JPH04211376A - フザリン酸耐性遺伝子 - Google Patents
フザリン酸耐性遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、フザリン酸分解もしく
はフザリン酸無毒化微生物よりクローン化したフザリン
酸耐性遺伝子、当該遺伝子を有するプラスミド、当該プ
ラスミドにより形質転換された宿主細胞、当該遺伝子の
塩基配列から明らかにされるアミノ酸配列を有するフザ
リン酸分解・無毒化に関係するタンパク質及びその製造
法並びに当該遺伝子又は蛋白質の利用に関する。 【０００２】 【従来の技術】植物がしおれて枯死する病気（萎凋病）
は、キュウリ、スイカ、メロンなどのウリ類、トマト、
ナスなどのナス科植物では深刻な病害である。萎凋病は
、土壌生息性のフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属糸状
菌によって引き起こされる病害である。フザリウム属糸
状菌による萎凋病に対しては、土壌殺菌や特定作物の連
作回避が唯一有効な防除法であるが、一般農家では技術
的にも経済的にも困難な点が多く、これらに代わる有効
な防除法はまだ確立されていない。 【０００３】フザリン酸（５−ｎ−ｂｕｔｙｌｐｉｃｏ
ｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）は、萎凋病を引き起こすフザリ
ウム属植物病原菌によって生産され、広く植物細胞に非
特異的に働く毒素として知られている（ Ｗｏｏｄ，Ｒ
．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， ” Ｐｈｙｔｏｔｏｘｉｎｓ
ｉｎ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ ”， Ａｃａ
ｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９
７２）． Ｄｕｒｂｉｎ， Ｒ．Ｄ．， ” Ｔｏｘｉ
ｎｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ ”，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８２）． Ｇａｕｍａｎｎ， Ｅ．， Ｐｈｙｔ
ｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ４７， ３４（１９５８））
。 フザリン酸の作用機構は確定していないが、トマト
カルス細胞やトマト枝葉において強い毒性を示すこと、
トマト細胞の原形質膜透過性を高め組織液の浸出を引き
起こして枯死作用を促進すること（松尾早見ら、「作物
のフザリウム病」、全国農村協会）、大麦における発芽
・発根の抑制作用（ Ｆｏｙ， Ｃ． Ｌ．ａｎｄ
Ｃｈａｎｇｅ， Ｉ．， Ａｄｖ． Ｐｅｓｔｉｃ
． Ｓｃｉ．， ３， ４９９ （１９７９））、真菌
・細菌に対する増殖抑制効果（ Ｋａｌｙａｍａｓｕｎ
ｄｒａｍ， Ｒ．， Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓ． Ｐｒ
ｏｂｌ．， １， １４２ （１９７０））などが知ら
れている。 【０００４】一方、フザリウム属糸状菌による病害に抵
抗性を示すトマトの品種が存在し、この抵抗性トマトの
植物組織内では、フザリン酸が代謝されＮ−メチルフザ
リン酸アミドに変換されており、このフザリン酸変換作
用はフザリン酸抵抗性の強い品種ほど大きい。 実際に
、このようなフザリン酸に抵抗性の植物体が、フザリウ
ム・オキスポリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏ
ｒｉｕｍ ）によって引き起こされる萎凋病に対して抵
抗性になることが示された（Ｓｈａｈｉｎ， Ｅ．Ａ．
ａｎｄ Ｓｐｉｒｅｙ， Ｒ．， Ｔｈｅｏｒ．Ａｐ
ｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ７３， １６４ （１９８６
）． Ｔｏｙｏｄａ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｈ
ｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ７８，１３０７ （１９
８８））。 【０００５】フザリン酸は単に植物に萎凋毒性を示すだ
けでなく、細菌等の微生物に対しても毒性を示すことが
知られている。 本発明者らは、土壌中よりフザリン酸
を含む培地上で生育できるフザリン酸耐性菌として、数
種の微生物を分離した。 これらフザリン酸耐性微生物
の分離方法、菌学的性質、フザリン酸耐性機構等につい
ては、特開昭 ６３−１９８９７４号、同６３−１９
８９８７号において詳しく開示されている。 上記フザ
リン酸耐性微生物の一つは、シュードモナス・セパシア
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｓｉａ）と同定さ
れ、フザリン酸分解能を有し、フザリン酸を唯一炭素源
として生育できる、すなわちフザリン酸資化能を有する
ことが明らかにされた。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】防除が非常に困難なフ
ザリウム属糸状菌による萎凋病等に対して、フザリウム
属糸状菌が産生する非特異的毒素であるフザリン酸を分
解・消失することができれば、フザリウム属糸状菌によ
る感染症の発現は回避されうると考えられる。この目的
のために、上記フザリン酸耐性微生物によって、フザリ
ン酸を分解し、無毒化することは有効な手段となりうる
。しかしながら、フザリン酸耐性微生物を、フザリウム
属糸状菌の感染によって植物体内に産生されるフザリン
酸と接触させることが、非常に困難となる。 【０００７】このような問題点を解決する手段として、
上記フザリン酸耐性微生物よりフザリン酸耐性遺伝子を
単離し、該遺伝子を植物体に導入・発現させることによ
り、フザリン酸を分解し、無毒化できる植物を育種する
ことがある。 このようなフザリン酸耐性能を有した植
物は、フザリウム属糸状菌による萎凋病の防除に有効な
手段となる。しかしながら、このような遺伝子工学的手
段を講じるためには、当該フザリン酸耐性遺伝子および
該遺伝子の構造についての知見が必要である。 【０００８】本発明は、フザリウム属糸状菌による萎凋
病などの植物病を防除するうえで有効な、微生物由来の
フザリン酸分解もしくはフザリン酸無毒化に関与する遺
伝子および該遺伝子の構造に関する知見を提供すること
にある。さらに、該遺伝子によってコードされるフザリ
ン酸分解ないしは無毒化に関係する蛋白質を提供するこ
とにある。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
問題点を解決すべく、鋭意研究を重ねた。 そしてその
結果、フザリン酸耐性遺伝子は、フザリン酸耐性微生物
、すなわちフザリン酸を含有する培地中で生育が可能で
あり、かつフザリン酸を分解もしくは植物に対して無毒
化しうる微生物に由来し、これらから取得できることを
見いだした。また、このフザリン酸耐性遺伝子からフザ
リン酸分解・無毒化に関係するペプチドが得られること
を見いだした。 【００１０】すなわち、本発明は、シュードモナス・セ
パシア由来のフザリン酸の分解ないしは無毒化に関係す
るタンパク質をコードするＤＮＡ断片の塩基配列、およ
び当該塩基配列から明らかにされるフザリン酸分解・無
毒化に関係するタンパク質のアミノ酸配列を提供するも
のである。さらに、本発明は、クレブシエラ・オキシト
ーカ由来のフザリン酸の分解・無毒化に関係するタンパ
ク質をコードするＤＮＡ断片および当該ＤＮＡ断片の制
限酵素地図を提供するものである。 【００１１】既に発明者らにより、いくつかの種類の細
菌や糸状菌がフザリン酸耐性微生物として見いだされて
いる。 例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ）属に属する微生物およびクレブシエラ（Ｋｌｅｂ
ｓｉｅｌｌａ）属に属する微生物が知られている。本発
明で用いるフザリン酸耐性微生物のうち、シュードモナ
ス属に属する微生物としては、シュードモナス・セパシ
ア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｓｉａ）、特に
シュードモナス・セパシアＵＫ−１株（微工研条寄第１
３８５号）が好適である。 クレブシエラ属に属する微
生物としてはクレブシエラ・オキシトーカ（Ｋｌｅｂｓ
ｉｅｌｌａｏｘｙｔｏｃａ）、特にクレブシエラ・オキ
シトーカＨＹ−１株（微工研条寄第３２２１号）が好適
である。 上記微生物の菌学的性質、培養条件およびフザリン酸の
分解ないし無毒化については、特開昭６３−１９８９７
４号、特願平２−２２９５７号に詳しく開示されている
。 【００１２】シュードモナス・セパシアＵＫ−１株はフ
ザリン酸を分解・無毒化し、フザリン酸を唯一炭素源と
して生育できる。 また、クレブシエラ・オキシトーカ
ＨＹ−１株は、フザリン酸を分解・無毒化することはで
きるが、フザリン酸を唯一炭素源として生育することは
できない。 【００１３】本発明のフザリン酸耐性遺伝子は、上記フ
ザリン酸分解もしくは無毒化能を有する微生物の遺伝子
ライブラリーを大腸菌を宿主として作成し、該遺伝子ラ
イブラリーよりフザリン酸耐性の大腸菌組換え体をスク
リーニングすることにより取得できる。 通常、遺伝子
ライブラリーは、当該微生物の菌体より単離したＤＮＡ
を適当な制限酵素で切断した後、ベクターに挿入し、得
られた組換えプラスミドにより大腸菌を形質転換するこ
とにより作成する。 宿主大腸菌はフザリン酸を含む培
地中では生育できないので、フザリン酸の分解ないしは
無毒化に関与する遺伝子を含む大腸菌組換え体だけが当
該培地上で生育可能となる。 【００１４】このようにして得られたフザリン酸耐性の
大腸菌組換え体よりプラスミドを回収して、その挿入Ｄ
ＮＡ断片の制限酵素地図を作成する。 この制限酵素地
図をもとに、当該挿入ＤＮＡ断片を各種制限酵素で切断
して得られたＤＮＡ断片をベクターに挿入後、大腸菌を
形質転換してフザリン酸耐性を示すクローンを選択する
。 フザリン酸耐性を示すクローンのうち、挿入ＤＮＡ
断片が最も短いものについてその全塩基配列を決定する
。 【００１５】このようにして決定された塩基配列を解析
することにより、タンパク質をコードしている領域（Ｏ
ＲＦ：オープンリーデイングフレーム）を推定し、各Ｏ
ＲＦがコードしているタンパク質のアミノ酸配列を推測
する。 さらに、各ＯＲＦ中に存在する制限酵素切断部
位を当該制限酵素で切断後、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）
酵素で切断点を平滑末端にした後、各ＯＲＦの平滑断片
を再結合することにより各ＯＲＦの読み枠をずらした変
異体遺伝子を作成する。これらの変異体遺伝子で形質転
換した大腸菌はいずれもフザリン酸耐性を消失すること
から、上記各ＯＲＦがフザリン酸の分解・無毒化に関係
するタンパク質をコードしていることを確認できる。 【００１６】由来微生物としてシュードモナス・セパシ
アを用い、上記の様にして決定された、フザリン酸耐性
関連塩基配列およびこれから導かれるアミノ酸配列の一
例は次の通りである。 （塩基配列） 【化１１】 【化１２】 【化１３】 【化１４】 【化１５】 （アミノ酸配列） 【化１６】 【化１７】 【化１８】 【化１９】 【化２０】 但し、式（Ｉ）ないし（Ｖ）中のアルファベットは、下
のアミノ酸を示す。Ａ：アラニン、Ｃ：システイン、Ｄ
：アスパラギン酸、Ｅ：グルタミン酸、Ｆ：フェニルア
