JPH0129559B2 - - Google Patents
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- JPH0129559B2 JPH0129559B2 JP54039617A JP3961779A JPH0129559B2 JP H0129559 B2 JPH0129559 B2 JP H0129559B2 JP 54039617 A JP54039617 A JP 54039617A JP 3961779 A JP3961779 A JP 3961779A JP H0129559 B2 JPH0129559 B2 JP H0129559B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
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- Y10S435/849—Escherichia coli
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
この発明は発酵法によるＬ−スレオニンの製造
法に関するものである。 発酵法によるＬ−スレオニンの製造法について
は、ブレビバクテリウム属、エシエリア属等の突
然変異株を用いる方法が知られている。 これに対し本発明者らは、デオキシリボ核酸
（以下「DNA」と記す）供与菌としてエシエリヒ
ア（Escherichia）属のα−アミノ−β−ヒドロ
キシ吉草酸（以下「AHV」と記す）に耐性を有
する変異株を選択し、これよりＬ−スレオニン合
成に関与する遺伝情報を有するDNAを抽出し、
ついでこのＬ−スレオニン合成に関与する遺伝情
報を有するDNAを組み込んだプラスミド
（Plasmid）を得て、このプラスミドをエシエリ
ヒア属の微生物に導入した。更に、当該プラスミ
ドの受容菌としてＬ−スレオニンを要求しないエ
シエリヒア属の微生物を用いればよりＬ−スレオ
ニンの生産能が高い菌株が得られることを知つ
た。 本発明の微生物を用いることによつて、従来の
突然変異株を用いる方法に比べて、極めて高い収
率でＬ−スレオニンを生産できることを見い出し
た。 エシエリヒア属のα−アミノ−β−ヒドロキシ
吉草酸に耐性を有する変異株は既に知られている
ものであり（特公昭45−26709）、通常の人工変異
操作をエシエリヒア属の微生物に施すことにより
得られる。これより染色体DNAを常法により抽
出し、常法により制限エンドヌクレアーゼ
（Endonuclase）で処理する。 我々の実験では制限エンドヌクレアーゼとして
Hindを用いてＬ−スレオニン合成に関与する
遺伝情報を担うDNAフラグメントを得たが、他
の制限エンドヌクレアーゼ例えばBamHIを用い
てもHindと同様の結果が得られる可能性があ
る。 ベクターDNAとしては、エシエリヒア・コリ
のリラツクスタイププラスミドより得られたもの
ならばどのようなものでもよい。このベクターに
エシエリヒア属のAHV耐性変異株より得たＬ−
スレオニン合成に関与する遺伝情報を担うDNA
フラグメントを組み込む方法は特定の方法を要し
ない。かくして得られたＬ−スレオニン合成に関
与する遺伝情報を担うDNAフラグメントを組み
込んだプラスミドを、エシエリヒア属の微生物に
含有せしめる方法も又従来知られているすべての
形質転換方法が、効率の良否はあつてもいずれも
適用できる。組換えブラスミドの受容菌として
は、エシエリヒア属のＬ−スレオニン要求株が形
質転換株の選別・分離の際に好都合なので通常用
いられるが、Ｌ−スレオニンを要求せず、特に更
にAHVに耐性を有する変異株を受容菌として用
いれば、よりＬ−スレオニン生産能が高い菌株が
得られる。かくして得られた形質転換株の選別・
分離方法は特定の方法を要せず、ベクターDNA
が有する性質及び必要により受容菌が有している
性質を指標にして選別・分離すればよい。 かくして得られたＬ−スレオニン生産菌を培養
する方法は、従来のＬ−スレオニン生産菌の培養
方法と特に変らない。即ち、培地としては炭素
源、窒素源、無機イオン更に必要に応じてアミノ
酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常
のものである。炭素源としては、グルコース、シ
ユクロース等及びこれらを含有する澱粉加水分解
液、糖蜜等が用いられる。窒素源としてはアンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩その他
が使用できる。培地に50mg／dl以上のＬ−アスパ
ラギン酸を添加すればより好ましい結果が得られ
る場合が多い。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ、実質的にＬ−スレオニンの生成蓄積
