JPH0422557B2 - - Google Patents
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- JPH0422557B2 JPH0422557B2 JP57058439A JP5843982A JPH0422557B2 JP H0422557 B2 JPH0422557 B2 JP H0422557B2 JP 57058439 A JP57058439 A JP 57058439A JP 5843982 A JP5843982 A JP 5843982A JP H0422557 B2 JPH0422557 B2 JP H0422557B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は発酵法によるグアノシン−5′−モノリ
ン酸（以下「GMP」と記す）の製造法に関する。 発酵法によるGMPの生産に関しては、アデニ
ン要求性、又はそれに各種のプリンアナログ耐性
を付与したバチルス属の微生物（特公昭42−
6158）ブレビバクテリウム属の微生物（特公昭42
−6158）、エシエリヒア属の微生物（特公昭43−
11760）、アデニン要求性およびデコイニン又はメ
チオニンスルフオキシド耐性のバチルス属の微生
物（特公昭56−12438）等がGMPを生産すること
が知られている。 本発明者らは上述のような従来のGMPの製造
法に対し、プリンアナログ耐性又はデコイニン耐
性を有するバチルス属の染色体より得たプリンア
ナログ耐性又はデコイニン耐性に関与する遺伝子
領域が組み込まれているベクターをアデニン要求
性のバチルス属の変異株に含有せしめたGMP生
産性バチルス属の微生物が著量のGMPを蓄積す
ることを見い出した。 本発明はこの知見に基づいて完成されたもので
ある。本発明でいうプリンアナログとはバチルス
属の微生物の増殖を抑制し、かつその抑制がヒポ
キサンチン、イノシン、５−イノシン酸、グアニ
ン、グアノシン、5′−グアニル酸等を培地中に添
加すれば全体的又は部分的に解除されるようにも
のである。例えば、８−アザグアニン、８−アザ
ヒポキサンチン、８−アザアデニン、２，６−ジ
アミノブリン、６−メルカプトプリン、６−メル
カプトプリンボシド、８−メルカプトグアノシン
等がある。 プリンアナログ耐性又はデコイニン耐性に関与
する染色体遺伝子の供与菌はバチルス属のプリン
アナログ耐性又はデコイニン耐性を有する変異株
ならどのような菌株でもよいが、耐性度のより高
いものが望ましい。又、アデニン要求性であつて
GMP生産能を有する菌株を親株として、プリン
アナログ耐性又はデコイニン耐性を有する変異株
を誘導すれば、GMP生産能がより高い変異株を
得ることができ、このような変異株を遺伝子供与
菌として用いればよりよい結果が得られる。又、
遺伝子供与菌として、アデニン要求性及びプリン
アナログ又はデコイニン耐性変異株に、さらに従
来知られているようなGMP生産能を向上させる
ような性質、例えばメチオニンスルホキシド耐
性、サイコフラニン耐性、サルフアグアニジン耐
性等を深した菌株を誘導して用いれば、GMPの
生産能がより高い菌株を得ることができ、このよ
うな菌株を染色体遺伝子供与菌として用いれば、
より好ましい結果が得られる。 遺伝子供与菌より染色体DNAを抽出する方法
は、例えばJ.Bacteriol.、89、1065（1965）に記載
されているような通常の方法により行うことがで
きる。 ベクターDNAとしては、バチルス属の菌体中
で複製するプラスミド又はフアージならば、どの
ようなものでもよい。例えばスタフイロコツカス
属微生物由来のpT127、pC194、pC221、pC223、
pUB112（以上、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、74、
1680（1977）参照）、pUB110（J.Bacteriol.、134、
318（1978）参照）、pTP4、pTP5（以上、
Microbiol Letters、５、55（1978）参照）、枯草
菌由来のpLS15、pLS28（以上、J.Bacteriol.、
131、699（1977）参照）、pLS13（J.Bacteriol.、
129、1487（1977）参照）、pPL1、pPL2（以上、J.