ラニン、Ｇ：グリシン、Ｈ：ヒスチジン、Ｉ：イソロイ
シン、Ｋ：リシン、Ｌ：ロイシン、Ｍ：メチオニン、Ｎ
：アスパラギン、Ｐ：プロリン、Ｑ：グルタミン、Ｒ：
アルギニン、Ｓ：セリン、Ｔ：スレオニン、Ｖ：バリン
、Ｗ：トリプトファン、Ｙ：チロシン。 【００１７】得られたフザリン酸の分解・無毒化に関与
する遺伝子およびそれらの遺伝子の構造を基に、当該遺
伝子を植物細胞で機能するプロモーターとターミネータ
ーの間に挿入し、植物細胞を形質転換することによりフ
ザリン酸耐性の植物細胞を得ることができる。さらにこ
の形質転換された植物細胞を植物体まで再生させること
により、フザリン酸耐性の植物体を得ることができる。 このようにして得られたフザリン酸耐性の植物はフザリ
ウム属糸状菌による病害に抵抗性となるので、現在、防
除が非常に困難な当該糸状菌による萎凋病等に対する有
効な防除法となる。また、当該フザリン酸の分解・無毒
化に関与する遺伝子によって形質転換された植物細胞は
フザリン酸耐性となるので、植物細胞を形質転換する際
の選択マーカーとしても利用できる。 植物細胞は公知
の方法、例えば、Ｔｉプラスミドを利用した方法（「続
生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、２０５頁、日
本生化学会編、１９８６年、東京化学同人）あるいは遺
伝子直接導入法（同書、２１１頁）に従って形質転換す
ることができる。 【００１８】さらに、フザリン酸耐性遺伝子の構造が明
らかにされることにより、フザリン酸分解ないしはフザ
リン酸無毒化に関係する蛋白質の構造も明らかになり、
当該蛋白質を遺伝子工学的手法により大量生産し、フザ
リウム属糸状菌による萎稠病などの防除に役立てること
ができる。 【００１９】 【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。 実 施 例 １ 遺伝子ライブラリーの作成：シュードモナス・セパシア
ＵＫ−１株より常法により全ＤＮＡを単離した。細菌Ｄ
ＮＡの単離法としては、例えばサイトウ・ミウラ法（Ｓ
ａｉｔｏ， Ｈ． ａｎｄ Ｍｉｕｒａ，Ｋ．， Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ７２，
６１９ （１９６３））が挙げられる。 分離したＤ
ＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、アガロース電気泳
動により分画し、４ｋｂ以上のＤＮＡ断片を回収した。 この回収したＤＮＡ断片と、ＥｃｏＲＩで切断後、フ
ォスファターゼ処理したベクターｐＵＣ１９とをＴ４リ
ガーゼを用いて結合し、これで大腸菌ＪＭ１０９を形質
転換して、アンピシリン耐性形質転換体としてシュード
モナス・セパシアの遺伝子ライブラリーを作成した。 【００２０】クレブシエラ・オキシトーカＨＹ−１株に
ついても、上記記載の方法と同様の方法により遺伝子ラ
イブラリーを作成した。 但し、制限酵素ＢａｍＨＩ／
ＨｉｎｄＩＩＩで切断したＤＮＡ断片をベクターｐＵＣ
１９に挿入した。 【００２１】実 施 例 ２ 遺伝子ライブラリーのスクリーニング：アンピシリン５
０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地に形成させた上記遺伝子ラ
イブラリーのコロニーを、二次選択培地（アンピシリン
５０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ １ｍＭ、フザリン酸 １
００μｇ／ｍｌを含むデイビス最小培地）にレプリカし
、フザリン酸耐性のクローンを選択した。シュードモナ
ス・セパシアの遺伝子ライブラリーからは、プラスミド
ｐＢＥ１を持つクローンが選択された。 ｐＢＥ１は、
シュードモナス・セパシア由来の８．５ｋｂのＤＮＡ断
片をＥｃｏＲＩ切断部位に挿入断片として有する。 な
お、ｐＢＥ１を含む大腸菌ＪＭ１０９は、エシェリヒア
・コリ ＳＡＭ １５５２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＳＡＭ １５５２）と命名され、工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１１３１７号（
ＦＥＲＭ Ｐ−１１３１７）として寄託されている。 【００２２】クレブシエラ・オキシトーカの遺伝子ライ
ブラリーからは、プラスミドｐＦＡＲ１を持つクローン
が選択された。 ｐＦＡＲ１は、クレブシエラ・オキシ
トーカ由来の、３．６ｋｂのＤＮＡ断片をＢａｍＨ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ切断部位に挿入断片として有する。 なお
、ｐＦＡＲ１を含む大腸菌ＪＭ１０９は、エシェリヒア
・コリ ＳＡＭ １５５３（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＳＡＭ １５５３）と命名され、工業技術院
微生物工業研究所に微工研菌寄第１１３１８号（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１１３１８）として寄託されている。 【００２３】実 施 例 ３ 制 限 酵 素 地 図 ：プラスミドｐＢＥ１および
ｐＦＡＲ１を各種制限酵素で切断し、アガロース電気泳
動により切断ＤＮＡ断片の大きさを測定して、制限酵素
地図を作成した。図１に上記プラスミドの挿入ＤＮＡ断
片の制限酵素地図を示した。なお、ｐＢＥ１の８．５ｋ
ｂ挿入ＤＮＡ断片を逆向きに挿入したｐＢＥ１１を持つ
大腸菌はフザリン酸耐性を消失すること、またｐＢＥ１
を持つ大腸菌でもＩＰＴＧ非存在下ではやはりフザリン
酸耐性を消失することから、フザリン酸分解・無毒化遺
伝子はベクターｐＵＣ１９上に存在するｌａｃプロモー
ターの制御下で発現し、その転写・翻訳の方向は図１中
左から右であることがわかった。一方、ｐＦＡＲ１の３
．６ｋｂ挿入ＤＮＡ断片を逆向きに挿入したｐＦＡＲ２
を持つクローンもフザリン酸耐性能を有することから、
フザリン酸分解・無毒化遺伝子は３．６ｋｂ挿入ＤＮＡ
断片上に存在するクレブシエラ・オキシトーカ由来のプ
ロモーターの制御下で発現していると考えられる。 【００２４】実 施 例 ４ サブクローニング−フザリン酸耐性遺伝子のマッピング
：上記制限酵素地図をもとに各種欠失プラスミドを作成
し、該欠失プラスミドで形質転換した大腸菌のフザリン
酸耐性を調べることにより、フザリン酸耐性遺伝子の位
置をより詳細に決定した。 また、この結果をもとにフ
ザリン酸遺伝子のサブクローニングを行った。シュード
モナス・セパシア由来の８．５ｋｂ ＥｃｏＲＩ挿入断
片を有するプラスミドｐＢＥ１の欠失プラスミドと、こ
れらのプラスミドによって形質転換された大腸菌ＪＭ１
０９のフザリン酸耐性については、図２に示した。 な
お、ｐＢＥ１で形質転換された大腸菌は、５００μｇ／
ｍｌのフザリン酸を含む培地で生育可能であることがわ
かったので、以後、フザリン酸耐性は５００μｇ／ｍｌ
のフザリン酸を含むデイビス最小培地（アンピシリン
５０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ １ｍＭを含む）での生育で
検定した。 【００２５】図１に示すプラスミドｐＢＥ１のＥｃｏＲ
Ｉ挿入断片中、６．４ｋｂ付近に唯一存在するＳｔｕＩ
サイトで切断後、ＳａｃＩリンカー（５’−ＣＧＡＧＣ
ＴＣＧ−３’）を挿入することによって、以後の読み枠
をずらしたプラスミドｐＢＥ−ｔａを作成した。 プラ
スミドｐＢＥ−ｔａをＳａｃＩで切断して生じた６．４
ｋｂのＳａｃＩ断片をベクターｐＵＣ１９のＳａｃＩサ
イトに挿入したプラスミドをｐＢＡＡ１とした。 次に
、プラスミドｐＢＡＡ１の左側から１ｋｂの所（図２参
照）と、ベクターｐＵＣ１９のマルチクローニングサイ
トに存在する ＳｍａＩサイトの間を欠失させたプラス
ミドｐＢＡＭを作成した。これらのプラスミドで大腸菌
ＪＭ１０９を形質転換し、フザリン酸耐性を調べたとこ
ろ、ｐＢＥ１−ｔａおよびｐＢＡＡ１の形質転換体はフ
ザリン酸耐性を示したが、プラスミドｐＢＡＭによる形
質転換体はフザリン酸耐性を示さなかった。 【００２６】また、プラスミドｐＢＡＡ１中に存在する
数カ所のＳｐｈＩサイトを利用して、各種欠失プラスミ
ドを作成した。 ｐＢＡＡ１を制限酵素ＳｐｈＩで部分
分解した後、Ｔ４リガーゼで再結合して、大腸菌ＪＭ１
０９を形質転換した。 形質転換体のうちフザリン酸耐
性を示すクローンからプラスミドを回収して、その制限
酵素地図を調べたところ、プラスミドｐＢＡＡ１の右側
に存在する約１．０ｋｂのＳｐｈＩ断片（図２参照）が
欠失したプラスミドｐＫＬＲ１が見いだされた。さらに
、プラスミドｐＢＡＡ１を制限酵素ＸｈｏＩで部分分解
し、再結合することによって、ｐＢＡＡ１の右側の約１
．３ｋｂが欠落したプラスミドｐＦＺＲ１が得られた。 このｐＦＺＲ１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は
フザリン酸耐性能を消失した。 【００２７】以上の結果から、シュードモナス・セパシ
ア由来の８．５ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片中、左側のＥｃｏ
ＲＩサイトから５．４ｋｂにあるＳｐｈＩサイトまでが
、フザリン酸耐性を示す必須領域であることがわかった
（図２参照）。 【００２８】実 施 例 ５ 塩 基 配 列 の 決 定 ：シュードモナス・セパ
シア由来のフザリン酸耐性遺伝子をコードするＤＮＡ断
片の塩基配列を決定した。 塩基配列を決定した部分は
、プラスミドｐＢＥ１の８．５ｋｂＥｃｏＲＩ断片中、
ＥｃｏＲＩサイトからＡｃｃＩサイトまでの約 ７．
０ｋｂ（図３参照）で、実施例３で述べたフザリン酸耐
性遺伝子をコードしている。 塩基配列の決定は、まず
７．０ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＡｃｃＩ断片を、図１に示し
た制限酵素地図を基に各種制限酵素で切断して、生成す
るＤＮＡ断片をファージＭ１３にクローン化した。 こ
こで、図３に示すように各ＤＮＡ断片は互いに重複する
ようになっている。 各断片をクローン化したファージ
Ｍ１３を大腸菌ＪＭ１０９に感染させ、二本鎖ＤＮＡを
調製した。 【００２９】これらの二本鎖ＤＮＡを大腸菌エキソヌク
レアーゼＩＩＩと反応させ、一方向に欠失が導入された
二本鎖ＤＮＡを調製した。エキソヌクレアーゼＩＩＩを
利用した一方向欠失挿入プラスミドの作成法に関しては
、「続生化学実験講座、第１巻、遺伝子研究法ＩＩ」の
２８９−３０５頁に詳しく記載されている。 前記の方
法により得られた一方向に欠失が挿入された各二本鎖Ｄ
ＮＡを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換して、一方向に欠失
が挿入されたファージクローンを作成した。 各ファー
ジクローンから二本鎖ＤＮＡを調製して、制限酵素によ
る切断パターンから欠失の程度を調べ、適当なクローン
から一本鎖ファージＤＮＡを調製した。 これら一本鎖
ファージＤＮＡを鋳型として、ジデオキシ法（Ｓａｎｇ
ｅｒ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７４， ５４６
３ （１９７７））によって塩基配列を決定した。 各
クローンの塩基配列をつなぎ合わせることにより、各Ｄ
ＮＡ断片の塩基配列を決定し、さらに各ＤＮＡ断片の塩
基配列をつなぎ合わせることにより、７．０ｋｂのＥｃ
ｏＲＩ／ＡｃｃＩ断片全体の塩基配列を決定した。 【００３０】また、クレブシエラ・オキシトーカ由来の
フザリン酸耐性遺伝子をコードするＤＮＡ断片の塩基配