が停止するまで行われる。 かくして培養液中には著量のＬ−スレオニンが
生成蓄積される。培養液よりＬ−スレオニンを採
取するには通常の方法が適用できる。 本発明の微生物を用いることにより、従来知ら
れているエシエリヒア・コリのＬ−スレオニン生
産菌を用いる場合に比べ、Ｌ−スレオニンの生成
収率が高いばかりでなく、更にＬ−スレオニン以
外のアミノ酸の副生量が極めて少く、Ｌ−スレオ
ニンの分離・採取の際に好都合である。 尚、以下の実験は米国国立衛生研究所保健・教
育・福祉省の1977年９月27日付「組換えDNA研
究指針改訂案」に従つて行つた。 実施例 １ エシエリヒア・コリーK12（ATCC10798）由来
のスレオニン生産菌AJ11332（FERM−P4898）
（pro−thia−ile−met−AHVr）を原株とし、こ
れより次のような手段とプロセスにより新規に著
量のスレオニンを生産する菌を造成した。 (1) スレオニン過剰生産能を遺伝情報にもつた染
色体DNAの調製 AJ11332株を１のＬ培地（ペプトン１％、
酵母0.5％、グルコース0.1％、NaCl0.5％；PH
7.2に調整）中37℃で約３時間振盪培養を行い、
対数増殖期の菌体を集菌後フエノール法による
通常のDNA抽出法によつて染色体DNAを抽出
精製し、最終5.3mgを得た。 (2) ベクターDNAの調製 スレオニン過剰生産能を支配する遺伝子領域
（AHV耐性変異点を含むスレオニン生合成系
オペロン）をクローニングするため、その担体
（ベクター）となる自己増殖DNAとしてアンピ
シリン耐性（Apr）、テトラサイクリン耐性
（Tcr）プラスミドの１種pBR322のDNAを次
のようにして調製した。まず、pBR322をプラ
スミドとして保有するエシエリヒア・コリ−
K12株の１種を１のグルコース・カザミノ
酸・無機塩培地（グルコース２ｇ、NH4Cl1
ｇ、Na2HPO46ｇ、KH2PO43ｇ、NaCl5ｇ、
MgSO4・7H2O0.1ｇ、CaCl2・2H2O0.015ｇ、
カザミノ酸20ｇを１の純水に溶解後PH7.2に
調整したものを基本培地として用い、これにＬ
−トリプトフアン0.05ｇ、チミン0.05ｇ、サイ
アミン（塩酸塩）100μｇ等、使用菌の栄養要
求物質、生育促進物質を添加）に接種し、
170μｇ／mlのクロラムフエニコール添加のも
とに37℃でインキユベートした。この操作によ
り、pBR322プラスミドの自己増殖が誘導さ
れ、細胞内にプラスミドDNAが多量に生産さ
れる。 16時間後に集菌し、リゾチーム・SDS処理に
よつて溶菌させ、30000×ｇ１時間の超遠心に
より上清を得た。 これよりプラスミドDNAを濃縮後、セシウ
ムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度
勾配遠心法によつて最終580μｇのpBR322プラ
スミドDNAを分画採取した。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)、(2)で得た染色体DNAおよびベクター
DNAの各10μｇをとり、各々に制限エンドヌ
クレアーゼの１種Hindを37℃１時間作用さ
せてDNA鎖を切断した。 65℃５分の熱処理後、両反応液を混合し、
ATP及びジチオスレイトール存在下、T4フア
ージ由来のDNAリガーゼによつて10℃、24時
間DNA鎖の連結反応を行つた。 65℃５分の熱処理後、反応液に２倍容のエタ
ノールを加えて連結反応終了後のDNAを沈澱
採取した。 (4) スレオニン過剰生産遺伝子を担つたプラスミ
ドによる形質転換 スレオニン生産菌AJ11332株からニトロソグ
アニジン変異処理によつて誘導したスレオニン
要求株No.255株をＬ培地10mlに接種し、37℃で
振盪培養を行い対数増殖期中期まで生育させた
後集菌し、これを氷冷下0.1M MgCl2、0.1M
CaCl2各溶液に順次懸濁させることによつてい
わゆるコンピテントな（DNA取り込み能を有
する）細胞を調製した。このコンピテント細胞
懸濁液に、(3)で得たDNA（スレオニン過剰生産
遺伝子を担つたプラスミドDNAが含まれる）
の溶解液を加えて氷冷下30分反応させ、直ちに
42℃２分のヒートシヨツクを与えた後、再び氷
冷下に30分放置してDNAを細胞内に取り込ま
せた。つぎに、この細胞懸濁液の一定量を新た
なＬ培地に接種し、37℃２時間振盪培養を行つ
て形質転換反応を完了させた後、集菌洗滌し、
再懸濁液をアンピシリン20μｇ／ml含有最少培
地プレート（グルコース２ｇ、（NH4）2SO41
ｇ、K2HPO47ｇ、KH2PO42ｇ、
MgSO4.7H4O0.1ｇ、クエン酸ナトリウム0.5ｇ
を１の純水に溶解しPH7.2に調整したものを
基本最少培地とし、これに寒天２％および使用
菌の栄養要求物質Ｌ−プロリン、Ｌ−イソロイ
シン、Ｌ−メチオニン、サイアミン（塩酸塩）
をそれぞれ100mg、100mg、100mg、１mg添加、