Bacteriol.、124、484（1975）参照）、テンペレー
トフアージとしても知られるrho11（Gene.、５、
89（1979））、phi105（Gene.、５、87（1979））、
SPO2（Gene.、７、51（1979））等がある。更に上
記プラスミドをもとにして構築した複合プラスミ
ドも当然のことながらベクターDNAとして利用
できうる。 染色体DNA及びベクターDNAはそれぞれ制限
エンドヌクレアーゼを用いて切断する。それぞれ
のベクターには適した制限エンドヌクレアーゼが
あるが、それは上記ベクターについての記載があ
る文献等に示されてある。染色体DNAについて
は制限エンドヌクレアーゼによる切断が部分的に
行なわれるように反応条件を調節すれば多くの種
類の制限酵素が利用できる。 かくして得られた染色体NDA断片と、切断さ
れたベクターNDAとを連結せしめる方法は、リ
ガーゼを用いる通常の法が使用できる。一方、タ
ーミナルトランスフエラーゼを用いて染色体
NDA断片と開裂したベクターDNAとにデオキシ
アデニール酸とデオキシシチジル酸をそれぞれ付
加し、混合した後アニーリングして連結せしめる
方法も利用し得る。 かくして得られた染色体NDA断片を組み込ん
で組換えベクターNDAの受容菌はバチルス属の
アデニン要求性を有する変異株からどのようなも
のでもよいが、プリンアナログ耐性又はデコイニ
ン耐性を有していない菌株を用いれば、形質転換
株を選択する際に好都合である。更に組換え
DNA受容菌としてプリンアナログ耐性又はデコ
イニン耐性を有し、より高いGMP生産能を有す
る菌株を用いれば、よりGMP生産性の高い形質
転換株を得ることができる。受容菌としては当然
GMP分解能がより低いものを用いなければなら
ない。 染色体NDAとベクターの混合物をNDA受容菌
に導入するには例えばMolec.Gene.Genet.、168、
111（1979）に記載されているような通常の形質転
換法が利用できる。 GMP生産能を有し、プリンアナログ耐性又は
デコイニン耐性に関与する遺伝子領域が組み込ま
れているベクターを含有する形質転換株を選択す
るには、例えばベクター受容菌としてアデニン要
求性変異株を用いて形質転換し、プリンアナログ
又はデコイニンを含有する培地で生育してくる菌
株を選択すればよい。又、ベクターNDA上の抗
生物質耐性等の性質を併せもつ菌株を選択できる
ような培地を用いればより選別が容易である。 このようにして、一旦選別されたプリンアナロ
グ耐性等に関与する遺伝子領域が組み込まれてい
る組換えベクターNDAは、形質転換株より抽出
後、他の組換えベクターNDA受容菌、例えば
GMP生産能を有する菌株に導入することにより
GMP蓄積量をさらに増大させることができる。 かくして得られたGMP生産菌を培養してGMP
を製造する方法は従来知られている方法と特に変
らない。 即ち、このような微生物を培養する培地は、炭
素源、窒素源、無機塩類、アデニンおよび必要な
らば更にその他の微量栄養素を含有する通常の液
体培地である。炭素源としては、グルコース、糖
蜜、デンプン加水分解液などの炭水化物が望まし
い。窒素源としては硫安、硝安、塩安、リン安等
のアンモニウム塩、硝安等の硝酸塩、尿素、アン
モニアガス等が使用できる。また栄養要求物質と
してのアデニンはアデニン、アデニン鉱酸塩、ア
デノシン、アデニル酸等のいずれも使用可能であ
る。また必要に応じてビタミン酸、アミノ酸、ア
デニン以外の核酸塩基などの微量栄養素を添加す
れば、GMP蓄積量を増すことができる場合が多
い。 培養方法は好気的条件がく、また、培養温度は