列も決定した。 塩基配列を決定した部分は、プラスミ
ドｐＦＡＲ１のＢａｍＨＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの３
．６ｋｂ（図１参照）で、前記のシュードモナス・セパ
シア由来のフザリン酸耐性遺伝子の場合と同様にして、
一方向に欠失が挿入された一本鎖ファージの塩基配列を
決定し、それらをつなぎあわせることにより３．６ｋｂ
ＤＮＡ断片全体の塩基配列を決定した。 【００３１】実 施 例 ６ 塩 基 配 列 の 解 析 ：シュードモナス・セパ
シア由来の７．０ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＡｃｃＩ断片は
７００６塩基対からなるが、そのうちＥｃｏＲＩから
ＳｐｈＩまでのフザリン酸耐性を示す最小領域の全塩基
配列（５４３７塩基対）を図４〜図８に示した。 【００３２】この塩基配列中のタンパク質をコードでき
る領域として、開始コドン（ＡＴＧないしＧＴＧ）で始
まり終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧないしＴＧＡ）で終わ
るオープンリーデイング・フレーム（ＯＲＦ： Ｏｐｅ
ｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）を探索した。 プラ
スミドｐＢＥ１の８．５ｋｂＥｃｏＲＩ断片を逆向きに
挿入したプラスミドｐＢＥ１１の形質転換体はフザリン
酸耐性を示さないことから、ＯＲＦの向きは図９中左か
ら右側方向とした。２５０塩基対以上のＯＲＦとして１
０個のＯＲＦが見いだされたが（図９参照）、これらの
内、開始コドンＡＴＧの直前にリボソームと結合できる
ＳＤ配列（Ｓｈｉｎｅ， Ｊ． ａｎｄ Ｄａｌｇａｒ
ｎｏ， Ｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，２５４， ３４−３８
（１９７５））を有し、かつ互いに重複しないＯＲＦと
して、ＯＲＦ３−１；５３１→１８３０（５３１番目の
開始コドンＡＴＧから始まり、１８３０番目の終止コド
ンで終わることを示す、以下同じ）、ＯＲＦ２−２；１
８４７→２２７３、ＯＲＦ１−２；２３１４→３３５２
、ＯＲＦ３−２；３４１４→４０３８およびＯＲＦ３−
３；４４７３→４９７７の５つのＯＲＦをフザリン酸耐
性に関係するタンパク質のＯＲＦと推定した。 【００３３】また、５１２５塩基から５１５７塩基の間
には安定なヘアピン構造をとり、転写のターミネイター
として機能しうるインバーテイド・リピート（逆方向反
復配列）構造が認められる。 【００３４】更に、クレブシエラ・オキシトーカ由来の
３．６ｋｂ ＤＮＡ断片の全塩基配列を図１１〜図
に示した。 この塩基配列中、タンパク質をコード
する領域として、開始コドン（ＡＴＧないしＧＴＧ）で
始まり、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧないしＴＧＡ）で
終わるＯＲＦを探索した。 ３００塩基対以上のＯＲＦ
として、両方向に計７個のＯＲＦが見出された。 【００３５】実 施 例 ７ オープンリーデイングフレームの確認：実施例６に示し
たシュードモナス・セパシアのＯＲＦが実際にフザリン
酸耐性に関与するタンパク質をコードしているかを以下
の方法で確認した。 決定された塩基配列から、詳細な
制限酵素地図を作成した。プラスミドｐＢＥ１などを適
当な制限酵素サイトで切断後、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ
）酵素で処理して平滑末端にし、再結合することにより
、切断点以降の読み枠をずらした変異プラスミドを作成
した。 これらの変異プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転
換し、形質転換体のフザリン酸耐性を調べることにより
、変異を導入した部位に存在するＯＲＦがフザリン酸耐
性に必要かを調べた。 図９にその結果を示した。 【００３６】プラスミドｐＢＥ１の８．５ｋｂＥｃｏＲ
Ｉ挿入断片中には、制限酵素ＢｓｔＰＩによる切断サイ
ト（１８２８；切断部位の塩基対の番号を示す）が唯一
箇所存在する。ｐＢＥ１を制限酵素ＢｓｔＰＩで切断後
、クレノー酵素で平滑末端して ＥｃｏＲＩリンカー（
５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣ−３’）を挿入したプラスミド
ｐＢＥ１−ｓｃを作成した。 プラスミドｐＢＥ１−ｓ
ｃをＥｃｏＲＩで切断して得られる１．８ｋｂおよび６
．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の各々を、ベクターｐＵＣ
１９に挿入したプラスミドｐＳＣ−１８１およびｐＳＣ
−６７１を作成した。 【００３７】プラスミドｐＢＥ１の８．５ｋｂＥｃｏＲ
Ｉ挿入断片中には制限酵素ＳｍａＩの切断サイト（１０
３４）が唯一存在する。 ＳｍａＩサイトはベクターｐ
ＵＣ１９のマルチクローニングサイトにもう一箇所存在
するので、ｐＢＥ１−ｔａを ＳｍａＩで部分分解
後、アガロース電気泳動法により分画してｐＢＥ１が直
鎖状になったＤＮＡ分子を回収した。 この直鎖状ＤＮ
Ａ分子とＥｃｏＲＩリンカー （５’−ＧＧＡＡＴＴＣ
Ｃ−３’）と混合して、Ｔ４リガーゼで結合した後、大
腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。 形質転換体からプラ
スミドを調製し制限酵素で切断して解析した結果、上記
１０３６塩基対目のＳｍａＩサイトにＥｃｏＲＩリンカ
ーが挿入されたプラスミドをｐＴＡ−Ｓ１とした。 【００３８】プラスミドｐＢＥ１の挿入ＤＮＡ断片中に
は２箇所のＡｐａＩサイト（１０３１、１９２０）が存
在する。 プラスミドｐＢＥ１−ｔａを制限酵素ＡｐａＩで部分
分解し、前記の方法により直鎖状ＤＮＡ分子を回収して
切断末端をクレノー酵素により平滑末端にした後、Ｔ４
リガーゼで再結合することによりそれ以降の読み枠をず
らした変異プラスミドを作成した。 １０３１番目のＡ
ｐａＩサイトで読み枠のずれたプラスミドをｐＴＡ−Ａ
１、１９２０番目のＡｐａＩサイトで読み枠のずれたプ
ラスミドをｐＴＡ−Ａ２とした。 制限酵素ＰｓｔＩの
サイトは、挿入ＤＮＡ中に５箇所（８９７、２９２６、
３９２１、４５４４、４７４０）存在するが、これらの
ＰｓｔＩサイトを利用して上記の方法により読み枠のず
れた変異プラスミドｐＴＡ−Ｐ２ （２９２６）、
ｐＴＡ−Ｐ３（３９２１）、ｐＴＡ−Ｐ４（４５４４）
およびｐＴＡ−Ｐ５（４７４０）を作成した（カッコ内
の数字は読み枠をずらした場所の塩基番号を示 す）。 これらのプラスミドでは各挿入断片中のＯＲＦの向き
が、ベクターｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターと同一方
向に挿入されている。 このようにして作成した変異プ
ラスミドで形質転換した大腸菌ＪＭ１０９のフザリン酸
耐性を調べたところ、プラスミドｐＢＥ１−ｓｃで形質
転換した大腸菌はフザリン酸耐性であったのに対して、
その他のプラスミド（ｐＳＣ１８１、ｐＳＣ６７１、ｐ
ＴＡ−Ｓ１、ｐＴＡ−Ａ１、ｐＴＡ−Ａ２、ｐＴＡ−Ｐ
２、ｐＴＡ−Ｐ３、ｐＴＡ−Ｐ４およびｐＴＡ−Ｐ５）
で形質転換した大腸菌はフザリン酸耐性を示さなかった
（図９）参照。 【００３９】制限酵素ＳｍａＩ（１０３４）にＥｃｏＲ
Ｉリンカーを挿入したり、ＡｐａＩサイト（１０３１）
で読み枠をずらした場合はフザリン酸耐性が消失するこ
とから、ＯＲＦ１−１（３０１→５８６）およびＯＲＦ
２−１（３６８→９５９）はフザリン酸耐性には関与し
ていないが、ＯＲＦ３−１（４５９→１８３７）は、フ
ザリン酸耐性に関与していることが明らかになった（Ｏ
ＲＦの後の括弧内の数字は翻訳開始コドンおよび終止コ
ドンの塩基番号を示し、制限酵素の後の括弧内の数字は
切断箇所の塩基番号を示す）。 ＯＲＦ３−１中のＳｍ
ａＩサイト（１０３１）の上流には４つの開始コドンＡ
ＴＧがあるが、このうち直前にＳＤ配列が認められる５
３１番目のＡＴＧを開始コドンとし、このＯＲＦをコー
ドする遺伝子をｆａｄＡとした（図９参照）。
【００４０】制限酵素ＢｓｔＰ１（１８２８）は、ＯＲ
Ｆ３−１の終止コドン（１８３０）の直後でＯＲＦ２−
２の開始コドン（１８４７）の直前を切断するが、この
ＢｓｔＰＩサイトにＥｃｏＲＩリンカーを挿入して読み
枠をずらした場合はフザリン酸耐性が存続する。 さら
に、ＡｐａＩサイト（１９２０）およびＰｓｔＩサイト
（２９２６）で読み枠をずらすとフザリン酸耐性が消失
することから、ＯＲＦ２−２（１８４７→２２７３）お
よびＯＲＦ１−２（１７０８→３３５２）の２３１４塩
基にあるＡＴＧ以降がフザリン酸耐性に必要であること
が明らかになった。 これらのＯＲＦをコードする遺伝
子を各々ｆａｄＢ（１８４７→２２７３）、ｆａｄＣ（
２３１４→３３５２）とした（図９参照）。 ｆａｄＢ
およびｆａｄＣのいずれも開始コドンの直前にＳＤ配列
が認められる。また、ＰｓｔＩサイト（３９２１、４５
４４、４７４０）で読み枠をずらした場合はフザリン酸
耐性が消失すること、および開始コドンの直前にあるＳ
Ｄ配列の存在から、ｆａｄＤ（３４１４→４０３８）お
よびｆａｄＥ（４４７３→４９７７）をフザリン酸耐性
に必要なタンパク質をコードする領域とした。 【００４１】以上の結果をまとめると、フザリン酸耐性
には５つのタンパク質が必要であり、それらタンパク質
をコードする遺伝子として各々ｆａｄＡ、ｆａｄＢ、ｆ
ａｄＣ、ｆａｄＤおよびｆａｄＥが明らかになった。
これらの遺伝子の塩基配列から推測されるタンパク質の
アミノ酸配列を図４〜図８に示した。 また、当該タン
パク質の予想分子量は、各々４５．７ｋｄ（キロダルト
ン）、３７．９ｋｄ、２３．０ｋｄ、１８．５ｋｄおよ
び１４．８ｋｄであった。 この値は、実施例８に述べ
る細菌無細胞抽出液による試験管内転写・翻訳産物の分
子量とよく一致した。 【００４２】更に、実施例６に示したクレブシエラ・オ
キシトーカ由来の３．６ｋｂ ＤＮＡ断片中に存在する
７個のＯＲＦの内、どのＯＲＦが実際にフザリン酸耐性
に関与するタンパク質にコードしているかを、前記シュ
ードモナス・セパシアの場合と同様な方法で調べた。
すなわち、プラスミドｐＦＡＲ１において、各種の欠失
プラスミドおよび読み枠をずらせた変異プラスミドを作
成した。 作成したプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形
質転換し、形質転換体のフザリン酸耐性を調べることに
より、欠失ないし変異を導入した部分に存在するＯＲＦ
がフザリン酸耐性に必要かを調べた。 その結果、フザ
リン酸耐性には３つのタンパク質が必要であり、それら
のタンパク質をコードする遺伝子としてｆｄｔ１、ｆｄ
ｔ２およびｆｄｔ３が明かとなった。 これら３つの遺
伝子のそれぞれの開始コドンの直前には、リボソームと
結合できるＳＤ配列が認められた。 これらの遺伝子に
コードされるタンパク質のアミノ酸配列を図１１〜図１
３に示した。 【００４３】実 施 例 ８ 試験管内転写・翻訳産物の解析：実施例７において同定
した各遺伝子の転写・翻訳産物が実際に存在することを
、転写と翻訳が共役した細菌無細胞抽出液（ＤｅＶｒｉ
ｅｓ， Ｊ．Ｋ． ａｎｄ Ｚｕｂａｙ， Ｇ．， Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，
５７， ２６７ （１９６７））による遺伝子産物の
解析によって確認した。 試験管内での転写・翻訳の反
応は、原核ＤＮＡ依存翻訳キット（Ｐｒｏーｋａｒｙｏ