ただしＬ−スレオニンは含まれない。）に塗沫
し、37℃でインキユベートした。３日後に上記
培地上に21ケのコロニーが出現したのでこれを
鈎菌し、各クローンをそれぞれ純粋に分離し
た。えられた形質転換株はいづれも用いた受容
菌No.255株と異つてスレオニン非要求性でしか
もアンピシリン耐性である。このことは、染色
体DNA上のスレオニン生合成系遺伝子領域が、
pBR322プラスミドのDNAに挿入されて生じ
た新規プラスミドDNAを取り込んだ細胞のみ
がコロニーとして選択されてきたことを意味す
る。 (5) 新規スレオニン生産菌株によるＬ−スレオニ
ン生産 (4)で得られたクローンのうちAJ11334株
（FERM−P4900）を用いてＬ−スレオニンを
発酵生産した試験結果を第１表Ａに示した。発
酵は500mlフラスコ中にスレオニン生産培地
（グルコース３％、（NH4）2SO41％、
KH2PO40.2％、MgSO4・7H2O0.1％、Fe+
+2ppm、Mn++2ppm、サイアミン塩酸塩１mg／
、Ｌ−ブロリン300mg／、Ｌ−イソロイシ
ン100mg／、Ｌ−メチオニン100mg／、
CaCO32％、KOHによりPH7.0に調整）を20ml
づつ分注し、菌体を接種後37℃70時間振盪培養
して行つた。対照として新規スレオニン生産株
の原株であるAJ11332株を用い、同様の条件で
発酵を行つた。表に明らかなように、新規スレ
オニン生産株AJ11334株は原株AJ11332に対し
て顕著な生産性の増加を示している。 第１表Ｂは、(4)で得られたクローンのうち
AJ11333株（FERM−P4899）を用いてＬ−ス
レオニンを発酵生産した例である。培地は第１
表Ａで用いたスレオニン生産培地にさらに酵母
エキス0.1％を添加したものを用い、培養温度
は30℃で行つた。他の条件は第１表Ａと同様で
ある。 この場合も新規スレオニン生産株AJ11333は
原株AJ11332に対して顕著な生産性の増加を示
している。
法に関するものである。 発酵法によるＬ−スレオニンの製造法について
は、ブレビバクテリウム属、エシエリア属等の突
然変異株を用いる方法が知られている。 これに対し本発明者らは、デオキシリボ核酸
（以下「DNA」と記す）供与菌としてエシエリヒ
ア（Escherichia）属のα−アミノ−β−ヒドロ
キシ吉草酸（以下「AHV」と記す）に耐性を有
する変異株を選択し、これよりＬ−スレオニン合
成に関与する遺伝情報を有するDNAを抽出し、
ついでこのＬ−スレオニン合成に関与する遺伝情
報を有するDNAを組み込んだプラスミド
（Plasmid）を得て、このプラスミドをエシエリ
ヒア属の微生物に導入した。更に、当該プラスミ
ドの受容菌としてＬ−スレオニンを要求しないエ
シエリヒア属の微生物を用いればよりＬ−スレオ
ニンの生産能が高い菌株が得られることを知つ
た。 本発明の微生物を用いることによつて、従来の
突然変異株を用いる方法に比べて、極めて高い収
率でＬ−スレオニンを生産できることを見い出し
た。 エシエリヒア属のα−アミノ−β−ヒドロキシ
吉草酸に耐性を有する変異株は既に知られている
ものであり（特公昭45−26709）、通常の人工変異
操作をエシエリヒア属の微生物に施すことにより
得られる。これより染色体DNAを常法により抽
出し、常法により制限エンドヌクレアーゼ
（Endonuclase）で処理する。 我々の実験では制限エンドヌクレアーゼとして
Hindを用いてＬ−スレオニン合成に関与する
遺伝情報を担うDNAフラグメントを得たが、他
の制限エンドヌクレアーゼ例えばBamHIを用い
てもHindと同様の結果が得られる可能性があ
る。 ベクターDNAとしては、エシエリヒア・コリ
のリラツクスタイププラスミドより得られたもの
ならばどのようなものでもよい。このベクターに
エシエリヒア属のAHV耐性変異株より得たＬ−
スレオニン合成に関与する遺伝情報を担うDNA
フラグメントを組み込む方法は特定の方法を要し
ない。かくして得られたＬ−スレオニン合成に関
与する遺伝情報を担うDNAフラグメントを組み
込んだプラスミドを、エシエリヒア属の微生物に
含有せしめる方法も又従来知られているすべての
形質転換方法が、効率の良否はあつてもいずれも
適用できる。組換えブラスミドの受容菌として
は、エシエリヒア属のＬ−スレオニン要求株が形
質転換株の選別・分離の際に好都合なので通常用
いられるが、Ｌ−スレオニンを要求せず、特に更
にAHVに耐性を有する変異株を受容菌として用
いれば、よりＬ−スレオニン生産能が高い菌株が
得られる。かくして得られた形質転換株の選別・
分離方法は特定の方法を要せず、ベクターDNA
が有する性質及び必要により受容菌が有している
性質を指標にして選別・分離すればよい。 かくして得られたＬ−スレオニン生産菌を培養
する方法は、従来のＬ−スレオニン生産菌の培養
方法と特に変らない。即ち、培地としては炭素