27ないし38℃の範囲が好適である。場合によつて
は培養途中にて培養温度を変更させてもよい。培
養開始時および培養中に培養液のPHを5.0ないし
9.0に調節し培養するのが望ましい。PHの調整に
は無機酸、有機酸あるいはアルカリさらに尿素、
炭酸カルシウム、アンモニウム水、アンモニアガ
スなどを使用することが出来る。かくして２ない
し５日間培養すれば著量のGMPが培地中に蓄積
される。 培養液からGMPを採取する方法は、イオン交
換樹脂を用いる等通常の方法でよい。 実施例 バチルス・ズブチリスAJ11711（アルギニン、
ロイシン複要求株）からＮ−メチル−N′−ニト
ロ−ニトロソグアニン変異処理（500μｇ／mlの
Ｎ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジンに０℃にて30分間108コ／mlの菌体を接触せ
しめた）によつてアデニン要求株の中からGMP
生産能を有する菌株AJ11853（FERM−P6484）
（アルギニン要求性、ロイシン要求性、アデニン
要求性）を得た。さらにこのアデニン要求株から
同様の変異処理によつて誘導したGMP生産菌
AJ11854（FERM−P6485）（アルギニン要求性、
ロイシン要求性、アデニン要求性、８−アガグア
ニン耐性）、AJ11855（FERM−Ｐ）（アルギニン
要求性、ロイシン要求性、アデニン要求性、デコ
イニン耐性）、AJ11856（アルギニン要求性、ロイ
シン要求性、アデニン要求性、８−アザグアニン
耐性、デコイニン耐性）を得た。 (1) 染色体DNAの調整 AJ11854、AJ11855及びAJ11856を各々１
の「Bacto−Penassay Broth」（Difco社製）
中で35℃、約２時間振盪培養を行い、対数増殖
期の菌株を集菌後、通常のNDA抽出法（J.
Bacteriol.、89、1065（1965））により染色体
NDAを抽出、精製し、最終AJ11854から3.1
mg、AJ11855から2.6mg、AJ11856から3.6mgを
得た。 (2) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 プリンアナログ耐性又はデコイニン耐性を支
配する遺伝子領域をクローニングするため、そ
のベクターとして自立増殖性のプラスミド
pUB110（カナマイシン耐性、ネオマイシン耐
性を発現する）を用いた。(1)で得られた染色体
DNAを各々5μｇずつとプラスミドpUB110 5μ
ｇずつをそぞれ制限エンドヌクレアーゼEcoRI
を37℃にて60分作用させてDNA鎖を切断した。
65℃で10分間熱処理後、各両反応液を混合し、
ATPおよびジチオスライトール存在下、T4フ
アージ由来のDNAリガーゼにて10℃にて24時
間、DNA鎖の連絡反応を行なつた。 (3) 組換えプラスミドNDAによる形質転換 バチルス・ズブチリスAJ11853を
「Penassay−Broth」（Difco社製）に接触した
30℃で１晩振とう培養を行ない、第培養培地
（グルコース５ｇ／、（NH4）2SO42ｇ／、
KH2PO46ｇ／、K2HPO414ｇ／、
MgSO4・7H2O0.2ｇ／、クエン酸ナトリウ
ム１ｇ／、酵母エキス２ｇ／、Ｌ−アルギ
ニン250mg／、Ｌ−ロイシン50mg／、アデ
ニン50mg／を含む）に接触し、37℃にて４時
間振盪培養を行なつた後、さらに第培養培地
（グルコース５ｇ／、（NH4）2SO42ｇ／、
KH2PO46ｇ／、K2HPO414ｇ／、
MgSO4・7H2O1.2ｇ／、クエン酸ナトリウ
ム１ｇ／、酵母エキス0.2ｇ／、Ｌ−アル