ｔｉｃ ＤＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｒａｎｓｌａｔ
ｉｏｎ ｋｉｔ、アマシャム社製）用い、キットの指示
書どうりに行った。 鋳型として用いたＤＮＡはフザリ
ン酸耐性を示すプラスミドｐＢＥ１−ｓｃおよび対照と
して上記キットに含まれるプラスミドｐＡＴ１５３を用
いた。 【００４４】プラスミドＤＮＡ ２．５μｇに、サプリ
メント液 ７．５μｌ、アミノ酸液 ３μｌ、Ｌ−［３
５Ｓメチオニン］２μｌ（１．１１ＭＢｑ）およびＳ−
３０抽出液 ５μｌを順次加え、よく混合した後、３７
℃で１時間保温した。 メチオニンチェース液を５μｌ
加えて３７℃で５分間保温した後、氷冷して反応を停止
させた。 反応液 ６μｌに等量の２倍濃度のサンプル
緩衝液を加え、９５℃で５分間処理した後、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法によりタンパク質を分
画した。 ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法は、
ラミリーらの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ．， Ｎ
ａｔｕｒｅ， ２２７， ６８０ （１９７０））に従
って行い、ゲル濃度は１５％とした。電気泳動後のゲル
をゲルドライヤーで乾燥し、オートラジオグラフィーを
行って、試験管内転写・翻訳産物の解析を行った。 【００４５】図１０に示したように、フザリン酸耐性を
示すプラスミドｐＢＥ１−ｔａを鋳型とした転写・翻訳
産物には、対照としたプラスミドｐＡＴ１５３を鋳型と
した場合のβ−ラクタマーゼに相当するバンド以外に、
５つのバンドが認められた。これらの５つのバンドに対
応するタンパク質の分子量を、同時に泳動した分子量マ
ーカーの泳動距離から推定すると、４７ｋｄ、３８ｋｄ
、２３ｋｄ、１８．５ｋｄおよび１５ｋｄとなった。
この分子量は、実施例７において記載したフザリン酸耐
性に関与する５つの遺伝子、ｆａｄＡ、ｆａｄＣ、ｆａ
ｄＤ、ｆａｄＥおよびｆａｄＢによってコードされるタ
ンパク質の予想分子量と各々よく一致した。 【００４６】この結果から、シュードモナス・セパシア
由来のフザリン酸耐性遺伝子によって形質転換された大
腸菌中では、上記５つのフザリン酸耐性遺伝子群が発現
し、該形質転換大腸菌をフザリン酸耐性にしていること
が明らかになった。 【００４７】 【発明の効果】本発明によれば、シュードモナス・セパ
シア由来のフザリン酸耐性遺伝子を含む５．４ｋｂのＤ
ＮＡ断片の全塩基配列を決定し、当該フザリン酸耐性遺
伝子構造、さらにはタンパク質構造（アミノ酸配列）が
明らかになった。また、クレブシエラ・オキシトーカ由
来のフザリン酸耐性遺伝子を含む、 ３．６ｋｂ
ＤＮＡ断片についても、その全塩基配列を決定し、遺伝
子構造、更にはタンパク質構造（アミノ酸配列）が明ら
かにされた。 【００４８】これらのフザリン酸耐性遺伝子を植物細胞
に導入することにより、フザリン酸耐性の植物を得るこ
とができる。このようにして得られるフザリン酸耐性の
植物は、フザリウム属糸状菌による萎凋病等に抵抗性と
なるので、当該糸状菌による病害防除上の問題点が解消
される。 【００４９】また、当該フザリン酸耐性遺伝子によって
コードされるフザリン酸分解ないしは無毒化に関係する
蛋白質を、遺伝子工学的手法により大量生産し、フザリ
ウム属糸状菌等による病害防除に役立てることもできる
。
はフザリン酸無毒化微生物よりクローン化したフザリン
酸耐性遺伝子、当該遺伝子を有するプラスミド、当該プ
ラスミドにより形質転換された宿主細胞、当該遺伝子の
塩基配列から明らかにされるアミノ酸配列を有するフザ
リン酸分解・無毒化に関係するタンパク質及びその製造
法並びに当該遺伝子又は蛋白質の利用に関する。 【０００２】 【従来の技術】植物がしおれて枯死する病気（萎凋病）
は、キュウリ、スイカ、メロンなどのウリ類、トマト、
ナスなどのナス科植物では深刻な病害である。萎凋病は
、土壌生息性のフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属糸状
菌によって引き起こされる病害である。フザリウム属糸
状菌による萎凋病に対しては、土壌殺菌や特定作物の連
作回避が唯一有効な防除法であるが、一般農家では技術
的にも経済的にも困難な点が多く、これらに代わる有効
な防除法はまだ確立されていない。 【０００３】フザリン酸（５−ｎ−ｂｕｔｙｌｐｉｃｏ
ｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）は、萎凋病を引き起こすフザリ
ウム属植物病原菌によって生産され、広く植物細胞に非
特異的に働く毒素として知られている（ Ｗｏｏｄ，Ｒ
．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， ” Ｐｈｙｔｏｔｏｘｉｎｓ
ｉｎ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ ”， Ａｃａ
ｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９
７２）． Ｄｕｒｂｉｎ， Ｒ．Ｄ．， ” Ｔｏｘｉ
ｎｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ ”，Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８２）． Ｇａｕｍａｎｎ， Ｅ．， Ｐｈｙｔ
ｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ４７， ３４（１９５８））
。 フザリン酸の作用機構は確定していないが、トマト
カルス細胞やトマト枝葉において強い毒性を示すこと、
トマト細胞の原形質膜透過性を高め組織液の浸出を引き
起こして枯死作用を促進すること（松尾早見ら、「作物
のフザリウム病」、全国農村協会）、大麦における発芽
・発根の抑制作用（ Ｆｏｙ， Ｃ． Ｌ．ａｎｄ
Ｃｈａｎｇｅ， Ｉ．， Ａｄｖ． Ｐｅｓｔｉｃ
． Ｓｃｉ．， ３， ４９９ （１９７９））、真菌
・細菌に対する増殖抑制効果（ Ｋａｌｙａｍａｓｕｎ
ｄｒａｍ， Ｒ．， Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓ． Ｐｒ
ｏｂｌ．， １， １４２ （１９７０））などが知ら
れている。 【０００４】一方、フザリウム属糸状菌による病害に抵
抗性を示すトマトの品種が存在し、この抵抗性トマトの
植物組織内では、フザリン酸が代謝されＮ−メチルフザ
リン酸アミドに変換されており、このフザリン酸変換作
用はフザリン酸抵抗性の強い品種ほど大きい。 実際に
、このようなフザリン酸に抵抗性の植物体が、フザリウ
ム・オキスポリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏ
ｒｉｕｍ ）によって引き起こされる萎凋病に対して抵
抗性になることが示された（Ｓｈａｈｉｎ， Ｅ．Ａ．
ａｎｄ Ｓｐｉｒｅｙ， Ｒ．， Ｔｈｅｏｒ．Ａｐ
ｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ７３， １６４ （１９８６
）． Ｔｏｙｏｄａ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｈ
ｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ７８，１３０７ （１９
８８））。 【０００５】フザリン酸は単に植物に萎凋毒性を示すだ
けでなく、細菌等の微生物に対しても毒性を示すことが
知られている。 本発明者らは、土壌中よりフザリン酸
を含む培地上で生育できるフザリン酸耐性菌として、数
種の微生物を分離した。 これらフザリン酸耐性微生物
の分離方法、菌学的性質、フザリン酸耐性機構等につい
ては、特開昭 ６３−１９８９７４号、同６３−１９
８９８７号において詳しく開示されている。 上記フザ
リン酸耐性微生物の一つは、シュードモナス・セパシア
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｓｉａ）と同定さ
れ、フザリン酸分解能を有し、フザリン酸を唯一炭素源
として生育できる、すなわちフザリン酸資化能を有する
ことが明らかにされた。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】防除が非常に困難なフ
ザリウム属糸状菌による萎凋病等に対して、フザリウム
属糸状菌が産生する非特異的毒素であるフザリン酸を分
解・消失することができれば、フザリウム属糸状菌によ
る感染症の発現は回避されうると考えられる。この目的
のために、上記フザリン酸耐性微生物によって、フザリ
ン酸を分解し、無毒化することは有効な手段となりうる
。しかしながら、フザリン酸耐性微生物を、フザリウム
属糸状菌の感染によって植物体内に産生されるフザリン
酸と接触させることが、非常に困難となる。 【０００７】このような問題点を解決する手段として、
上記フザリン酸耐性微生物よりフザリン酸耐性遺伝子を
単離し、該遺伝子を植物体に導入・発現させることによ
り、フザリン酸を分解し、無毒化できる植物を育種する
ことがある。 このようなフザリン酸耐性能を有した植
物は、フザリウム属糸状菌による萎凋病の防除に有効な
手段となる。しかしながら、このような遺伝子工学的手
段を講じるためには、当該フザリン酸耐性遺伝子および
該遺伝子の構造についての知見が必要である。 【０００８】本発明は、フザリウム属糸状菌による萎凋
病などの植物病を防除するうえで有効な、微生物由来の
フザリン酸分解もしくはフザリン酸無毒化に関与する遺
伝子および該遺伝子の構造に関する知見を提供すること
にある。さらに、該遺伝子によってコードされるフザリ
ン酸分解ないしは無毒化に関係する蛋白質を提供するこ
とにある。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
問題点を解決すべく、鋭意研究を重ねた。 そしてその
結果、フザリン酸耐性遺伝子は、フザリン酸耐性微生物
、すなわちフザリン酸を含有する培地中で生育が可能で
あり、かつフザリン酸を分解もしくは植物に対して無毒
化しうる微生物に由来し、これらから取得できることを
見いだした。また、このフザリン酸耐性遺伝子からフザ
リン酸分解・無毒化に関係するペプチドが得られること
を見いだした。 【００１０】すなわち、本発明は、シュードモナス・セ
パシア由来のフザリン酸の分解ないしは無毒化に関係す
るタンパク質をコードするＤＮＡ断片の塩基配列、およ
び当該塩基配列から明らかにされるフザリン酸分解・無
毒化に関係するタンパク質のアミノ酸配列を提供するも
のである。さらに、本発明は、クレブシエラ・オキシト
ーカ由来のフザリン酸の分解・無毒化に関係するタンパ
ク質をコードするＤＮＡ断片および当該ＤＮＡ断片の制
限酵素地図を提供するものである。 【００１１】既に発明者らにより、いくつかの種類の細
菌や糸状菌がフザリン酸耐性微生物として見いだされて
いる。 例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ）属に属する微生物およびクレブシエラ（Ｋｌｅｂ
ｓｉｅｌｌａ）属に属する微生物が知られている。本発
明で用いるフザリン酸耐性微生物のうち、シュードモナ
ス属に属する微生物としては、シュードモナス・セパシ
ア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｓｉａ）、特に
シュードモナス・セパシアＵＫ−１株（微工研条寄第１
