の固定化生体触媒。
6. 【請求項６】　　微生物菌体若しくはその処理物を包括
   含有する水不溶性ポリウロン酸ゲルを、水性媒体中で分
   子中にアミノ基、ヒドロキシ基またはこれらの官能性誘
   導体基を少なくとも２個有する架橋剤と縮合剤の存在下
   に接触せしめることを特徴とする請求項１記載の包括固
   定化生体触媒の製造法。
7. 【請求項７】　　該ポリウロン酸は、アルギン酸、ペク
   チン酸またはこれらの混合物である請求項６記載の製造
   法。
8. 【請求項８】　　該架橋剤は、水溶性高分子化合物であ
   る請求項６記載の製造法。
9. 【請求項９】　　該架橋剤は、ポリビニルアルコール、
   ポリアルキレンイミン、ポリアリルアミンおよびポリビ
   ニルアミンからなる群から選ばれた少なくとも１種であ
   る請求項６記載の製造法。
10. 【請求項１０】　　該縮合剤が水溶性カルボジイミドで
    ある請求項６記載の製造法。