ギニン50mg／、Ｌ−ロイシン５mg／、アデ
ニン50mg／を含む）に接触し、37℃で1.5時
間振盪培養を行なうことによつて、いわゆるコ
ンピテントな（NDA取込能を有する）細胞を
調製した（参考文献J.Bacteriol.、81、741
（1961））。このコンピテント細胞懸濁液に(2)で
得たNDA溶液を各々、別々に加えて37℃でさ
らに２時間振盪を行なつて形質転換反応を完了
させた。 次に菌株AJ11853のDNA形質転換株を含む
懸濁液をカナマイシン5μｇ／ml、８−アザグ
アニン100μｇ／を含有する最小培地（最小
培地）、カナマイシン5μｇ／ml及びデコイニ
ン1000μｇ／mlを含有する最小培地（最小培地
）、カナマイシン5μｇ／ml及び８−アザグア
ニン100μｇ／ml及びデコイニン1000μｇ／mlを
含有する最小培地（最小培地）のプレート上
に塗沫し37℃で培養した。（最小培地はグルコ
ース５ｇ／、（NH4）2SO42ｇ／、
KH2PO46ｇ／、K2HPO414ｇ／、
MgSO4・7H2O0.2ｇ／、クエン酸ナトリウ
ム１ｇ／、Ｌ−アルギニン100mg／、Ｌ−
ロイシン100mg／、アデニン50mg／及び寒
天20ｇ／、PH7.2）の組成を有するものであ
る。）培養３日後には上記最小培地上に６個
のコロニーが、最小培地上に５個のコロニー
が、最小培地上に３個のコロニーそそれぞれ
出現したので、これらを釣菌し各クローンをそ
れぞれ純粋に分離した。 得られた形質転換株の性質はいずれもアルギ
ニン要求性、ロイシン要求性、アデニン要求
性、カナマイシン耐性を有し、かつ最小培地
から得られた形質転換株は８−アザグアニン耐
性、最小培地から得られた形質転換株はデコ
イニン耐性、最小培地から得られた形質転換
株は８−アザグアニン耐性及びデコイニン耐性
の性質をそれぞれ併せもつ菌株であつた。 (4) 組換えプラスミドNDAの抽出 (3)で得られたクローンのうち、最小培地上
のクローンAJ11857（FERM−P6488）及び最
小培地上のクローンAJ11858（FERM−
P6489）、倍地上のクローンAJ11859を用いて
C.I.kadoらの方法（J.Bacteriol.、145、1368
（1981））に基づいたDNA抽出法により各々
別々に菌体DNAを抽出し、アガロース電気泳
動によつてプラスミドDNAと染色体DNAを分
離し、プラスミドDNA区分を各々分画、採取
し、精製した。得られたプラスミド、即ち菌株
AJ11857、AJ11858、AJ11859から得られたプ
ラスミドを(3)で述べたのと同様の方法によつて
各々の原株のGMP生産菌株AJ11854、
AJ11855、AJ11856へ形質転換法により再導入
し、各々の菌株に対応するカナマイシン耐性株
AJ11860、AJ11861（FERM−P6490）及び
AJ11870（FERM−P6501）を得た。 (5) GMPの生産；AJ11853、AJ11854、
AJ11855、AJ11856、AJ11857、AJ11858、
AJ11859、AJ11860、AJ11861、AJ11870を培
養した結果を第１表に示す。培養方法は500ml
容肩付フラスコにGMP生産培地（グルコース
80ｇ／、NH4Cl15ｇ／、KH2PO410ｇ／
、K2HPO414ｇ／、MgSO4・7H2O5ｇ／
、FeSO4・7H2O10mg／、MnSO4・
7H2O10mg／、CaCl2・2H2O ２ｇ／、ア
デニン200mg／、大豆蛋白加水分解液40mg／
、アルギニン100mg／、ロイシン100mg／
及びＬ−グルタミン酸10ｇ／を含みPH6.5に
KOHで調製した。）を20mlずつ分注し、115℃
