JPS59232092A - 酵素の固定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は包括法による酵素の固定化法に関する。

酵素反応は医薬品、食品等の製造過程で工業的に広く用
いられているが、従来酵素を基質の水溶液に溶解させて
、溶液中で反応を゛行わせている。

しかしこのような方法では、反応条件を一定に維持しつ
＼、新鮮な酵素を補給したシ、又反応後に酵素を回収す
る操作等が著し“く複雑であるばかシでなく、反応生成
物の分離、精製も又著しく煩雑　１− な操作となる。このよう々欠点を解消する為に、近年酵
素を固定化して酵素反応を連続的に行なう試みがある。

酵素の固定化法としては、（１）担体結合法、（２）物
理的吸着法もしくはイオン結合法、（３）架橋法、（４
）包括法、（５）マイクロカプセル法等が知られている
。

これらの固定化法のうち、（１）の担体結合法は特殊な
担体を必要とする上、反応条件の設定が難しく、一般に
高活性の固定化酵素を得るのが難、しい。

高活性な固定化酵素が得られるが、担体と酵素との結合
力が弱い為、担体より酵素が脱離し易い欠点がある。（
３）の架橋法は、比較的苛酷な条件で反応きせる為、活
性度の低い固定化酵素しか得られない難点があシ、又（
４）の包括法は一般に簡単かつ低廉に製造出来る利点が
あるが、水溶性重合体を架更に（５）のマイクロカプセ
ル法は、固定化の際の調整が煩雑であることの他、有機
溶媒の使用により固定化酵素の活性が低下する等の欠点
がある。

そこで本発明者等は上記諸欠点を考慮し、酵素の包括固
定化法に関し種々検討した結果、先ず水不溶性タンニン
は酵素蛋白質に対し特異的に強い吸着性を示すこと、そ
してこのような酵素を吸着した不溶性タンニンは、ｐＨ
１温度、イオン強度の変化によシ脱離し易い欠点がある
こと、更に検討した結果、該吸着物質を寒天、カラギー
ナン等のゲル化担体で包括することにより、酵素の脱離
が著しく抑制されること等の知見を得、本発明を完成し
た。

即ち本発明は、タンニンに水溶性高分子物質、活性炭、
キチン及びグルテンより選ばれた少なくとも７種を加え
て得られる水不溶性タンニンに、酵素を吸着させた後、
これを寒天、カラギーナン、アルキン酸塩、ゼラチン及
び低メチル化ペクチンより選ばれた少なくとも７種のゲ
ル化担体で包括■ することを特徴とする酵素の固定化法である。

以下、本発明を詳述する。

先ず本発明に用いられるタンニンとしては、タンニン酸
の他、ピロガロールタンニン例えば没食子酸又は五倍子
タンニン、カテコール例えば茶、カカオ等からタンニン
物質（カテコール重合体）が用いられる。これらのタン
ニンはタンニン作用を有する限り精製されていないもの
でも良く、例えば市販の柿渋タンニン等も用いられる。

これらは単独でも２種以上のタンニン混合物としても用
いることが出来る。

そして上記したタンニンに、水溶性高分子物質、活性炭
、キチン及びグルテンより選ばれた少なくとも７種のも
の（以下、これらをタンニン除去剤と言う）を加えて水
不溶、性のタンニンとする。

なお水溶性高分子物質としては、例えばゼラチン、カゼ
イン、大豆分離蛋白、卵白、ポリビニルピロリドン、ア
セチルセルロース、メチルセルロース等であり、特に好
ましくは大豆分離蛋白、ゼラチン、メチルセルロース等
である。

そして水不溶性タンニンは、例えば次のようにして製造
することが出来る。

タンニン又はタンニン含有物を水中に溶解又は懸濁し、
好ましくはｐＨ７以下及び０−ＳＯ℃の温度に保持し、
これに上述のタンニン除去剤の水溶液又は水性懸濁液を
添加し、攪拌又は振盪等により約７０分以上作用させる
。

逆にタンニン除去剤の水溶液又は水性懸濁液に、タンニ
ン又はタンニン含有物の水溶液又は水性懸濁液を加えて
も良い。この操作によりタンニンは剤の比率は、通常／
：／ないしｔニア、好ましくはｌ：／ないし！：／、特
に３：ｌないしｔ；ｌである。

又本発明に用いられる酵素は、一般に固定化法に用いら
れるものであれば如何なるものでも良く、例えばアミノ
ペプチダーゼ、乳酸脱水素酵素、ウレアーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルコール脱水素
酵素、インベルターゼ、カルボキシペプチダーゼ等が好
ましい例として挙げられる。

　５− これらの酵素含有溶液に、該酵素量に対し７〜２０倍量
（Ｗ／Ｗ　）の上述した水不溶性タンニンを攪拌しつ＼
加え、ｐＨＪ〜／２、温度θ〜７０℃で酵素を吸着させ
る。なお、この吸着操作はイオン強度／、０以下で行な
うのが望ましい。

次に、水不溶性タンニンに酵素を吸着させたものを、寒
天、カラギーナン、アルギン酸塩、ゼラチン及び低メチ
ル化ペクチンより選ばれた少なくとも７種のゲル化担体
で包括し、目的とする固定化酵素を得る。

なお、寒天、カラギーナン又はゼラチンをゲル化担体と
して用いる場合、これらを水に所定量加熱溶解させた後
、冷却したものが用いられる。前記カラギーナンとして
は、カッパーカラギーナンが最も好ましい。

