JPH04226982A - 抗高血圧性生成物を得るための微生物形質転換過程 - Google Patents
抗高血圧性生成物を得るための微生物形質転換過程Info
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- JPH04226982A JPH04226982A JP3105495A JP10549591A JPH04226982A JP H04226982 A JPH04226982 A JP H04226982A JP 3105495 A JP3105495 A JP 3105495A JP 10549591 A JP10549591 A JP 10549591A JP H04226982 A JPH04226982 A JP H04226982A
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】本特許出願は、１９９０年５月１１日付け
の一連の同時係属中の出願書第５２１９７０号の一部で
ある。
の一連の同時係属中の出願書第５２１９７０号の一部で
ある。
【０００２】本発明は、微生物アクチノプラーネス（Ａ
ｃｔｉｎｏｐｌａｎａｃｅｔｅ ｓｐ．） を用いた化
合物（ＩＩＩ）
ｃｔｉｎｏｐｌａｎａｃｅｔｅ ｓｐ．） を用いた化
合物（ＩＩＩ）
【化４】
の発酵から成る、２種の抗高血圧剤、すなわち化合物（
Ｉ）及び（ＩＩ）
Ｉ）及び（ＩＩ）
【化５】
の新規な製造方法に関する。化合物（Ｉ）と（ＩＩ）及
びそれらの前駆体（ＩＩＩ） は、ヒトの高血圧疾患の
治療に有用なアンジオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）受容体拮
抗物質である。
びそれらの前駆体（ＩＩＩ） は、ヒトの高血圧疾患の
治療に有用なアンジオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）受容体拮
抗物質である。
【０００３】ＡＩＩは、主にアンジオテンシン転換酵素
（ＡＣＥ）によってアンジオテンシンＩが切断される時
に血中で作られるオクタペプチドホルモンである。ＡＣ
Ｅは、肺、腎臓、及び多くの他の器官の血管内皮に局在
する。ＡＩＩは、正常な血圧を制御するのに中心的な役
割をはたし、高血圧の進行や持続と同様にうっ血性心疾
患にも深く関係していると思われる系である、レニン−
アンジオテンシン系の最終生産物である。ＡＩＩは、細
胞膜に存在する特定の受容体と相互作用することによっ
てその作用を生じる、強力な動脈収縮因子である。ＡＩ
Ｉ受容体の拮抗は、ＲＡＳの可能な制御方法の１つであ
る。
（ＡＣＥ）によってアンジオテンシンＩが切断される時
に血中で作られるオクタペプチドホルモンである。ＡＣ
Ｅは、肺、腎臓、及び多くの他の器官の血管内皮に局在
する。ＡＩＩは、正常な血圧を制御するのに中心的な役
割をはたし、高血圧の進行や持続と同様にうっ血性心疾
患にも深く関係していると思われる系である、レニン−
アンジオテンシン系の最終生産物である。ＡＩＩは、細
胞膜に存在する特定の受容体と相互作用することによっ
てその作用を生じる、強力な動脈収縮因子である。ＡＩ
Ｉ受容体の拮抗は、ＲＡＳの可能な制御方法の１つであ
る。
【０００４】１９８９年６月２３日登録の同時係属中の
米国特許出願第３７０，４８１号（ケース番号１７８５
２）において、発酵条件の制御下でアクチノプラーネス
（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎａｃｅｔｅ ｓｐ．） の存在
下にシンバスタチンの生体的転換で得たシンバスタチン
の水酸化された類似体が開示されている。１９９０年５
月４日登録の同時係属中の米国出願第５１６，２８６号
（代理人書類番号 Ｎｏ．１７９４６ＩＡ）において、
本発明で用いられ、本出願書で化合物（ＩＩＩ） と命
名された基質化合物が開示されており、又、一般的に、
本発明の５−ＨＯＣＨ２ −及び７−ＨＯＣＨ２ −酸
化物も言及されている。
米国特許出願第３７０，４８１号（ケース番号１７８５
２）において、発酵条件の制御下でアクチノプラーネス
（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎａｃｅｔｅ ｓｐ．） の存在
下にシンバスタチンの生体的転換で得たシンバスタチン
の水酸化された類似体が開示されている。１９９０年５
月４日登録の同時係属中の米国出願第５１６，２８６号
（代理人書類番号 Ｎｏ．１７９４６ＩＡ）において、
本発明で用いられ、本出願書で化合物（ＩＩＩ） と命
名された基質化合物が開示されており、又、一般的に、
本発明の５−ＨＯＣＨ２ −及び７−ＨＯＣＨ２ −酸
化物も言及されている。
【０００５】２つの新規な抗高血圧性酸化物（Ｉ）及び
（ＩＩ）は、基質化合物（ＩＩＩ） の存在下で微生物
アクチノプラーネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎａｃｅｔｅ
ｓｐ．） （ＭＡ６５５９）、ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３
７７１の発酵によって得られる。生物変換は、液内好気
性条件下に、窒素栄養を含む炭水化物水溶液中で、ｐＨ
約７で化合物（Ｉ）及び（ＩＩ）を生産するのに十分な
時間で行なわれる。双方の酸化物ともにＡＩＩ拮抗作用
を示す、すなわち、ウサギ大動脈から由来する調整した
膜に特異的に結合した１２５ Ｉ−Ｓａｒ１ −Ｉｌｅ
８ −アンジオテンシンＩＩ全体の５０％の置換を生じ
させるのに必要な有効ＡＩＩ拮抗物質濃度を測定するア
ッセイにおいて、双方ともに、５０μｍ 以下の阻害濃
度（ＩＣ５０）を持つ、つまり双方ともに抗高血圧剤で
ある。なお、このアッセイを本出願書ではＩＣ５０アッ
セイと呼ぶ。
（ＩＩ）は、基質化合物（ＩＩＩ） の存在下で微生物
アクチノプラーネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎａｃｅｔｅ
ｓｐ．） （ＭＡ６５５９）、ＡＴＣＣ Ｎｏ．５３
７７１の発酵によって得られる。生物変換は、液内好気
性条件下に、窒素栄養を含む炭水化物水溶液中で、ｐＨ
約７で化合物（Ｉ）及び（ＩＩ）を生産するのに十分な
時間で行なわれる。双方の酸化物ともにＡＩＩ拮抗作用
を示す、すなわち、ウサギ大動脈から由来する調整した
膜に特異的に結合した１２５ Ｉ−Ｓａｒ１ −Ｉｌｅ
８ −アンジオテンシンＩＩ全体の５０％の置換を生じ
させるのに必要な有効ＡＩＩ拮抗物質濃度を測定するア
ッセイにおいて、双方ともに、５０μｍ 以下の阻害濃
度（ＩＣ５０）を持つ、つまり双方ともに抗高血圧剤で
ある。なお、このアッセイを本出願書ではＩＣ５０アッ
セイと呼ぶ。
【０００６】さらに、本発明が提供するのは、医薬用の
無毒性の担体又は賦形剤と組み合わせた、治療に有効な
量の５−ＨＯＣＨ２ 酸化物又は７−ＨＯＣＨ２ −酸
化物のどちらかを含んだ医薬組成物である。
無毒性の担体又は賦形剤と組み合わせた、治療に有効な
量の５−ＨＯＣＨ２ 酸化物又は７−ＨＯＣＨ２ −酸
化物のどちらかを含んだ医薬組成物である。
【０００７】さらに、本発明が提供するのは、高血圧障
害の制御又はうっ血性心疾患の治療を目的としたホスト
のヒトの治療法において、当該ホストに治療に有効な量
の５−ＨＯＣＨ２ −酸化物又は７−ＨＯＣＨ２ −酸
化物を投与することを特徴とする治療法である。
害の制御又はうっ血性心疾患の治療を目的としたホスト
のヒトの治療法において、当該ホストに治療に有効な量
の５−ＨＯＣＨ２ −酸化物又は７−ＨＯＣＨ２ −酸
化物を投与することを特徴とする治療法である。
【０００８】本発明の生成物は化合物（Ｉ）及び（ＩＩ
）：
）：
【化６】
である。
【０００９】本発明の新規な方法は、栄養培地中の基質
化合物（ＩＩＩ） ：
化合物（ＩＩＩ） ：
【化７】
の存在下に微生物アクチノプラーネス（Ａｃｔｉｎｏｐ
ｌａｎａｃｅｔｅ ｓｐ．） を発酵させること及びそ
の結果得られる生物変換生成物である化合物（Ｉ）及び
（ＩＩ）を従来の方法で単離することから成る。生物的
に純粋なアクチノプラーネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎａ
ｃｅｔｅｓｐ．） は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎの永久培養コレ
クションの中で現在入手可能であり、アクセスナンバー
はＡＴＣＣ５３７７１である。
ｌａｎａｃｅｔｅ ｓｐ．） を発酵させること及びそ
の結果得られる生物変換生成物である化合物（Ｉ）及び
（ＩＩ）を従来の方法で単離することから成る。生物的
に純粋なアクチノプラーネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎａ
ｃｅｔｅｓｐ．） は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎの永久培養コレ
クションの中で現在入手可能であり、アクセスナンバー
はＡＴＣＣ５３７７１である。
【００１０】これまでに行なった分類分析によれば、微
生物アクチノプラーネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎａｃｅ
