JPH05227997A - アントラセン誘導体ホスフェートによる核酸及び蛋白質の検定方法 - Google Patents
アントラセン誘導体ホスフェートによる核酸及び蛋白質の検定方法Info
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- JPH05227997A JPH05227997A JP4115640A JP11564092A JPH05227997A JP H05227997 A JPH05227997 A JP H05227997A JP 4115640 A JP4115640 A JP 4115640A JP 11564092 A JP11564092 A JP 11564092A JP H05227997 A JPH05227997 A JP H05227997A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 データの保存が可能で操作性がよく、且つ、
高感度検出が可能な非ＲＩ標識による核酸の検定方法を
提供することである。 【構成】 核酸、蛋白質などの被検体をナイロンメンブ
レンフィルター上に付着させておき、該被検体にホスフ
ァターゼを結合させる。次いで該ホスファターゼにアン
トラセン誘導体ホスフェートを反応させ、その後励起光
を照射して、これにより発生する蛍光を検出する。
高感度検出が可能な非ＲＩ標識による核酸の検定方法を
提供することである。 【構成】 核酸、蛋白質などの被検体をナイロンメンブ
レンフィルター上に付着させておき、該被検体にホスフ
ァターゼを結合させる。次いで該ホスファターゼにアン
トラセン誘導体ホスフェートを反応させ、その後励起光
を照射して、これにより発生する蛍光を検出する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸配列及び蛋白質配
列を蛍光により効率よく検出できることができる、核酸
及び蛋白質等の検定方法に関する。
列を蛍光により効率よく検出できることができる、核酸
及び蛋白質等の検定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】医学、生物学の分野においては近年、核
酸断片検出法により、核酸配列を検定する方法が多用さ
れている。このような検出は、遺伝病の診断、ウイルス
検査等を行う医学臨床分野のみでなく、品種同定、種子
鑑定を行う育種分野、さらには親子鑑定、犯罪捜査等の
法医学分野においても用いられているものである。
酸断片検出法により、核酸配列を検定する方法が多用さ
れている。このような検出は、遺伝病の診断、ウイルス
検査等を行う医学臨床分野のみでなく、品種同定、種子
鑑定を行う育種分野、さらには親子鑑定、犯罪捜査等の
法医学分野においても用いられているものである。
【０００３】この検定方法においては、例えばＤＮＡ
（又はＲＮＡ）プローブを放射性同位元素を用いて標識
し、これと標的核酸とをハイブリダイズさせ、しかる後
にオートラジオグラフティーにより標的核酸の検出を行
うという手段が、現在広く行われている。
（又はＲＮＡ）プローブを放射性同位元素を用いて標識
し、これと標的核酸とをハイブリダイズさせ、しかる後
にオートラジオグラフティーにより標的核酸の検出を行
うという手段が、現在広く行われている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしアイソトープ法
には、多くの欠点があり、この分野の技術の応用と発展
にとって著しい障害となっている。
には、多くの欠点があり、この分野の技術の応用と発展
にとって著しい障害となっている。
【０００５】アイソトープ法の欠点は次の通りである。
【０００６】（ａ） 核酸ハイブリダイゼーシヨンにお
いて、近接した遺伝子間（核酸配列間）の相対的位置関
係を明らかにするだけの空間的解像力がない。
いて、近接した遺伝子間（核酸配列間）の相対的位置関
係を明らかにするだけの空間的解像力がない。
【０００７】（ｂ） アイソトープを用いた実験操作
は、特別の設備をそなえたアイソトープ実験室の中でし
か行うことが出来ない。このことは、特にハイブリダイ
ゼーション法の臨床検査への応用を妨げる原因となって
いる。
は、特別の設備をそなえたアイソトープ実験室の中でし
か行うことが出来ない。このことは、特にハイブリダイ
ゼーション法の臨床検査への応用を妨げる原因となって
いる。
【０００８】（ｃ） アイソトープを用いることは、た
とえ実験室の中であっても実験者にとって危険が伴い、
また廃棄物等による一般人への危険も常に存在する。
とえ実験室の中であっても実験者にとって危険が伴い、
また廃棄物等による一般人への危険も常に存在する。
【０００９】（ｄ） 検出のために非常な長時間（数週
間〜数ケ月）を有する場合があり、迅速臨床診断への応
用が難しい。
間〜数ケ月）を有する場合があり、迅速臨床診断への応
用が難しい。
【００１０】（ｅ） 放射活性は、一定の半減期をもっ
て減衰するため、アイソトープの購入予定日に合わせた
実験計画を立てねばならず、わずかな日程のずれによ
り、アイソトープや大規模な実験成果をむだにする危険
がある。
て減衰するため、アイソトープの購入予定日に合わせた
実験計画を立てねばならず、わずかな日程のずれによ
り、アイソトープや大規模な実験成果をむだにする危険
がある。
【００１１】（ｆ） 検出感度を高めるためにはプロー
ブとする核酸に、できるだけ高い放射性を付与する必要
があるが、放射性を高める程認識した核酸は放射崩壊し
易くなるという矛盾がある。
ブとする核酸に、できるだけ高い放射性を付与する必要
があるが、放射性を高める程認識した核酸は放射崩壊し
易くなるという矛盾がある。
【００１２】（ｇ） アイソトープは、一般に極めて高
価であり、１回の実験で数十万円に相当するアイソトー