３８５号）が好適である。 クレブシエラ属に属する微
生物としてはクレブシエラ・オキシトーカ（Ｋｌｅｂｓ
ｉｅｌｌａｏｘｙｔｏｃａ）、特にクレブシエラ・オキ
シトーカＨＹ−１株（微工研条寄第３２２１号）が好適
である。 上記微生物の菌学的性質、培養条件およびフザリン酸の
分解ないし無毒化については、特開昭６３−１９８９７
４号、特願平２−２２９５７号に詳しく開示されている
。 【００１２】シュードモナス・セパシアＵＫ−１株はフ
ザリン酸を分解・無毒化し、フザリン酸を唯一炭素源と
して生育できる。 また、クレブシエラ・オキシトーカ
ＨＹ−１株は、フザリン酸を分解・無毒化することはで
きるが、フザリン酸を唯一炭素源として生育することは
できない。 【００１３】本発明のフザリン酸耐性遺伝子は、上記フ
ザリン酸分解もしくは無毒化能を有する微生物の遺伝子
ライブラリーを大腸菌を宿主として作成し、該遺伝子ラ
イブラリーよりフザリン酸耐性の大腸菌組換え体をスク
リーニングすることにより取得できる。 通常、遺伝子
ライブラリーは、当該微生物の菌体より単離したＤＮＡ
を適当な制限酵素で切断した後、ベクターに挿入し、得
られた組換えプラスミドにより大腸菌を形質転換するこ
とにより作成する。 宿主大腸菌はフザリン酸を含む培
地中では生育できないので、フザリン酸の分解ないしは
無毒化に関与する遺伝子を含む大腸菌組換え体だけが当
該培地上で生育可能となる。 【００１４】このようにして得られたフザリン酸耐性の
大腸菌組換え体よりプラスミドを回収して、その挿入Ｄ
ＮＡ断片の制限酵素地図を作成する。 この制限酵素地
図をもとに、当該挿入ＤＮＡ断片を各種制限酵素で切断
して得られたＤＮＡ断片をベクターに挿入後、大腸菌を
形質転換してフザリン酸耐性を示すクローンを選択する
。 フザリン酸耐性を示すクローンのうち、挿入ＤＮＡ
断片が最も短いものについてその全塩基配列を決定する
。 【００１５】このようにして決定された塩基配列を解析
することにより、タンパク質をコードしている領域（Ｏ
ＲＦ：オープンリーデイングフレーム）を推定し、各Ｏ
ＲＦがコードしているタンパク質のアミノ酸配列を推測
する。 さらに、各ＯＲＦ中に存在する制限酵素切断部
位を当該制限酵素で切断後、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）
酵素で切断点を平滑末端にした後、各ＯＲＦの平滑断片
を再結合することにより各ＯＲＦの読み枠をずらした変
異体遺伝子を作成する。これらの変異体遺伝子で形質転
換した大腸菌はいずれもフザリン酸耐性を消失すること
から、上記各ＯＲＦがフザリン酸の分解・無毒化に関係
するタンパク質をコードしていることを確認できる。 【００１６】由来微生物としてシュードモナス・セパシ
アを用い、上記の様にして決定された、フザリン酸耐性
関連塩基配列およびこれから導かれるアミノ酸配列の一
例は次の通りである。 （塩基配列） 【化１１】 【化１２】 【化１３】 【化１４】 【化１５】 （アミノ酸配列） 【化１６】 【化１７】 【化１８】 【化１９】 【化２０】 但し、式（Ｉ）ないし（Ｖ）中のアルファベットは、下
のアミノ酸を示す。Ａ：アラニン、Ｃ：システイン、Ｄ
：アスパラギン酸、Ｅ：グルタミン酸、Ｆ：フェニルア
ラニン、Ｇ：グリシン、Ｈ：ヒスチジン、Ｉ：イソロイ
シン、Ｋ：リシン、Ｌ：ロイシン、Ｍ：メチオニン、Ｎ
：アスパラギン、Ｐ：プロリン、Ｑ：グルタミン、Ｒ：
アルギニン、Ｓ：セリン、Ｔ：スレオニン、Ｖ：バリン
、Ｗ：トリプトファン、Ｙ：チロシン。 【００１７】得られたフザリン酸の分解・無毒化に関与
する遺伝子およびそれらの遺伝子の構造を基に、当該遺
伝子を植物細胞で機能するプロモーターとターミネータ
ーの間に挿入し、植物細胞を形質転換することによりフ
ザリン酸耐性の植物細胞を得ることができる。さらにこ
の形質転換された植物細胞を植物体まで再生させること
により、フザリン酸耐性の植物体を得ることができる。 このようにして得られたフザリン酸耐性の植物はフザリ
ウム属糸状菌による病害に抵抗性となるので、現在、防
除が非常に困難な当該糸状菌による萎凋病等に対する有
効な防除法となる。また、当該フザリン酸の分解・無毒
化に関与する遺伝子によって形質転換された植物細胞は
フザリン酸耐性となるので、植物細胞を形質転換する際
の選択マーカーとしても利用できる。 植物細胞は公知
の方法、例えば、Ｔｉプラスミドを利用した方法（「続
生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、２０５頁、日
本生化学会編、１９８６年、東京化学同人）あるいは遺
伝子直接導入法（同書、２１１頁）に従って形質転換す
ることができる。 【００１８】さらに、フザリン酸耐性遺伝子の構造が明
らかにされることにより、フザリン酸分解ないしはフザ
リン酸無毒化に関係する蛋白質の構造も明らかになり、
当該蛋白質を遺伝子工学的手法により大量生産し、フザ
リウム属糸状菌による萎稠病などの防除に役立てること
ができる。 【００１９】 【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。 実 施 例 １ 遺伝子ライブラリーの作成：シュードモナス・セパシア
ＵＫ−１株より常法により全ＤＮＡを単離した。細菌Ｄ
ＮＡの単離法としては、例えばサイトウ・ミウラ法（Ｓ
ａｉｔｏ， Ｈ． ａｎｄ Ｍｉｕｒａ，Ｋ．， Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ７２，
６１９ （１９６３））が挙げられる。 分離したＤ
ＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、アガロース電気泳
動により分画し、４ｋｂ以上のＤＮＡ断片を回収した。 この回収したＤＮＡ断片と、ＥｃｏＲＩで切断後、フ
ォスファターゼ処理したベクターｐＵＣ１９とをＴ４リ
ガーゼを用いて結合し、これで大腸菌ＪＭ１０９を形質
転換して、アンピシリン耐性形質転換体としてシュード
モナス・セパシアの遺伝子ライブラリーを作成した。 【００２０】クレブシエラ・オキシトーカＨＹ−１株に
ついても、上記記載の方法と同様の方法により遺伝子ラ
イブラリーを作成した。 但し、制限酵素ＢａｍＨＩ／
ＨｉｎｄＩＩＩで切断したＤＮＡ断片をベクターｐＵＣ
１９に挿入した。 【００２１】実 施 例 ２ 遺伝子ライブラリーのスクリーニング：アンピシリン５
０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地に形成させた上記遺伝子ラ
イブラリーのコロニーを、二次選択培地（アンピシリン
５０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ １ｍＭ、フザリン酸 １
００μｇ／ｍｌを含むデイビス最小培地）にレプリカし
、フザリン酸耐性のクローンを選択した。シュードモナ
ス・セパシアの遺伝子ライブラリーからは、プラスミド
ｐＢＥ１を持つクローンが選択された。 ｐＢＥ１は、
シュードモナス・セパシア由来の８．５ｋｂのＤＮＡ断
片をＥｃｏＲＩ切断部位に挿入断片として有する。 な
お、ｐＢＥ１を含む大腸菌ＪＭ１０９は、エシェリヒア
・コリ ＳＡＭ １５５２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＳＡＭ １５５２）と命名され、工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１１３１７号（
ＦＥＲＭ Ｐ−１１３１７）として寄託されている。 【００２２】クレブシエラ・オキシトーカの遺伝子ライ
ブラリーからは、プラスミドｐＦＡＲ１を持つクローン
が選択された。 ｐＦＡＲ１は、クレブシエラ・オキシ
トーカ由来の、３．６ｋｂのＤＮＡ断片をＢａｍＨ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ切断部位に挿入断片として有する。 なお
、ｐＦＡＲ１を含む大腸菌ＪＭ１０９は、エシェリヒア
・コリ ＳＡＭ １５５３（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＳＡＭ １５５３）と命名され、工業技術院
微生物工業研究所に微工研菌寄第１１３１８号（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１１３１８）として寄託されている。 【００２３】実 施 例 ３ 制 限 酵 素 地 図 ：プラスミドｐＢＥ１および
ｐＦＡＲ１を各種制限酵素で切断し、アガロース電気泳
動により切断ＤＮＡ断片の大きさを測定して、制限酵素
地図を作成した。図１に上記プラスミドの挿入ＤＮＡ断
片の制限酵素地図を示した。なお、ｐＢＥ１の８．５ｋ
ｂ挿入ＤＮＡ断片を逆向きに挿入したｐＢＥ１１を持つ
大腸菌はフザリン酸耐性を消失すること、またｐＢＥ１
を持つ大腸菌でもＩＰＴＧ非存在下ではやはりフザリン
酸耐性を消失することから、フザリン酸分解・無毒化遺
伝子はベクターｐＵＣ１９上に存在するｌａｃプロモー
ターの制御下で発現し、その転写・翻訳の方向は図１中
左から右であることがわかった。一方、ｐＦＡＲ１の３
．６ｋｂ挿入ＤＮＡ断片を逆向きに挿入したｐＦＡＲ２
を持つクローンもフザリン酸耐性能を有することから、
フザリン酸分解・無毒化遺伝子は３．６ｋｂ挿入ＤＮＡ
断片上に存在するクレブシエラ・オキシトーカ由来のプ
ロモーターの制御下で発現していると考えられる。 【００２４】実 施 例 ４ サブクローニング−フザリン酸耐性遺伝子のマッピング
：上記制限酵素地図をもとに各種欠失プラスミドを作成
し、該欠失プラスミドで形質転換した大腸菌のフザリン
酸耐性を調べることにより、フザリン酸耐性遺伝子の位
置をより詳細に決定した。 また、この結果をもとにフ
ザリン酸遺伝子のサブクローニングを行った。シュード
モナス・セパシア由来の８．５ｋｂ ＥｃｏＲＩ挿入断
片を有するプラスミドｐＢＥ１の欠失プラスミドと、こ
れらのプラスミドによって形質転換された大腸菌ＪＭ１
０９のフザリン酸耐性については、図２に示した。 な
お、ｐＢＥ１で形質転換された大腸菌は、５００μｇ／
ｍｌのフザリン酸を含む培地で生育可能であることがわ
かったので、以後、フザリン酸耐性は５００μｇ／ｍｌ
のフザリン酸を含むデイビス最小培地（アンピシリン
５０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ １ｍＭを含む）での生育で
検定した。 【００２５】図１に示すプラスミドｐＢＥ１のＥｃｏＲ
Ｉ挿入断片中、６．４ｋｂ付近に唯一存在するＳｔｕＩ
サイトで切断後、ＳａｃＩリンカー（５’−ＣＧＡＧＣ
ＴＣＧ−３’）を挿入することによって、以後の読み枠
をずらしたプラスミドｐＢＥ−ｔａを作成した。 プラ
スミドｐＢＥ−ｔａをＳａｃＩで切断して生じた６．４
ｋｂのＳａｃＩ断片をベクターｐＵＣ１９のＳａｃＩサ
イトに挿入したプラスミドをｐＢＡＡ１とした。 次に
、プラスミドｐＢＡＡ１の左側から１ｋｂの所（図２参
照）と、ベクターｐＵＣ１９のマルチクローニングサイ
トに存在する ＳｍａＩサイトの間を欠失させたプラス
ミドｐＢＡＭを作成した。これらのプラスミドで大腸菌
ＪＭ１０９を形質転換し、フザリン酸耐性を調べたとこ
ろ、ｐＢＥ１−ｔａおよびｐＢＡＡ１の形質転換体はフ
ザリン酸耐性を示したが、プラスミドｐＢＡＭによる形
質転換体はフザリン酸耐性を示さなかった。 【００２６】また、プラスミドｐＢＡＡ１中に存在する
数カ所のＳｐｈＩサイトを利用して、各種欠失プラスミ
ドを作成した。 ｐＢＡＡ１を制限酵素ＳｐｈＩで部分
分解した後、Ｔ４リガーゼで再結合して、大腸菌ＪＭ１
０９を形質転換した。 形質転換体のうちフザリン酸耐