ｔｅ ｓｐ．） は放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔ
ａｌｅｓ） アクチノプラーネス科（Ａｃｔｉｎｏｐｌ
ａｎａｃｅａ）ストレプトスポランギウム属（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ） に属し、その特徴は以
下のようである：
生物アクチノプラーネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎａｃｅ
ｔｅ ｓｐ．） は放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔ
ａｌｅｓ） アクチノプラーネス科（Ａｃｔｉｎｏｐｌ
ａｎａｃｅａ）ストレプトスポランギウム属（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ） に属し、その特徴は以
下のようである：
【００１１】顕微鏡下の観察 培養
は、直径約６ミクロンまで分岐した繊維状に拡がって成
長する。球形ないし卵形の胞子嚢が、グリセロール・ア
スパラギン寒天培地、オートミール寒天培地、イースト
・麦芽糖抽出物寒天培地及び無機塩・デンプン寒天培地
で探知される。胞子嚢の大きさは直径２．５〜４４ミク
ロンである。 オートミール寒天培地 栄養増殖：背面は透明 気菌糸のかたまり：中程度、くすんだ白色、粉状水溶性
色素：無し グリセロール・アスパラギン寒天培地 栄養増殖：表面は赤褐色 気菌糸：周辺部はくすんだ白色で綿状であり、コロニー
中心部はにごった紅色で粉状に変わる 水溶性色素：ごく淡い茶色 無機塩・デンプン寒天培地 栄養増殖：赤褐色 気菌糸：周辺部はくすんだ白色で綿状であり、コロニー
中心部はにごった紅色で粉状に変わる。 水溶性色素：デンプンの小さな無色の部分があり、成長
の周辺部に茶色になっている部分がある。 イースト抽出物・麦芽糖抽出物寒天培地栄養増殖：赤褐
色ないしこげ茶色 気菌糸のかたまり：粉状でにごった紅色の菌糸のかたま
りに対して孤立した白色綿状の成長 水溶性色素：黄色味がかった茶色
は、直径約６ミクロンまで分岐した繊維状に拡がって成
長する。球形ないし卵形の胞子嚢が、グリセロール・ア
スパラギン寒天培地、オートミール寒天培地、イースト
・麦芽糖抽出物寒天培地及び無機塩・デンプン寒天培地
で探知される。胞子嚢の大きさは直径２．５〜４４ミク
ロンである。 オートミール寒天培地 栄養増殖：背面は透明 気菌糸のかたまり：中程度、くすんだ白色、粉状水溶性
色素：無し グリセロール・アスパラギン寒天培地 栄養増殖：表面は赤褐色 気菌糸：周辺部はくすんだ白色で綿状であり、コロニー
中心部はにごった紅色で粉状に変わる 水溶性色素：ごく淡い茶色 無機塩・デンプン寒天培地 栄養増殖：赤褐色 気菌糸：周辺部はくすんだ白色で綿状であり、コロニー
中心部はにごった紅色で粉状に変わる。 水溶性色素：デンプンの小さな無色の部分があり、成長
の周辺部に茶色になっている部分がある。 イースト抽出物・麦芽糖抽出物寒天培地栄養増殖：赤褐
色ないしこげ茶色 気菌糸のかたまり：粉状でにごった紅色の菌糸のかたま
りに対して孤立した白色綿状の成長 水溶性色素：黄色味がかった茶色
【００１２】卵アルブミン寒天培地
栄養増殖：淡黄色、扁平状
気菌糸のかたまり：成長の周辺にかぎってまばらに白色
綿状 水溶性色素：無し 栄養チロシン寒天培地 栄養増殖：透明ないし淡黄色 気菌糸のかたまり：無し 水溶性色素：無し チロシンの分解：無し 脱脂乳寒天培地 栄養増殖：レザー様で黄色 気菌糸のかたまり：まばらでくすんだ白色で粉状水溶性
色素：無し カゼインの加水分解：陽性 トマトペースト・オートミール寒天培地栄養増殖：オレ
ンジイエローしわ状 気菌糸のかたまり：粉状、くすんだ白色から紫がかった
茶色までさまざま
綿状 水溶性色素：無し 栄養チロシン寒天培地 栄養増殖：透明ないし淡黄色 気菌糸のかたまり：無し 水溶性色素：無し チロシンの分解：無し 脱脂乳寒天培地 栄養増殖：レザー様で黄色 気菌糸のかたまり：まばらでくすんだ白色で粉状水溶性
色素：無し カゼインの加水分解：陽性 トマトペースト・オートミール寒天培地栄養増殖：オレ
ンジイエローしわ状 気菌糸のかたまり：粉状、くすんだ白色から紫がかった
茶色までさまざま
【００１３】ゼラチン穿刺培養
栄養増殖：オレンジイエロー
気菌糸のかたまり：無し
水溶性色素：無し
ゼラチンの液化：陽性
ペプトン・鉄・イースト抽出物寒天傾斜培地栄養増殖：
無色レザー様 気菌糸のかたまり：中程度、くすんだ白色、粉状水溶性
色素：無し メラニン：陰性 Ｈ２ Ｓ：陰性 トリプトン・イースト抽出物かたまり 水溶性色素：無し
無色レザー様 気菌糸のかたまり：中程度、くすんだ白色、粉状水溶性
色素：無し メラニン：陰性 Ｈ２ Ｓ：陰性 トリプトン・イースト抽出物かたまり 水溶性色素：無し
【００１４】炭水化物利用パターン
【表１】
【００１５】炭素源利用の研究は、１％の炭素源をおぎ
なったＰｒｉｄｈａｍ− Ｇｏｔｔｌｌｅｂ基礎培地を
用いて行なった。 評価は「ストレプトマイシス種の特徴づけの方法」ＩＪ
ＳＢ１６：３１３〜３４０（Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃ
ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）に記載の方法によった。
なったＰｒｉｄｈａｍ− Ｇｏｔｔｌｌｅｂ基礎培地を
用いて行なった。 評価は「ストレプトマイシス種の特徴づけの方法」ＩＪ
ＳＢ１６：３１３〜３４０（Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃ
ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）に記載の方法によった。
【００１６】一般に、５−ＨＯＣＨ２ 及び７−ＨＯＣ
Ｈ２ 酸化物は、適当な濃度の基質化合物（ＩＩＩ）
の存在下に、同化可能な炭素及び窒素源を含んだ水性栄
養培地中で、好ましくは液内好気性条件下に（たとえば
振とう培養、液内培養等）前記の微生物の培養（発酵）
を行なって生産することができる。水性培地中の親（お
や）化合物の適当な濃度は、０．０５ｍｇ／ｍｌないし
０．２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌであり
、０．０５ｍｇ／ｍｌ未満では不十分で、０．２ｍｇ／
ｍｌをこえると培養を阻害することがある。水性培地は
２６℃から２９℃の温度で、好ましくは２７℃でインキ
ュベートされるが、この温度範囲以下では培養の成長が
阻害され、この温度範囲をこえると培養物が死ぬ。水性
培地は、ＨＰＬＣでモニターして酸化生物変換が完了す
るのに必要な時間、通常は約２４時間、約２２０ｒｐｍ
で運転する約２の作動を有する回転振とう器でインキ
ュベートする。この水性培地は、発酵過程の開始時及び
終了（回収）時にｐＨ６ないし８、好ましくは約７に維
持する。これより大きいかまたは小さいｐＨでは培養は
死んでしまう。所望のｐＨは、モルホリンエタンスルホ
ン酸（ＭＥＳ）及びモルホリンプロパンスルホン酸（Ｍ
ＯＰＳ）等のバッファーによって、あるいは後述の生産
培地のような本来バッファー特性を持つ栄養物質を選択
することによって維持される。
Ｈ２ 酸化物は、適当な濃度の基質化合物（ＩＩＩ）
の存在下に、同化可能な炭素及び窒素源を含んだ水性栄
養培地中で、好ましくは液内好気性条件下に（たとえば
振とう培養、液内培養等）前記の微生物の培養（発酵）
を行なって生産することができる。水性培地中の親（お
や）化合物の適当な濃度は、０．０５ｍｇ／ｍｌないし
０．２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌであり
、０．０５ｍｇ／ｍｌ未満では不十分で、０．２ｍｇ／
ｍｌをこえると培養を阻害することがある。水性培地は
２６℃から２９℃の温度で、好ましくは２７℃でインキ
ュベートされるが、この温度範囲以下では培養の成長が
阻害され、この温度範囲をこえると培養物が死ぬ。水性
培地は、ＨＰＬＣでモニターして酸化生物変換が完了す
るのに必要な時間、通常は約２４時間、約２２０ｒｐｍ
で運転する約２の作動を有する回転振とう器でインキ
ュベートする。この水性培地は、発酵過程の開始時及び
終了（回収）時にｐＨ６ないし８、好ましくは約７に維
持する。これより大きいかまたは小さいｐＨでは培養は
死んでしまう。所望のｐＨは、モルホリンエタンスルホ
ン酸（ＭＥＳ）及びモルホリンプロパンスルホン酸（Ｍ
ＯＰＳ）等のバッファーによって、あるいは後述の生産
培地のような本来バッファー特性を持つ栄養物質を選択
することによって維持される。
【００１７】栄養培地中の好ましい炭素源は、グルコー
ス、キシロース、ガラクトース、グリセリン、デンプン
、デキストリン等のある種の炭化水素である。他の供給
源には、麦芽糖、ラムノース、ラフィノース、アラビノ
ース、マンノース、サリシン、コハク酸ナトリウム等を
含めてもよい。好ましい窒素源は、イースト抽出物、肉
抽出物、ペプトン、グルテンミール、綿実ミール、大豆
ミール及び他の（一部あるいは完全に脱脂した）植物の
ミール、カゼイン加水分解物、大豆加水分解物及びイー