プを消費することも珍しくない。この事が、ハイブリダ
イゼーション法の一般的普及を妨げている。
価であり、１回の実験で数十万円に相当するアイソトー
プを消費することも珍しくない。この事が、ハイブリダ
イゼーション法の一般的普及を妨げている。
【００１３】このような背景から放射性アイソトープに
代わるＤＮＡ、ＲＮＡ標識法がこれまでにもいくつか開
発されている。例えば、特開平１−２１５３００号公報
に開示されているように、ベーリンガー・マンハイム
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社のディ
ゴキシゲニン・ラベル法では酵素としてアルカリホスフ
ァターゼが用いられ、その基質としてＢＣＩＰ／ＮＢＴ
（５−ブロモ−４−クロロ−３インドリルりん酸／ニト
ロブル−テトラゾリウム）が使われている。一方、ＰＣ
Ｔ特許 ＷＯ８８／００６９５号公報に開示されている
ように、同じアルカリホスファターゼの基質としてＡＭ
ＰＰＤ（アダルマンチル−１，２−ダイオキセタンりん
酸）がトロピックス社によって開発された。この方法は
化学発光を利用したもので、検出時間が短く済むという
利点を有する。感度という点では、両者ともＲＩ（ラジ
オアイソトープ）標識法に比べ劣るが、実用的には充分
高い感度をもっている。
代わるＤＮＡ、ＲＮＡ標識法がこれまでにもいくつか開
発されている。例えば、特開平１−２１５３００号公報
に開示されているように、ベーリンガー・マンハイム
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社のディ
ゴキシゲニン・ラベル法では酵素としてアルカリホスフ
ァターゼが用いられ、その基質としてＢＣＩＰ／ＮＢＴ
（５−ブロモ−４−クロロ−３インドリルりん酸／ニト
ロブル−テトラゾリウム）が使われている。一方、ＰＣ
Ｔ特許 ＷＯ８８／００６９５号公報に開示されている
ように、同じアルカリホスファターゼの基質としてＡＭ
ＰＰＤ（アダルマンチル−１，２−ダイオキセタンりん
酸）がトロピックス社によって開発された。この方法は
化学発光を利用したもので、検出時間が短く済むという
利点を有する。感度という点では、両者ともＲＩ（ラジ
オアイソトープ）標識法に比べ劣るが、実用的には充分
高い感度をもっている。
【００１４】しかし前者の方法（以下、ＢＣＩＰ／ＮＢ
Ｔ法と称する。）は、色の発色による微弱シグナルを検
出する方法であるため撮像が困難であり、写真で明確な
データを残すことが難しい。また、ナイロンメンブレン
フィルター上ではシグナルが褪色してしまい、実際には
半年ほどしかシグナルを保存できないため、この点から
もデータの保存は困難である。
Ｔ法と称する。）は、色の発色による微弱シグナルを検
出する方法であるため撮像が困難であり、写真で明確な
データを残すことが難しい。また、ナイロンメンブレン
フィルター上ではシグナルが褪色してしまい、実際には
半年ほどしかシグナルを保存できないため、この点から
もデータの保存は困難である。
【００１５】また、後者の方法（以下、ＡＭＰＰＤ法と
称する。）は、これらＢＣＩＰ／ＮＢＴ法の問題を解決
しかつ検出が短時間という利点を有するが、解像度が著
しく劣っており、検出シグナル量の差が著しい場合、複
数回条件を変えて検出を行い、複数の測定試料から総合
判断しなければならないなど熟練した技術と時間が必要
となる。また、Ｘ線フィルムを用いる方法であるため感
光させるまで結果を見ることができないなど、操作性が
悪い。
称する。）は、これらＢＣＩＰ／ＮＢＴ法の問題を解決
しかつ検出が短時間という利点を有するが、解像度が著
しく劣っており、検出シグナル量の差が著しい場合、複
数回条件を変えて検出を行い、複数の測定試料から総合
判断しなければならないなど熟練した技術と時間が必要
となる。また、Ｘ線フィルムを用いる方法であるため感
光させるまで結果を見ることができないなど、操作性が
悪い。
【００１６】そこで、本発明は上記問題を解決し、デー
タの保存が可能で操作性がよく、且つ、高感度検出が可
能な非ＲＩ標識による核酸及び蛋白質の検定方法を提供
するものである。
タの保存が可能で操作性がよく、且つ、高感度検出が可
能な非ＲＩ標識による核酸及び蛋白質の検定方法を提供
するものである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明は、核酸あるいは
蛋白質などの被検体にホスファターゼを結合させ、次い
で該ホスファターゼにアントラセン誘導体ホスフェート
を反応させ、その後これらに励起光を照射して、これに
より発生する蛍光を検出することを特徴とする核酸及び
蛋白質等の検定方法にある。上記検定方法に用いるアン
トラセン誘導体ホスフェートは，一般式Ｐ−Ａｎ−Ｂ−
Ｒで表され、ここでＡｎは，アントラセン環部であり、
Ｐは、上記アントラセン環のＣ３位に結合するホスフェ
ートであり、Ｂは、上記アントラセン環のＣ２位とＲを
結ぶ結合基であり、Ｒは、上記結合基に結合する芳香族
であるホスファターゼ修飾蛍光物質である。また上記Ｂ
の結合基はアミド結合基であり、Ｒの芳香族は、メチル
基、ジメチル基、メトキシ基、ジメトキシ基、フェニル
基、ジフェニル基、ブロモ基、クロロ基を持ったベンゼ
ン環であるホスファターゼ修飾蛍光物質である。さらに
上記アントラセン誘導体ホスフェートは、下記の化学構
造式で表されることを特徴とするホスファターゼ修飾蛍
光物質である。
蛋白質などの被検体にホスファターゼを結合させ、次い
で該ホスファターゼにアントラセン誘導体ホスフェート
を反応させ、その後これらに励起光を照射して、これに
より発生する蛍光を検出することを特徴とする核酸及び
蛋白質等の検定方法にある。上記検定方法に用いるアン
トラセン誘導体ホスフェートは，一般式Ｐ−Ａｎ−Ｂ−
Ｒで表され、ここでＡｎは，アントラセン環部であり、