性を示すクローンからプラスミドを回収して、その制限
酵素地図を調べたところ、プラスミドｐＢＡＡ１の右側
に存在する約１．０ｋｂのＳｐｈＩ断片（図２参照）が
欠失したプラスミドｐＫＬＲ１が見いだされた。さらに
、プラスミドｐＢＡＡ１を制限酵素ＸｈｏＩで部分分解
し、再結合することによって、ｐＢＡＡ１の右側の約１
．３ｋｂが欠落したプラスミドｐＦＺＲ１が得られた。 このｐＦＺＲ１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は
フザリン酸耐性能を消失した。 【００２７】以上の結果から、シュードモナス・セパシ
ア由来の８．５ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片中、左側のＥｃｏ
ＲＩサイトから５．４ｋｂにあるＳｐｈＩサイトまでが
、フザリン酸耐性を示す必須領域であることがわかった
（図２参照）。 【００２８】実 施 例 ５ 塩 基 配 列 の 決 定 ：シュードモナス・セパ
シア由来のフザリン酸耐性遺伝子をコードするＤＮＡ断
片の塩基配列を決定した。 塩基配列を決定した部分は
、プラスミドｐＢＥ１の８．５ｋｂＥｃｏＲＩ断片中、
ＥｃｏＲＩサイトからＡｃｃＩサイトまでの約 ７．
０ｋｂ（図３参照）で、実施例３で述べたフザリン酸耐
性遺伝子をコードしている。 塩基配列の決定は、まず
７．０ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＡｃｃＩ断片を、図１に示し
た制限酵素地図を基に各種制限酵素で切断して、生成す
るＤＮＡ断片をファージＭ１３にクローン化した。 こ
こで、図３に示すように各ＤＮＡ断片は互いに重複する
ようになっている。 各断片をクローン化したファージ
Ｍ１３を大腸菌ＪＭ１０９に感染させ、二本鎖ＤＮＡを
調製した。 【００２９】これらの二本鎖ＤＮＡを大腸菌エキソヌク
レアーゼＩＩＩと反応させ、一方向に欠失が導入された
二本鎖ＤＮＡを調製した。エキソヌクレアーゼＩＩＩを
利用した一方向欠失挿入プラスミドの作成法に関しては
、「続生化学実験講座、第１巻、遺伝子研究法ＩＩ」の
２８９−３０５頁に詳しく記載されている。 前記の方
法により得られた一方向に欠失が挿入された各二本鎖Ｄ
ＮＡを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換して、一方向に欠失
が挿入されたファージクローンを作成した。 各ファー
ジクローンから二本鎖ＤＮＡを調製して、制限酵素によ
る切断パターンから欠失の程度を調べ、適当なクローン
から一本鎖ファージＤＮＡを調製した。 これら一本鎖
ファージＤＮＡを鋳型として、ジデオキシ法（Ｓａｎｇ
ｅｒ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７４， ５４６
３ （１９７７））によって塩基配列を決定した。 各
クローンの塩基配列をつなぎ合わせることにより、各Ｄ
ＮＡ断片の塩基配列を決定し、さらに各ＤＮＡ断片の塩
基配列をつなぎ合わせることにより、７．０ｋｂのＥｃ
ｏＲＩ／ＡｃｃＩ断片全体の塩基配列を決定した。 【００３０】また、クレブシエラ・オキシトーカ由来の
フザリン酸耐性遺伝子をコードするＤＮＡ断片の塩基配
列も決定した。 塩基配列を決定した部分は、プラスミ
ドｐＦＡＲ１のＢａｍＨＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの３
．６ｋｂ（図１参照）で、前記のシュードモナス・セパ
シア由来のフザリン酸耐性遺伝子の場合と同様にして、
一方向に欠失が挿入された一本鎖ファージの塩基配列を
決定し、それらをつなぎあわせることにより３．６ｋｂ
ＤＮＡ断片全体の塩基配列を決定した。 【００３１】実 施 例 ６ 塩 基 配 列 の 解 析 ：シュードモナス・セパ
シア由来の７．０ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＡｃｃＩ断片は
７００６塩基対からなるが、そのうちＥｃｏＲＩから
ＳｐｈＩまでのフザリン酸耐性を示す最小領域の全塩基
配列（５４３７塩基対）を図４〜図８に示した。 【００３２】この塩基配列中のタンパク質をコードでき
る領域として、開始コドン（ＡＴＧないしＧＴＧ）で始
まり終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧないしＴＧＡ）で終わ
るオープンリーデイング・フレーム（ＯＲＦ： Ｏｐｅ
ｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）を探索した。 プラ
スミドｐＢＥ１の８．５ｋｂＥｃｏＲＩ断片を逆向きに
挿入したプラスミドｐＢＥ１１の形質転換体はフザリン
酸耐性を示さないことから、ＯＲＦの向きは図９中左か
ら右側方向とした。２５０塩基対以上のＯＲＦとして１
０個のＯＲＦが見いだされたが（図９参照）、これらの
内、開始コドンＡＴＧの直前にリボソームと結合できる
ＳＤ配列（Ｓｈｉｎｅ， Ｊ． ａｎｄ Ｄａｌｇａｒ
ｎｏ， Ｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，２５４， ３４−３８
（１９７５））を有し、かつ互いに重複しないＯＲＦと
して、ＯＲＦ３−１；５３１→１８３０（５３１番目の
開始コドンＡＴＧから始まり、１８３０番目の終止コド
ンで終わることを示す、以下同じ）、ＯＲＦ２−２；１
８４７→２２７３、ＯＲＦ１−２；２３１４→３３５２
、ＯＲＦ３−２；３４１４→４０３８およびＯＲＦ３−
３；４４７３→４９７７の５つのＯＲＦをフザリン酸耐
性に関係するタンパク質のＯＲＦと推定した。 【００３３】また、５１２５塩基から５１５７塩基の間
には安定なヘアピン構造をとり、転写のターミネイター
として機能しうるインバーテイド・リピート（逆方向反
復配列）構造が認められる。 【００３４】更に、クレブシエラ・オキシトーカ由来の
３．６ｋｂ ＤＮＡ断片の全塩基配列を図１１〜図
に示した。 この塩基配列中、タンパク質をコード
する領域として、開始コドン（ＡＴＧないしＧＴＧ）で
始まり、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧないしＴＧＡ）で
終わるＯＲＦを探索した。 ３００塩基対以上のＯＲＦ
として、両方向に計７個のＯＲＦが見出された。 【００３５】実 施 例 ７ オープンリーデイングフレームの確認：実施例６に示し
たシュードモナス・セパシアのＯＲＦが実際にフザリン
酸耐性に関与するタンパク質をコードしているかを以下
の方法で確認した。 決定された塩基配列から、詳細な
制限酵素地図を作成した。プラスミドｐＢＥ１などを適
当な制限酵素サイトで切断後、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ
）酵素で処理して平滑末端にし、再結合することにより
、切断点以降の読み枠をずらした変異プラスミドを作成
した。 これらの変異プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転
換し、形質転換体のフザリン酸耐性を調べることにより
、変異を導入した部位に存在するＯＲＦがフザリン酸耐
性に必要かを調べた。 図９にその結果を示した。 【００３６】プラスミドｐＢＥ１の８．５ｋｂＥｃｏＲ
Ｉ挿入断片中には、制限酵素ＢｓｔＰＩによる切断サイ
ト（１８２８；切断部位の塩基対の番号を示す）が唯一
箇所存在する。ｐＢＥ１を制限酵素ＢｓｔＰＩで切断後
、クレノー酵素で平滑末端して ＥｃｏＲＩリンカー（
５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣ−３’）を挿入したプラスミド
ｐＢＥ１−ｓｃを作成した。 プラスミドｐＢＥ１−ｓ
ｃをＥｃｏＲＩで切断して得られる１．８ｋｂおよび６
．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の各々を、ベクターｐＵＣ
１９に挿入したプラスミドｐＳＣ−１８１およびｐＳＣ
−６７１を作成した。 【００３７】プラスミドｐＢＥ１の８．５ｋｂＥｃｏＲ
Ｉ挿入断片中には制限酵素ＳｍａＩの切断サイト（１０
３４）が唯一存在する。 ＳｍａＩサイトはベクターｐ
ＵＣ１９のマルチクローニングサイトにもう一箇所存在
するので、ｐＢＥ１−ｔａを ＳｍａＩで部分分解
後、アガロース電気泳動法により分画してｐＢＥ１が直
鎖状になったＤＮＡ分子を回収した。 この直鎖状ＤＮ
Ａ分子とＥｃｏＲＩリンカー （５’−ＧＧＡＡＴＴＣ
Ｃ−３’）と混合して、Ｔ４リガーゼで結合した後、大
腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。 形質転換体からプラ
スミドを調製し制限酵素で切断して解析した結果、上記
１０３６塩基対目のＳｍａＩサイトにＥｃｏＲＩリンカ
ーが挿入されたプラスミドをｐＴＡ−Ｓ１とした。 【００３８】プラスミドｐＢＥ１の挿入ＤＮＡ断片中に
は２箇所のＡｐａＩサイト（１０３１、１９２０）が存
在する。 プラスミドｐＢＥ１−ｔａを制限酵素ＡｐａＩで部分
分解し、前記の方法により直鎖状ＤＮＡ分子を回収して
切断末端をクレノー酵素により平滑末端にした後、Ｔ４
リガーゼで再結合することによりそれ以降の読み枠をず
らした変異プラスミドを作成した。 １０３１番目のＡ
ｐａＩサイトで読み枠のずれたプラスミドをｐＴＡ−Ａ
１、１９２０番目のＡｐａＩサイトで読み枠のずれたプ
ラスミドをｐＴＡ−Ａ２とした。 制限酵素ＰｓｔＩの
サイトは、挿入ＤＮＡ中に５箇所（８９７、２９２６、
３９２１、４５４４、４７４０）存在するが、これらの
ＰｓｔＩサイトを利用して上記の方法により読み枠のず
れた変異プラスミドｐＴＡ−Ｐ２ （２９２６）、
ｐＴＡ−Ｐ３（３９２１）、ｐＴＡ−Ｐ４（４５４４）
およびｐＴＡ−Ｐ５（４７４０）を作成した（カッコ内
の数字は読み枠をずらした場所の塩基番号を示 す）。 これらのプラスミドでは各挿入断片中のＯＲＦの向き
が、ベクターｐＵＣ１９のｌａｃプロモーターと同一方
向に挿入されている。 このようにして作成した変異プ
ラスミドで形質転換した大腸菌ＪＭ１０９のフザリン酸
耐性を調べたところ、プラスミドｐＢＥ１−ｓｃで形質
転換した大腸菌はフザリン酸耐性であったのに対して、
その他のプラスミド（ｐＳＣ１８１、ｐＳＣ６７１、ｐ
ＴＡ−Ｓ１、ｐＴＡ−Ａ１、ｐＴＡ−Ａ２、ｐＴＡ−Ｐ
２、ｐＴＡ−Ｐ３、ｐＴＡ−Ｐ４およびｐＴＡ−Ｐ５）
で形質転換した大腸菌はフザリン酸耐性を示さなかった
（図９）参照。 【００３９】制限酵素ＳｍａＩ（１０３４）にＥｃｏＲ
Ｉリンカーを挿入したり、ＡｐａＩサイト（１０３１）
で読み枠をずらした場合はフザリン酸耐性が消失するこ
とから、ＯＲＦ１−１（３０１→５８６）およびＯＲＦ
２−１（３６８→９５９）はフザリン酸耐性には関与し
ていないが、ＯＲＦ３−１（４５９→１８３７）は、フ
ザリン酸耐性に関与していることが明らかになった（Ｏ
ＲＦの後の括弧内の数字は翻訳開始コドンおよび終止コ
ドンの塩基番号を示し、制限酵素の後の括弧内の数字は
切断箇所の塩基番号を示す）。 ＯＲＦ３−１中のＳｍ
ａＩサイト（１０３１）の上流には４つの開始コドンＡ
ＴＧがあるが、このうち直前にＳＤ配列が認められる５
３１番目のＡＴＧを開始コドンとし、このＯＲＦをコー
ドする遺伝子をｆａｄＡとした（図９参照）。
【００４０】制限酵素ＢｓｔＰ１（１８２８）は、ＯＲ
Ｆ３−１の終止コドン（１８３０）の直後でＯＲＦ２−
２の開始コドン（１８４７）の直前を切断するが、この
ＢｓｔＰＩサイトにＥｃｏＲＩリンカーを挿入して読み
枠をずらした場合はフザリン酸耐性が存続する。 さら
に、ＡｐａＩサイト（１９２０）およびＰｓｔＩサイト