スト加水分解物、コーン・スティープリカー、乾燥イー
スト、小麦胚芽、フェザーミール、ピーナツ粉、蒸留水
等、、また同様に、アンモニウム塩（たとえば、硝酸ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等
）、尿素、アミノ酸等の無機及び有機窒素化合物である
。炭素源及び窒素源は、組み合わせて用いるのが有効で
あるが、微量の成長因子と相当量の鉱物栄養を含むそれ
ほど純粋でないものも使用に適しているので、純粋な供
給源を用いる必要はない。所望ならば、炭酸ナトリウム
又は炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム又はリン酸カリ
ウム、塩化ナトリウム又は塩化カリウム、ヨウ化ナトリ
ウム又はヨウ化カリウム、マグネシウム塩、銅の塩、コ
バルト塩等の鉱物塩を培地に加えてもよい。必要ならば
、とくに培養媒質がいちじるしく発泡する場合には、流
動パラフィン、脂肪油、植物油、鉱油又はシリコーン等
の消泡剤を加えてもよい。
ス、キシロース、ガラクトース、グリセリン、デンプン
、デキストリン等のある種の炭化水素である。他の供給
源には、麦芽糖、ラムノース、ラフィノース、アラビノ
ース、マンノース、サリシン、コハク酸ナトリウム等を
含めてもよい。好ましい窒素源は、イースト抽出物、肉
抽出物、ペプトン、グルテンミール、綿実ミール、大豆
ミール及び他の（一部あるいは完全に脱脂した）植物の
ミール、カゼイン加水分解物、大豆加水分解物及びイー
スト加水分解物、コーン・スティープリカー、乾燥イー
スト、小麦胚芽、フェザーミール、ピーナツ粉、蒸留水
等、、また同様に、アンモニウム塩（たとえば、硝酸ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等
）、尿素、アミノ酸等の無機及び有機窒素化合物である
。炭素源及び窒素源は、組み合わせて用いるのが有効で
あるが、微量の成長因子と相当量の鉱物栄養を含むそれ
ほど純粋でないものも使用に適しているので、純粋な供
給源を用いる必要はない。所望ならば、炭酸ナトリウム
又は炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム又はリン酸カリ
ウム、塩化ナトリウム又は塩化カリウム、ヨウ化ナトリ
ウム又はヨウ化カリウム、マグネシウム塩、銅の塩、コ
バルト塩等の鉱物塩を培地に加えてもよい。必要ならば
、とくに培養媒質がいちじるしく発泡する場合には、流
動パラフィン、脂肪油、植物油、鉱油又はシリコーン等
の消泡剤を加えてもよい。
【００１８】液内好気性培養条件は、５−ＨＯＣＨ２
−及び７−ＨＯＣＨ２ −酸化物の大量生産に好ましい
。少量の生産には、フラスコ又はボトル内での振とう培
養又は表面培養を用いる。さらに、大型タンクで成長を
行なう場合、５−ＨＯＣＨ２ −及び７−ＨＯＣＨ２
−酸化物の生産工程における成長のずれをさけるために
、生産タンク内での接種には生物の栄養成長形態を用い
るのが好ましい。したがって、好ましくは、まず比較的
少量の培養培地に斜面培養した生物の胞子又は菌子を接
種し、「種（たね）培地」とも呼ばれる前記接種された
培地を培養し、その後培養した栄養成長接種物を無菌的
に大きなタンクにうつすのが好ましい。接種物を生産す
る発酵培地は、５−ＨＯＣＨ２ −及び７−ＨＯＣＨ２
−酸化物の生産に用いるものとほぼ同じものか、ある
いは異なるものであり、通常は接種前に滅菌のためにオ
ートクレーブに入れる。発酵培地は、通常、オートクレ
ーブの段階以前に、好ましくはバッファー溶液の形態の
適当な酸又は塩基を加えることによって、ｐＨ６ないし
８、好ましくは約７に調整する。種培地の温度は、２６
℃から２９℃、好ましくは２７℃に維持するが、この範
囲以下では培養物の成長が阻害され、この範囲をこえる
と培養物が死ぬ。この種培地のインキュベーションは、
通常、２２０ｒｐｍ で運転する回転振とう器で約１０
ないし３０時間、好ましくは２４時間行なわれるが、発
酵条件やスケールによってインキュベーションの時間を
変えてもよい。培養混合物の振とうと通気は、いろいろ
な方法で行なうことができる。振とうは、プロペラや類
似の機械的振とう装置、発酵槽の回転又は振とう、いろ
いろなポンプ装置もしくは無菌空気を培地中に通すこと
によって行なうことができる。通気は、発酵培地中に無
菌空気を通すことによって行うことができる。
−及び７−ＨＯＣＨ２ −酸化物の大量生産に好ましい
。少量の生産には、フラスコ又はボトル内での振とう培
養又は表面培養を用いる。さらに、大型タンクで成長を
行なう場合、５−ＨＯＣＨ２ −及び７−ＨＯＣＨ２
−酸化物の生産工程における成長のずれをさけるために
、生産タンク内での接種には生物の栄養成長形態を用い
るのが好ましい。したがって、好ましくは、まず比較的
少量の培養培地に斜面培養した生物の胞子又は菌子を接
種し、「種（たね）培地」とも呼ばれる前記接種された
培地を培養し、その後培養した栄養成長接種物を無菌的
に大きなタンクにうつすのが好ましい。接種物を生産す
る発酵培地は、５−ＨＯＣＨ２ −及び７−ＨＯＣＨ２
−酸化物の生産に用いるものとほぼ同じものか、ある
いは異なるものであり、通常は接種前に滅菌のためにオ
ートクレーブに入れる。発酵培地は、通常、オートクレ
ーブの段階以前に、好ましくはバッファー溶液の形態の
適当な酸又は塩基を加えることによって、ｐＨ６ないし
８、好ましくは約７に調整する。種培地の温度は、２６
℃から２９℃、好ましくは２７℃に維持するが、この範
囲以下では培養物の成長が阻害され、この範囲をこえる
と培養物が死ぬ。この種培地のインキュベーションは、
通常、２２０ｒｐｍ で運転する回転振とう器で約１０
ないし３０時間、好ましくは２４時間行なわれるが、発
酵条件やスケールによってインキュベーションの時間を
変えてもよい。培養混合物の振とうと通気は、いろいろ
な方法で行なうことができる。振とうは、プロペラや類
似の機械的振とう装置、発酵槽の回転又は振とう、いろ
いろなポンプ装置もしくは無菌空気を培地中に通すこと
によって行なうことができる。通気は、発酵培地中に無
菌空気を通すことによって行うことができる。
【００１９】発酵を行なうための好ましい培養／生産培
地には以下のものが含まれる、すなわち：
地には以下のものが含まれる、すなわち：
【表２】
【表３】
【００２０】生産した５−ＨＯＣＨ２ −及び７−ＨＯ
ＣＨ２ −酸化物は、他の公知の生物学的活性物質の回
収に通常用いられる従来の方法によって、培養培地から
回収できる。５−ＨＯＣＨ２ −及び７−ＨＯＣＨ２
−酸化物は、培養した菌糸及び濾過液中に見つかり、こ
れらは培養ブロスの濾過又は遠心によって得られる。し
たがって以下の従来の方法で菌糸及び濾過液から単離及
び精製できる、すなわち減圧下の濃縮、凍結乾燥、塩化
メチレン等のような通常の溶媒による抽出、ｐＨ調整、
通常の樹脂（たとえば陰イオン又は陽イオン交換樹脂、
非イオン吸収樹脂、等）を用いた処理、通常の吸収剤（
たとえば活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、ア
ルミナ等）を用いた処理、結晶化、再結晶等である。好
ましい回収方法は溶媒抽出、とくに塩化メチレンを用い
たものである。好ましい精製方法は、シリカゲルカラム
及び水とメタノール、アセトニトリル等の有機溶媒と少
量の酢酸、トリフルオロ酢酸、リン酸等の酸とから成る
溶離混合物を用いたクロマトグラフィー、とくにＨＰＬ
Ｃの使用である。好ましい溶離液は、水、アセトニトリ
ル及び０．１％のトリフルオロ酢酸から成り、リニアな
勾配でカラムに通される。
ＣＨ２ −酸化物は、他の公知の生物学的活性物質の回
収に通常用いられる従来の方法によって、培養培地から
回収できる。５−ＨＯＣＨ２ −及び７−ＨＯＣＨ２
−酸化物は、培養した菌糸及び濾過液中に見つかり、こ
れらは培養ブロスの濾過又は遠心によって得られる。し
たがって以下の従来の方法で菌糸及び濾過液から単離及
び精製できる、すなわち減圧下の濃縮、凍結乾燥、塩化
メチレン等のような通常の溶媒による抽出、ｐＨ調整、
通常の樹脂（たとえば陰イオン又は陽イオン交換樹脂、
非イオン吸収樹脂、等）を用いた処理、通常の吸収剤（
たとえば活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、ア
ルミナ等）を用いた処理、結晶化、再結晶等である。好
ましい回収方法は溶媒抽出、とくに塩化メチレンを用い
たものである。好ましい精製方法は、シリカゲルカラム
及び水とメタノール、アセトニトリル等の有機溶媒と少
量の酢酸、トリフルオロ酢酸、リン酸等の酸とから成る
溶離混合物を用いたクロマトグラフィー、とくにＨＰＬ
Ｃの使用である。好ましい溶離液は、水、アセトニトリ
ル及び０．１％のトリフルオロ酢酸から成り、リニアな
勾配でカラムに通される。
【００２１】本発明の化合物は、多種な無機及び有機の
酸及び塩基とともに塩を形成し、この塩もまた本発明の
範囲内にある。このような塩には、アンモニウム塩、ナ
トリウム及びカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カル
シウム及びマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩
、有機塩基との塩、たとえばジシクロヘキシルアミン塩
やＮ−メチル−Ｄ−グルカミン、アルギニン、リジン等
のアミノ酸との塩が含まれる。又、たとえばＨＣｌ、Ｈ
Ｂｒ、Ｈ２ ＳＯ４、Ｈ３ ＰＯ４ 、メタンスルホン
酸、トルエンスルホン酸、マレイン酸、フマル酸、カン
ファースルホン酸のような有機及び無機の酸との塩も調
製できる。無毒性の生理学的に許容な塩が好ましい。塩
は、遊離酸又は遊離塩基の形態の生成物を、塩が不溶な
溶媒又は媒質中で、又は後に減圧したりフリーズドライ
してとりのぞく水などの溶媒中で当量以上の適当な酸又
は塩と反応させたり、もしくは適当なイオン交換樹脂上
ですでに存在する塩の陽イオンを他の陽イオンに交換す
るなどの従来の方法によって形成することができる。又
、この物質の適切な形成は、酢酸塩などの分子上の水酸
基によって、形成した化合物（Ｉ）及び（ＩＩ）の通常
の医薬的に許容される生体内で不安定なエステルも含ま
れる。
酸及び塩基とともに塩を形成し、この塩もまた本発明の
範囲内にある。このような塩には、アンモニウム塩、ナ
トリウム及びカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カル
シウム及びマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩
、有機塩基との塩、たとえばジシクロヘキシルアミン塩
やＮ−メチル−Ｄ−グルカミン、アルギニン、リジン等
のアミノ酸との塩が含まれる。又、たとえばＨＣｌ、Ｈ
Ｂｒ、Ｈ２ ＳＯ４、Ｈ３ ＰＯ４ 、メタンスルホン
酸、トルエンスルホン酸、マレイン酸、フマル酸、カン
ファースルホン酸のような有機及び無機の酸との塩も調
製できる。無毒性の生理学的に許容な塩が好ましい。塩
は、遊離酸又は遊離塩基の形態の生成物を、塩が不溶な
溶媒又は媒質中で、又は後に減圧したりフリーズドライ
してとりのぞく水などの溶媒中で当量以上の適当な酸又
は塩と反応させたり、もしくは適当なイオン交換樹脂上
ですでに存在する塩の陽イオンを他の陽イオンに交換す
るなどの従来の方法によって形成することができる。又
、この物質の適切な形成は、酢酸塩などの分子上の水酸
基によって、形成した化合物（Ｉ）及び（ＩＩ）の通常
の医薬的に許容される生体内で不安定なエステルも含ま
れる。
【００２２】本発明の５−ＨＯＣＨ２ −及び７−ＨＯ
ＣＨ２ −酸化物はともにＩＣ５０アッセイでＡＩＩ拮
抗作用を示す、すなわち高血圧の治療に有用である。又
、これらは、急性及び慢性うっ血性心疾患の処置、２次
性高アルドステロン症の治療、原発性及び２次性肺動脈
高アルドステロン症、原発性及び２次性肺動脈高血圧、
腎不全、腎血管高血圧、眼の高血圧及び網膜血流障害の
処置、そして片頭痛やレイノー病等の血管障害の処置に
役立つ。 これら及び類似の障害に対する本発明の化合物の適用は
、当業者には明らかである。
ＣＨ２ −酸化物はともにＩＣ５０アッセイでＡＩＩ拮
抗作用を示す、すなわち高血圧の治療に有用である。又
、これらは、急性及び慢性うっ血性心疾患の処置、２次
性高アルドステロン症の治療、原発性及び２次性肺動脈
高アルドステロン症、原発性及び２次性肺動脈高血圧、
腎不全、腎血管高血圧、眼の高血圧及び網膜血流障害の
処置、そして片頭痛やレイノー病等の血管障害の処置に
役立つ。 これら及び類似の障害に対する本発明の化合物の適用は
、当業者には明らかである。
【００２３】高血圧及び上記の臨床的状態の処置におい
て、本発明の化合物は、経口投与のためには錠剤、カプ
セル剤又はエリキシル剤のような組成物として、直腸か
らの投与には坐薬として、非経口又は筋肉内投与のため
には滅菌した溶液又は懸濁液等として用いることができ
る。本発明の化合物は、このような治療を必要とする患
者（動物及びヒト）に対して、至適服用量で投与するこ
とができる。体質や病気の程度、患者の体重、患者が目
下のところ従がっている規定食、並行して行なわれる薬
物治療、及び当業者が認める他の要因により、服用量は
患者ごとに異なるが、一般に、１日当り患者に対して１
回又は複数回で服用され、その量は約１ないし約１００
０ｍｇの範囲である。好ましくは、服用量は１日に患者
あたり約２．５ないし２５０ｍｇの範囲、より好ましく
は１日に患者あたり約２．５ないし７５ｍｇの範囲であ
る。
て、本発明の化合物は、経口投与のためには錠剤、カプ
セル剤又はエリキシル剤のような組成物として、直腸か
らの投与には坐薬として、非経口又は筋肉内投与のため
には滅菌した溶液又は懸濁液等として用いることができ
る。本発明の化合物は、このような治療を必要とする患
者（動物及びヒト）に対して、至適服用量で投与するこ
とができる。体質や病気の程度、患者の体重、患者が目
下のところ従がっている規定食、並行して行なわれる薬
物治療、及び当業者が認める他の要因により、服用量は
患者ごとに異なるが、一般に、１日当り患者に対して１
回又は複数回で服用され、その量は約１ないし約１００
０ｍｇの範囲である。好ましくは、服用量は１日に患者
あたり約２．５ないし２５０ｍｇの範囲、より好ましく
は１日に患者あたり約２．５ないし７５ｍｇの範囲であ
る。
【００２４】又、本発明の化合物は、α−メチルドーパ
等の他の抗高血圧剤及び／又はヒドロクロロチアジド等
の利尿剤、及び／又はエナラプリル等のアンジオテンシ
ン変換酵素阻害剤、及び／又はニフェジピン等のカルシ
ウムチャンネル遮断剤と組み合わせて投与してもよい。 通常、これらを組み合わせたものの各１日の服用量は、
臨床服用量として勧められる最少量の１／５から、それ
らを単独に投与する場合に勧められる最大量までの範囲
である。これらの服用量の範囲は、一日に分けて服用す
るのに必要なように１回服用量を基本として調整するが
、前記のように、患者の体質や病気の程度、体重、特定
の規定食や他の要因によって変動する。通常これらを組
み合わせたものは、下記のように医薬組成物に処方され
る。約１ないし１００ｍｇの化合物（Ｉ）又は（ＩＩ）
、あるいは化合物（Ｉ）と（ＩＩ）の混合物、あるいは
それらの生理的に許容される塩を、生理的に適用できる
賦形剤、担体、添加剤、結合剤、保存剤、安定化剤、着
香剤等と混ぜ合わせて、一般に認められている薬物投与
の要求する１回服用量の形態に処方する。これらの混合
物又は処方中の活性物質の量は、前述の範囲の適当な服
用量が得られるようにする。
等の他の抗高血圧剤及び／又はヒドロクロロチアジド等
の利尿剤、及び／又はエナラプリル等のアンジオテンシ
ン変換酵素阻害剤、及び／又はニフェジピン等のカルシ
ウムチャンネル遮断剤と組み合わせて投与してもよい。 通常、これらを組み合わせたものの各１日の服用量は、
臨床服用量として勧められる最少量の１／５から、それ
らを単独に投与する場合に勧められる最大量までの範囲
である。これらの服用量の範囲は、一日に分けて服用す
るのに必要なように１回服用量を基本として調整するが
、前記のように、患者の体質や病気の程度、体重、特定
の規定食や他の要因によって変動する。通常これらを組
み合わせたものは、下記のように医薬組成物に処方され
る。約１ないし１００ｍｇの化合物（Ｉ）又は（ＩＩ）
、あるいは化合物（Ｉ）と（ＩＩ）の混合物、あるいは
それらの生理的に許容される塩を、生理的に適用できる
賦形剤、担体、添加剤、結合剤、保存剤、安定化剤、着
香剤等と混ぜ合わせて、一般に認められている薬物投与
の要求する１回服用量の形態に処方する。これらの混合
物又は処方中の活性物質の量は、前述の範囲の適当な服
用量が得られるようにする。
【００２５】錠剤、カプセル剤等に組み込むことのでき
る補助剤の例としては以下のものがある。すなわち；ト
ラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプン
又はゼラチン等の結合剤；微結晶セルロース等の添加剤
；コーンスターチのような崩壊剤；前もってゼラチン化
したデンプン、アルギン酸等；ステアリン酸マグネシウ
ム等の滑沢剤；白糖、乳糖又はサッカリン等の甘味剤；
ハッカ、メチルサリシレート油、サクランボなどの着香
剤。服用単位形態がカプセルの場合、上記のような物質
に加えて脂肪油等の液状の担体を含んでもよい。種々の
他の物質が、コーティングあるいは服用単位の物理的形
態の他の変更のために含まれていてもよい。たとえば、
錠剤をセラックか砂糖、あるいは両方でコーティングし
てもよい。シロップ剤又はエリキシル剤は、活性化合物
、甘味剤として白糖、保有剤としてメチル及びプロピル
パラオキシ安息香酸エステル、着色剤及びサクランボ又
はオレンジフレーバー等の着香剤を含んでよい。
る補助剤の例としては以下のものがある。すなわち；ト
ラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプン
又はゼラチン等の結合剤；微結晶セルロース等の添加剤
；コーンスターチのような崩壊剤；前もってゼラチン化
したデンプン、アルギン酸等；ステアリン酸マグネシウ
ム等の滑沢剤；白糖、乳糖又はサッカリン等の甘味剤；
ハッカ、メチルサリシレート油、サクランボなどの着香
剤。服用単位形態がカプセルの場合、上記のような物質
に加えて脂肪油等の液状の担体を含んでもよい。種々の
他の物質が、コーティングあるいは服用単位の物理的形
態の他の変更のために含まれていてもよい。たとえば、
錠剤をセラックか砂糖、あるいは両方でコーティングし