Ｐは、上記アントラセン環のＣ３位に結合するホスフェ
ートであり、Ｂは、上記アントラセン環のＣ２位とＲを
結ぶ結合基であり、Ｒは、上記結合基に結合する芳香族
であるホスファターゼ修飾蛍光物質である。また上記Ｂ
の結合基はアミド結合基であり、Ｒの芳香族は、メチル
基、ジメチル基、メトキシ基、ジメトキシ基、フェニル
基、ジフェニル基、ブロモ基、クロロ基を持ったベンゼ
ン環であるホスファターゼ修飾蛍光物質である。さらに
上記アントラセン誘導体ホスフェートは、下記の化学構
造式で表されることを特徴とするホスファターゼ修飾蛍
光物質である。
【００１８】
【化１】
【００１９】３−ヒドロキシ−２−アントラセンカルボ
ン酸−２−メチルアニリドリン酸体 3-Hydroxy-N-2'-methylphenyl-2-anthracenecarboxamid
ephosphate
ン酸−２−メチルアニリドリン酸体 3-Hydroxy-N-2'-methylphenyl-2-anthracenecarboxamid
ephosphate
【００２０】
【化２】
【００２１】３−ヒドロキシ−２−アントラセンカルボ
ン酸−４−メチルアニリドリン酸体 3-Hydroxy -N-4'-methylphenyl-2-anthracenecarboxami
dephosphate
ン酸−４−メチルアニリドリン酸体 3-Hydroxy -N-4'-methylphenyl-2-anthracenecarboxami
dephosphate
【００２２】
【化３】
【００２３】３−ヒドロキシ−２−アントラセンカルボ
ン酸−２、４−ジメチルアニリドリン酸体 3-Hydroxy-N-2',4'-dimethylphenyl-2-anthracenecarbo
xamidephosphate
ン酸−２、４−ジメチルアニリドリン酸体 3-Hydroxy-N-2',4'-dimethylphenyl-2-anthracenecarbo
xamidephosphate
【００２４】
【化４】
【００２５】３−ヒドロキシ−２−アントラセンカルボ
ン酸−３−メトキシアニリドリン酸体 3-Hydroxy-N-3'-methoxyphenyl-2-anthracenecarboxami
dephosphate
ン酸−３−メトキシアニリドリン酸体 3-Hydroxy-N-3'-methoxyphenyl-2-anthracenecarboxami
dephosphate
【００２６】
【化５】
【００２７】３−ヒドロキシ−２−アントラセンカルボ
ン酸−２−メトキシアニリドリン酸体 ３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−２’−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅ
ｎｙｌ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉ
ｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ン酸−２−メトキシアニリドリン酸体 ３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−２’−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅ
ｎｙｌ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉ
ｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ
【００２８】
【化６】
【００２９】３−ヒドロキシ−２−アントラセンカルボ
ン酸−４−メトキシアニリドリン酸体 ３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−４’−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅ
ｎｙｌ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉ
ｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ン酸−４−メトキシアニリドリン酸体 ３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−４’−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅ
ｎｙｌ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉ
ｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ
【００３０】
【化７】
【００３１】３−ヒドロキシ−２−アントラセンカルボ
ン酸−３、５−ジメチルアニリドリン酸体 ３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−３’，５’−ｄｉｍｅｔｙｌ
ｐｈｅｎｙｌ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃａｒｂｏｘ
ａｍｉｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ン酸−３、５−ジメチルアニリドリン酸体 ３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−３’，５’−ｄｉｍｅｔｙｌ
ｐｈｅｎｙｌ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃａｒｂｏｘ
ａｍｉｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ
【００３２】
【化８】
【００３３】３−ヒドロキシ−２−アントラセンカルボ
ン酸−２、４−ジメトキシアニリドリン酸体 ３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−２’，４’−ｄｉｍｅｔｈｏ
ｘｙｐｈｅｎｙｌ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃａｒｂ
ｏｘａｍｉｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ン酸−２、４−ジメトキシアニリドリン酸体 ３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−２’，４’−ｄｉｍｅｔｈｏ
ｘｙｐｈｅｎｙｌ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃａｒｂ
ｏｘａｍｉｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ
【００３４】
【化９】
【００３５】３−ヒドロキシ−２−アントラセンカルボ
ン酸−２−フェニルアニリドリン酸体 3-Hydroxy-N-2'biphenyl-2-anthracenecarboxamidephos
phate
ン酸−２−フェニルアニリドリン酸体 3-Hydroxy-N-2'biphenyl-2-anthracenecarboxamidephos
phate
【００３６】
【化１０】
【００３７】３−ヒドロキシ−２−アントラセンカルボ
ン酸−２，２′−ジフェニルアニリドリン酸体 3-Hydroxy-N-(2,2'-triphenyl)-2-anthracenecarboxami
dephosphate
ン酸−２，２′−ジフェニルアニリドリン酸体 3-Hydroxy-N-(2,2'-triphenyl)-2-anthracenecarboxami
dephosphate
【００３８】
【化１１】
【００３９】３−ヒドロキシ−２−アントラセンカルボ
ン酸−３，５−ジメトキシアニリドリン酸体 3-Hydroxy-N-3',5'-dimethoxyphenyl-2-anthracenecarb
oxamidephosphate
ン酸−３，５−ジメトキシアニリドリン酸体 3-Hydroxy-N-3',5'-dimethoxyphenyl-2-anthracenecarb
oxamidephosphate
【００４０】
【化１２】
【００４１】３−ヒドロキシ−２−アントラセンカルボ
ン酸−３−フェニルアニリドリン酸体 ３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−３’−ｂｉｐｈｅｎｙｌ−２
−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅ
ン酸−３−フェニルアニリドリン酸体 ３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−３’−ｂｉｐｈｅｎｙｌ−２
−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅ
【００４２】
【化１３】
【００４３】３−ヒドロキシ−２−アントラセンカルボ
ン酸−２，６−ジフェニルアニリドリン酸体 ３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−２’，６’−ｔｒｉｐｈｅｎ
ｙｌ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄ
ｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ン酸−２，６−ジフェニルアニリドリン酸体 ３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−２’，６’−ｔｒｉｐｈｅｎ
ｙｌ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄ
ｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ
【００４４】
【化１４】
【００４５】３−ヒドロキシ−２−アントラセンカルボ
ン酸−３−メチルアニリドリン酸体 ３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−３’−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎ
ｙｌ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄ
ｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ン酸−３−メチルアニリドリン酸体 ３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−３’−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎ
ｙｌ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄ
ｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ
【００４６】
【化１５】
【００４７】３−ヒドロキシ−２−アントラセンカルボ
ン酸−２−メチル−４−クロロアニリドリン酸体 ３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−１’−ｍｅｔｈｙｌ−３−ｃ
ｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃ
ａｒｂｏｘａｍｉｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ン酸−２−メチル−４−クロロアニリドリン酸体 ３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−１’−ｍｅｔｈｙｌ−３−ｃ
ｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ−２−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｃ
ａｒｂｏｘａｍｉｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ
【００４８】
【化１６】
【００４９】３−ヒドロキシ−２−アントラセンカルボ
ン酸−２−メチル−４−ブロモアニリドリン酸体 3-Hydroxy-N-1'-methyl-3-bromophenyl-2-anthraceneca
rboxamidephosphate
ン酸−２−メチル−４−ブロモアニリドリン酸体 3-Hydroxy-N-1'-methyl-3-bromophenyl-2-anthraceneca
rboxamidephosphate
【００５０】
【作用及び効果】本発明の検定方法においては、被検体
に前記ホスファターゼにアントラセン誘導体ホスフェー
トを反応させ、次いで励起光を照射する。これによりア
ントラセン誘導体ホスフェートの脱リン酸体が蛍光を発
する。そこで、この発生する蛍光を検出する。
に前記ホスファターゼにアントラセン誘導体ホスフェー
トを反応させ、次いで励起光を照射する。これによりア
ントラセン誘導体ホスフェートの脱リン酸体が蛍光を発
する。そこで、この発生する蛍光を検出する。
【００５１】即ち、ホスファターゼをナイロンメンブレ
ンフィルター上の試料（例えば核酸）に結合させ、次い
で該ホスファターゼに上記アントラセン誘導体ホスフェ
ートを反応させる。これにより、蛍光性を有すると共
に、ナイロンメンブレンフィルターへの沈着性を有する
アントラセン誘導体ホスフェートの脱リン酸体を生じ
る。そこで励起光を照射して、その蛍光及びパターン
（スポットや電気泳動法によるバンド等）を検出する。
ンフィルター上の試料（例えば核酸）に結合させ、次い
で該ホスファターゼに上記アントラセン誘導体ホスフェ
ートを反応させる。これにより、蛍光性を有すると共
に、ナイロンメンブレンフィルターへの沈着性を有する
アントラセン誘導体ホスフェートの脱リン酸体を生じ
る。そこで励起光を照射して、その蛍光及びパターン
（スポットや電気泳動法によるバンド等）を検出する。
【００５２】そして、本発明においては、上記アントラ
セン誘導体ホスフェートを用いることにより強力な蛍光
が得られるため、上記検出の感度が向上し、１０-14 ｇ
（１０ｆｇ）という極微少量のＤＮＡについても検出可
能となるとともに、アイソトープを用いないためアイソ
トープのもつ従来の問題点も解決でき、安全である。
セン誘導体ホスフェートを用いることにより強力な蛍光
が得られるため、上記検出の感度が向上し、１０-14 ｇ
（１０ｆｇ）という極微少量のＤＮＡについても検出可
能となるとともに、アイソトープを用いないためアイソ
トープのもつ従来の問題点も解決でき、安全である。
【００５３】従来のＢＣＩＰ／ＮＢＴ法ではデータの判
定が色の識別によるものであったため、撮像するとデー
タが判別しにくくなるばかりでなく、半年程でシグナル
が褪色化するためデータを保存することが難しかった
が、本発明では蛍光発色であるためこのような不具合は
なく、また写真にデータを撮っても明確に判別すること
ができ、データの保存が容易である。
定が色の識別によるものであったため、撮像するとデー
タが判別しにくくなるばかりでなく、半年程でシグナル
が褪色化するためデータを保存することが難しかった
が、本発明では蛍光発色であるためこのような不具合は
なく、また写真にデータを撮っても明確に判別すること
ができ、データの保存が容易である。
【００５４】また、ＡＭＰＰＤ法ではＸ線フィルムの感
光が終了するまでデータを得ることができないため、実
験の失敗は作業が全て終了しなければわからないが、本
発明では蛍光発色によるものであるため作業中から蛍光
の発色を見ることができ、実験の経過を確認しながら操
作することができるなど、操作性に優れている。
光が終了するまでデータを得ることができないため、実
験の失敗は作業が全て終了しなければわからないが、本
発明では蛍光発色によるものであるため作業中から蛍光
の発色を見ることができ、実験の経過を確認しながら操
作することができるなど、操作性に優れている。
【００５５】さらに本発明のホスフェート修飾蛍光物
質、すなわちアントラセン誘導体ホスフェートの蛍光波
長域は、核酸担体メンブレンフィルターの自発蛍光の波
長域(〜400nm)よりも長波長域(450〜600nm) であり、且
つ強い蛍光を示すため、分光学的に核酸担体メンブレン
フィルターの波長を除去することができ、Ｓ／Ｎ比が向
上する。
質、すなわちアントラセン誘導体ホスフェートの蛍光波
長域は、核酸担体メンブレンフィルターの自発蛍光の波
長域(〜400nm)よりも長波長域(450〜600nm) であり、且
つ強い蛍光を示すため、分光学的に核酸担体メンブレン
フィルターの波長を除去することができ、Ｓ／Ｎ比が向
上する。
【００５６】また、アントラセン誘導体ホスフェート
が、酵素反応直後に核酸担体メンブレフィルターに迅速
に効率よく吸着して水に不溶となるため、解像度も向上
する。
が、酵素反応直後に核酸担体メンブレフィルターに迅速
に効率よく吸着して水に不溶となるため、解像度も向上
する。
【００５７】
（実施例１） （１）文献Tetrahedron Vol.11,pp.133,(1960)に基づい
て、シヌアールクロリド５．６ｇ（０．０３ｍｏｌ）を