（２９２６）で読み枠をずらすとフザリン酸耐性が消失
することから、ＯＲＦ２−２（１８４７→２２７３）お
よびＯＲＦ１−２（１７０８→３３５２）の２３１４塩
基にあるＡＴＧ以降がフザリン酸耐性に必要であること
が明らかになった。 これらのＯＲＦをコードする遺伝
子を各々ｆａｄＢ（１８４７→２２７３）、ｆａｄＣ（
２３１４→３３５２）とした（図９参照）。 ｆａｄＢ
およびｆａｄＣのいずれも開始コドンの直前にＳＤ配列
が認められる。また、ＰｓｔＩサイト（３９２１、４５
４４、４７４０）で読み枠をずらした場合はフザリン酸
耐性が消失すること、および開始コドンの直前にあるＳ
Ｄ配列の存在から、ｆａｄＤ（３４１４→４０３８）お
よびｆａｄＥ（４４７３→４９７７）をフザリン酸耐性
に必要なタンパク質をコードする領域とした。 【００４１】以上の結果をまとめると、フザリン酸耐性
には５つのタンパク質が必要であり、それらタンパク質
をコードする遺伝子として各々ｆａｄＡ、ｆａｄＢ、ｆ
ａｄＣ、ｆａｄＤおよびｆａｄＥが明らかになった。
これらの遺伝子の塩基配列から推測されるタンパク質の
アミノ酸配列を図４〜図８に示した。 また、当該タン
パク質の予想分子量は、各々４５．７ｋｄ（キロダルト
ン）、３７．９ｋｄ、２３．０ｋｄ、１８．５ｋｄおよ
び１４．８ｋｄであった。 この値は、実施例８に述べ
る細菌無細胞抽出液による試験管内転写・翻訳産物の分
子量とよく一致した。 【００４２】更に、実施例６に示したクレブシエラ・オ
キシトーカ由来の３．６ｋｂ ＤＮＡ断片中に存在する
７個のＯＲＦの内、どのＯＲＦが実際にフザリン酸耐性
に関与するタンパク質にコードしているかを、前記シュ
ードモナス・セパシアの場合と同様な方法で調べた。
すなわち、プラスミドｐＦＡＲ１において、各種の欠失
プラスミドおよび読み枠をずらせた変異プラスミドを作
成した。 作成したプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形
質転換し、形質転換体のフザリン酸耐性を調べることに
より、欠失ないし変異を導入した部分に存在するＯＲＦ
がフザリン酸耐性に必要かを調べた。 その結果、フザ
リン酸耐性には３つのタンパク質が必要であり、それら
のタンパク質をコードする遺伝子としてｆｄｔ１、ｆｄ
ｔ２およびｆｄｔ３が明かとなった。 これら３つの遺
伝子のそれぞれの開始コドンの直前には、リボソームと
結合できるＳＤ配列が認められた。 これらの遺伝子に
コードされるタンパク質のアミノ酸配列を図１１〜図１
３に示した。 【００４３】実 施 例 ８ 試験管内転写・翻訳産物の解析：実施例７において同定
した各遺伝子の転写・翻訳産物が実際に存在することを
、転写と翻訳が共役した細菌無細胞抽出液（ＤｅＶｒｉ
ｅｓ， Ｊ．Ｋ． ａｎｄ Ｚｕｂａｙ， Ｇ．， Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，
５７， ２６７ （１９６７））による遺伝子産物の
解析によって確認した。 試験管内での転写・翻訳の反
応は、原核ＤＮＡ依存翻訳キット（Ｐｒｏーｋａｒｙｏ
ｔｉｃ ＤＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｒａｎｓｌａｔ
ｉｏｎ ｋｉｔ、アマシャム社製）用い、キットの指示
書どうりに行った。 鋳型として用いたＤＮＡはフザリ
ン酸耐性を示すプラスミドｐＢＥ１−ｓｃおよび対照と
して上記キットに含まれるプラスミドｐＡＴ１５３を用
いた。 【００４４】プラスミドＤＮＡ ２．５μｇに、サプリ
メント液 ７．５μｌ、アミノ酸液 ３μｌ、Ｌ−［３
５Ｓメチオニン］２μｌ（１．１１ＭＢｑ）およびＳ−
３０抽出液 ５μｌを順次加え、よく混合した後、３７
℃で１時間保温した。 メチオニンチェース液を５μｌ
加えて３７℃で５分間保温した後、氷冷して反応を停止
させた。 反応液 ６μｌに等量の２倍濃度のサンプル
緩衝液を加え、９５℃で５分間処理した後、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法によりタンパク質を分
画した。 ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法は、
ラミリーらの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ．， Ｎ
ａｔｕｒｅ， ２２７， ６８０ （１９７０））に従
って行い、ゲル濃度は１５％とした。電気泳動後のゲル
をゲルドライヤーで乾燥し、オートラジオグラフィーを
行って、試験管内転写・翻訳産物の解析を行った。 【００４５】図１０に示したように、フザリン酸耐性を
示すプラスミドｐＢＥ１−ｔａを鋳型とした転写・翻訳
産物には、対照としたプラスミドｐＡＴ１５３を鋳型と
した場合のβ−ラクタマーゼに相当するバンド以外に、
５つのバンドが認められた。これらの５つのバンドに対
応するタンパク質の分子量を、同時に泳動した分子量マ
ーカーの泳動距離から推定すると、４７ｋｄ、３８ｋｄ
、２３ｋｄ、１８．５ｋｄおよび１５ｋｄとなった。
この分子量は、実施例７において記載したフザリン酸耐
性に関与する５つの遺伝子、ｆａｄＡ、ｆａｄＣ、ｆａ
ｄＤ、ｆａｄＥおよびｆａｄＢによってコードされるタ
ンパク質の予想分子量と各々よく一致した。 【００４６】この結果から、シュードモナス・セパシア
由来のフザリン酸耐性遺伝子によって形質転換された大
腸菌中では、上記５つのフザリン酸耐性遺伝子群が発現
し、該形質転換大腸菌をフザリン酸耐性にしていること
が明らかになった。 【００４７】 【発明の効果】本発明によれば、シュードモナス・セパ
シア由来のフザリン酸耐性遺伝子を含む５．４ｋｂのＤ
ＮＡ断片の全塩基配列を決定し、当該フザリン酸耐性遺
伝子構造、さらにはタンパク質構造（アミノ酸配列）が
明らかになった。また、クレブシエラ・オキシトーカ由
来のフザリン酸耐性遺伝子を含む、 ３．６ｋｂ
ＤＮＡ断片についても、その全塩基配列を決定し、遺伝
子構造、更にはタンパク質構造（アミノ酸配列）が明ら
かにされた。 【００４８】これらのフザリン酸耐性遺伝子を植物細胞
に導入することにより、フザリン酸耐性の植物を得るこ
とができる。このようにして得られるフザリン酸耐性の
植物は、フザリウム属糸状菌による萎凋病等に抵抗性と
なるので、当該糸状菌による病害防除上の問題点が解消
される。 【００４９】また、当該フザリン酸耐性遺伝子によって
コードされるフザリン酸分解ないしは無毒化に関係する
蛋白質を、遺伝子工学的手法により大量生産し、フザリ
ウム属糸状菌等による病害防除に役立てることもできる
。
【図１】 フザリン酸耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片の
制限酵素地図を示す図面である。 図中、太線は、挿入
ＤＮＡ断片を示し、ｐＢＥ１は、シュードモナス・セパ
シア由来のフザリン酸耐性遺伝子を含むプラスミドを、
ｐＦＡＲ１は、クレブシエラ・オキシトーカ由来のフザ
リン酸耐性遺伝子である。
制限酵素地図を示す図面である。 図中、太線は、挿入
ＤＮＡ断片を示し、ｐＢＥ１は、シュードモナス・セパ
シア由来のフザリン酸耐性遺伝子を含むプラスミドを、
ｐＦＡＲ１は、クレブシエラ・オキシトーカ由来のフザ
リン酸耐性遺伝子である。
【図２】 シュードモナス・セパシア由来のフザリン
酸耐性遺伝子の最小領域を示す図面である。 図中、太
線は、左端に示した欠失・変異プラスミドの挿入ＤＮＡ
断片を示し、右端に該プラスミドで形質転換した大腸菌
のフザリン酸耐性を示す（＋はフザリン酸耐性であるこ
とを、−はフザリン酸耐性がないことを示す）。 太線
上のアルファベットは、制限酵素の切断部位を示す：Ｅ
；ＥｃｏＲＩ、Ｓａ；ＳａｃＩ、Ｓｍ；ＳｍａＩ、Ｓｐ
；ＳｐｈＩ、Ｓｔ；ＳｔｕＩ、Ｘ；ＸｈｏＩ）。 Ｓａ
（Ｓｔ）は、制限酵素ＳｔｕＩで切断後、ＳａｃＩリン
カーを挿入したことを示す。 左端の矢印はベクターｐ
ＵＣ１９上にあるプロモーター（Ｐｌａｃ）の位置と方
向を示し、下端の矢印は、フザリン酸耐性遺伝子の最小
領域と転写の向きを示す。
酸耐性遺伝子の最小領域を示す図面である。 図中、太
線は、左端に示した欠失・変異プラスミドの挿入ＤＮＡ
断片を示し、右端に該プラスミドで形質転換した大腸菌
のフザリン酸耐性を示す（＋はフザリン酸耐性であるこ
とを、−はフザリン酸耐性がないことを示す）。 太線
上のアルファベットは、制限酵素の切断部位を示す：Ｅ
；ＥｃｏＲＩ、Ｓａ；ＳａｃＩ、Ｓｍ；ＳｍａＩ、Ｓｐ
；ＳｐｈＩ、Ｓｔ；ＳｔｕＩ、Ｘ；ＸｈｏＩ）。 Ｓａ
（Ｓｔ）は、制限酵素ＳｔｕＩで切断後、ＳａｃＩリン
カーを挿入したことを示す。 左端の矢印はベクターｐ
ＵＣ１９上にあるプロモーター（Ｐｌａｃ）の位置と方
向を示し、下端の矢印は、フザリン酸耐性遺伝子の最小
領域と転写の向きを示す。
【図３】 シュードモナス・セパシア由来のフザリン
酸耐性遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を決定した際の概
略を示す図面である。 図中、太線は、塩基配列を決定
したＤＮＡ部分を示し、太線上のアルファベットは各種
ＤＮＡ断片を調製するのに用いた制限酵素の切断部位を
示す：Ａｃ；ＡｃｃＩ、Ｅ；ＥｃｏＲＩ、Ｈ；Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ、Ｐ；ＰｓｔＩ、Ｓｍ；ＳｍａＩ、Ｓｐ；Ｓｐｈ
Ｉ。 両方向の矢印は、調製した各種ＤＮＡ断片を示す
。
酸耐性遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を決定した際の概
略を示す図面である。 図中、太線は、塩基配列を決定
したＤＮＡ部分を示し、太線上のアルファベットは各種
ＤＮＡ断片を調製するのに用いた制限酵素の切断部位を
示す：Ａｃ；ＡｃｃＩ、Ｅ；ＥｃｏＲＩ、Ｈ；Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ、Ｐ；ＰｓｔＩ、Ｓｍ；ＳｍａＩ、Ｓｐ；Ｓｐｈ
Ｉ。 両方向の矢印は、調製した各種ＤＮＡ断片を示す
。
【図４】〜
【図８】 シュードモナス・セパシア由来のフザリン
酸耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列およびアミノ
酸配列を示す図面である。 塩基配列は、ＥｃｏＲＩサ
イトからＳｐｈＩサイトまでの５４３７塩基を示し、そ
の下側に推定されるタンパク質のアミノ酸配列を示した
。 各開始コドンの上部に遺伝子（ｆａｄＡ、ｆａｄＢ、ｆ
ａｄＣ、ｆａｄＤ、ｆａｄＥ）を示した。 開始コドン
の直前の下線は推定リボソーム結合部位（ＳＤ配列）を
示す。 両端の数字は、上が塩基対番号、下がアミノ酸
番号を示す。
酸耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列およびアミノ
酸配列を示す図面である。 塩基配列は、ＥｃｏＲＩサ
イトからＳｐｈＩサイトまでの５４３７塩基を示し、そ
の下側に推定されるタンパク質のアミノ酸配列を示した
。 各開始コドンの上部に遺伝子（ｆａｄＡ、ｆａｄＢ、ｆ
ａｄＣ、ｆａｄＤ、ｆａｄＥ）を示した。 開始コドン
の直前の下線は推定リボソーム結合部位（ＳＤ配列）を
示す。 両端の数字は、上が塩基対番号、下がアミノ酸
番号を示す。
【図９】 フザリン酸耐性に関与するタンパク質の解
析を行った結果を示す図面である。 図中、太線は左端
に記した変異プラスミド中の挿入ＤＮＡ断片を示す。
挿入したＤＮＡ断片（８．５ｋｂ）の一部である、５．
４ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ断片が示される。 太線