てもよい。シロップ剤又はエリキシル剤は、活性化合物
、甘味剤として白糖、保有剤としてメチル及びプロピル
パラオキシ安息香酸エステル、着色剤及びサクランボ又
はオレンジフレーバー等の着香剤を含んでよい。
【００２６】注射用無菌混合物は、通常の薬剤製法によ
って、注射用の水、ゴマ油やヤシ油、ピーナッツ油、綿
実油等の天然の植物油、あるいはオレイン酸エチル等の
合成脂肪賦形剤中に、活性物質を溶解又は懸濁して処方
することができる。必要ならば、バッファー、保存剤、
酸化防止剤等を組み込んでもよい。
って、注射用の水、ゴマ油やヤシ油、ピーナッツ油、綿
実油等の天然の植物油、あるいはオレイン酸エチル等の
合成脂肪賦形剤中に、活性物質を溶解又は懸濁して処方
することができる。必要ならば、バッファー、保存剤、
酸化防止剤等を組み込んでもよい。
【００２７】又、本発明の化合物は、上昇した眼圧の治
療に有用であり、このような治療を必要とする患者に、
錠剤、カプセル剤、注射剤のような通常の医薬組成物で
投与することができ、また同様に、溶液、軟膏、挿入剤
、ゲル剤等の眼用局所剤の処方でも投与できる。眼圧の
治療用に処方した医薬組成物は、通常重量パーセントで
約０．９ないし１５％、好ましくは０．５ないし２％の
本発明の化合物を含む。
療に有用であり、このような治療を必要とする患者に、
錠剤、カプセル剤、注射剤のような通常の医薬組成物で
投与することができ、また同様に、溶液、軟膏、挿入剤
、ゲル剤等の眼用局所剤の処方でも投与できる。眼圧の
治療用に処方した医薬組成物は、通常重量パーセントで
約０．９ないし１５％、好ましくは０．５ないし２％の
本発明の化合物を含む。
【００２８】
ウサギ大動脈より調整した膜を用いた受容体結合アッセ
イ ３つの（Ｐｅｌ − Ｆｒｅｅｚｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌｓ より入手した）冷凍したウサギ大動脈を、５ｍ
Ｍのトリス−０．２５Ｍ白糖中に懸濁して、バッファー
（５０ｍｌ） でｐＨ７．４にてホモジュナイズし、次
いで遠心した。混合物を目の粗い薄地の綿布で濾過し、
上ずみを４℃２０，０００ｒｐｍ で３０分間遠心した
。こうして得られたペレットを、０．２％ウシ血清アル
ブミンと０．２ｍｇ／ｍｌ のバシトラシンを含んだ５
０ｍＭトリスー５ｍＭ ＭｇＣｌ２ バッファー３０
ｍｌ中に再び懸濁して、この懸濁液を１００本のアッセ
イ用試験管に用いた。スクリーニング用にテストするサ
ンプルは２つずつ作られた。調整膜（０．２５ｍｌ）に
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ より入手
した） １２５Ｉ−Ｓａｒ１ −Ｉｌｅ８ −アンジオ
テンシンＩＩ（１０μｌ ；２０，０００ｃｐｍ ）を
単独で、あるいはテストサンプルといっしょに加えて、
この混合物を３７℃で９０分間インキュベートした。そ
の後混合物を氷冷した５０ｍＭトリス−０．９％ Ｎ
ａＣｌ、ｐＨ７．４（４ｍｌ）に希釈して、グラスファ
イバーフィルター（ＧＦ／Ｂ Ｗｈａｔｍａｎ径２．４
″）で濾過した。フィルターをシンチレーション反応混
液（１０ｍｌ）にひたし、Ｐａｃｋａｒｄ ２６６０Ｔ
ｒｉｃａｒｂ 液体シンチレーションカウンターを用い
て放射能を計測した。特異的に結合した全 １２５Ｉ−
Ｓａｒ１−Ｉｌｅ８ −アンジオテンシンＩＩの５０％
を置換する。ＡＩＩ拮抗物質の阻害濃度（ＩＣ５０）を
、ＡＩＩ拮抗物質である化合物の効力測定として表わし
た。上記の方法を用いて、本発明の２つの化合物をとも
に評価すると、少なくともＩＣ５０＜５０μｍ の活性
を示すことがわかり、本発明の化合物が効果的なＡＩＩ
拮抗剤として有用であることが証明され確かめられた。
イ ３つの（Ｐｅｌ − Ｆｒｅｅｚｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌｓ より入手した）冷凍したウサギ大動脈を、５ｍ
Ｍのトリス−０．２５Ｍ白糖中に懸濁して、バッファー
（５０ｍｌ） でｐＨ７．４にてホモジュナイズし、次
いで遠心した。混合物を目の粗い薄地の綿布で濾過し、
上ずみを４℃２０，０００ｒｐｍ で３０分間遠心した
。こうして得られたペレットを、０．２％ウシ血清アル
ブミンと０．２ｍｇ／ｍｌ のバシトラシンを含んだ５
０ｍＭトリスー５ｍＭ ＭｇＣｌ２ バッファー３０
ｍｌ中に再び懸濁して、この懸濁液を１００本のアッセ
イ用試験管に用いた。スクリーニング用にテストするサ
ンプルは２つずつ作られた。調整膜（０．２５ｍｌ）に
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ より入手
した） １２５Ｉ−Ｓａｒ１ −Ｉｌｅ８ −アンジオ
テンシンＩＩ（１０μｌ ；２０，０００ｃｐｍ ）を
単独で、あるいはテストサンプルといっしょに加えて、
この混合物を３７℃で９０分間インキュベートした。そ
の後混合物を氷冷した５０ｍＭトリス−０．９％ Ｎ
ａＣｌ、ｐＨ７．４（４ｍｌ）に希釈して、グラスファ
イバーフィルター（ＧＦ／Ｂ Ｗｈａｔｍａｎ径２．４
″）で濾過した。フィルターをシンチレーション反応混
液（１０ｍｌ）にひたし、Ｐａｃｋａｒｄ ２６６０Ｔ
ｒｉｃａｒｂ 液体シンチレーションカウンターを用い
て放射能を計測した。特異的に結合した全 １２５Ｉ−
Ｓａｒ１−Ｉｌｅ８ −アンジオテンシンＩＩの５０％
を置換する。ＡＩＩ拮抗物質の阻害濃度（ＩＣ５０）を
、ＡＩＩ拮抗物質である化合物の効力測定として表わし
た。上記の方法を用いて、本発明の２つの化合物をとも
に評価すると、少なくともＩＣ５０＜５０μｍ の活性
を示すことがわかり、本発明の化合物が効果的なＡＩＩ
拮抗剤として有用であることが証明され確かめられた。
【００２９】基質化合物（ＩＩＩ） ：５，７−ジメチ
ル−２−エチル−３−（２′−（テトラゾール−５−イ
ル）ビフェン−４−イル）メチル−３Ｈ−イミダゾ［４
，５−ｂ］ピリジンの製造 Ｉ．Ｎ−トリフェニルメチル−５−（４′−ブロモメチ
ル−ビフェン−２−イル）テトラゾールの製造工程１：
２−シアノ−４′−メチルビフェニル−７８℃の無水エ
ーテル（１５０ｍｌ）中のｐ−ブロモトルエン（３０ｇ
）の溶液に、ペンタン（１．７Ｍ）（２１０ｍｌ）中の
ｔ−ＢｕＬｉ溶液を、滴下ろうとを用いてゆっくりと１
時間半にわたって加えた。その後浴をはずして混合物を
室温でさらに２時間かくはんした。その後フラスコの内
容物に、前もって混合したエーテル（１Ｍ）（１８０ｍ
Ｌ）及び無水ＴＨＦ（３６０ｍＬ）中のＺｎＣｌ２ 溶
液を、室温でゆっくりと（カニューレを用いて）加えた
。混合物は、そのままの温度で２時間かくはんして、ス
ラリーに無水ＴＨＦ（３００ｍｌ）中の２−ブロモベン
ゾニトリル（２１．３ｇ）及びＮｉＣｌ２ （Ｐｈ３
Ｐ）２ （２．１ｇ）の溶液を加えた。室温でひと晩（
１８時間）かくはんした後に、混合物をかくはんしなが
らゆっくりと氷冷した０．５Ｎ ＨＣｌ（１５００ｍ
ｌ）にそそいだ。有機層を分離し、水性層をエーテル（
３×３００ｍｌ）で抽出した。合せた有機層は、水、食
塩水で洗浄した後にＭｇＳＯ４ 上で乾燥した。溶媒を
とりのぞくと、半固体のかたまり（３４ｇ）として未精
製生成物を得た。この物質を酢酸エチル／ヘキサン（１
：１２）を用いたシリカゲルフラッシュカラムで精製し
て、低融点の固体（２８ｇ、８８％）として所望のニト
リルを得た。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ）δ２．４２（ｓ，
３Ｈ）、７．２−７．８（ｍ，８Ｈ）；ＦＡＢ−ＭＳ：
ｍ／ｅ １９４（Ｍ＋Ｈ）。 工程２：トリメチルスタニル アジドＮａＮ３ （４
０ｇ）を含む濃ＮａＮ３ 水溶液（１００ｍｌ）に、ジ
オキサン（１０ｍｌ）中の塩化トリメチルすず（２０ｇ
）溶液を、はげしくかくはんしつつ３回にわけて加えた
。ただちに沈殿の形成を観察した。室温でひと晩かくは
んした後に、混合物を濾過した。残渣を水で洗浄して、
真空乾燥後、減圧下にＰ２ Ｏ５ 上で乾燥した。 収量は１８．７ｇ（８１％）、ｍｐ１３２〜１３６℃で
あった。 工程３：Ｎ−トリフェニルメチル−５−（４′−ブロモ
メチル−ビフェン−２−イル）テトラゾール当該化合物
を、ヨーロッパ特許出願ＥＰ第０，２９１，９６９号に
記されるように、２−シアノ−４′−メチルビフェニル
（工程１）から出発して製造した。
ル−２−エチル−３−（２′−（テトラゾール−５−イ
ル）ビフェン−４−イル）メチル−３Ｈ−イミダゾ［４
，５−ｂ］ピリジンの製造 Ｉ．Ｎ−トリフェニルメチル−５−（４′−ブロモメチ
ル−ビフェン−２−イル）テトラゾールの製造工程１：
２−シアノ−４′−メチルビフェニル−７８℃の無水エ
ーテル（１５０ｍｌ）中のｐ−ブロモトルエン（３０ｇ
）の溶液に、ペンタン（１．７Ｍ）（２１０ｍｌ）中の
ｔ−ＢｕＬｉ溶液を、滴下ろうとを用いてゆっくりと１
時間半にわたって加えた。その後浴をはずして混合物を
室温でさらに２時間かくはんした。その後フラスコの内
容物に、前もって混合したエーテル（１Ｍ）（１８０ｍ
Ｌ）及び無水ＴＨＦ（３６０ｍＬ）中のＺｎＣｌ２ 溶
液を、室温でゆっくりと（カニューレを用いて）加えた
。混合物は、そのままの温度で２時間かくはんして、ス
ラリーに無水ＴＨＦ（３００ｍｌ）中の２−ブロモベン
ゾニトリル（２１．３ｇ）及びＮｉＣｌ２ （Ｐｈ３
