JPH042238B2

JPH042238B2 -

Info

Publication number: JPH042238B2
Application number: JP60091648A
Authority: JP
Priority date: 1985-04-27
Filing date: 1985-04-27
Publication date: 1992-01-16
Also published as: JPS61249999A

Description

【発明の詳細な説明】

〔技術分野〕本発明は、胃低分化型腺癌由来細胞株（MKN
−45）を免疫原として作製されたハイブリドーマ
の産生する特定の特性を持つモノクローナル抗体
に関する。〔従来技術〕癌研究の究極の目標は、抗癌、制癌作用を示す
物質の探索と、癌の早期発見、即ち早期診断法の
確立にあるといえる。従来、癌に関して種々の薬
剤、治療法、試薬が開発されているが、これらは
いずれも癌細胞ばかりでなく、正常組織、正常細
胞にも影響を与え、如何に有効な薬剤とはいえ、
その副作用のために使用が著しく制限されている
のが現状である。免疫反応（抗原−抗体反応）は、非常に特異性
が高いものであるが、従来のポリクローナル抗体
ではいかに吸収操作を繰り返しても、例えばリン
パ球間のサブセツトのような、非常にマイナーな
抗原決定基によつて区別されるものを認識するこ
とは困難であつた。ミルステイン（Milstein）ら
によつて開発されたモノクローナル抗体〔ケーラ
ー、ジーおよびミルステイン、シー：ネーチヤー
（Ko¨hler、G.and Milstein、C.：Nature）256、
495、（1975）〕は、この壁を打ち破るものであり、
癌細胞上の癌特異抗原、あるいは癌関連抗原を特
異的に認識するモノクローナル抗体を得ることに
より、正常組織へのダメージを与えずに癌細胞の
みを特異的に排除できるものと期待される。ま
た、モノクローナル抗体を用いた診断薬あるいは
検査試薬は、正常血清成分に対する交叉反応がな
く、感度良く、癌関連抗原、癌特異抗原を検出で
きるものと思われる。〔発明が解決しようとする問題点〕本発明は、特定の癌抗原に対して特異的に反応
するモノクローナル抗体を提供するものである。
さらに本発明は、上記特定癌に対する抗原検出用
試薬を提供するものである。〔問題点を解決するための手段〕本発明は、胃癌、特に胃癌の細胞膜表在型抗原
に対して特異的に反応するモノクローナル抗体よ
りなるものである。本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞
融合によつて製造される。すなわち、抗体産生細
胞と骨髄腫細胞との間に、融合ハイブリツドを形
成させ、該ハイブリツドをクローン化し、上記癌
細胞（即ち、上記特性を有する特定抗原）に対し
特異性を示す抗体を産生するクローンを選択する
ことによつて製造される。その操作は、免疫用細
胞として下記細胞を使用する以外は、従来既知の
方法に準ずればよい。抗体産生細胞は、例えば株化癌細胞より得られ
る抗原によつて免疫させた動物からの脾細胞、リ
ンパ節細胞、Ｂ−リンパ球である。株化癌細胞と
しては、胃低分化型腺癌由来の株化癌細胞
（MKN−45）が例示される。免疫させる動物としてはマウス、ラツト、馬、
ヤギ、ウサギなどが例示される。抗体産生細胞は、たとえば次のようにして製造
される。すなわち、胃癌由来細胞株MKN−45
（低分化型腺癌）を超音波処理等で破壊し、遠心
分離（例、10000〜20000G、10〜60分）を行つて
細胞抽出液を得、この上清を分子量10万〜200万
の物質の分離が可能なゲル濾過担体（例、セフア
デツクス、セフアクリル、セフアロース、バイオ
ゲル等）を使用して分子篩し、高分子画分と低分
子画分とに分離する。かくして得られた分子量が
約70万〜150万の高分子画分は、たとえば、完全
フロインドアジユバント（Freund Complete
adjuvant）と混和後、動物の免疫用として使用
する。免疫は動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内