アセトン１５０ｍｌに溶解し、これに市販の３−ヒドロ
キシ−２−アントラセンカルボン酸−２−メチルアニリ
ド（ＳＩＧＭＡＣＨＥＭＩＫＡＬ Ｃｏ．製、商標名
ＮＡＰＨＴＯＬ ＡＳ−ＧＲ）１０ｇ（０．０３ｍｏ
ｌ）を加える。完全には溶解せず懸濁液となる。マグネ
ティックスターラーで強く攪拌し、内温を０〜５℃に保
ちながらこれに１０％ＮａＯＨ水溶液２４ｍｌ（０．０
６ｍｏｌ）を滴下する。ＮａＯＨ水溶液５００ｍｌを加
え終わってから１．５ｈｒ攪拌すると、赤褐色の溶液と
なる。このあと２％ＮａＯＨ水溶液５００ｍｌを加え
る。黄色の不溶物が析出するが、そのまま６０℃の浴温
で加熱攪拌する。結晶は徐々に溶解し４時間で反応終了
とする。反応液を室温まで冷却し、アセトンを減圧留去
する。次いで不溶物を減圧濾過して除く。水槽に濃塩酸
を注意して加え、強酸性にすると、黄色不溶物が析出す
る。２１分液ロートを用いて酢酸エチルで３回抽出、有
機層を飽和食塩水で２回中性になるまで洗い、有機層を
硫酸マグネシウムで脱水し、硫酸マグネシウムを炉去
し、酢酸エチルを減圧留去するとオレンジ色の結晶を得
る。この粗結晶を、ジメチルホルムアミドで結晶化、再
結晶化を行うと、下記の３−ヒドロキシ−２−アントラ
センカルボン酸を３ｇ得る。尚、この化合物の赤外吸収
スペクトルは、１６８４ｃｍ-1である。
て、シヌアールクロリド５．６ｇ（０．０３ｍｏｌ）を
アセトン１５０ｍｌに溶解し、これに市販の３−ヒドロ
キシ−２−アントラセンカルボン酸−２−メチルアニリ
ド（ＳＩＧＭＡＣＨＥＭＩＫＡＬ Ｃｏ．製、商標名
ＮＡＰＨＴＯＬ ＡＳ−ＧＲ）１０ｇ（０．０３ｍｏ
ｌ）を加える。完全には溶解せず懸濁液となる。マグネ
ティックスターラーで強く攪拌し、内温を０〜５℃に保
ちながらこれに１０％ＮａＯＨ水溶液２４ｍｌ（０．０
６ｍｏｌ）を滴下する。ＮａＯＨ水溶液５００ｍｌを加
え終わってから１．５ｈｒ攪拌すると、赤褐色の溶液と
なる。このあと２％ＮａＯＨ水溶液５００ｍｌを加え
る。黄色の不溶物が析出するが、そのまま６０℃の浴温
で加熱攪拌する。結晶は徐々に溶解し４時間で反応終了
とする。反応液を室温まで冷却し、アセトンを減圧留去
する。次いで不溶物を減圧濾過して除く。水槽に濃塩酸
を注意して加え、強酸性にすると、黄色不溶物が析出す
る。２１分液ロートを用いて酢酸エチルで３回抽出、有
機層を飽和食塩水で２回中性になるまで洗い、有機層を
硫酸マグネシウムで脱水し、硫酸マグネシウムを炉去
し、酢酸エチルを減圧留去するとオレンジ色の結晶を得
る。この粗結晶を、ジメチルホルムアミドで結晶化、再
結晶化を行うと、下記の３−ヒドロキシ−２−アントラ
センカルボン酸を３ｇ得る。尚、この化合物の赤外吸収
スペクトルは、１６８４ｃｍ-1である。
【００５８】
【化１７】
【００５９】（２）文献Enzyme Histochemistry に基づ
いて窒素雰囲気下で２−ヒドロキシ−３−アントラセン
カルボン酸２ｇ（８．４×１０-3ｍｏｌ）と脱水キシレ
ン３０ｍｌと２−フェニルアニリン１．２８ｇ（７．６
×１０-3ｍｏｌ）をジムロート冷却器を付けた１００ｍ
ｌナスフラスコに入れ、８０℃で１０分間攪拌する。次
いで、三塩化リン（２．８×１０-3ｍｏｌ）を加える。
そして、この混合物を２時間加熱還流する。その後、反
応液を熱いままデカンテーションして上清液をとる。次
いで４℃で冷却し、析出した沈澱物を減圧濾過で得て、
この結晶をキシレン、水で洗う。この沈澱物を３％ＨＣ
ｌ水溶液に入れ、１０分間加熱する。熱いうちに減圧濾
過し、さらに沈澱物を熱水で洗い、乾燥させる。この粗
結晶をジメチルホルムアミド／メタノール＝１：１で再
結晶して、下記の式で表される３−ヒドロキシ−２−ア
ントラセンカルボン酸２−フェニルアニリドを５２０ｍ
ｇ得た。
いて窒素雰囲気下で２−ヒドロキシ−３−アントラセン
カルボン酸２ｇ（８．４×１０-3ｍｏｌ）と脱水キシレ
ン３０ｍｌと２−フェニルアニリン１．２８ｇ（７．６
×１０-3ｍｏｌ）をジムロート冷却器を付けた１００ｍ
ｌナスフラスコに入れ、８０℃で１０分間攪拌する。次
いで、三塩化リン（２．８×１０-3ｍｏｌ）を加える。
そして、この混合物を２時間加熱還流する。その後、反
応液を熱いままデカンテーションして上清液をとる。次
いで４℃で冷却し、析出した沈澱物を減圧濾過で得て、
この結晶をキシレン、水で洗う。この沈澱物を３％ＨＣ
ｌ水溶液に入れ、１０分間加熱する。熱いうちに減圧濾
過し、さらに沈澱物を熱水で洗い、乾燥させる。この粗
結晶をジメチルホルムアミド／メタノール＝１：１で再
結晶して、下記の式で表される３−ヒドロキシ−２−ア
ントラセンカルボン酸２−フェニルアニリドを５２０ｍ
ｇ得た。
【００６０】
【化１８】
【００６１】（３）３−ヒドロキシ−２−アントラセン
カルボン酸−２−フェニルアニリド５２０ｍｇ（１．３
４×１０-3ｍｏｌ）を窒素雰囲気下で脱水ピリジン５ｍ
ｌに溶かし、０℃で３０分攪拌し、同様に冷却したオキ
シ塩化リン（３．３×１０-3ｍｏｌ）を加えて０℃で４
時間攪拌した。その後、氷を加えて反応を留めた。反応
物を逆相シリカゲルクロマトグラフィー精製すると下記
の式で表される３−ヒドロキシ−２−アントラセンカル
ボン酸−２−フェニルアニリドホスフェートを３２０ｍ
ｇ得た。収率は６０％であった。
カルボン酸−２−フェニルアニリド５２０ｍｇ（１．３
４×１０-3ｍｏｌ）を窒素雰囲気下で脱水ピリジン５ｍ
ｌに溶かし、０℃で３０分攪拌し、同様に冷却したオキ
シ塩化リン（３．３×１０-3ｍｏｌ）を加えて０℃で４
時間攪拌した。その後、氷を加えて反応を留めた。反応
物を逆相シリカゲルクロマトグラフィー精製すると下記
の式で表される３−ヒドロキシ−２−アントラセンカル
ボン酸−２−フェニルアニリドホスフェートを３２０ｍ
ｇ得た。収率は６０％であった。
【００６２】
【化９】
【００６３】（実施例２〜８）上記した実施例１と同様