Ｐ）２ （２．１ｇ）の溶液を加えた。室温でひと晩（
１８時間）かくはんした後に、混合物をかくはんしなが
らゆっくりと氷冷した０．５Ｎ ＨＣｌ（１５００ｍ
ｌ）にそそいだ。有機層を分離し、水性層をエーテル（
３×３００ｍｌ）で抽出した。合せた有機層は、水、食
塩水で洗浄した後にＭｇＳＯ４ 上で乾燥した。溶媒を
とりのぞくと、半固体のかたまり（３４ｇ）として未精
製生成物を得た。この物質を酢酸エチル／ヘキサン（１
：１２）を用いたシリカゲルフラッシュカラムで精製し
て、低融点の固体（２８ｇ、８８％）として所望のニト
リルを得た。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３ ）δ２．４２（ｓ，
３Ｈ）、７．２−７．８（ｍ，８Ｈ）；ＦＡＢ−ＭＳ：
ｍ／ｅ １９４（Ｍ＋Ｈ）。 工程２：トリメチルスタニル アジドＮａＮ３ （４
０ｇ）を含む濃ＮａＮ３ 水溶液（１００ｍｌ）に、ジ
オキサン（１０ｍｌ）中の塩化トリメチルすず（２０ｇ
）溶液を、はげしくかくはんしつつ３回にわけて加えた
。ただちに沈殿の形成を観察した。室温でひと晩かくは
んした後に、混合物を濾過した。残渣を水で洗浄して、
真空乾燥後、減圧下にＰ２ Ｏ５ 上で乾燥した。 収量は１８．７ｇ（８１％）、ｍｐ１３２〜１３６℃で
あった。 工程３：Ｎ−トリフェニルメチル−５−（４′−ブロモ
メチル−ビフェン−２−イル）テトラゾール当該化合物
を、ヨーロッパ特許出願ＥＰ第０，２９１，９６９号に
記されるように、２−シアノ−４′−メチルビフェニル
（工程１）から出発して製造した。
【００３０】ＩＩ．５，７−ジメチル−２−エチルイミ
ダゾ［４，５−ｂ］ピリジンの製造工程１：２−アミノ
−４，６−ジメチル−３−ニトロピリジン２−アミノ−
４，６−ジメチルピリジン（１０．０ｇ、８１．８ｍｍ
ｏｌ）を数回に分けて０℃で（機械的に）かくはんして
いる６５ｍＬのＨ２ＳＯ４ （高濃度ｄ＝１．８４）に
加えた。全量を加えた後、混合物を均一になるまで室温
まであたためた。その後、溶液を−１０℃まで冷却して
、前もって冷却しておいた濃ＨＮＯ３ （１１．５ｍＬ
，ｄ＝１．４０）とＨ２ ＳＯ４ （８．２ｍＬ，ｄ＝
１．８４）の混合物を、内部の反応温度が−９℃をこえ
ないような速さで加えた。全量を加えてから１０分後、
この冷却した（−１０℃）混合物を４００ｇのくだいた
氷の上にそそいだ。こうして得たスラリーを（氷浴で）
冷却しながら濃ＮＨ４ ＯＨを加えて（ｐＨ５．５まで
）中和していった。固体を濾過して単離し、室温で乾燥
させると、白色固体の２−ニトラミノ−４，６−ジメチ
ルピリジン１３．３ｇが得られた。７５ｍＬの−５℃ま
で（氷塩浴で）冷却してかくはんした濃Ｈ２ ＳＯ４
に、内部温度を−３℃以下に保ったままの速さで数回に
わけて、４，６−ジメチル−２−ニトラミノピリジン（
１３．２ｇ，７９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、ＴＬ
Ｃ（ＳｉＯ２ ，ＮＨ４ ＯＨで中和したアリコートで
１：１ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）が転位の完了を示して均
一になるまで（３０分間）０℃にあたためた。混合物を
４００ｇのくだいた氷の上にそそいで、濃ＮＨ４ ＯＨ
を加えてｐＨを５．５に調整した。得られた黄色スラリ
ーを０℃に冷却して濾過し、冷水（５０ｍＬ）で洗浄し
て室温で乾燥すると、（ １ＨＮＭＲによって決定した
ところ）５５：４５の比率の当該化合物と５−ニトロ異
性体の混合物１０．３２ｇを得た。この混合物をそのま
ま工程２に用いた。
ダゾ［４，５−ｂ］ピリジンの製造工程１：２−アミノ
−４，６−ジメチル−３−ニトロピリジン２−アミノ−
４，６−ジメチルピリジン（１０．０ｇ、８１．８ｍｍ
ｏｌ）を数回に分けて０℃で（機械的に）かくはんして
いる６５ｍＬのＨ２ＳＯ４ （高濃度ｄ＝１．８４）に
加えた。全量を加えた後、混合物を均一になるまで室温
まであたためた。その後、溶液を−１０℃まで冷却して
、前もって冷却しておいた濃ＨＮＯ３ （１１．５ｍＬ
，ｄ＝１．４０）とＨ２ ＳＯ４ （８．２ｍＬ，ｄ＝
１．８４）の混合物を、内部の反応温度が−９℃をこえ
ないような速さで加えた。全量を加えてから１０分後、
この冷却した（−１０℃）混合物を４００ｇのくだいた
氷の上にそそいだ。こうして得たスラリーを（氷浴で）
冷却しながら濃ＮＨ４ ＯＨを加えて（ｐＨ５．５まで
）中和していった。固体を濾過して単離し、室温で乾燥
させると、白色固体の２−ニトラミノ−４，６−ジメチ
ルピリジン１３．３ｇが得られた。７５ｍＬの−５℃ま
で（氷塩浴で）冷却してかくはんした濃Ｈ２ ＳＯ４
に、内部温度を−３℃以下に保ったままの速さで数回に
わけて、４，６−ジメチル−２−ニトラミノピリジン（
１３．２ｇ，７９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、ＴＬ
Ｃ（ＳｉＯ２ ，ＮＨ４ ＯＨで中和したアリコートで
１：１ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）が転位の完了を示して均
一になるまで（３０分間）０℃にあたためた。混合物を
４００ｇのくだいた氷の上にそそいで、濃ＮＨ４ ＯＨ
を加えてｐＨを５．５に調整した。得られた黄色スラリ
ーを０℃に冷却して濾過し、冷水（５０ｍＬ）で洗浄し
て室温で乾燥すると、（ １ＨＮＭＲによって決定した
ところ）５５：４５の比率の当該化合物と５−ニトロ異
性体の混合物１０．３２ｇを得た。この混合物をそのま
ま工程２に用いた。
【００３１】工程２：５，７−ジメチル−２−エチルイ
ミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン ＭｅＯＨ（１．２Ｌ）中の５５：４５の２−アミノ−３
−ニトロ−４，６−ジメチルピリジンと２−アミノ−４
，６−ジメチル−５−ニトロピリジンの混合物８．４４
ｇに、１０％のＰｄ／Ｃ（２．４ｇ）を加えた。反応容
器を排気した後に１ａｔｍ のＨ２ で置換して１８時
間はげしくかくはんした。濾過（セライト）して濃縮す
ると暗色固体の２，３−ジアミノ−４，６−ジメチルピ
リジンと２，５−ジアミノ−４，６−ジメチルピリジン
の混合物６．６５ｇを得た。この混合物５．４０ｇ（３
９．４ｍｍｏｌ）にプロピオン酸（８．８０ｍＬ，１１
８ｍｍｏｌ）、つづいてポリリン酸（１００ｍＬ）を加
えた。かくはんしたこの混合物を３時間９０℃に加熱し
た後、１時間１００℃に加熱した。反応完了後に、あた
たかい混合物を３００ｇの氷の上にそそぎ、混合物をＮ
Ｈ４ ＯＨを用いて塩基性にした。混合物を抽出し（４
×５０ｍＬ ＣＨ２ Ｃｌ２ ）、乾燥して（Ｋ２
ＣＯ３ ）、濃縮すると、標記化合物と４，６−ジメチ
ル−２，５−ビス（プロピオンアミド）ピリジンの混合
物を得た。これを精製して（ＳｉＯ２ ，５％ Ｍｅ
ＯＨ／ＥｔＯＡｃ）、より遅く溶離してくる成分である
標記化合物１．６６ｇを得た。 １ＨＮＭＲ（ＣＤ３Ｏ
Ｄ，３００ＭＨｚ）δ６．９５（ｓ，１Ｈ）、２．９２
（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、２．５４（明白なｓ，
６Ｈ）、１．４０（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）。
ミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン ＭｅＯＨ（１．２Ｌ）中の５５：４５の２−アミノ−３
−ニトロ−４，６−ジメチルピリジンと２−アミノ−４
，６−ジメチル−５−ニトロピリジンの混合物８．４４
ｇに、１０％のＰｄ／Ｃ（２．４ｇ）を加えた。反応容
器を排気した後に１ａｔｍ のＨ２ で置換して１８時
間はげしくかくはんした。濾過（セライト）して濃縮す
ると暗色固体の２，３−ジアミノ−４，６−ジメチルピ
リジンと２，５−ジアミノ−４，６−ジメチルピリジン
の混合物６．６５ｇを得た。この混合物５．４０ｇ（３
９．４ｍｍｏｌ）にプロピオン酸（８．８０ｍＬ，１１
８ｍｍｏｌ）、つづいてポリリン酸（１００ｍＬ）を加
えた。かくはんしたこの混合物を３時間９０℃に加熱し
た後、１時間１００℃に加熱した。反応完了後に、あた
たかい混合物を３００ｇの氷の上にそそぎ、混合物をＮ
Ｈ４ ＯＨを用いて塩基性にした。混合物を抽出し（４
×５０ｍＬ ＣＨ２ Ｃｌ２ ）、乾燥して（Ｋ２
ＣＯ３ ）、濃縮すると、標記化合物と４，６−ジメチ
ル−２，５−ビス（プロピオンアミド）ピリジンの混合
物を得た。これを精製して（ＳｉＯ２ ，５％ Ｍｅ
ＯＨ／ＥｔＯＡｃ）、より遅く溶離してくる成分である
標記化合物１．６６ｇを得た。 １ＨＮＭＲ（ＣＤ３Ｏ
Ｄ，３００ＭＨｚ）δ６．９５（ｓ，１Ｈ）、２．９２
（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、２．５４（明白なｓ，
６Ｈ）、１．４０（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）。
【００３２】ＩＩＩ ５，７−ジメチル−２−エチル−
３−（２′−（テトラゾール−５−イル）−ビフェン−
４−イル）メチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリ
ジン工程Ａ 室温の無水ジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）中のかく
はんしたＮａＨ（８０％の分散系１７．２ｍｍｏｌ）の
懸濁液に、一度に５，７−ジメチル−２−エチルイミダ
ゾ［４，５−ｂ］−ピリジン（１．５１ｇ，８．６２ｍ
ｍｏｌ）を加えた。２０分後、混合物を０℃に冷却して
、一度にＮ−トリフェニルメチル−５−（４′−ブロモ
メチルビフェニル−２−イル）−テトラゾール（５．２
９ｇ，９．４８ｍｍｏｌ）を加えた。こうして得た混合
物を室温まであたためて１５時間かくはんした。過剰の
ＮａＨを水で処理して、ＤＭＦのバルクを４０〜５０℃
で減圧下にとりのぞいた。残渣を食塩水からＥｔＯＡｃ
で抽出して乾燥し（Ｋ２ ＣＯ３ ）、濃縮した。フラ
ッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２ 溶媒勾配８
０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１００％ＥｔＯＡｃ）で精
製して、５，７−ジメチル−２−エチル−３−（２′−
Ｎ−トリフェニルメチルテトラゾール−５−イル）ビフ
ェン−４−イル）メチル−３Ｈ−イミダゾ−［４，５−
ｂ］ピリジン４．２５ｇを得た。１ ＨＮＭＲ（３００
ＭＨｚ ，ＣＤＣｌ３ ）δ７．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ
＝７．２Ｈｚ）、７．５０−７．４１（ｍ，２Ｈ）、７
．３６−７．２１（ｍ，１０Ｈ）、７．０５（ｄ，２Ｈ
，Ｊ＝４．５Ｈｚ）、６．９５−６．８９（ｍ，７Ｈ）
、６．８６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ）、５．３５（
ｓ，２Ｈ）、２．６７（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、
２．６５（ｓ，３Ｈ）、２．５８（ｓ，３Ｈ）、１．２
５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）。
３−（２′−（テトラゾール−５−イル）−ビフェン−
４−イル）メチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリ
ジン工程Ａ 室温の無水ジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）中のかく
はんしたＮａＨ（８０％の分散系１７．２ｍｍｏｌ）の
懸濁液に、一度に５，７−ジメチル−２−エチルイミダ
ゾ［４，５−ｂ］−ピリジン（１．５１ｇ，８．６２ｍ
ｍｏｌ）を加えた。２０分後、混合物を０℃に冷却して
、一度にＮ−トリフェニルメチル−５−（４′−ブロモ
メチルビフェニル−２−イル）−テトラゾール（５．２
９ｇ，９．４８ｍｍｏｌ）を加えた。こうして得た混合
物を室温まであたためて１５時間かくはんした。過剰の
ＮａＨを水で処理して、ＤＭＦのバルクを４０〜５０℃
で減圧下にとりのぞいた。残渣を食塩水からＥｔＯＡｃ
で抽出して乾燥し（Ｋ２ ＣＯ３ ）、濃縮した。フラ
ッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２ 溶媒勾配８
０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１００％ＥｔＯＡｃ）で精
製して、５，７−ジメチル−２−エチル−３−（２′−
Ｎ−トリフェニルメチルテトラゾール−５−イル）ビフ
ェン−４−イル）メチル−３Ｈ−イミダゾ−［４，５−
ｂ］ピリジン４．２５ｇを得た。１ ＨＮＭＲ（３００
ＭＨｚ ，ＣＤＣｌ３ ）δ７．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ
＝７．２Ｈｚ）、７．５０−７．４１（ｍ，２Ｈ）、７
．３６−７．２１（ｍ，１０Ｈ）、７．０５（ｄ，２Ｈ
，Ｊ＝４．５Ｈｚ）、６．９５−６．８９（ｍ，７Ｈ）
、６．８６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．５Ｈｚ）、５．３５（
ｓ，２Ｈ）、２．６７（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、
２．６５（ｓ，３Ｈ）、２．５８（ｓ，３Ｈ）、１．２
５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）。
【００３３】工程Ｂ
室温のＣＨ２ Ｃｌ２ （４０ｍＬ）中のトリチル保護
したテトラゾール（４．１３ｇ，６．３３ｍｍｏｌ）の
かくはんした溶液に、８５％ギ酸（６０ｍＬ）を室温で
加えた。４５分後に、混合物を濃縮し、残渣をクロマト
グラフィー（ＳｉＯ２ ，８５：１３．５：１．５ＣＨ
Ｃｌ３ ／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ ＯＨ）で精製して、つづ
いて３０ｍＬのＭｅＯＨから結晶させると、２．１８ｇ
（８４％）の固体を得た。ｍｐ１５６−１５８℃、１
ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ ，ＣＤ３ ＯＤ）δ７．６８
−７．６１（ｍ，２Ｈ）、７．５７−７．５０（ｍ，２
Ｈ）、７．０７（明らかなシングレット，４Ｈ）、７．
０４（ｓ，１Ｈ）、５．５５（ｓ，２Ｈ）、２．８５（
ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、２．６１（ｓ，３Ｈ）、
２．５８（ｓ，３Ｈ）、１．２５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．
５Ｈｚ）。分析、計算値Ｃ２４Ｈ２３Ｎ７ ・０．２５
Ｈ２ Ｏとして：Ｃ，６９．６３；Ｈ，５．７２；Ｎ，
２３．６８．実測値：Ｃ，６９．９１；Ｈ，５．７３；
Ｎ，２３．６０。
したテトラゾール（４．１３ｇ，６．３３ｍｍｏｌ）の
かくはんした溶液に、８５％ギ酸（６０ｍＬ）を室温で
加えた。４５分後に、混合物を濃縮し、残渣をクロマト
グラフィー（ＳｉＯ２ ，８５：１３．５：１．５ＣＨ
Ｃｌ３ ／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ ＯＨ）で精製して、つづ
いて３０ｍＬのＭｅＯＨから結晶させると、２．１８ｇ
（８４％）の固体を得た。ｍｐ１５６−１５８℃、１
ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ ，ＣＤ３ ＯＤ）δ７．６８
−７．６１（ｍ，２Ｈ）、７．５７−７．５０（ｍ，２
Ｈ）、７．０７（明らかなシングレット，４Ｈ）、７．
０４（ｓ，１Ｈ）、５．５５（ｓ，２Ｈ）、２．８５（
ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、２．６１（ｓ，３Ｈ）、
２．５８（ｓ，３Ｈ）、１．２５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．
５Ｈｚ）。分析、計算値Ｃ２４Ｈ２３Ｎ７ ・０．２５
Ｈ２ Ｏとして：Ｃ，６９．６３；Ｈ，５．７２；Ｎ，
２３．６８．実測値：Ｃ，６９．９１；Ｈ，５．７３；
Ｎ，２３．６０。
【００３４】以下の実施例は、本発明を説明する目的で
述べられるが、本発明の範囲及び意向に制限を加えるも
のと考えてはならない。
述べられるが、本発明の範囲及び意向に制限を加えるも
のと考えてはならない。
【００３５】実施例１
微生物及び培養条件
凍結したガラスびん（２ｍｌ）の培養物（ＭＡ６６５９
）ＡＴＣＣＮｏ．５３７７１を、（グラム／リットル単
位で）デキストリン１０．０、デキストロース１．０、
牛肉エキス３．０、アーダミンｐＨ（Ｙｅａｓｔ Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｓ．Ｉｎｃ．） ５．０、Ｎ−Ｚアミンタイ
プＥ５．０、ＭｇＳＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ ０．０５、
Ｋ２ ＨＰＯ４ ０．３、及びＣａＣＯ３ ０．５から
成る、オートクレーブに入れた（滅菌した）５０ｍｌの
種培地を含んだ２５０ｍｌ調節された振とうフラスコに
接種した。種培地のｐＨは、オートクレーブに入れる前
に７．１に調整した。種を、２２０ｒｐｍ で運転する
回転振とう器で２７℃で２４時間種培地でインキュベー
トした。得られた種培地の２．５ｍｌのアリコートを、
前もってオートクレーブに入れた（滅菌した）以下の形
質転換培地Ｂ＊ ５０ｍｌを含んだ２５０ｍｌ調節され
てない振とうフラスコに接種した。基質化合物（ＩＩＩ
） を、ｐＨ８の水溶液として加えて、最終濃度を０．
１ｍｇ／ｍｌとした。つづいて、振とうフラスコの内容
物を、２２０ｒｐｍ で運転する回転振とう器で２４時
間２７℃でインキュベートした。この工程を３回行なっ
て、得られた３つのブロスをまとめて単離及び精製した
。＊ １．形質転換培地Ｂは、（グラム／リットル単位
で）グルコース１０．０；ヒカーゼＳＦ２．０；牛肉エ
キス１．０；コーン・スティープ・リカー３．０から成
り、オートクレーブに入れる前にｐＨを７．０に調整す