で10分間加熱殺菌した後、予め斜面培地で培養
して得た各種菌体を接触後、34℃で３日間振盪
培養を行つた。 【表】 【表】 【表】
ン酸（以下「GMP」と記す）の製造法に関する。 発酵法によるGMPの生産に関しては、アデニ
ン要求性、又はそれに各種のプリンアナログ耐性
を付与したバチルス属の微生物（特公昭42−
6158）ブレビバクテリウム属の微生物（特公昭42
−6158）、エシエリヒア属の微生物（特公昭43−
11760）、アデニン要求性およびデコイニン又はメ
チオニンスルフオキシド耐性のバチルス属の微生
物（特公昭56−12438）等がGMPを生産すること
が知られている。 本発明者らは上述のような従来のGMPの製造
法に対し、プリンアナログ耐性又はデコイニン耐
性を有するバチルス属の染色体より得たプリンア
ナログ耐性又はデコイニン耐性に関与する遺伝子
領域が組み込まれているベクターをアデニン要求
性のバチルス属の変異株に含有せしめたGMP生
産性バチルス属の微生物が著量のGMPを蓄積す
ることを見い出した。 本発明はこの知見に基づいて完成されたもので
ある。本発明でいうプリンアナログとはバチルス
属の微生物の増殖を抑制し、かつその抑制がヒポ
キサンチン、イノシン、５−イノシン酸、グアニ
ン、グアノシン、5′−グアニル酸等を培地中に添
加すれば全体的又は部分的に解除されるようにも
のである。例えば、８−アザグアニン、８−アザ
ヒポキサンチン、８−アザアデニン、２，６−ジ
アミノブリン、６−メルカプトプリン、６−メル
カプトプリンボシド、８−メルカプトグアノシン
等がある。 プリンアナログ耐性又はデコイニン耐性に関与
する染色体遺伝子の供与菌はバチルス属のプリン
アナログ耐性又はデコイニン耐性を有する変異株
ならどのような菌株でもよいが、耐性度のより高
いものが望ましい。又、アデニン要求性であつて
GMP生産能を有する菌株を親株として、プリン
アナログ耐性又はデコイニン耐性を有する変異株
を誘導すれば、GMP生産能がより高い変異株を
得ることができ、このような変異株を遺伝子供与
菌として用いればよりよい結果が得られる。又、
遺伝子供与菌として、アデニン要求性及びプリン
アナログ又はデコイニン耐性変異株に、さらに従
来知られているようなGMP生産能を向上させる
ような性質、例えばメチオニンスルホキシド耐
性、サイコフラニン耐性、サルフアグアニジン耐
性等を深した菌株を誘導して用いれば、GMPの
生産能がより高い菌株を得ることができ、このよ
うな菌株を染色体遺伝子供与菌として用いれば、
より好ましい結果が得られる。 遺伝子供与菌より染色体DNAを抽出する方法
は、例えばJ.Bacteriol.、89、1065（1965）に記載
されているような通常の方法により行うことがで
きる。 ベクターDNAとしては、バチルス属の菌体中
で複製するプラスミド又はフアージならば、どの
ようなものでもよい。例えばスタフイロコツカス
属微生物由来のpT127、pC194、pC221、pC223、
pUB112（以上、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、74、
1680（1977）参照）、pUB110（J.Bacteriol.、134、
318（1978）参照）、pTP4、pTP5（以上、
Microbiol Letters、５、55（1978）参照）、枯草
菌由来のpLS15、pLS28（以上、J.Bacteriol.、
131、699（1977）参照）、pLS13（J.Bacteriol.、
129、1487（1977）参照）、pPL1、pPL2（以上、J.