に、各種のアニリン類を用いてアントラセン誘導体ホス
フェートを合成した。各実施例に用いるアニリン類、合
成されたアントラセン誘導体ホスフェート、及びそれら
の名称を図１乃至図２に示す。
に、各種のアニリン類を用いてアントラセン誘導体ホス
フェートを合成した。各実施例に用いるアニリン類、合
成されたアントラセン誘導体ホスフェート、及びそれら
の名称を図１乃至図２に示す。
【００６４】（評価）ナフトール誘導体ホスフェートの
核酸プローブとしての有用性を確かめるために、ベーリ
ンガー・マンハイム（Boehringer Mannheum)社のＤＮＡ
Labeling and Detection Kit 、及びアントラセン誘導
体ホスフェートとしての、３−ヒドロキシ−２−アント
ラセンカルボン酸−２−フェニルアニリドを用い、ナイ
ロンメンブレンフィルター上でＤＮＡの検出を行った。
核酸プローブとしての有用性を確かめるために、ベーリ
ンガー・マンハイム（Boehringer Mannheum)社のＤＮＡ
Labeling and Detection Kit 、及びアントラセン誘導
体ホスフェートとしての、３−ヒドロキシ−２−アント
ラセンカルボン酸−２−フェニルアニリドを用い、ナイ
ロンメンブレンフィルター上でＤＮＡの検出を行った。
【００６５】即ち、ディゴキシゲニン（以下、Ｄｉｇと
称する。）によりλＤＮＡを標識し、０ｆｇ、２．５ｆ
ｇ、５ｆｇ、１０ｆｇ、２０ｆｇ、４０ｆｇ、８０ｆ
ｇ、４００ｆｇ、２ｐｇとなるように希釈を行い、ナイ
ロンメンブレンフィルターにスポットし（図３）、減圧
下８０°Ｃ、３０分加熱することにより固定した。な
お、この際すべてのスポットが非特異的ＤＮＡとして１
００ｎｇ（１００×１０-9ｇ）のニシン精子ＤＮＡを含
むようにした。図中、１はナイロンメンブレンフィルタ
ー、１１は核酸試料のスポットを示す。
称する。）によりλＤＮＡを標識し、０ｆｇ、２．５ｆ
ｇ、５ｆｇ、１０ｆｇ、２０ｆｇ、４０ｆｇ、８０ｆ
ｇ、４００ｆｇ、２ｐｇとなるように希釈を行い、ナイ
ロンメンブレンフィルターにスポットし（図３）、減圧
下８０°Ｃ、３０分加熱することにより固定した。な
お、この際すべてのスポットが非特異的ＤＮＡとして１
００ｎｇ（１００×１０-9ｇ）のニシン精子ＤＮＡを含
むようにした。図中、１はナイロンメンブレンフィルタ
ー、１１は核酸試料のスポットを示す。
【００６６】ナイロンメンブレンフィルターをブロッキ
ング処理し、アルカリホスファターゼ標識抗Ｄｉｇ抗体
と反応させ、未反応の抗体を除いた後、１００ｍＭトリ
ス（ＰＨ９．５）、１００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭｇＣ
ｌ2 溶液中で終濃度２００μｇ／ｍｌの３−ヒドロキシ
−２−アントラセンカルボン酸−２−フェニルアニリド
ホスフェート（実施例１の化合物）を反応させた。
ング処理し、アルカリホスファターゼ標識抗Ｄｉｇ抗体
と反応させ、未反応の抗体を除いた後、１００ｍＭトリ
ス（ＰＨ９．５）、１００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭｇＣ
ｌ2 溶液中で終濃度２００μｇ／ｍｌの３−ヒドロキシ
−２−アントラセンカルボン酸−２−フェニルアニリド
ホスフェート（実施例１の化合物）を反応させた。
【００６７】蛍光シグナルの検出は紫外線励起光源下で
ポラロイドフィルム（商標名）による写真撮影すること
により行った。
ポラロイドフィルム（商標名）による写真撮影すること
により行った。
【００６８】この評価試験の結果を表１に示す。同表に
おいて、「＋」は検出可能を、「−」は検出不能を示
す。このように、１０ｆｇという極く微少量でも充分検
出することができ、３−ヒドロキシ−２−アントラセン
カルボン酸−２−フェニルアニリドホスフェートが核酸
検出用プローブとして有用であることが判明した。
おいて、「＋」は検出可能を、「−」は検出不能を示
す。このように、１０ｆｇという極く微少量でも充分検
出することができ、３−ヒドロキシ−２−アントラセン
カルボン酸−２−フェニルアニリドホスフェートが核酸
検出用プローブとして有用であることが判明した。
【００６９】また、実施例２乃至８に示すアントラセン
誘導体ホスフェートについても同様に試験を行った。こ
の結果も表１に合わせて記す。このように、どのアント
ラセン誘導体についても核酸検出用プローブとして有用
であることが判明した。
誘導体ホスフェートについても同様に試験を行った。こ
の結果も表１に合わせて記す。このように、どのアント
ラセン誘導体についても核酸検出用プローブとして有用
であることが判明した。
【００７０】
【表１】
【図１】実施例１乃至実施例４によるアントラセン誘導
体ホスフェート及び合成に用いるアニリン類の一覧を示
す。
体ホスフェート及び合成に用いるアニリン類の一覧を示
す。
【図２】実施例５乃至実施例８によるアントラセン誘導
体ホスフェート及び合成に用いるアニリン類の一覧を示
す。
体ホスフェート及び合成に用いるアニリン類の一覧を示
す。
【図３】ＤＮＡ検出テストを行うナイロンメンブレンフ
ィルターを示す。
ィルターを示す。
１ ナイロンメンブレンフィルター（核酸試料担体フ
ィルター） １１ 核酸試料のスポット
ィルター） １１ 核酸試料のスポット
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 近 藤 恭 光 愛知県刈谷市朝日町２丁目１番地 アイシ ン精機株式会社内 (72)発明者 堀 浩 北海道札幌市北区新琴似三条十丁目５番18 号
Claims (4)
- 【請求項１】 核酸あるいは蛋白質よりなる被検体にホ
スファターゼを結合させ、次いで該ホスファターゼにア
ントラセン誘導体ホスフェートを反応させ、その後これ
らに励起光を照射して、これにより発生する蛍光を検出