源、窒素源、無機イオン更に必要に応じてアミノ
酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常
のものである。炭素源としては、グルコース、シ
ユクロース等及びこれらを含有する澱粉加水分解
液、糖蜜等が用いられる。窒素源としてはアンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩その他
が使用できる。培地に50mg／dl以上のＬ−アスパ
ラギン酸を添加すればより好ましい結果が得られ
る場合が多い。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ、実質的にＬ−スレオニンの生成蓄積
が停止するまで行われる。 かくして培養液中には著量のＬ−スレオニンが
生成蓄積される。培養液よりＬ−スレオニンを採
取するには通常の方法が適用できる。 本発明の微生物を用いることにより、従来知ら
れているエシエリヒア・コリのＬ−スレオニン生
産菌を用いる場合に比べ、Ｌ−スレオニンの生成
収率が高いばかりでなく、更にＬ−スレオニン以
外のアミノ酸の副生量が極めて少く、Ｌ−スレオ
ニンの分離・採取の際に好都合である。 尚、以下の実験は米国国立衛生研究所保健・教
育・福祉省の1977年９月27日付「組換えDNA研
究指針改訂案」に従つて行つた。 実施例 １ エシエリヒア・コリーK12（ATCC10798）由来
のスレオニン生産菌AJ11332（FERM−P4898）
（pro−thia−ile−met−AHVr）を原株とし、こ
れより次のような手段とプロセスにより新規に著
量のスレオニンを生産する菌を造成した。 (1) スレオニン過剰生産能を遺伝情報にもつた染
色体DNAの調製 AJ11332株を１のＬ培地（ペプトン１％、
酵母0.5％、グルコース0.1％、NaCl0.5％；PH
7.2に調整）中37℃で約３時間振盪培養を行い、
対数増殖期の菌体を集菌後フエノール法による
通常のDNA抽出法によつて染色体DNAを抽出
精製し、最終5.3mgを得た。 (2) ベクターDNAの調製 スレオニン過剰生産能を支配する遺伝子領域
（AHV耐性変異点を含むスレオニン生合成系
オペロン）をクローニングするため、その担体
（ベクター）となる自己増殖DNAとしてアンピ
シリン耐性（Apr）、テトラサイクリン耐性
（Tcr）プラスミドの１種pBR322のDNAを次
のようにして調製した。まず、pBR322をプラ
スミドとして保有するエシエリヒア・コリ−
K12株の１種を１のグルコース・カザミノ
酸・無機塩培地（グルコース２ｇ、NH4Cl1
ｇ、Na2HPO46ｇ、KH2PO43ｇ、NaCl5ｇ、
MgSO4・7H2O0.1ｇ、CaCl2・2H2O0.015ｇ、
カザミノ酸20ｇを１の純水に溶解後PH7.2に
調整したものを基本培地として用い、これにＬ
−トリプトフアン0.05ｇ、チミン0.05ｇ、サイ
アミン（塩酸塩）100μｇ等、使用菌の栄養要
求物質、生育促進物質を添加）に接種し、
170μｇ／mlのクロラムフエニコール添加のも
とに37℃でインキユベートした。この操作によ
り、pBR322プラスミドの自己増殖が誘導さ
れ、細胞内にプラスミドDNAが多量に生産さ
れる。 16時間後に集菌し、リゾチーム・SDS処理に
よつて溶菌させ、30000×ｇ１時間の超遠心に
より上清を得た。 これよりプラスミドDNAを濃縮後、セシウ
ムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度
勾配遠心法によつて最終580μｇのpBR322プラ
スミドDNAを分画採取した。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)、(2)で得た染色体DNAおよびベクター
DNAの各10μｇをとり、各々に制限エンドヌ
クレアーゼの１種Hindを37℃１時間作用さ
せてDNA鎖を切断した。 65℃５分の熱処理後、両反応液を混合し、
ATP及びジチオスレイトール存在下、T4フア
ージ由来のDNAリガーゼによつて10℃、24時
間DNA鎖の連結反応を行つた。 65℃５分の熱処理後、反応液に２倍容のエタ
ノールを加えて連結反応終了後のDNAを沈澱
採取した。 (4) スレオニン過剰生産遺伝子を担つたプラスミ
ドによる形質転換 スレオニン生産菌AJ11332株からニトロソグ
アニジン変異処理によつて誘導したスレオニン
要求株No.255株をＬ培地10mlに接種し、37℃で
振盪培養を行い対数増殖期中期まで生育させた
後集菌し、これを氷冷下0.1M MgCl2、0.1M
CaCl2各溶液に順次懸濁させることによつてい
わゆるコンピテントな（DNA取り込み能を有
する）細胞を調製した。このコンピテント細胞
懸濁液に、(3)で得たDNA（スレオニン過剰生産
遺伝子を担つたプラスミドDNAが含まれる）