又、アルギン酸Ｎａ、アルギン酸に１アルギン酸Ｎ　Ｈ
ｅ等のアルギン酸塩又は低メチル化ペクチンを担体とし
て用いる場合、これらを所定量の水で溶解したものをＣ
ａＣ１ｘ、Ａｌｘ（ＳＯｇ）３、Ｃａ　（Ｃ，２ＨＪＯ
Ｊ）、２等のゲル化剤中に押出し、固化したものが用い
ら　６− れる。

本発明によれば、簡易な操作で安定性、殊に熱安定性の
優れた固定化酵素を効率良く得ることが出来、しかも該
酵素を種々の基質に繰り返し使用しても、該酵素の脱離
が著しく抑制される等、本発明は産業上極めて有意義で
ある。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す。

実施例１ タンニン酸〔和光紬薬（株）製〕／、＋０７ｎｇを５０
ｍｇの水に溶解したもの（１）Ｈ７，Ｏ）に、タンニン
除去剤としてメチルセルロース（本発明−１）、ゼラチ
ン（本発明−２）、ポリピロリドンに−６０（本発明−
３）、カゼイン（本発明−４）、活性炭（本発明−５）
を夫々ｚ　ｏ　ｏ　ｍｙ加えて混合し、水不溶性タンニ
ンを夫々得た。

次にアスペルギルス・オリゼーＦＥＲＭ　　Ｐ’−／／
≠りの皺培養物よυ硫安外画し、ＤＥＡＢ−１セルロー
スを用いて精製したロイシン・アミノペプチダーゼ標品
ｊＯ■をＯ２Ｏ３−Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）１００
ｍｌ！に溶解したものを、上記水不溶性タンニンに夫々
吸着させた。

該酵素を吸着させた水不溶性タンニンをＯ，ＯＳＭのｐ
ＨＡ、０の酢酸緩衝液で２回洗滌し、次いでこれを２％
アルギン酸ソーダ１０ｍ１３に懸濁した後、注射器を用
いて５係ＣａＣ１，２溶液に滴下し球状に包括し、固定
化酵素を夫々得た（本発明１〜５）。

なお第１表中、 対照−１：前述のロイシン・アミノペプチダーゼ（ＦＥ
ＲＭ　Ｐ−／／ｌ／Ｌり）の精製酵素標品。

対照−２：タンニン酸／ｊ０７ｎｇをよ０罰の水に溶解
したもの（ｐＥ（乙、（１））に、、ｔｏｏｍｇのポリ
ピロリドンに−６０を１０ｏ−の水に溶解したものを加
えて水不溶性タンニンを得、これに前述のロイシン・ア
ミノペプチダーゼ（ＦＥＲＭＰ−／／≠５？）の精製酵
素標品夕θ■を０．　Ｏｊ　Ｍの酢酸緩衝液に溶解した
ものを吸着させたもの。

対照−３：前述のロイシン・アミノペプチダーゼ（ＦＢ
ＲＭ　　Ｐ−／／４１り）の精製酵素標品夕Ｏｍｇを、
２％アルギン酸ソーダ１０ｍ１に懸濁した後、注射器を
用いてよ％ＣａＣＬｚ溶液に滴下し球状に包括した固定
化酵素。

第１表に於いて酵素の漏出試験は、本発明１〜５及び対
照−３はガーゼで包み、又対照−２は透析チューブに入
れた後、これらを２ｊ時間θ、Ｏ！Ｍ酢酸アンモニウム
緩衝液（ｐＨ７０）に透析し、固定化酵素の透析前の活
性値を基に残存活性値を測定した 々お対照−１は、固定化されていない為漏出率の算出は
出来なかった。

又、残存酵素活性（４）は各試料を０．０　ｊ　Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ６，Ｏ）中で、７０℃１．２０分放置した
後、酵素活性を測定した値である。

なお残存酵素の活性値（イ）は、各試料を５０〜７０℃
に３０分間放置後、ロイシン−Ｐ−ニトロアニリドを基
質として中台の方法〔中台忠信：置所り。

タタ（／り７７年）〕で測定した活性値を対照−１の標
品と比較した値（イ）である。

−９−−＾＾ 第　　　　　１　　　　　表 第１表から明らかな如く、本発明に係る固定化酵素は、
対照試料の何れに比しても、酵素の漏出率、残存酵素活
性（７０℃、２０分加熱処理）共に著しく優れたもので
あることが認められた。

実施例２ タンニン酸３００■をｊＯｄの水に溶解したも　１０− のに、メチルセルロースフグを５Ｐθ℃の熱水２００ｙ
ｎｌに懸濁後冷却した液を、加え混合し、水不溶性タン
ニンを得た。

該水不溶性タンニンに、ナタ豆起源のウレアーゼ（タイ
プ■、シグマ社製）ｓｏｍグを夕℃で７時間攪拌するこ
とによシ吸着させた。

次に該酵素を吸着させた水不溶性タンニンを遠心分離し
つ＼０．ＯｊＭトリス緩衝液（ｐＨ’７：Ｏ）で２回洗
滌し、次いでこれを１１０℃の２襲力ツパーカラギーナ
ン溶液２０ｍ１に懸濁した後、注射器を用いて冷０．３
ＭＫＣｌ溶液に滴下し球状に包括された固定化酵素を得
た。

特許出願人　　キッコーマン株式会社 −１１− ５１０−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. タンニンに水溶性高分子物質、活性炭、キチン及びグル
   テンよシ選ばれた少なくとも７種を加えて得られる水不
   溶性タンニンに、酵素を吸着させた後、これを寒天、カ
   ラギーナン、アルギン酸塩、ゼラチン及び低メチル化ペ
   クチンよシ選ばれた少なくとも７種のゲル化担体で包括
   することを特徴とする酵素の固定化法。