に約1.5×10⁵〜10⁸cell相当分／回を週１〜２回、
３〜７週間投与することによつて行われる。最終
免疫より約３〜５日後、免疫動物から抗体産生細
胞を分取する。骨髄腫細胞としては、マウス、ラツト、ヒト等
由来のものが使用される。抗体産生細胞と骨髄細
胞とは同種動物由来のものであることが好まし
い。細胞融合は、例えばジー、ケーラー（G.
Ko¨hler）〔ネーチヤー（Nature）256、495、
（1975）〕に記載の方法またはこれに準ずる方法に
よつて行われる。この際、30〜50％ポリエチレン
グリコール（平均分子量1000〜4000）を用いて30
〜40℃の温度下、約１〜３分間程度反応させるこ
とによつて行われる。細胞融合によつて得られた細胞はスクリーニン
グに付される。すなわち、当該細胞を、例えばマ
イロプレート中で培養し、増殖の見られたウエル
の培養上清中の抗体価を、例えば酵素抗体法など
によつて測定し、さらに例えば限界希釈法によつ
てクローニングを行つてクローンを得る。このク
ローンは、例えばあらかじめプリスタンを投与し
たBALB／Ｃマウスの腹腔内へ移植し、10〜30
日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を
採取し、検定する。得られたクローンは、次い
で、目的とするモノクローナル抗体を産生するク
ローンのスクリーニングに付される。スクリーニ
ングは、酵素抗体法などによつて追跡される。選
ばれたクローンの産生するモノクローナル抗体の
回収は、IgGの精製法として従来既知の硫安分画
法、PEG分画法、エタノール分画法、陰イオン
変換体を応用することで、容易に達成される。〔発明の効果〕本発明によつて得られたモノクローナル抗体
は、腺癌系に特異的と考えられ、細胞膜表在型抗
原を認識し、かつ正常組織由来培養細胞、赤血
球、白血球及び正常組織とは反応せず、癌特異的
な抗原を認識するものと推測される。すなわち、
本発明からなるモノクローナル抗体は腫瘍のイメ
ージングおよび制癌剤とコンジユゲートさせ
targeting therapy（ターゲテイングセラピイ）
等への臨床応用が期待される。実施例 (1) 免疫用癌関連抗原の調製：株化胃癌細胞（MKN−45株）を超音波処理
法で破壊し、遠心分離（15000G、30分）を行
い細胞抽出液を得た。この上清をセフアロース
4Bのカラムを用い、ゲル濾過し、高分子画分
と低分子画分とに分離した。分子量が約70万〜150万の高分子画分を、完
全フロインドアジユバントと混和後、マウスへ
週１回、５週間免疫した。最終免疫より４日後にマウス脾臓を取り出
し、以下の細胞融合に用いた。 (2) 細胞融合およびクローニング：上記のマウス脾細胞と、マウスミエロマー×
63.653〔ジヤーナルオブイムノロジー（J.
Immunol.）123、1548、（1979）〕とを４：１の
割合で混合し、ケーラー（Kohler）らの方法
〔イムノロジカルメソツド（アカデミツク
プレス）、ニユーヨーク（Immunological
Method（Academic Press）、New York、
391、1979）〕を一部改変して、42.6％ポリエチ
レングリコール（平均分子量1000）を用いて２
分間反応させることにより細胞融合を行つた。本細胞を96ウエルマイクロプレートに植え込
み、HAT培地（表１）で９〜14日間培養後、
HT培地（表１）に移行し、更にフラスコ（25
cm²）に培養できるようになつてからＤ−MEM
培地（表１）で培養した。増殖の見られたウエ
ルの培養上清中の抗体価を酵素抗体法により測
定し、適切なウエルから限界希釈法により、求
めるハイブリドーマのクローニングを行つた。すなわち、マイクロタイタープレートにウエ
ル当たり25000個のマウス腹腔浸出細胞を植え
込み、次にＤ−MEM培地で、10、５、2.5、１
個／0.1mlとなるようにハイブリドーマを希釈
し、これをマイクロタイタープレートに0.1ml
ずつ植え込み培養した。４日後にＤ−MEM培
地を0.1ml加え、以後４〜７日に１度培地の半
量交換を行つた。培養開始後10〜20日で肉眼で
認められるコロニーが形成され、クローン株を
得た。