の溶解液を加えて氷冷下30分反応させ、直ちに
42℃２分のヒートシヨツクを与えた後、再び氷
冷下に30分放置してDNAを細胞内に取り込ま
せた。つぎに、この細胞懸濁液の一定量を新た
なＬ培地に接種し、37℃２時間振盪培養を行つ
て形質転換反応を完了させた後、集菌洗滌し、
再懸濁液をアンピシリン20μｇ／ml含有最少培
地プレート（グルコース２ｇ、（NH4）2SO41
ｇ、K2HPO47ｇ、KH2PO42ｇ、
MgSO4.7H4O0.1ｇ、クエン酸ナトリウム0.5ｇ
を１の純水に溶解しPH7.2に調整したものを
基本最少培地とし、これに寒天２％および使用
菌の栄養要求物質Ｌ−プロリン、Ｌ−イソロイ
シン、Ｌ−メチオニン、サイアミン（塩酸塩）
をそれぞれ100mg、100mg、100mg、１mg添加、
ただしＬ−スレオニンは含まれない。）に塗沫
し、37℃でインキユベートした。３日後に上記
培地上に21ケのコロニーが出現したのでこれを
鈎菌し、各クローンをそれぞれ純粋に分離し
た。えられた形質転換株はいづれも用いた受容
菌No.255株と異つてスレオニン非要求性でしか
もアンピシリン耐性である。このことは、染色
体DNA上のスレオニン生合成系遺伝子領域が、
pBR322プラスミドのDNAに挿入されて生じ
た新規プラスミドDNAを取り込んだ細胞のみ
がコロニーとして選択されてきたことを意味す
る。 (5) 新規スレオニン生産菌株によるＬ−スレオニ
ン生産 (4)で得られたクローンのうちAJ11334株
（FERM−P4900）を用いてＬ−スレオニンを
発酵生産した試験結果を第１表Ａに示した。発
酵は500mlフラスコ中にスレオニン生産培地
（グルコース３％、（NH4）2SO41％、
KH2PO40.2％、MgSO4・7H2O0.1％、Fe+
+2ppm、Mn++2ppm、サイアミン塩酸塩１mg／
、Ｌ−ブロリン300mg／、Ｌ−イソロイシ
ン100mg／、Ｌ−メチオニン100mg／、
CaCO32％、KOHによりPH7.0に調整）を20ml
づつ分注し、菌体を接種後37℃70時間振盪培養
して行つた。対照として新規スレオニン生産株
の原株であるAJ11332株を用い、同様の条件で
発酵を行つた。表に明らかなように、新規スレ
オニン生産株AJ11334株は原株AJ11332に対し
て顕著な生産性の増加を示している。 第１表Ｂは、(4)で得られたクローンのうち
AJ11333株（FERM−P4899）を用いてＬ−ス
レオニンを発酵生産した例である。培地は第１
表Ａで用いたスレオニン生産培地にさらに酵母
エキス0.1％を添加したものを用い、培養温度
は30℃で行つた。他の条件は第１表Ａと同様で
ある。 この場合も新規スレオニン生産株AJ11333は
原株AJ11332に対して顕著な生産性の増加を示
している。
【表】
ンをバイオアツセイ法で測定
(6) Ｌ−スレオニン非要求菌へのプラスミドの導
入 実施例１で得られた著量スレオニン生産菌
AJ11334株のもつ新規プラスミドを(2)で述べた
のと同様の方法によつて分画採取し、これを(4)
で述べたのと同様の方法によつて今度は原株の
AJ11332株（スレオニン非要求性で、Ｌ−スレ
オニンを若干生産する。）へ形質転換法により
挿入した。得られたアンピシリン耐性の形質転
換株AJ11335（FERM−P4901）を用い(5)で述
べたのと同様の方法でＬ−スレオニンの発酵生
産試験を行なつた。 培養液中に生成蓄積されたＬ−スレオニン及
び他の副生アミノ酸を液体クロマトグラフイー
により定量分析し、結果を第２表にまとめた。
(6) Ｌ−スレオニン非要求菌へのプラスミドの導
入 実施例１で得られた著量スレオニン生産菌
AJ11334株のもつ新規プラスミドを(2)で述べた
のと同様の方法によつて分画採取し、これを(4)
で述べたのと同様の方法によつて今度は原株の
AJ11332株（スレオニン非要求性で、Ｌ−スレ
オニンを若干生産する。）へ形質転換法により
挿入した。得られたアンピシリン耐性の形質転
換株AJ11335（FERM−P4901）を用い(5)で述
べたのと同様の方法でＬ−スレオニンの発酵生
産試験を行なつた。 培養液中に生成蓄積されたＬ−スレオニン及
び他の副生アミノ酸を液体クロマトグラフイー
により定量分析し、結果を第２表にまとめた。
【表】
【表】
実施例１で得られたAJ11333株および上記
AJ11335株を用い、発酵生産培地として第１表
Ａに用いた組成の培地のほか、これにさらにＬ
−アスパラギン酸を0.05又は0.1ｇ／dl添加し
た培地を用いて30℃で発酵生産試験を試みた結
果を、第３表に示した。
AJ11335株を用い、発酵生産培地として第１表
Ａに用いた組成の培地のほか、これにさらにＬ
−アスパラギン酸を0.05又は0.1ｇ／dl添加し
た培地を用いて30℃で発酵生産試験を試みた結
果を、第３表に示した。
【表】
＊ 第１表の脚注と同じ。
Claims (1)