Bacteriol.、124、484（1975）参照）、テンペレー
トフアージとしても知られるrho11（Gene.、５、
89（1979））、phi105（Gene.、５、87（1979））、
SPO2（Gene.、７、51（1979））等がある。更に上
記プラスミドをもとにして構築した複合プラスミ
ドも当然のことながらベクターDNAとして利用
できうる。 染色体DNA及びベクターDNAはそれぞれ制限
エンドヌクレアーゼを用いて切断する。それぞれ
のベクターには適した制限エンドヌクレアーゼが
あるが、それは上記ベクターについての記載があ
る文献等に示されてある。染色体DNAについて
は制限エンドヌクレアーゼによる切断が部分的に
行なわれるように反応条件を調節すれば多くの種
類の制限酵素が利用できる。 かくして得られた染色体NDA断片と、切断さ
れたベクターNDAとを連結せしめる方法は、リ
ガーゼを用いる通常の法が使用できる。一方、タ
ーミナルトランスフエラーゼを用いて染色体
NDA断片と開裂したベクターDNAとにデオキシ
アデニール酸とデオキシシチジル酸をそれぞれ付
加し、混合した後アニーリングして連結せしめる
方法も利用し得る。 かくして得られた染色体NDA断片を組み込ん
で組換えベクターNDAの受容菌はバチルス属の
アデニン要求性を有する変異株からどのようなも
のでもよいが、プリンアナログ耐性又はデコイニ
ン耐性を有していない菌株を用いれば、形質転換
株を選択する際に好都合である。更に組換え
DNA受容菌としてプリンアナログ耐性又はデコ
イニン耐性を有し、より高いGMP生産能を有す
る菌株を用いれば、よりGMP生産性の高い形質
転換株を得ることができる。受容菌としては当然
GMP分解能がより低いものを用いなければなら
ない。 染色体NDAとベクターの混合物をNDA受容菌
に導入するには例えばMolec.Gene.Genet.、168、
111（1979）に記載されているような通常の形質転
換法が利用できる。 GMP生産能を有し、プリンアナログ耐性又は
デコイニン耐性に関与する遺伝子領域が組み込ま
れているベクターを含有する形質転換株を選択す
るには、例えばベクター受容菌としてアデニン要
求性変異株を用いて形質転換し、プリンアナログ
又はデコイニンを含有する培地で生育してくる菌
株を選択すればよい。又、ベクターNDA上の抗
生物質耐性等の性質を併せもつ菌株を選択できる
ような培地を用いればより選別が容易である。 このようにして、一旦選別されたプリンアナロ
グ耐性等に関与する遺伝子領域が組み込まれてい
る組換えベクターNDAは、形質転換株より抽出
後、他の組換えベクターNDA受容菌、例えば
GMP生産能を有する菌株に導入することにより
GMP蓄積量をさらに増大させることができる。 かくして得られたGMP生産菌を培養してGMP
を製造する方法は従来知られている方法と特に変
らない。 即ち、このような微生物を培養する培地は、炭
素源、窒素源、無機塩類、アデニンおよび必要な
らば更にその他の微量栄養素を含有する通常の液
体培地である。炭素源としては、グルコース、糖
蜜、デンプン加水分解液などの炭水化物が望まし
い。窒素源としては硫安、硝安、塩安、リン安等
のアンモニウム塩、硝安等の硝酸塩、尿素、アン
モニアガス等が使用できる。また栄養要求物質と
してのアデニンはアデニン、アデニン鉱酸塩、ア
デノシン、アデニル酸等のいずれも使用可能であ
る。また必要に応じてビタミン酸、アミノ酸、ア
デニン以外の核酸塩基などの微量栄養素を添加す
れば、GMP蓄積量を増すことができる場合が多
い。 培養方法は好気的条件がく、また、培養温度は
27ないし38℃の範囲が好適である。場合によつて
は培養途中にて培養温度を変更させてもよい。培
養開始時および培養中に培養液のPHを5.0ないし
9.0に調節し培養するのが望ましい。PHの調整に
は無機酸、有機酸あるいはアルカリさらに尿素、
炭酸カルシウム、アンモニウム水、アンモニアガ
スなどを使用することが出来る。かくして２ない
し５日間培養すれば著量のGMPが培地中に蓄積
される。 培養液からGMPを採取する方法は、イオン交
換樹脂を用いる等通常の方法でよい。 実施例 バチルス・ズブチリスAJ11711（アルギニン、
ロイシン複要求株）からＮ−メチル−N′−ニト
ロ−ニトロソグアニン変異処理（500μｇ／mlの
Ｎ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジンに０℃にて30分間108コ／mlの菌体を接触せ
しめた）によつてアデニン要求株の中からGMP
生産能を有する菌株AJ11853（FERM−P6484）
（アルギニン要求性、ロイシン要求性、アデニン
要求性）を得た。さらにこのアデニン要求株から
同様の変異処理によつて誘導したGMP生産菌
AJ11854（FERM−P6485）（アルギニン要求性、
ロイシン要求性、アデニン要求性、８−アガグア
ニン耐性）、AJ11855（FERM−Ｐ）（アルギニン
要求性、ロイシン要求性、アデニン要求性、デコ
イニン耐性）、AJ11856（アルギニン要求性、ロイ
シン要求性、アデニン要求性、８−アザグアニン
耐性、デコイニン耐性）を得た。 (1) 染色体DNAの調整 AJ11854、AJ11855及びAJ11856を各々１
の「Bacto−Penassay Broth」（Difco社製）
中で35℃、約２時間振盪培養を行い、対数増殖
期の菌株を集菌後、通常のNDA抽出法（J.