することを特徴とする核酸及び蛋白質の検定方法。 - 【請求項２】 請求項１において、検定方法に用いるア
ントラセン誘導体ホスフェートは，一般式Ｐ−Ａｎ−Ｂ
−Ｒで表され、Ａｎは，アントラセン環部であり、Ｐ
は、上記アントラセン環のＣ３位に結合するホスフェー
トであり、Ｂは、上記アントラセン環のＣ２位とＲを結
ぶ結合基であり、Ｒは、上記結合基に結合する芳香族で
あることを特徴とする核酸及び蛋白質の検定方法。 - 【請求項３】 請求項２において、Ｂの結合基はアミド
結合基であり、Ｒの芳香族は、メチル基、ジメチル基、
メトキシ基、ジメトキシ基、フェニル基、ジフェニル
基、ブロモ基、クロロ基を持ったベンゼン環であること
を特徴とする核酸及び蛋白質の検定方法。 - 【請求項４】 請求項３において、アントラセン誘導体
ホスフェートは、下記の化学構造式で表されることを特
徴とする核酸及び蛋白質等の検定方法。 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】 【化６】 【化７】 【化８】 【化９】 【化１０】 【化１１】 【化１２】 【化１３】 【化１４】 【化１５】 【化１６】
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4115640A JPH05227997A (ja) | 1991-12-27 | 1992-05-08 | アントラセン誘導体ホスフェートによる核酸及び蛋白質の検定方法 |
| US07/994,727 US5385823A (en) | 1991-12-27 | 1992-12-22 | Method for assaying nucleic acids and proteins using anthracene derivative phosphate |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3-347019 | 1991-12-27 | ||
| JP34701991 | 1991-12-27 | ||
| JP4115640A JPH05227997A (ja) | 1991-12-27 | 1992-05-08 | アントラセン誘導体ホスフェートによる核酸及び蛋白質の検定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05227997A true JPH05227997A (ja) | 1993-09-07 |
Family
ID=26454123
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4115640A Pending JPH05227997A (ja) | 1991-12-27 | 1992-05-08 | アントラセン誘導体ホスフェートによる核酸及び蛋白質の検定方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5385823A (ja) |
| JP (1) | JPH05227997A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109212187A (zh) * | 2018-09-06 | 2019-01-15 | 东华大学 | 一种检测多环芳烃的类酶联免疫试剂盒及其应用 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030036106A1 (en) * | 1996-10-28 | 2003-02-20 | Burke Thomas J. | Kinase and phosphatase activity measurement using fluorescence polarization |
| EP1941903A1 (en) * | 2007-01-03 | 2008-07-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prophylaxis and treatment of PRDC |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4978614A (en) * | 1988-10-26 | 1990-12-18 | Tropix, Inc. | Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes |
| DE4114131C2 (de) * | 1991-04-30 | 1994-04-07 | Bernhard Dr Koch | Die Azur B - Eosin - APAAP Färbung, ein Verfahren zur simultanen hämatologischen und immunologischen Charakterisierung von Zellen |
-
1992
- 1992-05-08 JP JP4115640A patent/JPH05227997A/ja active Pending
- 1992-12-22 US US07/994,727 patent/US5385823A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109212187A (zh) * | 2018-09-06 | 2019-01-15 | 东华大学 | 一种检测多环芳烃的类酶联免疫试剂盒及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5385823A (en) | 1995-01-31 |
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