【表】 (3) スクリーニング法得られたハイブリドーマについて目的とする
モノクローナル抗体を産生するクローンのスク
リーニングを次のように行つた。 (イ) 方法の説明以下のようにして酵素抗体法を行つた。抗原（各種株化癌細胞または部分精製癌関
連抗原または正常細胞）をコートしたマイク
ロプレートに検体を加え、37℃で１時間反応
させ、洗浄後ペルオキシダーゼ標識抗マウス
免疫グロブリン（IgG＋IgA＋IgM）ウサギ
抗体を加え、さらに37℃で１時間反応させ
た。未反応の標識抗体を洗浄後、Ｏ−フエニ
レンジアミン液を加え、室温にて30分間反応
させた後、2M硫酸を加えて反応を停止させ、
490nｍの吸光度を測定した。この方法で各
種細胞との反応性を調べた。なお白血球との
交叉反応性はＢ−ガラクトシダーゼ（Ｂ−
Galactosidase）標識抗体を用いた。その他、
ヒト赤血球との交叉反応性は、ヒトＡ、Ｂ、
Ｏ型赤血球を混合し、PHA法で検討した。
癌胎児性抗原（Carcinoembryonic antigen）
（CEA）との交叉反応性は、CEA感作血球を
用いPHA法で行つた。モノクローナル抗体がMKN−45の分泌物
抗原か或いは細胞膜抗原のどちらを認識して
いるかの検討のために、MKN−45の培養上
清でモノクローナル抗体をMKN−45細胞そ
のものとの反応性が阻害されるかどうかを調
べた。酵素抗体法を用いたインヒビシヨンテス
ト（Inhibition Test）の具体的な方法は、
以下の通りである。即ち、ハイブリドーマの
上清を酵素抗体法でタイトレーシヨン
（titration）を行い、それより判断して適当
な希釈倍率を決める。次に、MKN−45培養
上清を５〜25培濃縮したものを原液として、
１：５、１：5²……１：5ⁿ希釈したものを適
当に希釈したハイブリドーマ上清にそれぞれ
等量加え、１時間、37℃でインキユベーシヨ
ンする。そして、通常の酵素抗体法（ターゲ
ツト：MKN−45）の系でアツセイ（assay）
を行つた。 (ロ) スクリーニングの流れ１次スクリーニング：ターゲツトセル
（MKN−45）および正常由来細胞（Flow
2000）を用いた酵素抗体法で、MKN−45に
対して陽性でFlow 2000に対して陰性なwell
を選抜。２次スクリーニング：さらに他の正常由来
細胞株及び赤血球、白血球を用いたアツセイ
系ですべてに陰性のwellを選抜。３次スクリーニング：以上で選抜された細
胞株を２〜３回クローニングし、その培養上
清を多くの癌由来のcell lineとの反応性を検
討するとともに、分泌型或いは細胞膜型抗原
のどちらを認識するかを、酵素抗体法を用い
たインヒビシヨンテストで同定する。 (4) モノクローナル抗体の回収、精製 (イ) 上記のスクリーニングによつて得られたク
ローン株を予め0.5ml／匹プリスタンを投与
した４週令以後のBALB／Ｃマウス（雄）
の腹腔内へ2.0〜3.0×10⁷cell／匹移植し、10
〜14日後にモノクローナル抗体を高濃度に含
む腹水を採取した。この腹水を0.9％NaCl液を加え５〜10倍希
釈した後、硫酸アンモニウムを40％濃度とな
るように加え、沈澱画分を分取した。この沈
澱画分をなるべく少量の0.9％NaCl液で溶解
させた後、0.9％NaCl液を外液として透析し
た。透析終了後、高速液体クロマトグラフイ
ー（TSK−Gell Ｇ−3000SW）を行い、IgG
画分を得、精製モノクローナル抗体とした。 (ロ) 本クローン株は、BSA含無血清培地中で
も増殖させることができる。すなわち、0.5
％BSA含無血清培地（RITC55−９倍地）中
で増殖させ、培養上清を集めた。この上清に
硫酸アンモニウムを40％濃度となるように加
え、沈澱画分を分取し、これに0.9％NaCl液
を加え、溶解させた後、さらに硫酸アンモニ
ウムを40％濃度となるように加え沈澱画分を
分取した。この沈澱画分をなるべく少量の
0.9％NaCl液で溶解させた後、0.02M生理的
リン酸緩衝液を外液として透析した。透析終
了後、この溶液を再び抗体胎児血清抗体（ウ
サギ）を結合したセフアロース4Bカラムに
通した後DEAE−セルロフアインカラムに加
え、カラムクロマトグラフイーを行つた。 DEAE−セルロフアインクロマトグラフイ
ーの最初のピーク部分を精製モノクローナル
抗体とした。 (5) モノクローナル抗体の特性かくしてスクリーニングされたクローンの産
生するモノクローナル抗体の性状は、表２及び
表３のとおりである。免疫グロブリンのクラス
はオクタロニー法で検定した。なお、本発明で用いた酵素抗体法は、ケネツ
ト（Kennett）らの方法〔モノクロナルアン
チボデイー（プレニウムプレス）ニユーヨー
クロンドン、376、（1980）〕に準じて細胞を
そのまま利用するエリザ（ELIZA）法〔エン
ザイムリンクトウイムノソルベントアツ
セイ（Enzyme Linked Immunosorbent
Assay）〕（以下、CELISAと略す）である。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１胃低分化型腺癌由来細胞株（MKN−45）を
免疫原として作製されたハイブリドーマの産生す
る以下の特性を持つモノクローナル抗体： Igクラス（Light鎖）：IgG_2a 認識抗原タイプ：細胞表面抗原癌細胞との反応性：次の癌細胞に対して陽性
を示す。肺癌（PC−３）、結腸癌（COLO−201）、胃
癌（MKN−45）、胃癌（KATO−）、肝癌
（HEK）、鼻咽腔癌（KB）。