る。
）ＡＴＣＣＮｏ．５３７７１を、（グラム／リットル単
位で）デキストリン１０．０、デキストロース１．０、
牛肉エキス３．０、アーダミンｐＨ（Ｙｅａｓｔ Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｓ．Ｉｎｃ．） ５．０、Ｎ−Ｚアミンタイ
プＥ５．０、ＭｇＳＯ４ ・７Ｈ２ Ｏ ０．０５、
Ｋ２ ＨＰＯ４ ０．３、及びＣａＣＯ３ ０．５から
成る、オートクレーブに入れた（滅菌した）５０ｍｌの
種培地を含んだ２５０ｍｌ調節された振とうフラスコに
接種した。種培地のｐＨは、オートクレーブに入れる前
に７．１に調整した。種を、２２０ｒｐｍ で運転する
回転振とう器で２７℃で２４時間種培地でインキュベー
トした。得られた種培地の２．５ｍｌのアリコートを、
前もってオートクレーブに入れた（滅菌した）以下の形
質転換培地Ｂ＊ ５０ｍｌを含んだ２５０ｍｌ調節され
てない振とうフラスコに接種した。基質化合物（ＩＩＩ
） を、ｐＨ８の水溶液として加えて、最終濃度を０．
１ｍｇ／ｍｌとした。つづいて、振とうフラスコの内容
物を、２２０ｒｐｍ で運転する回転振とう器で２４時
間２７℃でインキュベートした。この工程を３回行なっ
て、得られた３つのブロスをまとめて単離及び精製した
。＊ １．形質転換培地Ｂは、（グラム／リットル単位
で）グルコース１０．０；ヒカーゼＳＦ２．０；牛肉エ
キス１．０；コーン・スティープ・リカー３．０から成
り、オートクレーブに入れる前にｐＨを７．０に調整す
る。
【００３６】ブロスの単離及び精製方法形質転換培地Ｂ
のブロス全量（１５０ｍｌ）をｐＨ３．５まで酸性にし
た後に、塩化メチレンで３回（３×１００ｍｌ）抽出し
た。塩化メチレンの抽出液をひとまとめにして硫酸ナト
リウム上で乾燥し、減圧下に油性残渣となるまで濃縮し
た。この残渣をメタノールに溶解して高性能液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけて精製した。ＨＰＬＣ
はＷｈａｔｍａｎ Ｐａｒｔｉｓｉｌ １０ ＯＤ
Ｓ−３、９．４ｍｍ×２５ｃｍカラムで室温で行ない、
２５５ｎｍと２７５ｎｍで検知した。カラムは４５分間
で０．１％水性ＴＦＡ−ＣＨ３ ＣＮ８５：１５から０
．１％水性ＴＦＡ−ＣＨ３ ＣＮ１５：８５までのリニ
アーな勾配で、３ｍｌ／ｍｉｎ で展開した。化合物は
、前記の抽出液をくりかえし注入しながら回収した。両
方の化合物が２５５ｎｍ及び２７５ｎｍで見られた。保
持時間１７．５分及び１９．８分の分画を別々にプール
して、溶媒を蒸発させると、それぞれ５−ＨＯＣＨ２
−酸化物であると確認される化合物（Ｉ）６．０ｍｇ、
および７−ＨＯＣＨ２ −酸化物であると確認される化
合物（ＩＩ） ３．０ｍｇを収量した。
のブロス全量（１５０ｍｌ）をｐＨ３．５まで酸性にし
た後に、塩化メチレンで３回（３×１００ｍｌ）抽出し
た。塩化メチレンの抽出液をひとまとめにして硫酸ナト
リウム上で乾燥し、減圧下に油性残渣となるまで濃縮し
た。この残渣をメタノールに溶解して高性能液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけて精製した。ＨＰＬＣ
はＷｈａｔｍａｎ Ｐａｒｔｉｓｉｌ １０ ＯＤ
Ｓ−３、９．４ｍｍ×２５ｃｍカラムで室温で行ない、
２５５ｎｍと２７５ｎｍで検知した。カラムは４５分間
で０．１％水性ＴＦＡ−ＣＨ３ ＣＮ８５：１５から０
．１％水性ＴＦＡ−ＣＨ３ ＣＮ１５：８５までのリニ
アーな勾配で、３ｍｌ／ｍｉｎ で展開した。化合物は
、前記の抽出液をくりかえし注入しながら回収した。両
方の化合物が２５５ｎｍ及び２７５ｎｍで見られた。保
持時間１７．５分及び１９．８分の分画を別々にプール
して、溶媒を蒸発させると、それぞれ５−ＨＯＣＨ２
−酸化物であると確認される化合物（Ｉ）６．０ｍｇ、
および７−ＨＯＣＨ２ −酸化物であると確認される化
合物（ＩＩ） ３．０ｍｇを収量した。
【００３７】特性評価
本発明の化合物（Ｉ）は、ＮＭＲ分光測定で確認したと
ころ図１のプロトンＮＭＲスペクトルを示し、又、想定
した分子構造を持つ。本発明の化合物（ＩＩ）は、ＮＭ
Ｒ分光測定で確認したところ想定した分子構造を含む図
２のプロトンＮＭＲスペクトル及び図４の１３ＣＮＭＲ
を示した。
ころ図１のプロトンＮＭＲスペクトルを示し、又、想定
した分子構造を持つ。本発明の化合物（ＩＩ）は、ＮＭ
Ｒ分光測定で確認したところ想定した分子構造を含む図
２のプロトンＮＭＲスペクトル及び図４の１３ＣＮＭＲ
を示した。
【図１】図１はＣＤ３ ＯＤ中の化合物（Ｉ）の４００
ＭＨｚ における１ Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクト
ルである。
ＭＨｚ における１ Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクト
ルである。
【図２】図２はＣＤ３ ＯＤ中の化合物（ＩＩ）の４０
０ＭＨｚにおける１ ＨＮＭＲスペクトルである。
０ＭＨｚにおける１ ＨＮＭＲスペクトルである。
【図３】図３はＣＤ３ ＯＤ中の化合物（ＩＩＩ） の
４００ＭＨｚ における１ ＨＮＭＲスペクトルである
。
４００ＭＨｚ における１ ＨＮＭＲスペクトルである
。
【図４】図４は化合物（ＩＩ）の１３ＣＮＭＲスペクト
ルである。なお、図中においてＡはスペクトルチャート
、Ｂは各々の相当する化合物を示す。
ルである。なお、図中においてＡはスペクトルチャート
、Ｂは各々の相当する化合物を示す。
Claims (6)
- 【請求項１】 構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）：【化１】 の化合物。
- 【請求項２】 無毒性で治療効果のある量の、請求項
１の化合物及び医薬的に許容される担体から成る抗高血
圧医薬組成物。 - 【請求項３】 無毒性で治療効果のある量の、請求項
１の化合物を、高血圧又はうっ血性心疾患の治療を要す
る対象に投与することからなる治療方法。 - 【請求項４】 構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）：【化２】 で表わされる化合物の製造過程において、十分な量のこ
の化合物が生産されるまで好気的条件下に、同化可能な
窒素源、炭素源及び基質化合物（ＩＩＩ）【化３】 を含む栄養培地中で微生物アクチノプラーネス（Ａｃｔ
ｉｎｏｐｌａｎａｃｅｔｅ ｓｐ．）（ＭＡ６５５９）
（ＡＴＣＣ５３７７１） を培養すること、そしてこの
ように生産された化合物を単離することから成る過程。 - 【請求項５】 温度が２６〜２９℃である請求項４記
載の過程。 - 【請求項６】 温度が２７℃である請求項５記載の過
程。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US52197090A | 1990-05-11 | 1990-05-11 | |
| US521970 | 1990-05-11 | ||
| US53994190A | 1990-06-18 | 1990-06-18 | |
| US539941 | 1990-06-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04226982A true JPH04226982A (ja) | 1992-08-17 |
Family
ID=27060656
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3105495A Withdrawn JPH04226982A (ja) | 1990-05-11 | 1991-05-10 | 抗高血圧性生成物を得るための微生物形質転換過程 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0456510A1 (ja) |
| JP (1) | JPH04226982A (ja) |
| CA (1) | CA2041763A1 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE70593B1 (en) * | 1989-09-29 | 1996-12-11 | Eisai Co Ltd | Biphenylmethane derivative the use of it and pharmacological compositions containing same |
| US5128327A (en) * | 1991-03-25 | 1992-07-07 | Merck & Co., Inc. | Angiotensin II antagonists incorporating a nitrogen containing six membered ring heterocycle |
| US5177074A (en) * | 1991-03-26 | 1993-01-05 | Merck & Co., Inc. | Angiotensin ii antagonists incorporating a substituted thiophene or furan |
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