- １ エシエリヒア属のα−アミノ−β−ヒドロキ
シ吉草酸に耐性を有する変異株より得たＬ−スレ
オニン合成に関与する遺伝情報を担うデオキシリ
ボ核酸を組み込んだプラスミドを、エシエリヒア
属の微生物に含有せしめたＬ−スレオニン生産性
微生物を培養し、培養液中に蓄積したＬ−スレオ
ニンを採取することを特徴とするＬ−スレオニン
の製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3961779A JPS55131397A (en) | 1979-04-02 | 1979-04-02 | Preparation of l-threonine by fermentation |
| GB8010635A GB2049670B (en) | 1979-04-02 | 1980-03-28 | Producing l-threonine by fermentation c2c c6f |
| FR8007433A FR2453216A1 (fr) | 1979-04-02 | 1980-04-02 | Procede pour produire de la l-threonine par fermentation |
| US06/136,475 US4347318A (en) | 1979-04-02 | 1980-04-02 | Method for producing L-threonine by fermentation |
| DE19803012921 DE3012921A1 (de) | 1979-04-02 | 1980-04-02 | Verfahren zur fermentativen herstellung von l-threonin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3961779A JPS55131397A (en) | 1979-04-02 | 1979-04-02 | Preparation of l-threonine by fermentation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS55131397A JPS55131397A (en) | 1980-10-13 |
| JPH0129559B2 true JPH0129559B2 (ja) | 1989-06-12 |
Family
ID=12558063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3961779A Granted JPS55131397A (en) | 1979-04-02 | 1979-04-02 | Preparation of l-threonine by fermentation |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4347318A (ja) |
| JP (1) | JPS55131397A (ja) |
| DE (1) | DE3012921A1 (ja) |
| FR (1) | FR2453216A1 (ja) |
| GB (1) | GB2049670B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994011517A1 (fr) * | 1992-11-10 | 1994-05-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production de l-threonine par fermentation |
| WO2006016705A1 (en) | 2004-08-10 | 2006-02-16 | Ajinomoto Co., Inc. | The use of phosphoketolase for producing useful metabolites |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57186496A (en) * | 1981-05-11 | 1982-11-16 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-threonine by fermentation |
| JPS58893A (ja) * | 1981-06-25 | 1983-01-06 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法 |
| US5236831A (en) * | 1981-12-29 | 1993-08-17 | Kiowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Amino acid synthesis in corynebacteria using E. coli genes |