Bacteriol.、89、1065（1965））により染色体
NDAを抽出、精製し、最終AJ11854から3.1
mg、AJ11855から2.6mg、AJ11856から3.6mgを
得た。 (2) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 プリンアナログ耐性又はデコイニン耐性を支
配する遺伝子領域をクローニングするため、そ
のベクターとして自立増殖性のプラスミド
pUB110（カナマイシン耐性、ネオマイシン耐
性を発現する）を用いた。(1)で得られた染色体
DNAを各々5μｇずつとプラスミドpUB110 5μ
ｇずつをそぞれ制限エンドヌクレアーゼEcoRI
を37℃にて60分作用させてDNA鎖を切断した。
65℃で10分間熱処理後、各両反応液を混合し、
ATPおよびジチオスライトール存在下、T4フ
アージ由来のDNAリガーゼにて10℃にて24時
間、DNA鎖の連絡反応を行なつた。 (3) 組換えプラスミドNDAによる形質転換 バチルス・ズブチリスAJ11853を
「Penassay−Broth」（Difco社製）に接触した
30℃で１晩振とう培養を行ない、第培養培地
（グルコース５ｇ／、（NH4）2SO42ｇ／、
KH2PO46ｇ／、K2HPO414ｇ／、
MgSO4・7H2O0.2ｇ／、クエン酸ナトリウ
ム１ｇ／、酵母エキス２ｇ／、Ｌ−アルギ
ニン250mg／、Ｌ−ロイシン50mg／、アデ
ニン50mg／を含む）に接触し、37℃にて４時
間振盪培養を行なつた後、さらに第培養培地
（グルコース５ｇ／、（NH4）2SO42ｇ／、
KH2PO46ｇ／、K2HPO414ｇ／、
MgSO4・7H2O1.2ｇ／、クエン酸ナトリウ
ム１ｇ／、酵母エキス0.2ｇ／、Ｌ−アル
ギニン50mg／、Ｌ−ロイシン５mg／、アデ
ニン50mg／を含む）に接触し、37℃で1.5時
間振盪培養を行なうことによつて、いわゆるコ
ンピテントな（NDA取込能を有する）細胞を
調製した（参考文献J.Bacteriol.、81、741
（1961））。このコンピテント細胞懸濁液に(2)で
得たNDA溶液を各々、別々に加えて37℃でさ
らに２時間振盪を行なつて形質転換反応を完了
させた。 次に菌株AJ11853のDNA形質転換株を含む
懸濁液をカナマイシン5μｇ／ml、８−アザグ
アニン100μｇ／を含有する最小培地（最小
培地）、カナマイシン5μｇ／ml及びデコイニ
ン1000μｇ／mlを含有する最小培地（最小培地
）、カナマイシン5μｇ／ml及び８−アザグア
ニン100μｇ／ml及びデコイニン1000μｇ／mlを
含有する最小培地（最小培地）のプレート上
に塗沫し37℃で培養した。（最小培地はグルコ
ース５ｇ／、（NH4）2SO42ｇ／、
KH2PO46ｇ／、K2HPO414ｇ／、
MgSO4・7H2O0.2ｇ／、クエン酸ナトリウ
ム１ｇ／、Ｌ−アルギニン100mg／、Ｌ−
ロイシン100mg／、アデニン50mg／及び寒
天20ｇ／、PH7.2）の組成を有するものであ
る。）培養３日後には上記最小培地上に６個
のコロニーが、最小培地上に５個のコロニー
が、最小培地上に３個のコロニーそそれぞれ
出現したので、これらを釣菌し各クローンをそ
れぞれ純粋に分離した。 得られた形質転換株の性質はいずれもアルギ
ニン要求性、ロイシン要求性、アデニン要求
性、カナマイシン耐性を有し、かつ最小培地
から得られた形質転換株は８−アザグアニン耐
性、最小培地から得られた形質転換株はデコ
イニン耐性、最小培地から得られた形質転換
株は８−アザグアニン耐性及びデコイニン耐性
の性質をそれぞれ併せもつ菌株であつた。 (4) 組換えプラスミドNDAの抽出 (3)で得られたクローンのうち、最小培地上
のクローンAJ11857（FERM−P6488）及び最
小培地上のクローンAJ11858（FERM−
P6489）、倍地上のクローンAJ11859を用いて
C.I.kadoらの方法（J.Bacteriol.、145、1368