上のアルファベットは以下の制限酵素の切断点を示す：
Ａｐ；ＡｐａＩ、Ｂｐ；ＢｓｔＰＩ、Ｅ；ＥｃｏＲＩ、
Ｐ；ＰｓｔＩ、Ｓｍ；ＳｍａＩ、Ｓｐ；ＳｐｈＩ。 括
弧は、括弧内に記した制限酵素で切断後、クレノー酵素
処理することにより、読み枠をずらしたことを示す。
また、例えば、Ｅ（Ｓｍ）は、ＳｍａＩで切断後、Ｅｃ
ｏＲＩリンカーを挿入することにより、読み枠をずらし
たことを示す。右端に、これらの変異プラスミドで形質
転換した大腸菌ＪＭ１０９のフザリン酸耐性を示す。
図中、上部の矢印は、このＤＮＡ断片中のオープンリー
デイングフレーム（ＯＲＦ）を示し、このうち欠失プラ
スミドを持つ大腸菌のフザリン酸耐性の解析から、実際
にフザリン酸耐性に関与するＯＲＦ（ｆａｄＡ、ｆａｄ
Ｂ、ｆａｄＣ、ｆａｄＤ、ｆａｄＥ）を太矢印で示した
。
析を行った結果を示す図面である。 図中、太線は左端
に記した変異プラスミド中の挿入ＤＮＡ断片を示す。
挿入したＤＮＡ断片（８．５ｋｂ）の一部である、５．
４ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ断片が示される。 太線
上のアルファベットは以下の制限酵素の切断点を示す：
Ａｐ；ＡｐａＩ、Ｂｐ；ＢｓｔＰＩ、Ｅ；ＥｃｏＲＩ、
Ｐ；ＰｓｔＩ、Ｓｍ；ＳｍａＩ、Ｓｐ；ＳｐｈＩ。 括
弧は、括弧内に記した制限酵素で切断後、クレノー酵素
処理することにより、読み枠をずらしたことを示す。
また、例えば、Ｅ（Ｓｍ）は、ＳｍａＩで切断後、Ｅｃ
ｏＲＩリンカーを挿入することにより、読み枠をずらし
たことを示す。右端に、これらの変異プラスミドで形質
転換した大腸菌ＪＭ１０９のフザリン酸耐性を示す。
図中、上部の矢印は、このＤＮＡ断片中のオープンリー
デイングフレーム（ＯＲＦ）を示し、このうち欠失プラ
スミドを持つ大腸菌のフザリン酸耐性の解析から、実際
にフザリン酸耐性に関与するＯＲＦ（ｆａｄＡ、ｆａｄ
Ｂ、ｆａｄＣ、ｆａｄＤ、ｆａｄＥ）を太矢印で示した
。
【図１０】 試験管内転写・翻訳産物の解析の結果を
示す模式図である。 左端の矢印は、同時に泳動した分
子量マーカーの泳動位置を示し、数字は分子量マーカー
の分子量を示す。 右端の矢印は、フザリン酸耐性に関
与する５つのタンパク質の泳動位置を示す。
示す模式図である。 左端の矢印は、同時に泳動した分
子量マーカーの泳動位置を示し、数字は分子量マーカー
の分子量を示す。 右端の矢印は、フザリン酸耐性に関
与する５つのタンパク質の泳動位置を示す。
【図１１】〜
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03044027A JP3115340B2 (ja) | 1990-02-28 | 1991-02-18 | フザリン酸耐性遺伝子 |
| EP91103006A EP0444664B1 (en) | 1990-02-28 | 1991-02-28 | Fusaric acid resistant genes |
| ES91103006T ES2169020T3 (es) | 1990-02-28 | 1991-02-28 | Genes resistentes al acido fusarico. |
| DE69132828T DE69132828T2 (de) | 1990-02-28 | 1991-02-28 | Resistenzgene gegen Fusarsäure |
| AT91103006T ATE209440T1 (de) | 1990-02-28 | 1991-02-28 | Resistenzgene gegen fusarsäure |
| US07/661,610 US5292643A (en) | 1990-02-28 | 1991-02-28 | Fusaric acid resistant genes |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4548190 | 1990-02-28 | ||
| JP2-45481 | 1990-02-28 | ||
| JP03044027A JP3115340B2 (ja) | 1990-02-28 | 1991-02-18 | フザリン酸耐性遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04211376A true JPH04211376A (ja) | 1992-08-03 |
| JP3115340B2 JP3115340B2 (ja) | 2000-12-04 |
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ID=26383878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
| US (1) | US5292643A (ja) |
| EP (1) | EP0444664B1 (ja) |
| JP (1) | JP3115340B2 (ja) |
| AT (1) | ATE209440T1 (ja) |
| DE (1) | DE69132828T2 (ja) |
| ES (1) | ES2169020T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022521497A (ja) * | 2019-02-14 | 2022-04-08 | コパート ベスローテン フェンノートシャップ | Ｄｎａ分子の混合物を含む組成物、生物学的阻害剤としてのその使用及び製造方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994003065A1 (en) * | 1992-07-31 | 1994-02-17 | The University Of Sydney | Biocontrol of fungal infection using pseudomonas strains |
| AU728202B2 (en) * | 1996-11-22 | 2001-01-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Moniliformin detoxification compositions and methods |
| US7279321B2 (en) * | 2003-01-17 | 2007-10-09 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Methods for increasing the resistance of a host cell to aromatic carboxylic acids |
| US6943028B2 (en) * | 2003-01-17 | 2005-09-13 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Regulator/promoter for tunable gene expression and metabolite sensing |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0481963A3 (en) * | 1986-07-03 | 1992-06-03 | Occidental Chemical Corporation | Microorganisms for degrading toxic waste materials |
| IL83089A (en) * | 1986-07-11 | 1990-12-23 | Daikin Ind Ltd | Method for the prevention of fusarium diseases in plants and microorganisms used for the same |
| JPS63198607A (ja) * | 1987-02-13 | 1988-08-17 | Daikin Ind Ltd | フザリウム病防除法 |
| JPS63198974A (ja) * | 1987-02-13 | 1988-08-17 | Daikin Ind Ltd | フザリン酸分解能を有する微生物およびそれを用いたフザリン酸分解方法 |
| CA1293701C (en) * | 1986-07-28 | 1991-12-31 | Peter J. Dart | Agricultural products and methods |
| JPH022957A (ja) * | 1988-06-14 | 1990-01-08 | Hitachi Electron Eng Co Ltd | プリント配線試験用プローズ装置 |
| JPH03228673A (ja) * | 1990-01-31 | 1991-10-09 | Daikin Ind Ltd | フザリン酸を無毒化する微生物およびそれを用いたフザリン酸の無毒化方法 |
-
1991
- 1991-02-18 JP JP03044027A patent/JP3115340B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-02-28 AT AT91103006T patent/ATE209440T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-02-28 US US07/661,610 patent/US5292643A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-28 ES ES91103006T patent/ES2169020T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-28 EP EP91103006A patent/EP0444664B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-28 DE DE69132828T patent/DE69132828T2/de not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022521497A (ja) * | 2019-02-14 | 2022-04-08 | コパート ベスローテン フェンノートシャップ | Ｄｎａ分子の混合物を含む組成物、生物学的阻害剤としてのその使用及び製造方法 |
| JP2025060642A (ja) * | 2019-02-14 | 2025-04-10 | コパート ベスローテン フェンノートシャップ | Ｄｎａ分子の混合物を含む組成物、生物学的阻害剤としてのその使用及び製造方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3115340B2 (ja) | 2000-12-04 |
| EP0444664B1 (en) | 2001-11-28 |
| DE69132828T2 (de) | 2002-06-20 |
| ES2169020T3 (es) | 2002-07-01 |
| EP0444664A3 (en) | 1991-10-23 |
| US5292643A (en) | 1994-03-08 |
| EP0444664A2 (en) | 1991-09-04 |
| DE69132828D1 (de) | 2002-01-10 |
| ATE209440T1 (de) | 2001-12-15 |
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