| JPS59232088A (ja) * | 1983-06-15 | 1984-12-26 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | Ｌ−アスパラギン酸の製法 |
| JPS6043392A (ja) * | 1983-08-20 | 1985-03-07 | Showa Denko Kk | Ｌ−トリプトフアンの製造法 |
| JPS6274294A (ja) * | 1985-09-28 | 1987-04-06 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−スレオニンの精製方法 |
| JPS6291176A (ja) * | 1985-10-18 | 1987-04-25 | Toray Ind Inc | Ｌ−スレオニン生産能を有する形質転換体 |
| JPH0716429B2 (ja) * | 1985-10-18 | 1995-03-01 | 東レ株式会社 | Ｌ−スレオニンの製造法 |
| US5976843A (en) | 1992-04-22 | 1999-11-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Bacterial strain of Escherichia coli BKIIM B-3996 as the producer of L-threonine |
| US5175107A (en) * | 1988-10-25 | 1992-12-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Bacterial strain of escherichia coli bkiim b-3996 as the producer of l-threonine |
| EP1020526B1 (en) * | 1992-11-10 | 2008-03-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing L-Threonine by fermentation |
| JP3880636B2 (ja) * | 1994-01-10 | 2007-02-14 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 |
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| US7220571B2 (en) * | 2000-09-28 | 2007-05-22 | Archer-Daniels-Midland Company | Escherichia coli strains which over-produce L-threonine and processes for the production of L-threonine by fermentation |
| EP1404856B1 (en) * | 2001-07-06 | 2006-07-26 | Degussa AG | Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family |
| US20050221448A1 (en) * | 2001-07-18 | 2005-10-06 | Degussa Ag | Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an attenuated aceb gene |
| WO2003008602A2 (en) * | 2001-07-18 | 2003-01-30 | Degussa Ag | Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an attenuated ugpb gene |
| DE10154102A1 (de) * | 2001-11-02 | 2003-05-15 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| US7723097B2 (en) * | 2005-03-11 | 2010-05-25 | Archer-Daniels-Midland Company | Escherichia coli strains that over-produce L-threonine and processes for their production |
| WO2007001982A1 (en) * | 2005-06-20 | 2007-01-04 | Archer-Daniels-Midland Company | Altered glyoxylate shunt for improved production of aspartate-derived amino acids and chemicals |