（1981））に基づいたDNA抽出法により各々
別々に菌体DNAを抽出し、アガロース電気泳
動によつてプラスミドDNAと染色体DNAを分
離し、プラスミドDNA区分を各々分画、採取
し、精製した。得られたプラスミド、即ち菌株
AJ11857、AJ11858、AJ11859から得られたプ
ラスミドを(3)で述べたのと同様の方法によつて
各々の原株のGMP生産菌株AJ11854、
AJ11855、AJ11856へ形質転換法により再導入
し、各々の菌株に対応するカナマイシン耐性株
AJ11860、AJ11861（FERM−P6490）及び
AJ11870（FERM−P6501）を得た。 (5) GMPの生産；AJ11853、AJ11854、
AJ11855、AJ11856、AJ11857、AJ11858、
AJ11859、AJ11860、AJ11861、AJ11870を培
養した結果を第１表に示す。培養方法は500ml
容肩付フラスコにGMP生産培地（グルコース
80ｇ／、NH4Cl15ｇ／、KH2PO410ｇ／
、K2HPO414ｇ／、MgSO4・7H2O5ｇ／
、FeSO4・7H2O10mg／、MnSO4・
7H2O10mg／、CaCl2・2H2O ２ｇ／、ア
デニン200mg／、大豆蛋白加水分解液40mg／
、アルギニン100mg／、ロイシン100mg／
及びＬ−グルタミン酸10ｇ／を含みPH6.5に
KOHで調製した。）を20mlずつ分注し、115℃
で10分間加熱殺菌した後、予め斜面培地で培養
して得た各種菌体を接触後、34℃で３日間振盪
培養を行つた。 【表】 【表】 【表】
Claims (1)
- １ バチルス属のプリンアナログ耐性又はデコイ
ニン耐性を有する変異株の染色体遺伝子より得た
プリンアナログ耐性又はデコイニン耐性に関与す
る遺伝子領域が組み込まれているベクターをバチ
ルス属のアデニン要求性変異株に含有せしめたグ
アノシン−5′−モノリン酸性産性微生物を培養
し、培地中に蓄積されたグアノシン−5′−モノリ
ン酸を採取することを特徴とするグアノシン−
5′−モノリン酸の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57058439A JPS58175492A (ja) | 1982-04-08 | 1982-04-08 | 発酵法によるグアノシン−５′−モノリン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57058439A JPS58175492A (ja) | 1982-04-08 | 1982-04-08 | 発酵法によるグアノシン−５′−モノリン酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58175492A JPS58175492A (ja) | 1983-10-14 |
| JPH0422557B2 true JPH0422557B2 (ja) | 1992-04-17 |
Family
ID=13084425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57058439A Granted JPS58175492A (ja) | 1982-04-08 | 1982-04-08 | 発酵法によるグアノシン−５′−モノリン酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58175492A (ja) |
-
1982
- 1982-04-08 JP JP57058439A patent/JPS58175492A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58175492A (ja) | 1983-10-14 |
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