| EP1979486B1 (en) * | 2006-01-30 | 2013-04-17 | Ajinomoto Co., Inc. | L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid |
| JP2009153382A (ja) | 2006-03-30 | 2009-07-16 | Ajinomoto Co Inc | メタノール資化性細菌を用いたカルボン酸の製造法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1580549A (ja) * | 1967-07-28 | 1969-09-05 | ||
| GB1521032A (en) * | 1974-08-08 | 1978-08-09 | Ici Ltd | Biological treatment |
| US4237224A (en) * | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
| SU875663A1 (ru) * | 1978-06-30 | 1982-09-15 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Штаммы е.coLI ВНИИГенетика VL 334 @ N6 и ВНИИГенетика VL 334 @ N7-продуценты L-треонина и способ их получени |
| JPS55156591A (en) * | 1979-05-23 | 1980-12-05 | Ajinomoto Co Inc | Method for stabilizing property of bacteria containing plasmid |
| FR2464299A1 (fr) * | 1979-08-28 | 1981-03-06 | Inst Genetiki Selektsii | Procede de preparation de souches productrices d'acides amines |
-
1979
- 1979-04-02 JP JP3961779A patent/JPS55131397A/ja active Granted
-
1980
- 1980-03-28 GB GB8010635A patent/GB2049670B/en not_active Expired
- 1980-04-02 DE DE19803012921 patent/DE3012921A1/de active Granted
- 1980-04-02 FR FR8007433A patent/FR2453216A1/fr active Granted
- 1980-04-02 US US06/136,475 patent/US4347318A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994011517A1 (fr) * | 1992-11-10 | 1994-05-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production de l-threonine par fermentation |
| CN1071378C (zh) * | 1992-11-10 | 2001-09-19 | 味之素株式会社 | 发酵生产l-苏氨酸的方法 |
| WO2006016705A1 (en) | 2004-08-10 | 2006-02-16 | Ajinomoto Co., Inc. | The use of phosphoketolase for producing useful metabolites |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2453216B1 (ja) | 1984-03-09 |
| US4347318A (en) | 1982-08-31 |
| GB2049670B (en) | 1983-03-30 |
| DE3012921A1 (de) | 1980-10-23 |
| GB2049670A (en) | 1980-12-31 |
| DE3012921C2 (ja) | 1990-01-18 |
| JPS55131397A (en) | 1980-10-13 |
| FR2453216A1 (fr) | 1980-10-31 |
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